專利名稱：人退變椎間盤軟骨終板干細(xì)胞、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人退變椎間盤軟骨終板干細(xì)胞在臨床治療椎間盤退變性疾病及其它生物治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
下腰痛是臨床常見病和多發(fā)病，是引起勞動(dòng)力喪失和殘疾的最常見病因之一。一般認(rèn)為椎間盤退行性改變是引起下腰痛最常見的原因，因此對(duì)椎間盤退行性疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義。目前椎間盤退變相關(guān)疾病的治療手段主要包括保守治療、手術(shù)治療和生物治療。保守治療為對(duì)癥治療，以緩解癥狀為目的，屬于階梯治療的第一步。椎間盤髓核摘除術(shù)或脊柱節(jié)段融合內(nèi)固定等手術(shù)治療方式只是解決了椎間盤突出所致的神經(jīng)受壓及脊柱節(jié)段不穩(wěn)的問題，不能從根本上解決椎間盤退行性改變。此外，單純椎間盤髓核摘除會(huì)引起椎間隙塌陷，脊柱節(jié)段不穩(wěn)從而產(chǎn)生腰痛等癥狀，且有一定的復(fù)發(fā)率；內(nèi)固定的使用會(huì)加速鄰近椎體節(jié)段的退變，從而產(chǎn)生新的臨床癥狀。因此，手術(shù)治療的長期效果仍然不是十分理想，而且治療費(fèi)用高，手術(shù)所帶來的相關(guān)并發(fā)癥較多。目前，生物治療方式包括基因治療、生長因子治療、細(xì)胞治療和組織工程等。椎間盤退行性疾病的生物治療作為一種新興的治療手段，還沒有普遍應(yīng)用于臨床，但是生物治療的應(yīng)用前景廣泛，有望成為手術(shù)治療和保守治療的有效補(bǔ)充，延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的生物學(xué)過程，以改善患者的臨床癥狀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從人退變椎間盤軟骨終板中分離、純化出具有多向分化潛能的干細(xì)胞，該干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性相似，能向骨、軟骨及脂肪等方向誘導(dǎo)分化，而且較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨和成軟骨分化能力。其具體特征為①在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下能貼塑料瓶壁生長；②細(xì)胞表面標(biāo)志物能表達(dá)CD105、CD73、⑶90，不表達(dá)⑶45、⑶34、⑶14或⑶lib、⑶79alpha或⑶19及HLA-DR表面分子；③在體外培養(yǎng)能向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞方向分化。本發(fā)明還提供一套較為完整的人軟骨終板干細(xì)胞獲取、篩選、純化和擴(kuò)增方法，包括以下步驟步驟1:制定標(biāo)本來源的病例納入標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)患者知情并同意，年齡小于70歲，大于40歲；無結(jié)核、肝炎、腫瘤、糖尿病等傳染性疾病及自身免疫性疾??；行頸椎、胸椎和腰椎融合手術(shù)。步驟2 :將手術(shù)中遺棄的軟骨終板標(biāo)本，在無菌條件下用解剖顯微鏡對(duì)軟骨終板標(biāo)本進(jìn)行分離，去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環(huán)組織，用尖刀仔細(xì)刮除粘附于軟骨終板上的髓核，剩下透明狀的軟骨終板。機(jī)械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細(xì)胞，并以臺(tái)盼藍(lán)測定細(xì)胞活力。將獲取到的原代細(xì)胞置37°C、5%C02、95%濕度條件下孵箱培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長情況，每3天換液1次。
