專利名稱：加載于磷酸鈣納米載體的脂溶性化療藥的制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的化療藥物的制備方法及應用，特別是涉及一新型的加載于磷酸鈣納米載體的脂溶性化療藥的制備方法，以及采用該方法制備的脂溶性化療藥在抗腫瘤領域中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是影響人類健康的重大疾病之一，近年來隨著生活習慣、飲食習慣及環(huán)境惡化等多種因素的影響，惡性腫瘤的發(fā)病率呈不斷上升的趨勢。據(jù)WHO統(tǒng)計，截至2008年，全球共有760萬人死于癌癥，約占各種疾病總死亡人數(shù)的13%，推測至2030年，全世界將有1100萬人死于癌癥(摘自WHO官方網(wǎng)站)。 癌癥的治療方法迄今已經(jīng)發(fā)展了十幾種之多，常規(guī)治療手段主要有三種手術治療、化學治療和放射治療(Chinese Journal of Cancer, 2010，29(3) : 370-375)。化學治療也被人們稱為藥物治療，在癌癥的治療過程中占有很重要的地位，從上世紀40年代以來，就開始使用化學藥物來殺死快速生長的癌細胞，化療藥物的應用使腫瘤的全身治療成為可能，病人的生存率明顯提聞。化學治療的作用機制主要分生化作用機制和細胞生物學機制兩種生化作用機制主要通過破壞DNA結構和功能、抑制轉(zhuǎn)錄過程阻止RNA合成、影響蛋白質(zhì)合成與功能、影響體內(nèi)激素平衡、影響核酸生物合成來實現(xiàn)其抗腫瘤作用；從細胞生物學角度來說，能夠誘導腫瘤細胞分化，抑制腫瘤細胞增殖或者引起腫瘤細胞死亡的藥物均可發(fā)揮抗腫瘤作用。由于化學治療是將藥物經(jīng)血管帶到全身，對身體所有的細胞都有影響，這種療法有時也成為“胞毒療法”，因為所用藥物都是有害，甚至是帶毒性的，體內(nèi)細胞，無論是否惡性細胞，都將受到破壞。所以化療藥物在使用過程中所帶來的各種副作用極大的限制了其在臨床中的應用，使它們的療效并不能盡如人意。另外，許多高活性的化療藥為疏水性物質(zhì)，在生理條件下溶解性差，在血液傳輸過程中容易聚集形成團塊堵塞毛細血管，進而影響到藥物的有效傳輸。因此，開展脂溶性化療藥臨床前期的應用基礎研究，改變已有藥物的劑型，解決其在血液中的有效傳輸?shù)葐栴}，成為推動化學療法臨床應用進程的關鍵。近年來，研究者主要通過構建化療藥納米載體的途徑來克服化療藥水溶性差的缺陷(Nat. Rev. Cancer 2005; 5:161-171 ;ACS Nano 2009; 3:16-20 ;Mol. Cancer Ther.2006; 5: 1909-1917)。目前使用的載體主要包括脂質(zhì)體、聚合物膠束和可生物降解的高分子聚合物(聚已內(nèi)脂、聚乳酸、聚乙酸-羥基乙酸共聚物等)。利用上述的載體來遞送化療藥，雖然可增強化療藥的水溶性，卻仍然存在缺陷，例如脂質(zhì)體容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬清除，阻礙了載藥脂質(zhì)體向?qū)嶓w瘤的運輸；而聚合物膠束在進入人體后會存在臨界膠束濃度，在臨界膠束濃度下容易解聚，導致藥物快速釋放。因此，探索研發(fā)新型化療藥遞送載體成為該領域的研究熱點。無機型納米粒子作為一種新型的藥物和生物分子載體，其應用前景廣闊。在生物分子載體領域，許多無機型納米材料(如磷酸鈣、氧化鐵、層狀雙氫氧化物)都已得到了廣泛應用(Acta Biomater. 5 (2009) 3112-3121)。磷酸鈣作為最具有前途的載體之一，既是人體骨骼與牙齒的重要組 成部分，又具有生物相容性好、在生理條件下能夠生物降解、降解產(chǎn)物無毒等優(yōu)點。磷酸鈣類物質(zhì)的多孔特性使得其可與多種藥物和生物活性物質(zhì)結合，且不會使結合的藥物失去活性，因此可用作藥物載體。已有諸多文獻報道將磷酸鈣類物質(zhì)用作抗生素、蛋白質(zhì)、生長因子及抗癌藥物的載體(Expert Rev. Med. Devices. 2005, 2:87-101)。而且，納米級磷酸鈣用作載體材料，具有生物相容性好、比表面積大、無毒副用、不像脂質(zhì)體易被巨噬細胞攝取以及對蛋白類和多肽類藥物具有較好載藥性能等一系列優(yōu)點(J. Biomater. Appl. , 2003, 17, 235-264; Biomater. , 2001, 22, 963-972)。納米憐酸鈣的這些特點使其具有作為藥物載體材料的優(yōu)秀品質(zhì)，受到從事給藥體系研究工作者的廣泛關注。