專利名稱：用于治療和預(yù)防老化相關(guān)癥狀的方法和組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的組分及其使用方法，具體涉及包含Cisd2基因的新穎的組分和治療劑及其在治療和預(yù)防老化相關(guān)癥狀中的使用方法。
背景技術(shù)：
從很早以前，人就開始為了延長(zhǎng)生命并幫助維持年老時(shí)候的生活質(zhì)量而。尋找青春之泉的秘密，除了像可調(diào)節(jié)壽命的飲食營(yíng)養(yǎng)控制和熱量限制之類的環(huán)境因素以外，有重要證據(jù)支持在人類中有家族性的長(zhǎng)壽，這表明有一個(gè)遺傳因素或多個(gè)遺傳因素影響長(zhǎng)壽。2001年，波爾斯和昆克及他們的同事開創(chuàng)了一個(gè)無限制的搜尋，用來選取任何對(duì)人類長(zhǎng)壽有影響的遺傳區(qū)域。他們對(duì)長(zhǎng)壽家族的成員進(jìn)行了遍及基因組的掃描，這些成員一供308人，分別來自137組非常長(zhǎng)壽的近親中；該聯(lián)接研究鑒定了一個(gè)位于染色體4q的基因座，并標(biāo)明存在一個(gè)對(duì)長(zhǎng)壽有重要貢獻(xiàn)的遺傳組件(Puca等，2001)。該遺傳組件可能由一個(gè)或多個(gè)對(duì)長(zhǎng)壽有重要遺傳作用的基因組成，擁有該遺傳組件的人的壽命高出人類平均壽命2(Γ25年。Gees aman等利用美國(guó)的一長(zhǎng)壽人群(平均月齡100.8歲)進(jìn)行了一項(xiàng)對(duì)染色體4q之候選間隔的基于單體型的精細(xì)的繪圖研究來鑒定對(duì)壽命有重要影響的特異的基因和基因變體；該相關(guān)研究鑒定了一個(gè)在微粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)基因中的單體型標(biāo)記，該標(biāo)記可能是人類壽命的助劑。為了調(diào)查上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否能在不同人群中重復(fù)出現(xiàn)，多個(gè)歐洲研究組也進(jìn)行了多方面的詳細(xì)的遺傳分析和一個(gè)利用歐洲九十歲以上人群作為樣本的長(zhǎng)壽研究，這些樣本采集字德國(guó)、丹麥、荷蘭和英格蘭(Nebel等，2005 ;Bathum等，2006 ；Neville等，2007)。然而，這些后續(xù)的研究顯示在MTP基因和長(zhǎng)壽之間沒有明顯的聯(lián)系，并表明MTP單體型對(duì)人類的長(zhǎng)壽沒有值得注意的影響。盡管多篇文章在各種各樣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中研究老化的過程，但是取得與人相關(guān)的信息仍然是十分有價(jià)值的。相應(yīng)地，對(duì)長(zhǎng)壽的兄弟姐妹之間的關(guān)聯(lián)的研究顯示出巨大的進(jìn)展(Puca等，2001)，因?yàn)樵撗芯恐赶蛞粋€(gè)更加深遠(yuǎn)的探索區(qū)域。然而，染色體4q上的可疑區(qū)域跨越大約12Mb冰包括數(shù)百個(gè)候選基因。由此而論，這場(chǎng)比賽的勝利者可能是一新的基因，該基因的編碼產(chǎn)物涉及一新的生理學(xué)路徑或一個(gè)已知路徑中的新成員。編碼一個(gè)線粒體外膜蛋白的CISD2基因是一個(gè)在進(jìn)化上保守的基因(Chen等，2010a)。CISD2是包括⑶GSH鐵硫區(qū)域的基因家族的第二個(gè)成員。該基因家族目前有三個(gè)成員=CISDl (同義詞:ZCDl、mitoNEET)、CISD2 (同義詞:ZCD2、No 倍 p70,、Minerl)和 CISD3(同義詞:Miner2)。CISDl是一個(gè)外線粒體膜蛋白，該蛋白最初被鑒定為用于治療II型糖尿病的胰島素激活劑吡格列酮的靶蛋白。CISDl蛋白包括一個(gè)跨膜區(qū)域、一個(gè)CDGSH區(qū)域和一個(gè)保守的結(jié)合鐵的氨基酸序列；生化實(shí)驗(yàn)暗示CISDl涉及呼吸率的控制和氧化能力的調(diào)節(jié)。然而，CISD2和CISD3為新的基因，而沒有之前功能。已報(bào)道的CISD2是在細(xì)胞培養(yǎng)研究中的早期神經(jīng)分化的標(biāo)記之一。值得注意的是，CISD2基因位于染色體4q的候選區(qū)域中，在該候選區(qū)域中具有一個(gè)與人類長(zhǎng)壽相關(guān)的遺傳組件。已有一 Cisd2缺陷的基因敲除小鼠被設(shè)計(jì)用來研究Cisd2在發(fā)育和病理生理學(xué)中的角色(Chen等，2009a和2009b)。研究結(jié)果顯示Cisd2缺陷引起小鼠的早衰并表明Cisd2是哺乳動(dòng)物壽命控制的一個(gè)重要部分。此外，細(xì)胞培養(yǎng)和亞線粒體分餾實(shí)驗(yàn)顯示Cisd2為一線粒體外膜蛋白。因此，Cisd2蛋白的缺陷導(dǎo)致線粒體的退化和功能紊亂，并伴隨有自體吞噬特征的細(xì)胞死亡；這些事件的發(fā)生先于神經(jīng)和肌肉的退化并和這些退化一起導(dǎo)致早衰先關(guān)的表型特征的出現(xiàn)。因?yàn)榧∪夂蜕窠?jīng)具有最高的能量需求且最依賴于線粒體的功能，這就解釋了為什么神經(jīng)元損傷和肌肉畸形是最早兩個(gè)臨床表現(xiàn)和為什么它們?cè)陲@而易見早衰表型出現(xiàn)前產(chǎn)生。相應(yīng)的，線粒體退化似乎具有一直接的表型的結(jié)果，該結(jié)果加速了 Cisd2基因敲除小鼠的衰老過程。因此這些結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)證明線粒體功能紊亂與哺乳動(dòng)物老化過程是有重要關(guān)聯(lián)的。許多遺傳因子具有調(diào)節(jié)壽命的潛力(Kuro-o等，1997 ;Hasty等,2003 ;Mounkes等，2003 ；Niedemhofer等，2006 ；Chen等，2010b)。然而，迄今為止，Cisd2是唯一的存在于染色體4q的長(zhǎng)壽區(qū)域中的已經(jīng)鑒定的基因并通過功能缺失小鼠研究證明為一個(gè)壽命控制的必需基因。盡管如此，延長(zhǎng)健康的壽命的實(shí)驗(yàn)比縮短壽命的實(shí)驗(yàn)更具說服力。