專利名稱：一種可以用于上皮種植的新型納米支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米支架，尤其涉及一種可以用于上皮種植的新型納米支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，機(jī)體在因炎癥、外傷、腫瘤或其他病變導(dǎo)致氣管大范圍受損、切除較長段氣管的情況下，需要修復(fù)缺損氣管。長期以來，氣管軟骨缺損的修復(fù)問題，一直困擾著臨床醫(yī)生。一期端端吻合技術(shù)僅適合局部缺損的修復(fù)，當(dāng)缺損長度超過6. Ocm時，由于吻合口張力高而易產(chǎn)生吻合口漏等嚴(yán)重為、并發(fā)癥。組織工程技術(shù)研究的突飛猛進(jìn)給氣管重建帶來了新的希望，但自1994年初嘗試后再無突破性進(jìn)展，仍處于實(shí)驗(yàn)和探索階段，仍有問題有待解決。許多學(xué)者嘗試應(yīng)用同種異體移植、自體組織移植以及人工材料替代物等方法，效果均不夠理想。人工氣管完善應(yīng)用更關(guān)鍵的是如何在人工氣管內(nèi)腔表面引入具有調(diào)節(jié)氣管粘膜 細(xì)胞生長代謝作用的材料，促進(jìn)粘膜上皮爬行再生。在眾多的生物材料中，膠原被認(rèn)為是較理想的選擇。然而，膠原屬于異體動物組織提取物，存在傳染病毒等疾病的潛在可能性，且制作過程復(fù)雜，而絲素蛋白屬于天然蛋白，來源豐富，價格適宜。國外學(xué)者研究了不同的人體細(xì)胞株在絲素蛋白膜上的生長情況，結(jié)果表明，絲素蛋白和膠原蛋白一樣，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長。絲素蛋白是一種天然結(jié)構(gòu)性蛋白，主要有三種簡單的氨基酸甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，它們約占絲素蛋白總量的85%，所以絲素蛋白表面含有相當(dāng)比例的OH、C00H、NH2等極性基團(tuán)，這對成纖維細(xì)胞的粘附和增殖具有重要作用，而且絲素蛋白表面還含有一定比例的帶正電荷的氨基酸殘基，這也為成纖維細(xì)胞的粘附和增殖創(chuàng)造了良好條件。聚乳酸乙醇酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由兩種單體-
乳酸和羥基乙酸聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，PLGA的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，是人代謝途徑的副產(chǎn)物，所當(dāng)它應(yīng)用在醫(yī)藥和生物材料中時不會有毒副作用。由于其具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，PLGA被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。但是迄今為止，國內(nèi)外尚無絲素蛋白與PLGA結(jié)合應(yīng)用于氣管缺損重建方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有絲素蛋白與PLGA的可以用于上皮種植的新型納米支架。本發(fā)明所述的一種可以用于上皮種植的新型納米支架，其中，組成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比為1-3: 7-9。優(yōu)選地，所述乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比為2:8。所述乳酸乙醇酸共聚物中單體乳酸和乙醇酸的摩爾比為40-60%: 40-60%，優(yōu)選為50%:50%ο所述可以用于上皮種植的新型納米支架可以經(jīng)高壓靜電紡絲技術(shù)制成。電紡工藝參數(shù)條件為高壓靜電紡的電壓為15-25kv，接受臺離噴射孔的板距為10-20cm。進(jìn)一步地，高壓靜電紡時的環(huán)境空氣濕度〈20%，經(jīng)過甲醇蒸汽交聯(lián)8-16小時。所述絲素蛋白的制作方法為采用桑蠶蠶繭在MHCO3水溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶于AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子透析除去溶液中的無機(jī)鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍干燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為堿金屬，如Li、Na、K或Cs等，優(yōu)選為Na、K，更優(yōu)選為Na ;X為鹵素，如F、Cl、Br或I等，優(yōu)選為Br或I，更優(yōu)選為Br等。所述鈣鹽可以為氟化鈣、氯化鈣、溴化鈣、磷酸鈣或磷酸氫鈣等可溶解的鈣鹽，更優(yōu)選為氯化鈣等。·
優(yōu)選地，所述絲素蛋白的制作方法中，桑蠶蠶繭脫膠過程為，干的桑蠶蠶繭25-35克加入含10-20g NaHCO3的3升沸水，煮20-40分鐘，可根據(jù)需要反復(fù)脫膠數(shù)次。優(yōu)選地，所述絲素蛋白的制作方法中，制備絲素蛋白鹽溶液，可采用經(jīng)脫膠處理后的干蠶繭8-12克放入溴化鋁溶液(70-90克溴化鋁加水配成IOOml溶液)，或者將上述烘干的蠶繭45-55克放入氯化鈣溶液(150-170g氯化鈣加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，加熱溶解，加熱溫度為55-75°C。本發(fā)明所述的可以用于上皮種植的新型納米支架可以為圓形，橢圓形、三角形、四邊形、多邊形等任意平面幾何圖形。一種制備上述可以用于上皮種植的新型納米支架的方法包括以下步驟
I)制備絲素蛋白，所述絲素蛋白的制作方法如下
