專利名稱：一種采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于針對鹿茸中蛋白質(zhì)提取的方法領(lǐng)域，特別是涉及到以經(jīng)過乙醇萃取新鮮鹿茸有效成分后剩余殘渣為原料，采用一種堿性蛋白酶酶解剩余鹿茸殘渣中鹿茸多肽，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成低分子量的鹿茸多肽混合物。
背景技術(shù)：
鹿鸞(Cornucervi pantotrichum)系雄性鹿科動物梅花鹿(Cervus nipponTemminch)或者馬鹿(Cervus elaphus Linaeus)的密生鸞毛未骨化幼角，鹿鸞的藥理功效主要是“壯腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨，調(diào)沖任和托瘡毒等。對陽痿滑精，冷宮不孕，贏瘦，神疲，畏寒，眩暈耳鳴耳聾，腰膝冷痛，筋骨冷軟，崩漏帶下，陰疽不斂”等均有良好的療效。鹿茸含有多種氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、膠質(zhì)、脂類、粘多糖、微量元素及其它無機(jī)物等，具有廣泛的藥理作用。多種鹿茸品系的化學(xué)成分研究表明，鹿茸中粗蛋白含量都占干重的50%以上。在已有的報道中我們得知梅花鹿茸中粗蛋白含量高達(dá)61. 24%(干重)；采用凍干、冷凍和傳統(tǒng)熱加工工藝制備鹿茸藥材中蛋白成分和活性差異研究發(fā)現(xiàn)，凍干鹿茸中可能最大限度地保存鹿茸含有的活性蛋白，從而提高鹿茸的藥物療效，實(shí)驗(yàn)證實(shí)鹿茸水溶性總蛋白、鹿托盤水溶性總蛋白、鹿骨水溶性總蛋白的相對含量及組成差異極其明顯。研究人員從鮮梅花鹿茸成分分離實(shí)驗(yàn)中獲得了具有強(qiáng)的促進(jìn)骨和軟骨細(xì)胞增殖的低分子量活性物質(zhì)的有效部位。馬鹿鮮鹿茸提取物中的有效活性物質(zhì)通過凝膠過濾層析、離子交換層析以及高效液相純化，分離得到分子量在3216Da的純多肽。本文采用409ffit0H萃取新鮮梅花鹿茸多肽，丙酮溶液分級沉淀，Sephadex G-25柱層析純化，得到了梅花鹿鹿茸多肽I和II組分，剩余鹿茸殘渣保留待酶解。測定萃取鹿茸多肽I和II的UV、IR光譜，生物效應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，鹿茸多肽I和II均具有抗炎、促進(jìn)生長的作用。采用Folin —酚試劑法測定鹿茸含有的水溶性蛋白含量，表明其含量范圍為14. 72% 15. 71%。鹿茸中含有多種氨基酸成分，占干重50. 13%，其中包括人體內(nèi)不能合成的必需氨基酸包括蘇氨酸、纈氨酸，以及組氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸等約有19種以上，其中甘氨酸含量最高，其次是谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸，蛋氨酸的含量最低。分析梅花鹿茸和馬鹿茸不同部位的氨基酸含量，其中氨基酸含量從基部到頂端逐漸增加。我們的研究結(jié)果表明，酶解鹿茸殘渣制備的活性鹿茸多肽(VAP- II)的蛋白含量比乙醇提取物的蛋白含量提高了 5倍，將酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化后，得到了分子量范圍為500Da 700Da的多肽類混合物質(zhì)，利用MTT法和細(xì)胞周期分析證實(shí)酶解鹿茸多肽(VAP- II -A)具有明顯促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(0S-732細(xì)胞)的生物活性作用、明顯提高G2+S期細(xì)胞指數(shù)生長的效果，細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)的活性明顯提高。