專(zhuān)利名稱(chēng)：從肝素副產(chǎn)物中分離提純肝素鈉和硫酸乙酰肝素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從肝素副產(chǎn)物中分離提純肝素鈉和硫酸乙酰肝素的方法，屬于粘多糖生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝素鈉是粘多糖硫酸酯類(lèi)抗凝血藥，近年來(lái)研究證明肝素鈉還具有降血脂作用。硫酸乙酰肝素是肝素的亞成分，存在于未分離的肝素中。與肝素鈉相比，硫酸乙酰肝素具有抗凝活性緩和的優(yōu)點(diǎn)。硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者腎臟保護(hù)，是近年來(lái)研究最熱的粘多糖類(lèi)生化藥物。從豬小腸粘膜經(jīng)過(guò)離子交換以及分級(jí)沉淀生產(chǎn)肝素的過(guò)程中產(chǎn)生了大量的副產(chǎn) 物，即肝素副產(chǎn)物，其中主要組成是硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和肝素鈉，其含量因副產(chǎn)物的旋光度不同而有所差異。但是由于其中的有效物質(zhì)分離困難，故生產(chǎn)肝素后一般將這些副產(chǎn)物丟棄或存儲(chǔ)，或者只做簡(jiǎn)單處理，如傳統(tǒng)工藝主要是從肝素副產(chǎn)物中提純硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素，而肝素鈉則棄去，造成一定的損失。硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素性質(zhì)相似，采用通常的離子交換層析和有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀方法難以將硫酸乙酰肝素純化?，F(xiàn)有技術(shù)中，利用硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素與班氏試劑的特殊反應(yīng)實(shí)現(xiàn)兩者的分離，但是在分離得到的硫酸乙酰肝素溶液中，含有大量銅離子。專(zhuān)利(200910039359. 9)通過(guò)離子交換層析柱的吸附和洗滌去除銅離子，不僅容易降低樹(shù)脂壽命，而且難以將銅離子除盡，使得硫酸乙酰肝素粗品仍帶有淡藍(lán)色，經(jīng)原子吸收分光光度法測(cè)定，銅離子含量超過(guò)30ppm。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從肝素副產(chǎn)物中同時(shí)分離出質(zhì)量穩(wěn)定的高純度的肝素鈉和硫酸乙酰肝素的方法，該法適合于工業(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低廉，工藝簡(jiǎn)單。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施達(dá)到一種從肝素副產(chǎn)物中分離提純肝素鈉和硫酸乙酰肝素的方法，其特征是按以下步驟①.將原料肝素副產(chǎn)物溶解于純化水中得到濃度為5-20%(w/v)的溶液，加入醋酸鉀，使溶液中醋酸鉀的含量達(dá)30-60% (w/v)，用醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至5-7后，在18_20°C下沉淀20-80小時(shí)，離心分離沉淀和上清液；②.收集步驟①所得的沉淀，以該沉淀為原料重復(fù)步驟①的操作；③.收集步驟②所得的沉淀，用純化水溶解后，加入無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀；得到的沉淀物重復(fù)純化水溶解和無(wú)水乙醇沉淀的步驟，最后收集沉淀，干燥，得到肝素鈉；④·向步驟①所得的上清液中，加入O. 2-1. 2倍體積的班氏試劑和O. 1-0. 8倍體積的飽和氫氧化鈉溶液，于20-25°C下沉淀后，分離沉淀和上清液；⑤.步驟④所得的上清液加入硫化鈉，靜置沉淀1-3小時(shí)，再加入活性炭攪拌后過(guò)濾；
⑥.步驟⑤得到的清液中加入1-5倍純化水稀釋?zhuān)⒄{(diào)節(jié)溶液的pH值至5-7，然后加入陰離子交換樹(shù)脂攪拌吸附，棄去吸附液，樹(shù)脂浙干；⑦.先以濃度為O. 1-0. 5mol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂，樹(shù)脂浙干；⑧.再以濃度為2. 0-4. Omol/L的氯化鈉溶液洗脫樹(shù)脂，收集洗脫液，過(guò)濾洗脫液后加入無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀，收集沉淀物，重復(fù)純化水溶解和無(wú)水乙醇沉淀的步驟，最后收集沉淀物，干燥，得到硫酸乙酰肝素。在步驟①中，原料肝素副產(chǎn)物可采用生產(chǎn)肝素鈉獲取的副產(chǎn)物(濕料)脫水干燥并稱(chēng)重后為原料，以便于后續(xù)處理和計(jì)算。原料肝素副產(chǎn)物旋光度的不同體現(xiàn)了其主要成分硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和肝素鈉的含量差異。該步驟中的肝素副產(chǎn)物水溶液的濃度優(yōu)選為5-10%，溶液中醋酸鉀的含量?jī)?yōu)選為30-40%，沉淀處理時(shí)間優(yōu)選為20-50小時(shí)。在步驟②中，收集步驟①所得的沉淀，重新進(jìn)行溶解于純化水中、加入醋酸鉀、用醋酸調(diào)節(jié)PH值、沉淀以及分離的操作，其條件同步驟①。在步驟③中，純化水的用量以能完全溶解沉淀物為佳，無(wú)水乙醇的用量以使溶液中不再繼續(xù)產(chǎn)生沉淀為佳。在步驟④中，該步驟中可采用離心或過(guò)濾等方式分離沉淀和上清液，優(yōu)選采用離心分離。在步驟⑤中，硫化鈉的加入量?jī)?yōu)選為10_12%(w/v)?；钚蕴康募尤肓繛?_ll%(w/V)。加入活性炭后的攪拌時(shí)間一般為5-100分鐘，優(yōu)選10-30分鐘?！ぴ诓襟E⑥中，所述的陰離子交換樹(shù)脂為丙烯酸類(lèi)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。其中中陰離子交換樹(shù)脂攪拌吸附時(shí)間為1-20小時(shí)，優(yōu)選2-6小時(shí)。在步驟⑦中，以濃度為O. 1-0. 5mol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂時(shí)間一般為1_5小時(shí)。在步驟⑧中，以濃度為2. 0-4. Omol/L的氯化鈉溶液洗脫樹(shù)脂時(shí)間一般2_10小時(shí)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法利用它們?cè)谒腥芙舛却嬖诓町愡@一特點(diǎn)，加入醋酸鉀使肝素鈉從肝素副產(chǎn)物中沉淀分離，沉淀溶解后再加入醋酸鉀沉淀，收集沉淀，溶解后經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇多次分級(jí)沉淀，進(jìn)而制得純度較高的肝素鈉；上清液通過(guò)加入班氏試劑和飽和氫氧化鈉溶液，離心得到含有硫酸乙酰肝素的溶液，以除銅劑除去銅離子，加入活性炭吸附沉淀并脫色后過(guò)濾，再通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂吸附和洗脫，分離得到高純度的硫酸乙酰肝素，經(jīng)原子吸收分光光度法測(cè)定，硫酸乙酰肝素中銅離子的含量不超過(guò)8ppm，能夠有效地除去銅離子。本方法可直接得到肝素鈉精品和硫酸乙酰肝素品精品。本發(fā)明解決了上清液加入班氏試劑和飽和氫氧化鈉溶液后，經(jīng)離子交換層析柱難以除盡銅離子的問(wèn)題。本法在陰離子交換樹(shù)脂吸附硫酸乙酰肝素前使用除銅劑將銅離子以沉淀形式過(guò)濾除去，由于沉淀細(xì)小，不易沉降，使用吸附劑攪拌后再過(guò)濾，所制得的硫酸乙酰肝素具有更高的純度，且不需要后續(xù)再次除銅步驟，可直接用作硫酸乙酰肝素的原料藥。本發(fā)明能夠同時(shí)從生產(chǎn)肝素鈉的副產(chǎn)物中再次分離得到高純度的肝素鈉和硫酸乙酰肝素，解決了存儲(chǔ)或丟棄大量肝素副產(chǎn)物所需財(cái)力和物力，并變廢為寶，將副產(chǎn)物再次利用，即節(jié)約了大量成本，又創(chuàng)造了價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(I)原料為肝素鈉生產(chǎn)的副產(chǎn)物260kg，測(cè)得的旋光值為-34. 5°，將原料溶解于純化水中，使原料濃度為5%(g/mL)，加入醋酸鉀，使醋酸鉀的含量為30%，調(diào)節(jié)pH至6，在溫度18-20°C下靜置24小時(shí)。(2)離心收集沉淀，溶解為5%(g/mL)的溶液，加入醋酸鉀，使醋酸鉀的含量為30%(g/mL)，用醋酸調(diào)節(jié)pH至6，在溫度18_20°C下靜置24小時(shí)。
(3)離心收集沉淀，用純化水溶解后，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心收集沉淀后再次用純化水溶解，以無(wú)水乙醇沉淀。收集沉淀并脫水干燥，得肝素鈉18. 6kg。測(cè)得肝素鈉精品的旋光為55°，抗凝血效價(jià)為176USP u/mg。(4)步驟⑴所得上清液加入O. 2倍班氏試劑和O. 5倍飽和氫氧化鈉溶液，室溫下沉淀30分鐘，離心分離沉淀和上清液。(5)步驟(4)所得上清液加入適量硫化鈉使其濃度為10%(g/mL)，攪拌后，靜置沉淀I. 5小時(shí)，加入適量活性炭使其濃度為10%(g/mL)，攪拌60分鐘后過(guò)濾。(6)步驟(5)過(guò)濾得到的清液加入I倍純化水稀釋?zhuān)脻恹}酸調(diào)節(jié)pH至7。加入丙烯酸類(lèi)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂攪拌吸附2小時(shí)后，棄去吸附液，浙干。(7)用O. lmol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂2小時(shí)，浙干后再次用O. lmol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂I小時(shí)。樹(shù)脂浙干。(8)將樹(shù)脂加入4. Omol/L的氯化鈉溶液洗脫6小時(shí)，分離洗脫液后再次用
4.Omol/L的氯化鈉溶液洗脫2小時(shí)，合并2次洗脫液。加入無(wú)水乙醇沉淀，收集沉淀后加入純化水溶解后加入無(wú)水乙醇沉淀。收集沉淀用無(wú)水乙醇脫水并烘干，得到白色粉末32kg，SP為硫酸乙酰肝素。測(cè)得硫酸乙酰肝素精品的旋光為38°，抗凝血效價(jià)為52USP u/mg，經(jīng)原子吸收分光光度法測(cè)定，硫酸乙酰肝素中銅離子的含量為6ppm。實(shí)施例二(I)原料為肝素鈉生產(chǎn)的副產(chǎn)物254kg，測(cè)得的旋光值為-I. 7°，將原料溶解于純化水中，使原料濃度為15%(g/mL)，加入醋酸鉀，使醋酸鉀的含量為45%，調(diào)節(jié)pH至5，在溫度18-20°C下靜置48小時(shí)。(2)離心收集沉淀，溶解為15%(g/mL)的溶液，加入醋酸鉀，使醋酸鉀的含量為45%(g/mL)，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5，在溫度18_20°C下靜置48小時(shí)。(3)離心收集沉淀，用純化水溶解后，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心收集沉淀后再次用純化水溶解，以無(wú)水乙醇沉淀。收集沉淀并脫水干燥，得肝素鈉36. 6kg。測(cè)得肝素鈉精品的旋光為51°，抗凝血效價(jià)為172USP u/mg。(4)步驟(I)所得上清液加入I. 2倍班氏試劑和0. 8倍飽和氫氧化鈉溶液，室溫下沉淀30分鐘，離心分離沉淀和上清液。(5)步驟(4)所得上清液加入適量硫化鈉使其濃度為8% (g/mL)，攪拌后，靜置沉淀3小時(shí)，加入適量活性炭使其濃度為15%(g/mL)，攪拌30分鐘后過(guò)濾。(6)步驟(5)過(guò)濾得到的清液加入3倍純化水稀釋?zhuān)脻恹}酸調(diào)節(jié)pH至6。加入丙烯酸類(lèi)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂攪拌吸附10小時(shí)后，棄去吸附液，浙干。(7)用0. 5mol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂2小時(shí)。樹(shù)脂浙干。
(8)將樹(shù)脂加入3. Omol/L的氯化鈉溶液洗脫6小時(shí)，加入無(wú)水乙醇沉淀，收集沉淀后加入純化水溶解后加入無(wú)水乙醇沉淀。收集沉淀用無(wú)水乙醇脫水并烘干，得到白色粉末48kg，即為硫酸乙酰肝素。測(cè)得硫酸乙酰肝素精品的旋光為40°，抗凝血效價(jià)為52USP u/mg，經(jīng)原子吸收分光光度法測(cè)定，硫酸乙酰肝素中銅離子的含量為5ppm。實(shí)施例三(I)原料為肝素鈉生產(chǎn)的副產(chǎn)物197kg，測(cè)得的旋光值為15. 2°，將原料溶解于純化水中，使原料濃度為20%(g/mL)，加入醋酸鉀，使醋酸鉀的含量為60%(g/mL)，調(diào)節(jié)pH至7，在溫度18-20°C下靜置72小時(shí)。(2)離心收集沉淀，溶解為20%(g/mL)的溶液，加入醋酸鉀，使醋酸鉀的含量為60%(g/mL)，用醋酸調(diào)節(jié)pH至7，在溫度18_20°C下靜置72小時(shí)。(3)離心收集沉淀，用純化水溶解后，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心收集沉淀后再次用純化水溶解，以無(wú)水乙醇沉淀。收集沉淀并脫水干燥，得肝素鈉34. 2kg。 測(cè)得肝素鈉精品的旋光為48°，抗凝血效價(jià)為167USP u/mg。(4)步驟⑴所得上清液加入O. 7倍班氏試劑和O. I倍飽和氫氧化鈉溶液，室溫下沉淀30分鐘，離心分離沉淀和上清液。(5)步驟(4)所得上清液加入適量硫化鈉使其濃度為15%(g/mL)，攪拌后，靜置沉淀I小時(shí)，加入適量活性炭使其濃度為8%(g/mL)，攪拌10分鐘后過(guò)濾。(6)步驟(5)過(guò)濾得到的清液加入5倍純化水稀釋?zhuān)脻恹}酸調(diào)節(jié)pH至5。加入丙烯酸類(lèi)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂攪拌吸附6小時(shí)后，棄去吸附液，浙干。(7)用O. 3mol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂3小時(shí)。樹(shù)脂浙干。(8)將樹(shù)脂加入3. Omol/L的氯化鈉溶液洗脫4小時(shí)，洗脫液加入無(wú)水乙醇沉淀，收集沉淀后加入純化水溶解后加入無(wú)水乙醇沉淀。收集沉淀用無(wú)水乙醇脫水并烘干，得到白色粉末52. 8kg，即為硫酸乙酰肝素。測(cè)得硫酸乙酰肝素精品的旋光為42°，抗凝血效價(jià)為55USP u/mg，經(jīng)原子吸收分光光度法測(cè)定，硫酸乙酰肝素中銅離子的含量為8ppm。
權(quán)利要求
1.一種從肝素副產(chǎn)物中分離提純肝素鈉和硫酸乙酰肝素的方法，其特征是按以下步驟 ①.將原料肝素副產(chǎn)物溶解于純化水中得到濃度為5-20%(w/v)的溶液，加入醋酸鉀，使溶液中醋酸鉀的含量達(dá)30-60% (w/v)，用醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至5-7后，在18_20°C下沉淀20-80小時(shí)，離心分離沉淀和上清液； ②.收集步驟①所得的沉淀，以該沉淀為原料重復(fù)步驟①的操作； ③.收集步驟②所得的沉淀，用純化水溶解后，加入無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀；得到的沉淀物重復(fù)純化水溶解和無(wú)水乙醇沉淀的步驟，最后收集沉淀，干燥，得到肝素鈉； ④.向步驟①所得的上清液中，加入O.2-1. 2倍體積的班氏試劑和O. 1-0. 8倍體積的飽和氫氧化鈉溶液，于20-25°C下沉淀后，分離沉淀和上清液； ⑤.步驟④所得的上清液加入硫化鈉，靜置沉淀1-3小時(shí)，再加入活性炭攪拌后過(guò)濾； ⑥.步驟⑤得到的清液中加入1-5倍純化水稀釋?zhuān)⒄{(diào)節(jié)溶液的pH值至5-7，然后加入陰離子交換樹(shù)脂攪拌吸附，棄去吸附液，樹(shù)脂浙干； ⑦.先以濃度為O.1-0. 5mol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂，樹(shù)脂浙干； ⑧.再以濃度為2.0-4. OmoI/L的氯化鈉溶液洗脫樹(shù)脂，收集洗脫液,過(guò)濾洗脫液后加入無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀，收集沉淀物，重復(fù)純化水溶解和無(wú)水乙醇沉淀的步驟，最后收集沉淀物，干燥，得到硫酸乙酰肝素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟⑤中硫化鈉的加入量為8-15%(w/v)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟⑤中活性炭的加入量為8-15%(w/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟⑥中所述的陰離子交換樹(shù)脂為丙烯酸類(lèi)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟⑥中陰離子交換樹(shù)脂攪拌吸附時(shí)間為1-20小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟⑦以濃度為O.1-0. 5mol/L的氯化鈉溶液洗滌樹(shù)脂時(shí)間1-5小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟⑧以濃度為2.0-4. Omol/L的氯化鈉溶液洗脫樹(shù)脂時(shí)間2-10小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從肝素副產(chǎn)物中分離提純肝素鈉和硫酸乙酰肝素的方法，其包括將原料肝素副產(chǎn)物溶解后加入醋酸鉀使肝素鈉沉淀分離，沉淀溶解后再加入醋酸鉀沉淀，收集沉淀，溶解后經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇多次分級(jí)沉淀，進(jìn)而制得純度較高的肝素鈉；上清液通過(guò)加入班氏試劑和飽和氫氧化鈉溶液，離心得到含有硫酸乙酰肝素的溶液，以除銅劑除去銅離子，加入活性炭吸附沉淀并脫色后過(guò)濾，再通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂吸附和洗脫，分離得到高純度的硫酸乙酰肝素。本發(fā)明能夠同時(shí)從生產(chǎn)肝素鈉的副產(chǎn)物中再次分離得到高純度的肝素鈉和硫酸乙酰肝素，解決了存儲(chǔ)或丟棄大量肝素副產(chǎn)物所需財(cái)力和物力，并變廢為寶，將副產(chǎn)物再次利用，既節(jié)約了大量成本，又創(chuàng)造了價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K31/715GK102911290SQ20121042445
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者段艷冰, 辛妮, 王永毅 申請(qǐng)人:南京健友生化制藥股份有限公司