采用桑蠶蠶繭在MHCOyK溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶于AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子，透析除去溶液中的無機(jī)鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍干燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為堿金屬，如Li、Na、K或Cs等，優(yōu)選為Na等；X為鹵素，如F、Cl、Br或I等，優(yōu)選為Cl等。2)制備納米支架，原料包括乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合后制成納米級網(wǎng)狀纖維平面支架。步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白的質(zhì)量比為1-3: 7-9。優(yōu)選地，所述絲素蛋白的制作方法中，制備絲素蛋白鹽溶液，可采用經(jīng)脫膠處理后的干蠶繭8-12克放入溴化鋁溶液(70-90克溴化鋁加水配成IOOml溶液)，或者將上述烘干的蠶繭45-55克放入氯化鈣溶液(150-170g氯化鈣加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，加熱溶解，加熱溫度為55-75°C。優(yōu)選地，步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比為2:8。優(yōu)選地，步驟2)中乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合后經(jīng)高壓靜電紡絲的技術(shù)制成納米級網(wǎng)狀纖維平面支架。
本發(fā)明所述的可以用于上皮種植的新型納米支架，利于細(xì)胞的黏附和增殖，可以用作氣管上皮、消化道上皮、消化腺腺泡和導(dǎo)管等的修復(fù)，尤其可用作氣管缺損修補(bǔ)，對促進(jìn)氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥提供了有意義的參考。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的介紹和描述，以更好的理解本發(fā)明，在下文中可以用于上皮種植的新型納米支架表示為PLGA/SF。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例PLGA/SF的超微結(jié)構(gòu)電子顯微鏡照片；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例PLGA/SF纖維直徑測量結(jié)果；
圖3為大鼠氣管上皮細(xì)胞在PLGA/SF上的黏附攀爬能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
圖4為大鼠氣管上皮細(xì)胞在PLGA/SF上的黏附實(shí)驗(yàn)電鏡超微結(jié)構(gòu) 圖5為大鼠氣管上皮細(xì)胞在PLGA/SF增殖能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
圖6為大鼠氣管上皮細(xì)胞在PLGA/SF上的HE染色以及熒光蛋白表達(dá)染色照片。
具體實(shí)施方式

下面參照附圖，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明所述的一種可以用于上皮種植的新型納米支架進(jìn)行詳細(xì)的介紹和描述，以更好的理解本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。一、制備絲素蛋白 按照下述步驟制備絲素蛋白
1)15gNaHC03加入到3升水煮沸后，加入干的桑蠶蠶繭30克，煮30分鐘后，取出蠶繭，重新加上述NaHCO3水溶液，繼續(xù)煮，重復(fù)3次；
2)用去離子水漂洗煮過的蠶繭5-6次后，將蠶繭放入45度烘箱，烘干(盡量將蠶繭剪碎后分散擺放，使之干燥徹底)；
3)將上述烘干的蠶繭10克放入溴化鋁溶液(78.165克溴化鋁加水配成IOOml溶液)，或者將上述烘干的蠶繭50克放入氯化鈣溶液(160g氯化鈣加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，置于65度水浴鍋，定時攪拌混勻，直至完全溶解，然后室溫下冷卻至常溫；
4)用去離子水沖洗透析袋，將蠶繭溶解液灌入透析袋(1/3至1/2袋)，然后封扎兩端，置于去離子水中透析3天(每4-5小時換水)；
5)將透析液進(jìn)行壓力過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至大口培養(yǎng)皿中(高度一半為宜)置于-80度預(yù)凍1-2天，凍存干燥2-3天，即可得到純化的絲素。二、PLGA與絲素蛋白經(jīng)高壓靜電紡絲技術(shù)制成納米支架
PLGA與絲素蛋白按質(zhì)量比為2:8的比例混合，PLGA與絲素蛋白混合物按質(zhì)量體積比12%充分溶解在分析純的六氟異丙醇溶液中，然后經(jīng)高壓靜電紡絲機(jī)制成納米支架。電紡工藝參數(shù)條件為高壓靜電紡的電壓為20kV，接受臺離噴射孔的板距為15cm。電紡時的環(huán)境空氣濕度〈20%，經(jīng)過甲醇蒸汽交聯(lián)12小時。超微結(jié)構(gòu)電子顯微鏡觀察效果，如圖I所示，纖維直徑均一，表面光滑沒有斷裂，孔隙率均一，孔隙直徑約為30-40 μ m。測量納米支架纖維直徑，結(jié)果如圖2所示，其中，6. 5%的纖維直徑為240-360nm，12%的纖維直徑為361_480nm，直徑為481_600nm占15%，直徑為601-720nm的占17. 8%,直徑為721_840nm的占16%，直徑為841_840nm的占16. 2%,直徑為841-960nm和直徑為961_1080nm的分別占9. 8%，直徑為1081_1200nm的占6. 4%，平均直徑為650nm，標(biāo)準(zhǔn)差210nm，整體纖維的直徑變異范圍符合正態(tài)分布。測試大鼠氣管上皮細(xì)胞在不同材料上的黏附攀爬能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示圖3中，在接種細(xì)胞最初30分鐘內(nèi)，PLGA/SF (PLGA)就顯示出較玻璃板(Glass)和塑料板(TCP)顯著優(yōu)越的利于細(xì)胞黏附能力(*表示統(tǒng)計(jì)學(xué)P〈0. 01，**表示統(tǒng)計(jì)學(xué)P〈0. 001)，在接種后24小時這種差異變小，可能是細(xì)胞在材料上的增殖影響的原因。圖4中顯示，隨著時間的推移，上皮細(xì)胞在PLGA/SF上的數(shù)量逐漸增多，并且細(xì)胞膜上的突起逐漸形成，攀沿著纖維支架，并且細(xì)胞之間開始連接成片。測試大鼠氣管上皮細(xì)胞在PLGA/SF上的增殖能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6所示圖5中，在接種細(xì)胞在24小時以后，在PLGA/SF上的增殖顯著快于另外兩種材料。在種植后的第3至第7天，這種增殖的速率達(dá)到最大值，隨后至第14天增殖速率趨于相對平穩(wěn)，且PLGA/SF材料上的細(xì)胞絕對數(shù)始終顯著大于對照的兩種材料(TCP :塑料培養(yǎng)板，Bo :玻璃板，Mo :PLGA/SF)。圖6中，熒光染色是活體細(xì)胞經(jīng)由慢病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)熒光蛋白，只有活體細(xì)胞才可以表達(dá)熒光，可以清晰地看到隨著時間的推移，上皮細(xì)胞在PLGA/SF上的數(shù)量逐漸增多連成片狀，并且細(xì)胞活性良好。本發(fā)明的可以用于上皮種植的新型納米支架纖維直徑均一，表面光滑沒有斷裂，孔隙率均一，細(xì)胞在其上具有良好的黏附攀爬能力和增殖能力，這可用于氣管缺損修補(bǔ)，對 促進(jìn)氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥提供了有意義的參考。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種可以用于上皮種植的新型納米支架，其特征在于，組成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比為1-3: 7-9。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可以用于上皮種植的新型納米支架，其特征在于，所述乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比為2:8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可以用于上皮種植的新型納米支架，其特征在于，所述乳酸乙醇酸共聚物中單體乳酸和乙醇酸的摩爾比為40-60%:40-60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可以用于上皮種植的新型納米支架，其特征在于，所述乳酸乙醇酸共聚物中單體乳酸和乙醇酸的摩爾比為50%:50%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可以用于上皮種植的新型納米支架，其特征在于，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白經(jīng)高壓靜電紡絲的技術(shù)制成納米級網(wǎng)狀纖維平面支架。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種可以用于上皮種植的新型納米支架，其特征在于，所述絲素蛋白的制作方法如下 采用桑蠶蠶繭在MHCOyK溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶于AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子透析除去溶液中的無機(jī)鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍干燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為堿金屬，X為鹵素。
7.一種制備如權(quán)利要求I所述的可以用于上皮種植的新型納米支架的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)制備絲素蛋白，所述絲素蛋白的制作方法如下 采用桑蠶蠶繭在MHCOyK溶液中脫膠，將脫膠蠶絲溶于AlX3或鈣鹽溶液，得絲素蛋白鹽溶液，去離子透析除去溶液中的無機(jī)鹽，透析，壓力過濾，將濾液冷凍干燥，即可得到純化的絲素蛋白，其中，M為Li、Na、K或Cs，X為F、Cl、Br或I ； 2)制備納米支架，原料包括乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合后制成納米級網(wǎng)狀纖維平面支架。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白的質(zhì)量比為1-3: 7-9。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述絲素蛋白的質(zhì)量比為2: 8。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白混合后經(jīng)高壓靜電紡絲的技術(shù)制成納米級網(wǎng)狀纖維平面支架。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種可以用于大鼠氣管上皮種植的新型電紡納米支架及其制備方法，其中，組成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和絲素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比為1-3:7-9，混合后的乳酸乙醇酸共聚物與絲素蛋白制成納米級網(wǎng)狀纖維平面支架。本發(fā)明所述的可以用于上皮種植的新型納米支架，利于細(xì)胞的黏附和增殖，可以用作氣管上皮、消化道上皮、消化腺腺泡和導(dǎo)管等的修復(fù)，尤其可用作氣管缺損修補(bǔ)，對促進(jìn)氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥提供了有意義的參考。
文檔編號A61L27/26GK102895701SQ20121041873
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者鄭卉, 陳昶, 高文 申請人:上海市肺科醫(yī)院