專(zhuān)利名稱(chēng)：伊維菌素及其衍生物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種法尼醇受體(Farnesoid X receptor, FXR)的新型有效的配體伊維菌素(ivermectin)及其衍生物區(qū)別于抗寄生蟲(chóng)藥物的新用途，以及用于新用途的伊維菌素的衍生物的設(shè)計(jì)、優(yōu)化和合成的方法。
背景技術(shù)：
核受體是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。FXR是人體48種核受體中非常重要的一員，在代謝、炎癥、腫瘤等重大疾病及相關(guān)生理功能中起著重要的調(diào)控作用。FXR的配體介導(dǎo)的藥理作用原理是配體通過(guò)與FXR的配體結(jié)合域(LBD)結(jié)合，招募各類(lèi)輔激活因子(或輔抑制因子)來(lái)調(diào)節(jié)下游靶基因。在體內(nèi)，膽汁酸是FXR的內(nèi)源性配體，F(xiàn)XR的激活能夠維持膽汁酸在肝臟和小腸中的正常循環(huán)和穩(wěn)態(tài)，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)糖類(lèi)、脂類(lèi)和膽固醇的水平。FXR牽涉到許多代謝相關(guān)的信號(hào)通路，成為治療代謝疾病如膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈·粥樣硬化和糖尿病等出色的藥物靶分子。最近，F(xiàn)XR被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)肝臟的再生，小鼠FXR基因敲除會(huì)導(dǎo)致肝癌的形成。鵝去氧膽酸(英文名chenodeoxycholic acid,縮寫(xiě)CDCA)是一種能結(jié)合并激活FXR的膽酸，用于治療膽結(jié)石。CDCA是能結(jié)合FXR的配體中唯一用于臨床的藥物。但是⑶CA對(duì)FXR的親和性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人工合成的FXR的配體GW4064，而且⑶CA還能結(jié)合膽酸結(jié)合蛋白(I-BABP)和膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Bile Acid Transporter)等其它蛋白，因此，CDCA也不是特異性以FXR為靶標(biāo)的藥物。目前，世界銷(xiāo)售額前100名的藥物中有高于13%的藥物都是以核受體為靶標(biāo)的，基于FXR參與調(diào)控的重要生理作用，篩選以FXR為靶標(biāo)的新配體藥物以及對(duì)配體藥物進(jìn)行優(yōu)化、設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。伊維菌素(ivermectin)是鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯阿維菌素(avermectin)的一種衍生物，具有高效廣譜的抗寄生蟲(chóng)作用，主要應(yīng)用于家畜寄生蟲(chóng)控制和人絲蟲(chóng)感染的治療。已有報(bào)道表明伊維菌素在無(wú)脊椎動(dòng)物中的靶標(biāo)是GABA和GluClR等離子通道受體。Hibbs研究組首先解析了 GluClR/ivermectin復(fù)合物的結(jié)構(gòu),揭示了 ivermectin抗寄生蟲(chóng)的作用機(jī)制，但這些無(wú)脊椎動(dòng)物中的離子通道受體不存在于脊椎動(dòng)物。多拉克汀(Doramectin)也是阿維菌素的衍生物。也廣泛用于家畜寄生蟲(chóng)控制和人絲蟲(chóng)感染的治療。迄今為止尚未報(bào)道在哺乳動(dòng)物中存在伊維菌素的靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供伊維菌素及其衍生物的用途。所述伊維菌素(ivermectin)是鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯阿維菌素(avermectin)的一種衍生物，具有高效廣譜的抗寄生蟲(chóng)作用，主要應(yīng)用于家畜寄生蟲(chóng)控制和人絲蟲(chóng)感染的治療，其結(jié)構(gòu)式(記為結(jié)構(gòu)式I )為23 ,
I ^ I 16
V° 11 18 T Η 1
I OiJ5
Il OHl1
I
OH結(jié)構(gòu)式I