因此，評(píng)估表達(dá)高水平Cisd2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的生活史對(duì)于檢驗(yàn)增加的Cisd2是否延長(zhǎng)壽命是十分重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了新穎的組分及其使用方法。更具體的，發(fā)明人已經(jīng)鑒定了新穎的包含Cisd2基因的組分和治療劑，并所述組分和治療劑在治療和/或預(yù)防老年相關(guān)癥狀中的使用方法。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，所述治療劑包括一負(fù)載一 Cisd2基 因的運(yùn)載工具。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Cisd2基因選自人Cisd2基因和鼠科動(dòng)物Cisd2基因。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述運(yùn)載工具為一載體、一脂質(zhì)體、一聚合物、一藥學(xué)上可接受的組分、或一能夠促進(jìn)上述運(yùn)載工具的運(yùn)載的裝置。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體為腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒群載體、單純性皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小核糖核酸病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體、甲病毒載體、一助劑依賴的腺病毒或一質(zhì)粒。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療劑在治療老化相關(guān)損傷中是有效的。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療劑在預(yù)防老化相關(guān)損傷中是有效的。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述老化相關(guān)損傷為細(xì)胞損傷、組織損傷、器官功能紊亂、老化相關(guān)的壽命縮短和癌變。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述老化相關(guān)的損傷為與皮膚、神經(jīng)、肌肉、胰腺、大腦、腎臟、肺、胃、腸、脾臟、心臟、脂肪組織、睪丸、卵巢、子宮、肝臟和骨相關(guān)的組織損傷，其中皮膚包括表皮層、真皮層、脂肪層、毛囊、毛發(fā)和皮脂腺。。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述運(yùn)載工具與另一個(gè)不相關(guān)的治療聯(lián)合。本發(fā)明還提供了一種包括多核苷酸的表達(dá)框，該表達(dá)框包括一段與一段在宿主細(xì)胞內(nèi)具有功能的啟動(dòng)子可操作的連接的編碼Cisd2多肽的序列。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Cisd2多肽選在人Cisd2多肽和鼠科動(dòng)物Cisd2多肽。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子為一組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，包括給予需要這種治療的一哺乳動(dòng)物有療效的Cisd2基因的量。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一 Cisd2基因，所述Cisd2基因選自人Cisd2基因和鼠科動(dòng)物Cisd2基因。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一給藥步驟，所述給藥步驟包括使用一運(yùn)載工具。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一運(yùn)載工具，所述運(yùn)載工具為一載體、一脂質(zhì)體、一聚合物、一藥學(xué)上可接受的組分、或一能夠促進(jìn)上述運(yùn)載工具的運(yùn)載的
>J-U ρ α裝直。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一載體，所述載體為腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒群載體、單純性皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小核糖核酸病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體、甲病毒載體、一助劑依賴的腺病毒或一質(zhì)粒。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一給藥步驟，所述給藥步驟為對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行靜脈給藥、皮下給藥、骨髓內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、心臟內(nèi)給藥、大腦內(nèi)給藥、脊柱內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌肉內(nèi) 給藥、腸胃外給藥、直腸內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、皮膚內(nèi)給藥、表皮給藥、口服或上述給藥方式的混合。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括治療和/或預(yù)防老化相關(guān)癥狀，所述老化相關(guān)癥狀為細(xì)胞損傷、組織損傷、器官功能紊亂、老化相關(guān)的壽命縮短和癌變。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括治療和/或預(yù)防老化相關(guān)癥狀，所述老化相關(guān)癥狀為與皮膚、神經(jīng)、肌肉、胰腺、大腦、腎臟、肺、胃、腸、脾臟、心臟、脂肪組織、睪丸、卵巢、子宮、肝臟和骨相關(guān)的組織損傷，其中皮膚包括表皮層、真皮層、脂肪層、毛囊、毛發(fā)和皮脂腺。。