通過P38MAPK抑制劑阻斷細(xì)胞通路后，加入活性鹿茸多肽作用細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，多肽組人成骨肉瘤細(xì)胞無明顯的細(xì)胞活性及周期變化。進(jìn)一步通過SYBR Green I嵌合熒光法Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，成功檢測到人成骨肉瘤細(xì)胞中的BMP、P21及(Cyclin) Dl逆轉(zhuǎn)錄水平的mRNA相對含量差異，與對照組相比，加入鹿茸多肽作用的細(xì)胞中BMP、P2ImRNA相對含量明顯提高7倍，進(jìn)一步闡述了酶解鹿茸殘渣多肽能夠促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞的分化、增殖的可能機(jī)理，并且提高了鹿茸的生物利用率，提高了鹿茸更為廣泛的合理利用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是首先采用乙醇萃取新鮮鹿茸制備鹿茸多肽，然后以萃取新鮮鹿茸后的鹿茸殘渣為原料，通過酶解法制備活性鹿茸多肽物質(zhì)，通過分離純化，檢測鹿茸多肽理化性質(zhì)，并測定該鹿茸多肽是分子量范圍在500Da 700Da的混合物。酶解法制備鹿茸多肽粗提取物蛋白質(zhì)含量比乙醇萃取物蛋白含量提高5倍。一種采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是該鹿茸多肽干粉為淡黃色粉末狀，能溶解于水，在4°C保存；該鹿茸多肽干粉的粗蛋白含量為57. 6%;該鹿茸多肽干粉為寡肽混合物，70% 80%寡肽的分子量分布在500Da 700Da ;該鹿茸多肽干粉的氨基酸 組成為天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸；采用酶解法制取鹿茸多肽干粉包括以下步驟①制備鹿茸多肽的原料為鹿茸殘渣，即利用乙醇萃取新鮮鹿茸后剩余的鹿茸殘渣為原料；②酶水解取鹿茸殘渣IOg溶于IOOml蒸餾水中，該蒸餾水的溫度為50°C，調(diào)節(jié)為堿性，然后加入O. 5ml堿性蛋白酶即枯草桿菌蛋白酶Alcalase，仍保持溫度在50°C，堿性條件，酶解I小時后滴加O. 05mol/L的氫氧化鈉NaOH，維持體系堿性調(diào)節(jié)；③酶滅活向步驟②中添加氯化氫HCl調(diào)節(jié)pH值為4. O,保持溫度為50°C，經(jīng)過20分鐘酶解結(jié)束,采用800rpnTl000rpmX 20min離心操作,然后過濾該液體并保存濾液,將濾液凍干后即得到鹿茸殘渣酶解的粗提物；④精制將步驟③中所得到的粗提取物依次通過截止分子量為10k、3k，其中k為1000單位的超濾膜，采用S^hadex G-25凝膠過濾色譜柱及高效液相分離，得到精制的鹿茸多肽產(chǎn)品;⑤干燥將精制鹿茸多肽產(chǎn)品通過冷凍濃縮后，經(jīng)冷凍干燥制成干粉。所述的鹿茸多肽干粉藥理功效是促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞的增殖、分化，有抗氧化的能力。所述的鹿茸多肽干粉制備成預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松疾病的藥物。有益效果目前認(rèn)為堿性蛋白酶更適合蛋白質(zhì)的酶水解反應(yīng)，水解能力高于中性蛋白酶，更具有應(yīng)用價值；蛋白水解物溶解性好、水解效率高、蛋白回收率高，具有良好的營養(yǎng)成分和功能性。Alcalase的主要成分是枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,這是一種專一'丨生廣泛的內(nèi)切蛋白酶，堿性蛋白酶水解蛋白質(zhì)具有較多的切割位點(diǎn)，而達(dá)到較高的水解度。因此本發(fā)明中選用Alcalase酶來進(jìn)行酶解。