所述伊維菌素具有完全不同于抗寄生蟲(chóng)作用的新功能。該功能的特征在于，首次提出伊維菌素在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在特異性靶標(biāo)蛋白法尼醇受體，伊維菌素通過(guò)高親和力并特異性結(jié)合法尼醇受體(FXR)，調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物血清中糖、脂和膽固醇的代謝，有效降低糖尿病動(dòng)物模型血清中糖、脂和膽固醇的水平，改善相應(yīng)的癥狀。伊維菌素還能通過(guò)法尼醇受體介導(dǎo)抑制炎癥反應(yīng)。因此，所述伊維菌素及其衍生物在制備用于治療哺乳動(dòng)物高血糖、胰島素抗性、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥等代謝相關(guān)疾病的藥物，以及用于治療法尼醇受體介導(dǎo)的膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等疾病的藥物中的應(yīng)用。所述伊維菌素衍生物,例如阿維菌素(avermectin)、多拉克汀(Doramectin)等。阿維菌素(avermectin)是在伊維菌素結(jié)構(gòu)式中C22-C23位為雙鍵。我們發(fā)現(xiàn)阿維菌素能高親和力特異性結(jié)合FXR，也是FXR的配體。因此，阿維菌素具有用于治療哺乳動(dòng)物高血糖、胰島素抗性、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥等代謝相關(guān)疾病，以及用于治療法尼醇受體介導(dǎo)的膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等疾病的新用途。多拉克汀(Doramectin)，是在伊維菌素結(jié)構(gòu)式中C22-C23位為雙鍵，C25位是苯環(huán)側(cè)鏈取代。我們發(fā)現(xiàn)多拉克汀能高親和力特異性結(jié)合FXR，也是FXR的配體。因此，多拉克汀具有用于治療哺乳動(dòng)物高血糖、胰島素抗性、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥等代謝相關(guān)疾病，以及用于治療法尼醇受體介導(dǎo)的膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等疾病的新用途。伊維菌素作為抗寄生蟲(chóng)藥物用于家畜和人體，其使用的安全性已經(jīng)在全世界得到認(rèn)證。因此，本發(fā)明通過(guò)X射線晶體衍射，從原子水平上提供了伊維菌素與法尼醇受體結(jié)合的獨(dú)特結(jié)構(gòu)模式，為以法尼醇受體為靶標(biāo)的配體藥物設(shè)計(jì)提供了安全的先導(dǎo)藥物小分子以及藥物優(yōu)化結(jié)構(gòu)模板和設(shè)計(jì)方法。以法尼醇受體與伊維菌素結(jié)合的結(jié)構(gòu)模式為根據(jù)(附錄1)，以伊維菌素結(jié)構(gòu)式(如結(jié)構(gòu)式I )為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)、藥物合成和藥物篩選的方法，具體步驟為以結(jié)構(gòu)式I為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)該結(jié)構(gòu)式中C3-C4，C8-C9，C10-C11, C14-C15碳碳雙鍵進(jìn)行改造；對(duì)〇5、
C7、C4”位羥基進(jìn)行改造；對(duì)C4、C12、C14、C24、C25位的側(cè)鏈進(jìn)行改造；對(duì)C13位的糖基進(jìn)行水解以及其他基團(tuán)進(jìn)行取代等改造方法。特征在于以上任何單一改造和不同方式改造的組合在制備治療哺乳動(dòng)物高血糖、胰島素抗性、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥等代謝相關(guān)疾病，以及用于治療法尼醇受體介導(dǎo)的膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)高通量篩選得到抗寄生蟲(chóng)藥物伊維菌素(ivermectin)是FXR的特異性配體。根據(jù)對(duì)伊維菌素的結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)方案，發(fā)現(xiàn)多拉克汀和阿 維菌素也是FXR的特異性配體。基于體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中熒光素酶報(bào)告基因活性分析及分子結(jié)構(gòu)水平闡述這種受體與配體間的特異的選擇性識(shí)別；通過(guò)體外的細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型檢測(cè)ivermectin處理后相關(guān)靶基因的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)狀態(tài)，闡述對(duì)下游信號(hào)通路功能的影響；檢測(cè)ivermectin處理的小鼠模型中各項(xiàng)生化指標(biāo)的變化并結(jié)合相應(yīng)的信號(hào)通路的功能變化闡述致病的分子機(jī)理；用糖尿病肥胖癥模型小鼠經(jīng)伊維菌素藥物處理，確定伊維菌素在用于治療哺乳動(dòng)物高血糖、胰島素抗性、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥等疾病，以及代謝相關(guān)的法尼醇受體介導(dǎo)的膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中的用途，確定伊維菌素在治療炎癥反應(yīng)中的用途。