磷酸鈣類載體的載藥功效主要依靠吸附，吸附位點通常是載體中帶正電荷的鈣離子和帶負電的磷酸根離子，兩位點的靜電荷種類和數(shù)量決定了該載體的吸附能力。目前，已見報道的納米磷酸鈣制備方法主要有溶膠-凝膠法、微乳液法、化學沉淀法、水熱法等。在三元系統(tǒng)Ca(OH)2- H3PO4 - H2O (or CaO - P2O5 - H2O)中有11種非離子型磷酸鈣，它們的鈣、磷摩爾比(Ca/P)從O. 5到2. 5不等，且Ca/P越小，磷酸鈣的水溶性越好。因此，該類載體在化療藥物納米載藥體系構建領域具有極大的潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服化療藥由于水溶性差而在臨床使用過程中引起諸多副反應的缺點，同時結合提高化療藥在臨床治療過程中的抗腫瘤活性原則，將磷酸鈣納米載體引入到化學療法的應用研究中，制備出具有臨床應用前景的負載脂溶性化療藥的水溶性磷酸鈣載體，并將該成果應用于化學療法領域，即，本申請將提供一種負載于水溶性磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法及其在制備化學療法靜脈注射劑中的應用，該載體可以達到使脂溶性化療藥在血液中有效傳輸和增強其生理相容性的目的。本發(fā)明對推動脂溶性化療藥的實用化進程具有理論和實用雙重意義。本發(fā)明所采用的技術方案是一種加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，步驟如下
在蒸餾水中，依次加入鈣鹽水溶液、磷酸鹽水溶液和脂溶性化療藥溶液(溶劑助溶)，磁力攪拌，反應結束后得到粒徑小于200nm的負載脂溶性化療藥的磷酸鈣納米粒。其中，所述鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為1:20-20:1。本申請推薦，所述鈣鹽與磷酸鹽優(yōu)化的摩爾比為1:5-5: I。以上所述粒徑小于200nm的脂溶性化療藥的磷酸鈣納米粒，是一種適合靜脈注射的水溶性無機鹽納米粒。所述的鈣鹽選自氯化鈣、硝酸鈣或氫氧化鈣等。所述的磷酸鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨或磷酸等。本發(fā)明是一種在單一體系條件制備負載脂溶性化療藥的水溶性磷酸鈣納米粒的方法，以上所述的方法，是在同一反應體系中獨立完成的，在單一體系中，先通過化學沉淀法制備出磷酸鈣納米粒，再對脂溶性化療藥進行吸附，制備出適合靜脈注射的粒徑小于200nm的吸附脂溶性化療藥的水溶性磷酸鈣納米粒。更具體和更優(yōu)化地說，本發(fā)明技術方案的具體步驟如下單一體系條件制備加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥，反應體系及條件如下
反應體系中依次加入二次蒸餾水20 mL，鈣鹽水溶液、磷酸鹽水溶液、脂溶性化療藥的DMSO溶液，其中鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為1:5-5:1，磁力攪拌10 30分鐘，反應結束后透析進行純化，以除去體系中的小分子物質(zhì)及少量DMS0，得加載脂溶性化療藥的磷酸鈣納米粒。本發(fā)明中所涉及的脂溶性化療藥包括紫杉醇類(紫杉醇及其衍生物、多西紫杉醇及其衍生物)、長春花生物堿類(包括長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞賓等)、5_氟脲嘧啶(5-FU)、蒽環(huán)類抗癌藥物(阿霉素、表阿霉素等)、培美曲塞、鉬類抗癌藥物(奧沙利鉬、奈達鉬等)、喜樹堿及其衍生物、環(huán)磷酰胺、鹽酸吡柔比星等，或是其中兩種以上脂溶性化療藥的混合物。 本發(fā)明還涉及所述的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥在抗腫瘤領域中的應用，完成本發(fā)明第二項發(fā)明任務的方案是所述方法制備的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥在制備抗腫瘤藥物中的應用。同樣，該發(fā)明在化學療法領域中的應用所涉及的脂溶性化療藥包括紫杉醇類(紫杉醇及其衍生物、多西紫杉醇及其衍生物)、長春花生物堿類(包括長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞賓等)、5_氟脲嘧啶(5-FU)、蒽環(huán)類抗癌藥物(阿霉素、表阿霉素等)、培美曲塞、鉬類抗癌藥物(奧沙利鉬、奈達鉬等)、喜樹堿及其衍生物、環(huán)磷酰胺、鹽酸吡柔比星等，或是其中兩種以上脂溶性化療藥的混合物。本發(fā)明所制得的加載脂溶性化療藥的水溶性磷酸鈣納米粒具有如下的優(yōu)點
1.制備方法簡單、易操作、穩(wěn)定性高且成本低廉，同時其納米粒的直徑小于200nm，有利于本發(fā)明的脂溶性化療藥的制備和保存；
2.與單獨存在的脂溶性化療藥相比，該納米粒不但水溶性高，而且分散性好，因此可以促進脂溶性化療藥在血液中的有效傳輸，同時消除其單獨使用時產(chǎn)生的毒副作用；
3.體外癌細胞實驗結果表明，該類納米粒子的抗腫瘤活性得到了有效的提高。


圖I為磷酸鈣納米粒的透射電鏡圖。圖2為吸附多西紫杉醇的磷酸鈣納米粒的透射電鏡圖。圖3為多西紫杉醇吸附到磷酸鈣納米粒表面前后的體外抗腫瘤活性比較。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細描述，所述的實施例有助于對本發(fā)明的理解和實施，并非構成對本發(fā)明的限制，實施本發(fā)明，除具體實施例中所涉及的物質(zhì)外，本領域技術人員還可以對其中所用的脂溶性化療藥和其它組分采用功能上相同或相似的替換物，或根據(jù)不同的目的改變組分間的比例。本發(fā)明的保護范圍并不以具體實施方式
為限，而是由權利要求加以限定。在本發(fā)明的實施例中，對于加載脂溶性化療藥的磷酸鈣納米粒結構的表征以化療藥多西紫杉醇(DTX)為例作出詳細描述。DTX為一種廣譜的抗腫瘤藥，主要通過抑制腫瘤細胞的有絲分裂和增殖實現(xiàn)其抗腫瘤活性，治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌和非小細胞癌療效顯著，對胃腸癌、卵巢癌及前列腺癌等惡性腫瘤也有較好療效。本發(fā)明對多西紫杉醇磷酸鈣納米粒結構的描述是為了闡明本發(fā)明，本發(fā)明的水溶性磷酸鈣載體同樣適用于其他的脂溶性化療藥。實施例I
單一體系條件下制備水溶性多西紫杉醇磷酸鈣納米粒，反應體系及條件如下
實驗體系中依次加入二次蒸餾水20 mL，氯化鈣溶液、磷酸氫二鈉溶液、DTX的DMSO溶液(5 mM)后，磁力攪拌10分鐘，反應結束后透析除去體系中的小分子物質(zhì)及少量DMS0，得水溶性多西紫杉醇磷酸鈣納米粒，上述過程保持Ca/P摩爾比為O. 5。多西紫杉醇磷酸鈣納米粒的表征本發(fā)明實例中納米粒的形貌以透射電子顯微鏡 觀測。納米粒的抗腫瘤活性使用酶標儀通過MTT法定量比較。( I)磷酸鈣納米粒的電鏡觀察
上述方法中不加DTX則沉淀法制得磷酸鈣納米粒。透射電鏡觀察納米粒大小及形貌，透射電鏡照片顯示通過化學沉淀法制得的磷酸鈣納米粒徑約為60 nm，粒徑分布較均勻且單分散性良好。(2)吸附多西紫杉醇的磷酸鈣納米粒的電鏡觀察
加入多西紫杉醇后制得的吸附多西紫杉醇的磷酸鈣納米粒的粒徑約為150 nm-200nm，粒徑分布較均勻且單分散性良好。從粒徑的大小變化我們也可以看出多西紫杉醇吸附到了磷酸鈣納米粒表面上。(3)抗腫瘤能力比較
MTT法是檢測某種藥物對腫瘤細胞的生長是否具有抑制作用的一種經(jīng)典方法。實驗結果顯示，在相同的藥物濃度和給藥時間內(nèi)，吸附多西紫杉醇的磷酸鈣納米粒的抗腫瘤活性明顯高于多西紫杉醇，即在給藥24，48和96 h后，多西紫杉醇/磷酸鈣納米載藥體系的抗腫瘤活性比多西紫杉醇分別增加了 23. 79%，26. 01%和9. 19%。實施例2，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用紫杉醇。實施例3，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用長春堿。實施例4，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用5-氟脲嘧啶(5-FU)。實施例5，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用阿霉素。實施例6，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用培美曲塞。實施例7，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用奧沙利鉬。實施例9，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用喜樹堿。實施例10，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用環(huán)磷酰胺。實施例11，與實施例I基本相同，但所述的多西紫杉醇改用鹽酸吡柔比星。實施例12，與實施例I基本相同，但所述的氯化鈣水溶液改用硝酸鈣水溶液。實施例13，與實施例I基本相同，但所述的磷酸氫二鈉水溶液改用磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀。實施例14，與實施例I基本相同，但所述的方法中，Ca/P摩爾比為O. 5-5。
權利要求
1.一種加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，步驟如下在蒸餾水中，依次加入鈣鹽水溶液、磷酸鹽水溶液和脂溶性化療藥溶液，磁力攪拌，反應結束后得到粒徑小于200 nm的負載脂溶性化療藥的磷酸鈣納米粒。
2.根據(jù)權利要求I所述的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，所述鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為1:20-20:1。
3.根據(jù)權利要求2所述的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，所述鈣鹽與磷酸鹽的摩爾比為1:5-5: I。
4.根據(jù)權利要求I所述的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，所述的鈣鹽選自氯化鈣、硝酸鈣或氫氧化鈣。
5.根據(jù)權利要求I所述的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，所述的磷酸鹽選自磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨或磷酸。
6.根據(jù)權利要求I或2所述的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，所述的脂溶性化療藥包括紫杉醇類抗癌藥、長春花生物堿類、5-氟脲嘧啶、蒽環(huán)類抗癌藥物、培美曲塞、鉬類抗癌藥物、喜樹堿及其衍生物、環(huán)磷酰胺或鹽酸吡柔比星，或是其中兩種以上脂溶性化療藥的混合物。
7.根據(jù)權利要求6所述的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，其特征在于，所述的紫杉醇類抗癌藥包括紫杉醇或其衍生物、多西紫杉醇或其衍生物；長春花生物堿類包括長春堿、長春新堿、長春地辛或長春瑞賓；蒽環(huán)類抗癌藥物包括阿霉素或表阿霉素；鉬類抗癌藥物包括奧沙利鉬或奈達鉬。
8.—種權利要求I所述的方法制備得到的加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥在制備抗腫瘤藥物中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的加載于加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的脂溶性化療藥包括紫杉醇類抗癌藥、長春花生物堿類、5-氟脲嘧啶、蒽環(huán)類抗癌藥物、培美曲塞、鉬類抗癌藥物、喜樹堿及其衍生物、環(huán)磷酰胺或鹽酸吡柔比星，或是其中兩種以上脂溶性化療藥的混合物。
10.根據(jù)權利要求9所述的加載于加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的紫杉醇類抗癌藥包括紫杉醇或其衍生物、多西紫杉醇或其衍生物；長春花生物堿類包括長春堿、長春新堿、長春地辛或長春瑞賓；蒽環(huán)類抗癌藥物包括阿霉素或表阿霉素；鉬類抗癌藥物包括奧沙利鉬或奈達鉬。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種加載于納米磷酸鈣載體的脂溶性化療藥的制備方法，步驟如下在蒸餾水中，依次加入鈣鹽水溶液、磷酸鹽水溶液和脂溶性化療藥溶液，磁力攪拌，反應結束后得到粒徑小于200nm的脂溶性化療藥的磷酸鈣納米粒。本發(fā)明在單一體系中，先通過化學沉淀法制備出磷酸鈣納米粒，再對脂溶性化療藥進行吸附，制備出適合靜脈注射的負載脂溶性化療藥的水溶性磷酸鈣納米粒。本發(fā)明方法制備的化療藥水溶性高、分散性好，可以促進脂溶性化療藥在血液中有效傳輸，消除其毒副作用；同時本發(fā)明制備方法簡單、易操作、穩(wěn)定性高且成本低。本發(fā)明還涉及所述方法制備的化療藥在制備抗腫瘤藥物中的應用。
文檔編號A61K45/00GK102886046SQ20121041119
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權日2012年10月25日
發(fā)明者周林, 周家宏, 魏少華, 楊超, 馬菲, 韓麗娜 申請人:南京師范大學