可以看出酶解鹿茸殘渣粗提取物中蛋白含量較乙醇萃取方法高出5倍。由此可見酶法水解提取鹿鸞殘禮:中多妝類物質(zhì)的提取率大幅提聞，有效提聞了鹿鸞的生物利用率。凱氏定氮法測定含氮量，比較乙醇直接萃取鹿茸與酶解所剩鹿茸殘渣的提取物的蛋白含量。鹿茸萃取液中鹿茸蛋白含量11%，鹿茸殘渣蛋白含量71. 2%，鹿茸殘渣酶解液提取物蛋白含量57.6%。酶解乙醇萃取后的鹿茸殘渣得到的活性鹿茸多肽(VAP- II -A)分子量范圍與乙醇提取物中所得的多肽分子量范圍接近；含鹿茸多肽血清培養(yǎng)基作用細(xì)胞后細(xì)胞活性明顯提高，表明酶解得到的多肽成分能夠促進(jìn)0S-732細(xì)胞的分化與增殖，進(jìn)而為酶解鹿茸多肽的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)?？傊?，本技術(shù) 發(fā)明，不僅為鹿茸的綜合利用提供了新的途徑，提高了鹿茸生物利用率，而且為進(jìn)一步開發(fā)能促進(jìn)骨質(zhì)生長以及預(yù)防和治療治療骨質(zhì)疏松等的臨床鹿茸多肽藥物奠定了必要的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式該鹿茸多肽干粉為淡黃色干粉末狀，能溶解于水，放置于4°C保存。該鹿茸多肽干粉的粗蛋白含量為57. 6%，其為寡肽混合物，70%-80%寡肽的分子量分布在500-700Da。鹿茸多肽的氨基酸組成天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸。本鹿茸多肽干粉的藥理作用是能夠促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞的增殖、分化、提高抗氧化能力，可以制成預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松等臨床疾病的口服藥物，也可以將該鹿茸多肽制備成醫(yī)療保健品等。鹿茸多肽的提取鹿茸殘渣含水量的測定采用真空干燥法。乙醇萃取新鮮鹿茸中有效物質(zhì)后的剩余殘渣在高溫下真空干燥除去其中的水分，測定殘渣含水量。具體操作如下稱取殘渣2.3g高溫下干燥，定時稱重，待重量恒定后計算其含水量。依照公式水分(％)=G/WX100%，其中G為樣品干燥后的失重(g) ；W為樣品重量(g)。測定某一固體樣品中的蛋白質(zhì)含量，都是以按100克該物質(zhì)的干重中所含蛋白質(zhì)克數(shù)來表示(％)。定氮前將固體樣品中的水分除掉首先將樣品磨細(xì)，在已稱重的稱量瓶中加入樣品，于105°C的烘箱內(nèi)干燥，每烘干I小時后稱量一次，直至兩次稱量數(shù)值恒定不變，即達(dá)到恒重為止。分別稱取鹿茸殘渣干燥粉、鹿茸萃取液粗提物干燥粉、鹿茸殘渣酶解粗提物進(jìn)行蛋白含量測定。實(shí)驗(yàn)方法稱取鹿茸殘渣IOg溶于IOOml蒸餾水中(水浴50°C，20min，調(diào)節(jié)堿性恒定)加O. 5ml堿性蛋白酶(水浴50°C，堿性恒定)酶解Ih后，添加HC1，調(diào)節(jié)酸性恒定(500C，20min)酶解結(jié)束，冷卻至室溫后800rpmX 20mirTl000rpmX 20min離心，紙漿過濾(三次)保存濾液，凍干后即得鹿茸殘渣酶解粗提物。準(zhǔn)備層析柱及凝膠干粉，凝膠干粉溶脹過夜，平衡液洗脫層析柱。操作方法鹿茸殘渣酶解得到的鹿茸粗提取物依次經(jīng)截止分子量為10k、3k (k 1000單位)超濾膜，蠕動泵過濾后樣品凍干。取樣品凍干粉約20mg，用Iml蒸餾水溶解，采用Sephadex G-25 (16mmX 1000mm)凝膠過濾色譜柱進(jìn)行分離，流動相蒸懼水，流速
8.lml/10min，采用紫外可見分光過度計檢測，檢測波長220nm，收集各洗脫峰樣品，冷凍干燥備用。
上述凍干品用流動相溶解，進(jìn)樣純化，收集樣品冷凍干燥。高效液相色譜儀島津LC-8A ;層析柱:反相柱C 18 (250mmX4. 6mm)柱;流速:0. 6ml/min ;柱溫:20°C;流動相10%(乙腈7jC =1 :10);進(jìn)樣量5ul ;檢測波長:220nm。蛋白含量的測定三種樣品的蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果列于表I中，其中，鹿茸乙醇萃取粗提物蛋白含量11. 0%，酶解鹿茸殘渣粗提物蛋白含量57. 6% ;鹿茸殘渣蛋白含量71.2%?？梢钥闯雒附饴谷讱堅痔崛∥镏械鞍缀枯^乙醇萃取方法高出5倍。由此可見酶法水解提取鹿鸞殘禮:中多妝類物質(zhì)的提取率大幅提聞，有效提聞了鹿鸞的生物利用率。表I凱氏定氮蛋白含量
權(quán)利要求
1.一種采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是該鹿茸多肽干粉為淡黃色粉末狀，能溶解于水，在4°c保存；該鹿茸多肽干粉的粗蛋白含量為57. 6% ;該鹿茸多肽干粉為寡肽混合物，70% 80%寡肽的分子量分布在500Da 700Da ;該鹿茸多肽干粉的氨基酸組成為天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸； 采用酶解法制取鹿茸多肽干粉包括以下步驟 ①制備鹿茸多肽的原料為鹿茸殘渣，即利用乙醇萃取新鮮鹿茸后剩余的鹿茸殘渣為原料； ②酶水解 取鹿茸殘渣IOg溶于IOOml蒸餾水中，該蒸餾水的溫度為50°C，調(diào)節(jié)為堿性，然后加入O.5ml堿性蛋白酶即枯草桿菌蛋白酶Alcalase，仍保持溫度在50°C，堿性條件，酶解I小時后滴加O. 05mol/L的氫氧化鈉NaOH，維持體系堿性調(diào)節(jié)； ③酶滅活 向步驟②中添加氯化氫HCl調(diào)節(jié)為酸性條件，保持溫度為50°C，20分鐘酶解結(jié)束，采用800rpnTl000rpmX20min離心操作，然后過濾該液體并保存濾液，將濾液凍干后即得到鹿茸殘渣酶解的粗提物； ④精制 將步驟③中所得到的粗提取物依次通過截止分子量為10k、3k，其中k為1000單位的超濾膜，采用S^hadex G-25凝膠過濾色譜柱及高效液相分離，得到精制的鹿茸多肽產(chǎn)品； ⑤干燥 將精制鹿茸多肽產(chǎn)品通過冷凍濃縮后，經(jīng)冷凍干燥制成干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是所述的鹿茸多肽干粉藥理功效是促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞的增殖、分化，有抗氧化的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是所述的鹿茸多肽干粉制備成預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松疾病的藥物。
全文摘要
一種采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，屬于針對鹿茸中蛋白質(zhì)提取的方法領(lǐng)域。首先以經(jīng)過乙醇萃取新鮮鹿茸有效成分后剩余殘渣為原料，然后采用一種堿性蛋白酶酶解剩余鹿茸殘渣中的鹿茸多肽物質(zhì)，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成低分子量的鹿茸多肽混合物。通過酶解法制備鹿茸殘渣中鹿茸多肽物質(zhì)通過實(shí)驗(yàn)檢測鹿茸殘渣中鹿茸多肽的理化性質(zhì)，確定鹿茸多肽是分子量范圍在500Da～700Da的混合物。我們發(fā)現(xiàn)酶解鹿茸殘渣中鹿茸多肽粗提取物蛋白質(zhì)含量比乙醇萃取物蛋白含量提高5倍，本發(fā)明不僅為鹿茸的綜合利用提供了新的途徑，提高了鹿茸生物利用率，而且為進(jìn)一步開發(fā)能促進(jìn)骨質(zhì)生長以及預(yù)防和治療治療骨質(zhì)疏松等的臨床鹿茸多肽藥物奠定了必要的基礎(chǔ)。
文檔編號A61P19/10GK102925522SQ20121042742
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者王 華, 劉穎男, 宋麗晶, 南正三 申請人:王 華