并根據(jù)FXR在癌癥細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)作用衍生出ivermectin在癌癥中的治療作用。將FXR/ivermectin制備復(fù)合物,通過(guò)結(jié)晶學(xué)手段,對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行結(jié)晶、X射線晶體衍射以及結(jié)構(gòu)解析，從原子水平闡明了 FXR與伊維菌素相互結(jié)合的獨(dú)特結(jié)合模式，為以FXR為靶標(biāo)的哺乳動(dòng)物的上述疾病的治療藥物的設(shè)計(jì)提供了安全的先導(dǎo)藥物小分子以及藥物設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)模板和設(shè)計(jì)方法。


圖I為GW4064與ivermectin分別和FXR結(jié)合促進(jìn)了 FXR募集輔調(diào)節(jié)因子。在圖I中，橫坐標(biāo)表示生物素標(biāo)記的幾種輔調(diào)節(jié)因子與FXR結(jié)合序列的多肽。圖2為O. 5 μ M ivermectin對(duì)FXR受體的特異性轉(zhuǎn)錄激活。用FXR等不同核受體的全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒和不同核受體相應(yīng)的內(nèi)源結(jié)合元件構(gòu)建的報(bào)告基因共同轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，用DMSO或O. 5 μ M ivermectin處理細(xì)胞。圖3為ivermectin對(duì)FXR受體轉(zhuǎn)錄活性的激活是受配體濃度影響的。在圖3中，橫坐標(biāo)表示配體濃度的對(duì)數(shù)值。圖4為FXR/ivermectin蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)圖。結(jié)合在FXR LBD配體口袋的ivermectin用棒狀結(jié)構(gòu)式表示。在圖4中,NcoR2表示與FXR和ivermectin形成復(fù)合體的輔調(diào)節(jié)因子NcoR中與FXR結(jié)合序列的多肽。圖5為結(jié)合在FXR上的ivermectin電子云圖譜。圖6為Ivermectin和FXR結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)及其對(duì)FXR轉(zhuǎn)錄活性的影響與ivermectin相互作用的關(guān)鍵氨基酸的突變對(duì)ivermectin和GW4064激活FXR轉(zhuǎn)錄活性的影響。全長(zhǎng)表達(dá)FXR(Wt)或相應(yīng)點(diǎn)突變的表達(dá)質(zhì)粒與EcRE報(bào)告基因公轉(zhuǎn)染于C0S-7細(xì)胞后用ivermectin和GW4064處理細(xì)胞后檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活性。在圖6中，橫坐標(biāo)表示野生型的FXR(WT)和4個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變體。圖7為Ivermectin通過(guò)FXR下調(diào)血清中糖的水平。
圖8為Ivermectin通過(guò)FXR下調(diào)血清中胰島素的水平。圖9為Ivermectin通過(guò)FXR下調(diào)血清中膽固醇的水平。圖10為Ivermectin能下調(diào)血清中甘油三酯的水平。圖11為Ivermectin處理對(duì)小鼠攝食量無(wú)影響。圖12為Ivermectin處理后小鼠的體重沒(méi)有變化。圖13為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Ivermectin處理后小鼠肝臟內(nèi)FXR靶基因及和糖類(lèi)、甘油三酯和膽固醇代謝相關(guān)的基因表達(dá)。1(Γ12周齡野生型小鼠和FXR基因敲除型小鼠通過(guò)腹腔注射4O%HBC(2-hydroxypropyl_0-cyclodextrin)或由40%HBC稀釋的 ivermectin 14 天,攝食量每隔一天稱(chēng)一次，Kcal, kilocalories ；Bff, body weight。處理14天后饑餓6h，稱(chēng)體重(F)。眼球取血收集血清用于糖脂水平檢測(cè)。取肝臟凍存用于提
取RNA檢測(cè)基因表達(dá)水平。在圖疒13中，WT表示野生型小鼠，KO表示FXR基因敲除型小鼠。白色柱子表示用HBC溶劑處理的對(duì)照組小鼠，黑色柱子表示ivermectin處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠。每組6只小鼠。*表示相對(duì)對(duì)照組的數(shù)據(jù)具有顯著差異性，*為ρ〈0· 05 ;**為ρ〈0· 01, ***為ρ〈0· 001。圖14為Ivermectin處理對(duì)KK-Ay糖尿病模型小鼠攝食量無(wú)影響。圖15為Ivermectin處理后降低了 ΚΚ-Ay糖尿病模型小鼠體重。圖16為Ivermectin處理后降低了 ΚΚ-Ay小鼠中血糖水平。圖17為Ivermectin處理后降低了 ΚΚ-Ay小鼠中胰島素水平。圖18為Ivermectin處理后降低了 ΚΚ-Ay小鼠中膽固醇水平。圖19為Ivermectin處理后降低了 ΚΚ-Ay小鼠中甘油三酯水平。圖20為Ivermectin處理后降低了 KK-Ay小鼠中自由脂肪酸水平。圖21為Ivermectin處理后檢測(cè)和血糖、膽固醇、甘油三酯和脂肪酸代謝的相關(guān)基因表達(dá)。I (Γ12周齡KK-Ay小鼠分別腹腔注射HBC對(duì)照、GW4064 (30mg/kg)和ivermectin (I. 3mg/kg) 14 天，攝食量每隔一天稱(chēng)一次，Kcal, kilocalories ；Bff, bodyweight。處理14天后饑餓6h，稱(chēng)體重(B)。眼球取血收集血清用于糖脂水平檢測(cè)。取肝臟凍存用于提取RNA檢測(cè)基因表達(dá)水平。在圖1Γ21中，白色柱子表示HBC溶劑處理的對(duì)照組小鼠，斜紋柱子表示用用GW4064處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠，黑色柱子表示ivermectin處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠。每組6只小鼠。*表示相對(duì)對(duì)照組的數(shù)據(jù)具有顯著差異性，*為p〈0. 05 ;**為p〈0. 01。圖22為Ivermectin通過(guò)FXR介導(dǎo)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)(iNOS)。圖23為Ivermectin通過(guò)FXR介導(dǎo)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)(TNFa)。圖24為Ivermectin通過(guò)FXR介導(dǎo)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)(IL-6)。圖25為Ivermectin通過(guò)FXR介導(dǎo)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)(MIP-la)。在圖22 25中，WT表示野生型小鼠，KO表示FXR基因敲除型小鼠。白色柱子表示用HBC溶劑處理的對(duì)照組小鼠，斜紋柱子表示用用GW4064處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠，黑色柱子表示ivermectin處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠。每組6只小鼠。*表示相對(duì)對(duì)照組的數(shù)據(jù)具有顯著差異性，* 為 Ρ〈0· 05 ;林為 ρ〈0· 01。圖26為Ivermectin通過(guò)FXR介導(dǎo)抑制NF-K B (ρ65)的轉(zhuǎn)錄活性。
圖27為Ivermectin通過(guò)RXR介導(dǎo)抑制NF-κ B (ρ65)的轉(zhuǎn)錄活性。圖28為阿維菌素和多拉克汀具有與伊維菌素相似的FXR高親和力。在圖28中，橫坐標(biāo)表示配體濃度的對(duì)數(shù)值。圖29為阿維菌素與多拉克汀具有與伊維菌素類(lèi)似的誘導(dǎo)FXR募集各種輔調(diào)節(jié)因子的能力。
具體實(shí)施例方式蛋白純化I.克隆(I)以 pcDNA-FXR 質(zhì)粒為模板，O. 5 μ L 50mM 前向引物 5 , GATATGGATCCAATCCAGAGTCCGCTGACCTC, O. 5 μ L 50mM 反向引物 3 , GATATCTCGAGCTAGTACAAGT CCTTGTAGATC 為 引物，4yL 10XPCR buffer, I μ L IOmM dNTP 及 5U pfu 酶(Invitrogen)加水(Milli-Q)補(bǔ)足至50 μ L體系進(jìn)行PCR反應(yīng)以獲得含有雙酶切位點(diǎn)BamH I和Xho I的人源FXR LBD(配體結(jié)合域)(氨基酸殘基數(shù)243-472)的PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2min
94C 30s 、
580C Imin [ 30 個(gè)循環(huán) 72 V Imin ^72 °C IOmin(2)酶切克隆插入DNA片段和pET24a (Novagen)載體用BamH I和Xho I對(duì)PCR產(chǎn)物及pET24a載體進(jìn)行酶切。酶切體系為
FXR LBD PCR /'物成 pET24a 戰(zhàn)休i Ug (丨 O1UL)
BamH I (Thermo)0.5 liL
Xho I CThermo)0.5 μL
4X Digestion Buffer (. Tiiermo)4 μΙ>
(IdH2O (Milli-QjuL37°C I. 5h。 (4)酶切后的PCR產(chǎn)物和pET24a載體通過(guò)加有SYBR DNA染料的1%瓊脂糖凝膠分離并通過(guò)Promega膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收處理。(5)將回收片段和載體以摩爾比3 I連接。連接體系為FXR LBD PCR 產(chǎn)物2 μ
pET24a ( Novagen)戰(zhàn)體2 μL
5 X Ligation Buffer緩？ 11 液(Invitrogen)2 pL
T4 DNA Ligase (T4 DNA 述接^-Invitrogen)0.5 μ
,!JHddH2O 個(gè)IO^1L室溫反應(yīng)30min。(6)取2 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入50 μ L Trans 109感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min后42°C熱激30s。加入無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基250yL，于225rpm 37°C預(yù)搖40min后，取150 μ L·轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于添加有50μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。(7)次日，挑取單克隆于2ml含50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng) IOh0(8)采用Qiagen MiniPrep質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)所搖菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。(9)對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定體系
質(zhì)粒2 gL
BamH I C Thermo)0.5 LiL
Xho S C Thermo)0.5 μL
4X Digestion Buffer (Thermo)2 μL
ddH20 (Milli-Q)15 μ 37°C恒溫箱酶切反應(yīng)30min后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)以確定目的片段成功插入表達(dá)載體。最后將獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。得到六聚組氨酸標(biāo)記的人類(lèi)核受體FXR LBD的表達(dá)質(zhì)粒,表示為pET24a-His6-FXR LBD02.目的蛋白表達(dá)和純化(I)轉(zhuǎn)化將pET24a_Hi s6_FXR LBD轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21 (DE3 )感受態(tài)細(xì)胞，取I μ L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入50 μ LBL21感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min后放入42°C水浴鍋中熱激30s。加入無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基250 μ L于225rpm 37°C預(yù)搖40min后取15 μ L涂于添加有50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。(2)搖菌次日挑單克隆于50ml含50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C預(yù)搖8h后轉(zhuǎn)入含50 μ g/ml卡那霉素的I. 5L LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)0D600達(dá)到I. O左右時(shí)，加入O. ImM的IPTG在16°C下低溫誘導(dǎo)表達(dá)。(3)收集含有誘導(dǎo)目的蛋白的菌體細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜的I. 5L菌液于4°C 3，OOOrpm離心IOmin收集細(xì)菌，用純化緩沖液 100ml (20mM Tris pH8. O, 150mM NaCl, 10%glycerol, 25mM imidazole)重懸菌液，凍存于-80。。。(4)蛋白質(zhì)提取
米用Fisher Scientific Sonic Dismembrator 超聲破碎儀以振幅 60%, 5s 工作IOs休息的頻率超聲波處理8min。BECKMAN 離心機(jī)以 20，OOOrpm 4°C 離心 30min 后取上清。(5)蛋白質(zhì)純化將上清過(guò)5ml 的鎮(zhèn)離子交換柱(NiS04_loaded HisTrap HP column, GEHealthcare),使目的蛋白質(zhì)充分富集到鎳柱上。采用GE公司AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)及UNICORN軟件操作。洗泵先用水洗,再用緩沖液洗。操作步驟為在System Control窗口中，依次選擇ManuaI — Pump — Pumpwashbasic — PumpA, PumpB — On — Excute0層析柱連接先啟動(dòng)系統(tǒng)泵，待有溶液流出時(shí)，將層析柱動(dòng)態(tài)接入系統(tǒng)，使流出的
蛋白質(zhì)可以經(jīng)過(guò)UV檢測(cè)到峰值，打開(kāi)UNICORN軟件，編輯蛋白洗脫的程序20ml洗脫緩沖液進(jìn)行柱平衡25-500mM咪唑進(jìn)行梯度競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合柱子以洗脫目的蛋白質(zhì)15ml緩沖液進(jìn)行柱平衡。蛋白質(zhì)洗脫用洗脫緩沖液A、B梯度洗脫該柱子上的蛋白(洗脫緩沖液A成分25mMTris, 150mM NaCl, 25mM Imidazole 和 10% 甘油，pH 7. 5 ;洗脫緩沖液 B 成分25mMTris, 150mM Imidazole和10%甘油，pH7. 5)，通過(guò)控制咪唑濃度梯度變化在25 500mM，以在合適濃度競(jìng)爭(zhēng)下洗脫含相似結(jié)構(gòu)的組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白質(zhì)。采用Q陰離子交換柱利用目的蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷進(jìn)一步分離純化過(guò)鎳柱后的蛋白質(zhì)，方法同上。蛋白洗脫緩沖液換為洗脫緩沖液C、D (洗脫緩沖液C:25mM Tris，pH7. 5;洗脫緩沖液 D 25mM Tris, I. OM NaCl，ρΗ7· 5)。采用Hiload26分子篩層析柱(GE Healthcare)利用分子量不同進(jìn)一步純化目的蛋白質(zhì)，步驟如下將Q柱收集的蛋白質(zhì)盛入Millipore IOkD的濃縮管，4°C 4，000g, 20min離心到終體積IOml后，經(jīng)注射器注入AKTA端口后開(kāi)始程序運(yùn)行，方法同上。蛋白洗脫緩沖液換為含有IOmM NaCl的洗脫緩沖液C (洗脫緩沖液C 25mM Tris, ρΗ7· 5)。(6)制備蛋白質(zhì)復(fù)合體采用從金斯瑞定制合成的NcoR2多肽(PASNLGLEDIIRKALMGS)與FXR LBD蛋白復(fù)合體分子篩柱層析得到的20ml蛋白質(zhì)與NcoR2多肽及ivermectin按摩爾比1:1:1混合加入IOkD MILLIP0RE 15ml濃縮管中濃縮，4°C 4，000離心濃縮，將蛋白濃縮到10mg/ml的終濃度。蛋白結(jié)晶，晶體數(shù)據(jù)收集與結(jié)構(gòu)解析采用懸滴法進(jìn)行結(jié)晶篩選，F(xiàn)XR/ivermectin/NcoR2復(fù)合物在室溫條件下，懸滴液成分為I. 0μ I上述蛋白多肽配體復(fù)合體溶液混合上I. 0μ I結(jié)晶緩沖液(50mM HEPESpH7. O, 3. 5Msodium formate)。生長(zhǎng)成熟的蛋白晶體用液氮進(jìn)行急速冷凍保存。在上海光源的BL17U1線站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。經(jīng)X光照射處理后，所得衍射數(shù)據(jù)通過(guò)HKL2000軟件處理確定每個(gè)不對(duì)稱(chēng)單元含有兩個(gè)分子，晶體空間基團(tuán)為I 212121 (a=53. 01, b=161. 76,c=169. 02, α =90° , β =90° , Y =90° ),具體結(jié)構(gòu)解析使用由 CCP4 程序包(http://www.ccp4. ac. uk)中的Molrep、Phaser等通過(guò)分子置換確定出大致結(jié)構(gòu)模型,通過(guò)Coot的人工模型精細(xì)構(gòu)建及REFMAC和phenix. refine深入修飾的多次循環(huán),得到最終蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)模型的Rwork和Rfree分別為25. 4%和28. 2%，分辨率為2.81 A。具體的三維晶體結(jié)構(gòu)空間元素見(jiàn)附錄I。輔因子結(jié)合實(shí)驗(yàn)通過(guò) Alphascreen 分析方法，用 Alpha Screen nickel chelate detection kit試劑盒(Perkins-Elmer)檢測(cè)配體誘導(dǎo)核受體募集各種輔調(diào)節(jié)因子的結(jié)合能力(Li etal. 2005)。該實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系是20nM的融合組氨酸標(biāo)簽的受體LBD蛋白，20nM生物素化標(biāo)記的輔因子多肽，5 μ g/ml的供體和受體珠子，緩沖液(50mM MOPS, 50mM NaF, O. 05mMCHAPS, and 0. lmg/ml bovine serum albumin, pH7. 4),反應(yīng)體系 50 μ L 于 384 孔板中室溫反應(yīng)Ih后用AlphaScreen檢測(cè)儀讀取680nm激發(fā)光下520_620nm的發(fā)射光信號(hào)。用于Alphascreen分析的生物素標(biāo)記的多肽序列如下SRC1-2, SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP; SRC2-3, QEPVSPKKKENALLRYLLDKDDTKD;SRC3-3, PDAASKHKQLSELLRGGSG;NC0R-2, GHSFADPASNLGLED11RKALMGSF.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)I.質(zhì)粒(I)FXR全長(zhǎng)質(zhì)粒將人類(lèi)FXR全長(zhǎng)cDNA表達(dá)序列采用經(jīng)典克隆方法克隆到pCMX表達(dá)載體。(2)獲得關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的FXR點(diǎn)突變表達(dá)載體。使用Quick-Changesite-directed mutagenesis試劑盒(Stratagene)進(jìn)行突變,突變反應(yīng)體系如下
野生型質(zhì)粒 pCMX-FXR (50 ng)0.5 ^iL
突變引物(100 pMstock)0.2 pL
pfi.i. DNA(Invitrogen) (,2 Lj)I ^iL
10 mM dNTPsI μL
IO X PCR buffer5
ddH2043 suL94°C 2min
94't 30s '
55 0C Imin > 15 個(gè)循環(huán)I TC 7min
J4°C forever20yLPCR產(chǎn)物用Dpn I甲基化酶消化后取2 μ L消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans 109感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min后42°C熱激30s。加入無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基250 μ L于225rpm37°C預(yù)搖40min后取150 μ L涂于添加有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取單克隆于2ml含100μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。采用Qiagen MiniPrep質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)所搖菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)定鑒定。(3)各內(nèi)源結(jié)合元件的報(bào)告基因直接商業(yè)購(gòu)買(mǎi)。2.轉(zhuǎn)染使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行猴腎上皮細(xì)胞C0S-7細(xì)胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天在24孔板進(jìn)行C0S-7細(xì)胞接種，接種密度為5X IO4細(xì)胞/每孔，第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(Li et al. 2005)。在報(bào)告基因分析實(shí)驗(yàn)中，使用200ng的核受體全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)?；蚱渫蛔凅w表達(dá)質(zhì)粒與200ng的內(nèi)源啟動(dòng)子報(bào)告基因以及30ng的Renilla熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。每孔添加500 μ LOpti-MEM··培養(yǎng)5h后，添加稀釋在Opti-MEM的配體藥物至相應(yīng)濃度，處理18h。各種核受體及相應(yīng)的報(bào)告基因使用如下:人 FXR, EcRE-Luc ;人 PPARs ( α，δ，and y), PPRE-Luc ;人 RORs ( α，β和 Y )，Pcp2/R0RE-Luc ;人 GR 和 PR, MMTV-Luc ;人 RARa 和 RAR^，β RE-Luc。用于檢測(cè)炎癥反應(yīng)相關(guān)的報(bào)告基因分析中，轉(zhuǎn)染Ρ65使用的是含NF- κ B (ρ65)的靶基因啟動(dòng)子結(jié)合元件的兩種報(bào)告基因(IL6) X3-luc和NF-κ B-Iuc。3.報(bào)告基因分析配體藥物處理18h后，用Promega公司的雙熒光素梅報(bào)告基因分析試劑盒進(jìn)行報(bào)告基因活性分析。