步驟3 :將長滿近90%培養(yǎng)瓶的軟骨終板干細(xì)胞用胰蛋白酶消化傳代時(shí)，以瓊脂糖篩選系統(tǒng)篩選干細(xì)胞，挑選細(xì)胞克隆，置培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶置37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)擴(kuò)增、傳代。步驟4 :將傳至第3代的干細(xì)胞進(jìn)行凍存?zhèn)溆?，需要?yīng)用時(shí)將該細(xì)胞復(fù)蘇。步驟5 :復(fù)蘇后，將該細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增，將生物學(xué)性能穩(wěn)定的細(xì)胞復(fù)合海藻酸鈉，術(shù)中X線引導(dǎo)下向目標(biāo)椎間盤穿刺注射。本發(fā)明提供了人軟骨終板干細(xì)胞在防止椎間盤退變性疾病的應(yīng)用，主要可應(yīng)用治療的疾病范圍包括1.椎間盤源性腰痛或椎間盤源性頸肩痛病例，經(jīng)磁共振及椎間盤封閉等手段可明確責(zé)任椎間盤。2.腰椎間盤或頸椎間盤髓核摘除術(shù)后病例，術(shù)后殘留腰痛及頸肩痛且可以明確手術(shù)椎間盤為責(zé)任椎間盤。3.其它可以采用人軟骨終板干細(xì)胞治療的椎間盤退變性疾病。將上述干細(xì)胞復(fù)合海藻酸鈉凝膠植入新西蘭大白兔退變椎間盤模型中，六個(gè)月后觀察檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞支架復(fù)合物能夠顯著阻止椎間盤的退變，且髓核再生能力明顯 強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組。此外，該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屬于異種移植，組織學(xué)檢測未見明顯免疫排斥反應(yīng)。綜上所述，椎間盤軟骨終板干細(xì)胞經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)其顯著的髓核再生能力，且不存在明顯免疫排斥反應(yīng)。因此，軟骨終板干細(xì)胞在椎間盤退變性疾病的生物治療中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。


圖1所示為人軟骨終板大體標(biāo)本。圖2所示為人軟骨終板干細(xì)胞相差顯微鏡下形態(tài)。圖3所示為瓊脂糖篩選系統(tǒng)中軟骨終板干細(xì)胞集落。圖4所示為流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨終板干細(xì)胞免疫標(biāo)志物結(jié)果。符合國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)(the International Society for Cellular Therapy, ISCT)所定義的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)標(biāo)準(zhǔn)。圖5所示為人軟骨終板干細(xì)胞在相應(yīng)的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)下,能向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化。圖5A為非誘導(dǎo)對(duì)照組，茜素紅染色不著色，而誘導(dǎo)組經(jīng)茜紅素染色著色，證實(shí)有骨礦化結(jié)節(jié)生成。圖5B為非誘導(dǎo)對(duì)照組經(jīng)油紅O染色不著色，圖5E為誘導(dǎo)組油紅O染色著色，證實(shí)有脂滴形成。圖5C為非誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)，阿利新藍(lán)染色不著色，圖5F為誘導(dǎo)后細(xì)胞團(tuán)，阿利新藍(lán)染色呈藍(lán)染，證實(shí)有細(xì)胞團(tuán)內(nèi)有大量蛋白聚糖產(chǎn)生，經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的生物學(xué)性能。圖6所示為軟骨終板干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外進(jìn)行細(xì)胞聚集成團(tuán)試驗(yàn)，等量細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化，分別在第1，2，3周時(shí)，都顯示軟骨終板干細(xì)胞比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所成細(xì)胞團(tuán)更大，顯示的分泌的蛋白聚糖更多，成軟骨的能力更強(qiáng)。圖7所示為分別植入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-海藻酸鈉復(fù)合物組、人軟骨終板干細(xì)胞-海藻酸鈉復(fù)合物組和海藻酸鈉植入組術(shù)后第6月磁共振檢查結(jié)果圖(箭頭所指為手術(shù)椎間盤，箭頭以上為正常對(duì)照椎間盤)?？梢娙塑浌墙K板干細(xì)胞組手術(shù)椎間盤信號(hào)強(qiáng)度(亮度)及髓核再生能力明顯強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，而單純海藻酸鈉植入組中實(shí)驗(yàn)椎間盤顯著退變，磁供振T2信號(hào)顯著降低，且鄰近的下位椎間盤也信號(hào)強(qiáng)度降低，發(fā)生退變。