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一給藥步驟，所述給藥步驟包括給予需要治療的一哺乳動(dòng)物多倍有效劑量的Cisd2基因的量。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一給藥步驟，所述給藥步驟包括將Cisd2基因與其他治療劑聯(lián)合給藥。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括治療和/或預(yù)防一哺乳動(dòng)物的至少一老化相關(guān)癥狀，所述哺乳動(dòng)物為人。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)基因小鼠。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種基因組包括一段編碼一小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，該轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)導(dǎo)致該種轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的Cisd2相較于非轉(zhuǎn)基因小鼠過量表達(dá)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞包括一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，該轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)導(dǎo)致上述細(xì)胞內(nèi)的Cisd2相較于非轉(zhuǎn)基因小鼠過量表達(dá)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種基因組包括一段編碼一小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，所述轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出如下之一特征:皮膚退化減少、骨骼肌退化減少、神經(jīng)退化減少、線粒體損傷減少、新陳代謝加快和壽命的延長(zhǎng)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因小鼠包括一轉(zhuǎn)入基因，該所述轉(zhuǎn)入基因可操作的與能夠增加小鼠體內(nèi)Cisd2表達(dá)量的啟動(dòng)子相連接，該啟動(dòng)子優(yōu)選為RNA聚合酶II大亞基啟動(dòng)子，其中RNA聚合酶大亞基簡(jiǎn)寫為Pol II。本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，該方法包括將編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因引入胚胎干細(xì)胞或生殖細(xì)胞的步驟。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因小鼠的后代，其中，該后代表達(dá)一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因。本發(fā)明還提供了一種分離自或來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種得到自或來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞表達(dá)編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種篩 選能夠調(diào)節(jié)Cisd2表達(dá)的化合物的方法，包括如下步驟:(a)提供一種待測(cè)化合物；(b)將該待測(cè)化合物與權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要去所述的一種轉(zhuǎn)基因小鼠或獲得自或來源于權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞接觸；(c)檢測(cè)該化合物是否能夠調(diào)節(jié)Cisd2的表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種識(shí)別調(diào)節(jié)一老化相關(guān)癥狀的一特征的藥劑的方法，該方法包括:(a)提供一種轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組包括一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因，并且與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出如下之一特征:皮膚退化減少、骨骼肌退化減少、神經(jīng)退化減少、線粒體損傷減少、新陳代謝加快和壽命的延長(zhǎng)；(b)評(píng)價(jià)所述轉(zhuǎn)基因小鼠的特征；(C)將(b)中的評(píng)價(jià)特征與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相同特征進(jìn)行比較；(d)給予步驟Ca)的轉(zhuǎn)基因小鼠一待測(cè)藥劑；(e)測(cè)定該待測(cè)藥劑是否調(diào)節(jié)所述一老化相關(guān)癥狀的所述特征。參考下面的描述、實(shí)施例和附加的權(quán)利要求，能夠更好的理解本發(fā)明的這些或其他特征、方面和有益效果。


圖1、Cisd2的持久表達(dá)延長(zhǎng)了小鼠的壽命；(A) Pol II_Cisd2轉(zhuǎn)入基因構(gòu)建，小鼠Cisd2編碼區(qū)域由RNA聚合酶II大亞基啟動(dòng)子(Pol II pro)驅(qū)動(dòng)；雞HS4絕緣子的兩個(gè)直接重復(fù)序列位于polyA (pA)的下游用以阻斷位置效應(yīng)，Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的背景為C57BL/6 ;(B) 3月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)源的(endo)和轉(zhuