專利名稱：一種rTRAIL突變體及其海兔毒素偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種rTRAIL突變體及其海兔毒素偶聯(lián)物。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL，或Apo2L，TNFSF10)是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第三個TNF家族的凋亡因子，為一種抗癌應(yīng)用前景良好的生物藥物。TRAIL由Wiley等從心肌cDNA文庫中克隆出來的，因其氨基酸序列具有TNF超家族的結(jié)構(gòu)特征并能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的人類淋巴細(xì)胞凋亡而得名。TRAIL屬II型跨膜蛋白，由281個氨基酸組成，其N端(f 17位氨基酸)位于胞內(nèi)，C端(第39 281位氨基酸)延伸到胞外，其中第11Γ281位是發(fā)揮主要功能的部位。許多臨床前期研究表明TRAIL能有效誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞系凋亡，但對正常細(xì)胞無毒副作用。目前國外已進(jìn)行關(guān)于TRAIL及其受體激動型抗體的I、II期臨床試驗，并取得初步療效。另外，TRAIL對NF-K B僅有很微弱的激活作用，即使是全身用藥，也不會像TNF-α和Fas-L那樣產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，這些特性使得TRAIL有成為新一代抗腫瘤藥物的潛質(zhì)。TRAIL在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，并且位于細(xì)胞膜中，可經(jīng)半胱氨酸蛋白酶加工成可溶形式。TRAIL是通過與與其細(xì)胞膜受體結(jié)合發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用的。目前已發(fā)現(xiàn)5種TRAIL受體，包括TRAIL-R1 (DR4，TNFSFIOa)和TRAIL-R2 (DR5, TNFRSFIOb)；TRAIL-R3 (DcRl，TNFRSFlOc)和 TRAIL-R4 (DcR2, TNFRSFlOd)；循環(huán)骨保護(hù)素(OPG，TNFRSFllb)。DR4和DR5具有一段死亡結(jié)構(gòu)域(DD)，是TRAIL結(jié)合受體后誘導(dǎo)凋亡所必需的。其余三個受體由于缺乏功能性死亡結(jié)構(gòu)域，雖然能與TRAIL結(jié)合，但無法誘導(dǎo)凋亡。TRAIL與DR4或DR5結(jié)合后可激活線粒體依賴和非線粒體依賴兩條細(xì)胞凋亡信號途徑，介導(dǎo)死亡信號傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，啟動效應(yīng)物半胱天冬酶-3 (caspase-3)，最終引起腫瘤細(xì)胞凋亡。近年來，人們發(fā)現(xiàn)重組可溶TRAIL誘導(dǎo)了廣譜的人腫瘤細(xì)胞系凋亡，但同時也存在一些對TRAIL敏感性較低或耐受的腫瘤細(xì)胞，如所有的人黑色素瘤細(xì)胞系、大部分乳腺癌細(xì)胞系、前列腺癌細(xì)胞系LNcaP等，這些細(xì)胞表面雖然或多或少也表達(dá)DR4或DR5，卻由于細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑中關(guān)鍵酶的缺失、突變和其他抑制凋亡的蛋白高表達(dá)等原因，導(dǎo)致TRAIL結(jié)合DR4或DR5之后并不能引起細(xì)胞的最終凋亡。對于這類細(xì)胞所形成的實體瘤，亟須其他治療手段或改造TRAIL使之具備殺傷敏感性低以及耐受腫瘤細(xì)胞的能力。研究發(fā)現(xiàn)，可溶型重組TRAIL (rTRAIL)與放化療聯(lián)合應(yīng)用能提高腫瘤細(xì)胞對rTRAIL的敏感性，二者具有協(xié)同作用。目前國際通用的rTRAIL是95^281位氨基酸片段，rTRAIL單體傾向于形成生物活性較好的三聚體而存在，在三聚體的頂部有一個鋅離子結(jié)合位點，對穩(wěn)定三聚體構(gòu)象起重要作用。
但聯(lián)合治療方案僅是將rTRAIL和這些藥物同時給藥，并未在二者之間建立聯(lián)系，無法將這些藥物單一地導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞，因此一般只選擇低劑量低毒性的藥物，以免對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒害。相應(yīng)地，也就無法得到更好的治療效果。因此，若能將一些能夠強力殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物加以有效利用，將更有利于腫瘤的治療。例如化療藥物海兔毒素(MonomethylauristatinE, MMAE)是一種人工合成抗腫瘤小分子,它通過抑制細(xì)胞內(nèi)微管蛋白二聚化而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但由于它具有很強的無選擇毒性，會對正常細(xì)胞造成傷害，所以其本身并不能成藥。另外，針對TRAIL的突變體、TRAIL受體的抗體的研究都在進(jìn)行中，但治療效果仍不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種rTRAIL突變體，將特定氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，從而實現(xiàn)與海兔毒素的偶聯(lián)，且不會大幅降低蛋白對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。一種rTRAIL突變體，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。·
該突變體取自全長TRAIL蛋白的第95 281個氨基酸，且第109位的天冬酰胺(Asn)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)。本發(fā)明還提供了一種編碼所述rTRAIL突變體的基因，堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。該基因第109位編碼天冬酰胺(Asn)的密碼子AAT突變?yōu)榫幋a半胱氨酸(Cys)的密碼子 TGT。本發(fā)明還提供了一種含有所述基因的表達(dá)單元、重組載體或表達(dá)系統(tǒng)。所述表達(dá)單元的啟動子為T7，在這些啟動子的作用下，rTRAIL突變體可以直接在大腸桿菌宿主細(xì)胞中實現(xiàn)胞內(nèi)可溶表達(dá)。所述重組載體的原始載體為pET_28a ( + )。所述表達(dá)系統(tǒng)可選細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選為細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，最優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了一種rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物，由海兔毒素通過連接臂偶聯(lián)rTRAIL突變體三聚體構(gòu)成。所述海兔毒素的合成方法參考美國專利文獻(xiàn)Tumerinhibiting tetrapeptide bearing modified phenethylamides,(專利號5,635, 483)。本發(fā)明所使用的連接臂為馬來酰亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽，其合成方法參考文獻(xiàn)Gene M. D. , et al, Cathepsin B-Labile Dipeptide LinkersforLysosomal Release of Doxorubicin from Internalizing Immunoconjugates:ModelStudies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In VitroAnticancerActivity,Bioconjugate Chem.，13(4)855-869(2002).。本發(fā)明帶連接臂的海兔毒素(vcMMAE)由江陰康諾泰生物技術(shù)有限公司代為合成，也可以參考文獻(xiàn)(Svetlana 0. D. , et al, Development of potentmonoclonal antibodyauristatin conjugates for cancer therapy, NatureBiotechnology. , 21 (7) 778-784(2003).),偶聯(lián)時再通過纈氨酸上的馬來酰亞胺與rTRAIL突變體的半胱氨酸巰基進(jìn)行烷基化反應(yīng)，最終形成本發(fā)明偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了所述rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物的制備方法，包括(I)將rTRAIL突變體多聚體解聚，重新聚合得到rTRAIL突變體三聚體，具體包括將rTRAIL突變體溶于含鋅離子的緩沖液中，加入磷酸三(β -氯乙基)酯，3(T40°C水浴反應(yīng)I 3h ；由于rTRAIL突變體之間會通過二硫鍵形成多聚體，加入磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)使不穩(wěn)定的多聚體解聚，保持單體狀態(tài)，反應(yīng)體系中的鋅離子進(jìn)一步促使rTRAIL突變體單體形成穩(wěn)定的三聚體。(2)將rTRAIL突變體三聚體與帶連接臂的海兔毒素混合，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)后，每個三聚體可以結(jié)合1-3個海兔毒素分子；偶聯(lián)反應(yīng)的溫度優(yōu)選為0 4°C，時間為30 60mino(3)反應(yīng)完成后，分離純化得到rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物； 由于本發(fā)明rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物單體的分子量為23kDa，而反應(yīng)體系中存在的其他分子的分子量均小于IOkDa,因此，用截留分子量IOkDa的超濾管即可除去體系中的小分子，再經(jīng)離心去沉淀，將所得上清過濾除菌，即得本發(fā)明的偶聯(lián)物。用于突變的TRAIL分子可來源于人或動物，但為了對人的腫瘤治療更有幫助，優(yōu)選為人的天然TRAIL分子。天然rTRAIL單體分子表面也有半胱氨酸巰基，但均用于形成穩(wěn)定的三聚體，三聚體分子表面因沒有游離巰基存在而失去了偶聯(lián)位點。因此，本發(fā)明利用PCR定點突變手段獲得了含有一個半胱氨酸突變位點的rTRAIL突變體，步驟為(I)提取人組織總RNA，以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA文庫；(2)以所述cDNA為模板，利用引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴增，得到TRAIL編碼序列；(3)以所述TRAIL編碼序列為模板，利用引物P3和P4進(jìn)行PCR定點突變擴增，獲得突變序列；(4)將突變序列可操作性地連入載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(5)誘導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白，獲得所述rTRAIL突變體。所述引物Pl和P2的序列為Pl :5’ -ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3’ ；P2 :5， -TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3，；所述引物P3和P4的序列為P3 :5’ -TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3’ ；P4 :5，-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3，。本發(fā)明還提供了所述rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述抗腫瘤藥物包括有效量的rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。制備時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時，它可采用固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水等；制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。所述抗腫瘤藥物可制成單元或多元劑型，各劑型包含為了產(chǎn)生所期望的療效而計算出預(yù)定量的rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物，以及合適的藥劑學(xué)賦形劑。所述的抗腫瘤藥物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、局部給藥等。使用該藥物時，是將安全有效量的rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物施用于人，其中該安全有效量的范圍優(yōu)選為O. 5^50毫克/千克體重，更優(yōu)選為f 10毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是在熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。此外，本發(fā)明的偶聯(lián)物還可與其他治療藥物聯(lián)用，其中包括(但并不限于)各種細(xì)胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各種腫瘤化療藥物，如5-FU、氨甲喋呤等影響核酸生物合成的藥物；氮芥、環(huán)磷酰胺等烷化劑類藥物；阿霉素、放線菌素D等干擾轉(zhuǎn)錄過程阻止RNA合成的藥物；長春新堿、喜樹堿類等影響蛋白質(zhì)合成的藥物及某些激素類藥物，等等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明偶聯(lián)物具有rTRAIL突變體和MMAE兩者的生物學(xué)功能，既具有rTRAIL突變體在腫瘤細(xì)胞外誘導(dǎo)凋亡的能力，又具有MMAE在細(xì)胞內(nèi)抑制微管蛋白從而誘導(dǎo)凋亡的能力，在二者的協(xié)同下，抗腫瘤效果得到顯著增強。(2)本發(fā)明偶聯(lián)物通過rTRAIL突變體與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體特異結(jié)合，將MMAE定向轉(zhuǎn)運到腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放發(fā)揮作用，既可殺傷對TRAIL敏感性低甚至抵抗的腫瘤細(xì)胞，也減少MMAE單獨給藥產(chǎn)生的毒副作用。(3 )本發(fā)明偶聯(lián)物中的rTRAIL突變體與MMAE偶聯(lián)后，其水溶液具有比單純的rTRAIL分子更佳的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為經(jīng)反復(fù)凍融后不出現(xiàn)沉淀。


圖I為大腸桿菌表達(dá)的rTRAIL突變體N109C電泳圖。其中，M代表低分子量Marker ；1為未誘導(dǎo)的菌液；2、3為誘導(dǎo)的菌液；4為未誘導(dǎo)的菌液破碎后離心取的上清(可溶部分);5、6為誘導(dǎo)的菌液破碎后離心取的上清(可溶部分);7、8、9為誘導(dǎo)和不誘導(dǎo)的沉淀用8M尿素重溶后的樣品。圖2為rTRAIL突變體N109C的親和純化結(jié)果電泳圖。其中，M為蛋白分子量marker。I為IPTG誘導(dǎo)后的菌液，2為破菌后的上清；3為Ni柱的流穿液；4為IOmM咪唑洗脫液；5為60mM咪唑洗脫液；6為500mM咪唑洗脫液。圖3為rTRAIL突變體N109C的SP強陽離子交換柱純化結(jié)果電泳圖。其中，I為IOmM咪唑洗脫液脫鹽后的蛋白溶液；2和3都是SP柱的洗脫蛋白，即純化后的N109C，4為N109C非變性電泳的結(jié)果。圖4為N109C及其MMAE偶聯(lián)物的電泳圖。其中，I為N109C，2為N109C_vcMMAE偶聯(lián)物，3為N109C-vcMMAE脫鹽后的產(chǎn)物，4、5、6分別為1、2、3樣品非變性條件下的電泳結(jié)
果O圖5為rTRAIL突變體-vcMMAE偶聯(lián)物各部分連接關(guān)系示意圖。圖6為各TRAIL元件對不同細(xì)胞系的殺傷效果。圖7為N109C-vcMMAE偶聯(lián)物在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。
圖8為N109C-vcMMAE偶聯(lián)物的腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞實驗圖。圖9為rTRAIL突變體-vcMMAE偶聯(lián)物誘導(dǎo)凋亡機制示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。I、建立人前列腺cDNA文庫
(I)提取人前列腺mRNA液氮研磨凍存的人前列腺組織小塊(IOOmg左右)成粉末狀，加TRIZOL試劑ImL繼續(xù)反復(fù)研磨，轉(zhuǎn)移至I. 5mL無RNA酶EP管中，室溫放置5min，加O. 2mL氯仿劇烈振蕩15s，室溫放置3min。4°C 12000g離心15min，轉(zhuǎn)移上層水相至另一無RNA酶的EP管中。加入異丙醇O. 5mL，室溫放置lOmin，沉淀RNA。4°C 12000g離心lOmin，去上清，75%乙醇洗滌沉淀。·40C 12000g離心5min，去上清，干燥后用50 μ L DEPC水溶解，-70°C保存。(2)反轉(zhuǎn)錄 PCR以oligodT為引物，人前列腺RNA為模板，加AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行Reverse-PCR，得到cDNA文庫。具體步驟為I) RNA 預(yù)變性:5 μ g 人前列腺 RNA+25 μ g OligodT，用 0. 1% DEPC 補足至 10 μ L ；70°C水浴5min，冷卻至室溫，破壞mRNA 二級結(jié)構(gòu)。2)反轉(zhuǎn)錄合成體系為
權(quán)利要求
1.一種rTRAIL突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種編碼如權(quán)利要求I所述rTRAIL突變體的基因，其特征在于，堿基序列如SEQ IDNO. 2所示。
3.一種含有如權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)單元、重組載體或表達(dá)系統(tǒng)。
4.一種rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物，其特征在于，由海兔毒素通過連接臂偶聯(lián)rTRAIL突變體三聚體構(gòu)成，rTRAIL突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
5.如權(quán)利要求4所述的rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物，其特征在于，所述連接臂為馬來酰亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽。
6.如權(quán)利要求4 5任一所述rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7.—種rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物的制備方法，包括(1)將rTRAIL突變體多聚體解聚，重新聚合得到rTRAIL突變體三聚體；(2)將rTRAIL突變體三聚體與帶連接臂的海兔毒素混合，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；(3)反應(yīng)完成后，分離純化得到rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物；rTRAIL突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示；所述連接臂為馬來酰亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述rTRAIL突變體三聚體制備方法為將rTRAIL突變體溶于含鋅離子的緩沖液中，加入磷酸三(β-氯乙基)酯，30 40°C水浴反應(yīng)I 3h。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度為4°C以下，時間為 30 60min。
10.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述分離純化方法為利用超濾除去反應(yīng)液中分子量低于IOkDa的物質(zhì)，再經(jīng)離心去沉淀，將所得上清過濾除菌，即為rTRAIL突變體-海兔毒素偶聯(lián)物。
全文摘要
一種rTRAIL突變體及其海兔毒素偶聯(lián)物。本發(fā)明公開了一種rTRAIL突變體，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還公開了所述rTRAIL突變體的編碼基因及含有該編碼基因的表達(dá)單元、重組載體或表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還公開了一種rTRAIL突變體-vcMMAE偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明偶聯(lián)物具有rTRAIL突變體和MMAE兩者的生物學(xué)功能，通過rTRAIL突變體與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體特異結(jié)合，將MMAE定向轉(zhuǎn)運到腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放發(fā)揮作用，既可殺傷對TRAIL敏感性低甚至抵抗的腫瘤細(xì)胞，也減少MMAE單獨給藥產(chǎn)生的毒副作用。
文檔編號A61K38/17GK102936281SQ201210416648
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者陳樞青, 潘利強 申請人:浙江大學(xué)