圖8所示為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-海藻酸鈉復(fù)合物組、人軟骨終板干細(xì)胞-海藻酸鈉復(fù)合物組和單純海藻酸鈉植入組在植入手術(shù)后第6月X線檢查結(jié)果圖(箭頭所指為手術(shù)椎間盤，箭頭以上為正常對(duì)照椎間盤)?？梢娙塑浌墙K板干細(xì)胞組維持椎間隙高度的能力強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，而單純海藻酸鈉植入組中實(shí)驗(yàn)椎間盤顯著退變，椎間隙變窄，且臨近椎間盤也發(fā)生高度丟失。圖9示X線引導(dǎo)下行椎間盤穿刺注入人軟骨終板干細(xì)胞-海藻酸鈉復(fù)合物模式圖，此圖為椎間盤造影病例。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了人軟骨終板干細(xì)胞的制備及其臨床治療的應(yīng)用。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施進(jìn)行了描述，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明
實(shí)施例1人退變軟骨終板干細(xì)胞的獲取及篩選純化將手術(shù)中遺棄的椎間盤標(biāo)本，無菌狀態(tài)下在無菌操作臺(tái)紫外燈照射30分鐘殺菌，以含1%慶大霉素的磷酸鹽緩沖液漂洗標(biāo)本組織直到無血跡，在解剖顯微鏡下對(duì)椎間盤標(biāo)本組織進(jìn)行分離，去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環(huán)組織，用尖刀仔細(xì)刮除粘附于軟骨終板上的髓核組織，剩下透明狀的軟骨終板。眼科剪將剩下的軟骨終板剪至ImmX ImmX Imm大小，將剪醉的組織用O. 25%11型膠原酶于37°C消化6小時(shí)或先于搖床I小時(shí)，再于37°C消化4小時(shí)。將軟骨終板組織消化液經(jīng)孔徑為IOOum或200目的濾網(wǎng)過濾，濾液在1000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，所得沉淀用含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基洗滌3遍，再以該培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，吹打使其成單細(xì)胞懸液，取IOul細(xì)胞懸液以怠盼藍(lán)測定細(xì)胞活力。剩下的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，在37°C、5%C02、95%濕度條件下孵箱培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長情況，每3天換液I次。將長滿近90%培養(yǎng)瓶的軟骨終板干細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基，加入磷酸緩沖液漂洗2遍，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞約3-5分鐘，顯微鏡下觀察見少量細(xì)胞脫落時(shí)加入Iml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離瓶底，將細(xì)胞吸取移入離心管以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，磷酸鹽緩沖液漂洗2遍，用含10%胎牛血清培養(yǎng)基輕輕吹打使細(xì)胞變成單細(xì)胞懸液，取IOul懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基調(diào)整為3 X 104/ml。將1%瓊脂加熱融化，于45°C水浴中溫育，同時(shí)將培養(yǎng)基也置于45°C水浴中預(yù)溫。將細(xì)胞瓊脂培養(yǎng)基(含血清)(1:1:1)混勻后立即倒入24孔板或35_平皿中，10-14天后肉眼可以觀察到白色細(xì)胞團(tuán)。待觀察到大量細(xì)胞克隆形成后，解剖鏡下挑取單個(gè)細(xì)胞集落吹散，將細(xì)胞接種至96孔板或24孔板進(jìn)行于37°C、5%C02孵箱條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)施例2凍存人軟骨終板干細(xì)胞將增殖狀態(tài)良好的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，加入適量經(jīng)37°C預(yù)溫的O. 25%胰蛋白酶溶液，消化3-5分鐘分散細(xì)胞。加入2-4ml含血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化作用。吹打分散細(xì)胞，移入離心管中，平衡后以(800-1000)r/min離心5-10分鐘，棄上清液。加l_2ml培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度，用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整到(2-5) X IO6/ml,放置冰浴中。將同樣含10%胎牛血清的培養(yǎng)基制成含20% 二甲基亞砜(DMSO)或制成含20%甘油的冷凍保護(hù)液，將等量的冷凍保護(hù)液滴加于等量的細(xì)胞懸液中，輕輕吹打均勻，制成含10%DMS0或甘油的冷細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為(1_2)X 10%1。將細(xì)胞懸液分別移到冷凍管中，每管1-1. 5ml (事先在管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、日期、密度),旋緊管蓋。將冷凍管先置于4°C冰箱O. 5-1小時(shí)，再移至-20°C低溫冰箱1-2小時(shí)，然而置于_70°C低溫冰箱中過夜，再投入液氣中。實(shí)施例3復(fù)蘇人軟骨終板干細(xì)胞迅速將冷凍管取出，立即投入38_40°C溫水中，并充分搖動(dòng)，使其迅速融化，一般I分鐘左右完成。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將細(xì)胞懸液移至含5ml培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，1000r/min離心5分鐘，棄上清液，加入5ml培養(yǎng)液，吸管輕輕吹打懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37 °C培養(yǎng)箱，次日更換一次培養(yǎng)液后 ，待用。實(shí)施例4制備人軟骨終板干細(xì)胞藻酸鹽復(fù)合物海藻酸鈉，一種天然多糖，是從褐藻類海洋生物中提取的一種線型陰離子天然多糖，是由甘露糖醛酸殘基和古洛糖醛酸殘基以均聚物和雜聚物排列的共聚物，其均聚物部分可在遇到二階陽離子(如Ca2+)時(shí)，通過離子交聯(lián)發(fā)生凝膠化，形成網(wǎng)狀藻酸鈣離子水凝膠。具有一般藥物制劑輔料所需要的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性。將長滿近90%培養(yǎng)瓶的軟骨終板干/祖細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基，加入磷酸緩沖液沖洗2遍，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞約3-5分鐘，顯微鏡下觀察見少量細(xì)胞脫落時(shí)加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化，輕輕吹打細(xì)胞，將細(xì)胞吸取移入離心管離心5分鐘，棄上清，磷酸鹽緩沖液漂洗2遍，含10%胎牛血清培養(yǎng)基輕輕吹打使細(xì)胞變成單細(xì)胞懸液，再次離心將上清液吸棄，剩下細(xì)胞團(tuán)。以質(zhì)量濃度1. 2%的海藻酸鈉加入細(xì)胞團(tuán)塊，輕輕軟打混勻，制成3X 107ml密度的藻酸鹽細(xì)胞復(fù)合物。實(shí)施例5選取符合適合治療的病例可應(yīng)用治療的疾病范圍包括1.椎間盤源性腰痛或椎間盤源性頸肩痛病例，經(jīng)磁共振及椎間盤封閉等手段可明確責(zé)任椎間盤。2.腰椎間盤或頸椎間盤髓核摘除術(shù)后病例，術(shù)后殘留腰痛及頸肩痛且可以明確手術(shù)椎間盤為責(zé)任椎間盤。3.其它可以采用人軟骨終板干細(xì)胞治療的椎間盤退變性疾病。實(shí)施例6人軟骨終板干細(xì)胞-海藻酸鈉復(fù)合物的植入治療在適合治療的病例中，術(shù)中在X線引導(dǎo)下行目標(biāo)椎間盤穿刺，向椎間盤注入適量體積的人軟骨終板干細(xì)胞-海藻酸鈉復(fù)合物，再從原通道注入上述凝膠復(fù)合物1/3體積的35g/L氯化鈣溶液完成體內(nèi)的交聯(lián)過程，置入穿刺針芯封住注入通道30秒，拔出穿刺針完成操作。實(shí)施例7椎間盤退變的治療效果驗(yàn)證術(shù)后定期進(jìn)行腰椎正側(cè)位、動(dòng)力位X線片，腰骶椎椎間盤MRI掃描觀察；術(shù)前及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行VAS，JOA, ODI評(píng)分對(duì)比，判斷治療效果。以上所述僅是本發(fā)明的基本內(nèi)容，應(yīng)當(dāng)指出，在不脫離本發(fā)明的前提下，其它科技人員可以對(duì)軟骨終板干細(xì)胞做出基因轉(zhuǎn)染和修飾等改進(jìn)，但只要涉及運(yùn)用人軟骨終板干細(xì)胞用于治療等商業(yè)目的，這些改進(jìn)和修飾及其治療等行為都應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種人軟骨終板干細(xì)胞，其是從人退變椎間盤軟骨終板中分離出的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，其特征在于①在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下能貼塑料瓶壁生長；②細(xì)胞表面標(biāo)志物能表達(dá) CD105、CD73、CD90，不表達(dá) CD45、CD34、CD14 或 CDllb、CD79alpha 或 CD19 及 HLA-DR 表面分子；③在體外培養(yǎng)能向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞方向分化，且較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨和成軟骨分化能力。
2.權(quán)利要求1所述干細(xì)胞的制備方法，其包括以下步驟步驟1:對(duì)軟骨終板標(biāo)本組織進(jìn)行分離獲得軟骨終板，用機(jī)械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細(xì)胞，體外擴(kuò)增時(shí)并篩選、純化，將獲取到的細(xì)胞置孵箱培養(yǎng)，每3天換液I次；步驟2 :待細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)，對(duì)軟骨終板細(xì)胞消化傳代，運(yùn)用瓊脂糖篩選系統(tǒng)篩選細(xì)胞，得到較高純度的軟骨終板干細(xì)胞，再置于孵箱培養(yǎng)，進(jìn)行擴(kuò)增；步驟3 :將傳至第3代的細(xì)胞進(jìn)行凍存?zhèn)溆茫枰獞?yīng)用時(shí)將該細(xì)胞復(fù)蘇即可。
3.權(quán)利要求1所述人軟骨終板干細(xì)胞在制備治療椎間盤退變性疾病的組織工程髓核中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述人軟骨終板干細(xì)胞在制備治療椎間盤退變性疾病的組織工程髓核中的應(yīng)用，所述組織工程髓核是將人軟骨終板干細(xì)胞與支架材料復(fù)合而獲得，人軟骨終板干細(xì)胞的用量為>lX105/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述人軟骨終板干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于所述椎間盤退變性疾病包括椎間盤源性腰痛、椎間盤源性頸肩痛，還可用于經(jīng)磁共振及椎間盤封閉等手段可明確責(zé)任椎間盤病例、腰椎間盤或頸椎間盤髓核摘除術(shù)后病例、術(shù)后殘留腰痛及頸肩痛且可以明確手術(shù)椎間盤為責(zé)任椎間盤病例。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述人軟骨終板干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于所述組織工程髓核是將人軟骨終板干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增并經(jīng)篩選后，復(fù)合海藻酸鈉而形成，在X線引導(dǎo)下行目標(biāo)椎間盤穿刺注射。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從人退變椎間盤軟骨終板中分離、純化出具有多向分化潛能的干細(xì)胞，該干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性相似，經(jīng)誘導(dǎo)能向骨、軟骨及脂肪等方向分化，而且較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨和成軟骨分化能力。軟骨終板干細(xì)胞經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)其具有顯著的髓核再生能力和阻止椎間盤退變的作用，且不存在明顯免疫排斥反應(yīng)，在椎間盤退變性疾病的生物治療中具有良好的應(yīng)用前景和價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P19/08GK103013910SQ201210418889
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者黃博, 王海, 周躍 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院