裂解細(xì)胞用于熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，取 ο μ L細(xì)胞裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板，加入50 μ L熒光素酶反應(yīng)液后使用EnSpire 2300多功能酶標(biāo)儀(Perkin Elmer)檢測(cè)在560nm下的發(fā)射光信號(hào),后加入Stop&Glo 反應(yīng)液終止突光素酶反應(yīng)并檢測(cè)renilla突光素酶活力。報(bào)告基因的活性以renilla活性為內(nèi)參。小鼠試驗(yàn)使用10-12周的野生型C57BL/6J小鼠和同樣背景的FXR基因缺失純合子小鼠(FXR+)以及糖尿病肥胖癥模型小鼠(KK-Ay)，在廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別動(dòng)物房，用高脂飼料(Research Diets, D12492)喂養(yǎng)，自由飲水。按對(duì)照組、伊維菌素處理組和/或GW4064處理組分，每組6只，分別通過(guò)腹腔注射對(duì)照(40%的HBC (2_hydroxypropyl-β -cyclodextrin))溶液、用對(duì)照溶液稀釋的ivermectin (按藥物質(zhì)量/小鼠體重來(lái)算，注射量為I. 3mg/kg)，和/或用對(duì)照溶液稀釋的GW4064 (30mg/kg)。每天早上9點(diǎn)腹腔注射一次，連續(xù)注射14天，每隔一天稱(chēng)小鼠體重和小鼠攝食量。14天結(jié)束后，給小鼠饑餓6h，自由進(jìn)水。禁食6h后，稱(chēng)小鼠體重，用最后體重相對(duì)注射試驗(yàn)處理前的初始體重百分比表示小鼠體重的變化(附圖4F和5B)。然后從眼球取血，分離得到血清。血清中成分分別是由以下試劑盒測(cè)得糖-氧化酶法(北京普利萊)；胰島素(Crystal Chem. Inc.，USA);膽固醇(Bioassay Systems, USA);甘油三酯(北京普利萊和 WAKO Chemicals Inc.，Japan);自由脂肪酸(Bioassay Systems，USA)。取下小鼠肝臟，液氮凍存，供提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)使用。熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)從對(duì)照(40%HBC)或ivermectin處理的野生型和FXR敲除的小鼠模型中獲得肝臟組織；從對(duì)照、GW4064或ivermectin處理過(guò)的KK-Ay小鼠模型中獲得肝臟組織,凍存于_80度冰箱。用RNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek, GA)從組織中提取總RNA。采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用SYBR綠色熒光染料在CFX 96系統(tǒng)(BIO-RAD)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)下進(jìn)行熒光定量PCR分析基因表達(dá)水平。反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.伊維菌素及其衍生物在制備用于治療哺乳動(dòng)物代謝相關(guān)疾病的藥物，以及用于治療法尼醇受體介導(dǎo)的膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述伊維菌素的結(jié)構(gòu)式為
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述代謝相關(guān)疾病包括高血糖、胰島素抗性、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、糖尿病或肥胖癥。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述衍生物包括阿維菌素或多拉克汀。
全文摘要
伊維菌素及其衍生物的用途，涉及一種伊維菌素。所述伊維菌素是鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯阿維菌素的一種衍生物，所述伊維菌素及其衍生物在制備用于治療哺乳動(dòng)物高血糖、胰島素抗性、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖癥等代謝相關(guān)疾病的藥物，以及用于治療法尼醇受體介導(dǎo)的膽汁阻塞、膽結(jié)石、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102872066SQ201210403320
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者李勇, 金利華, 馮需輝 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)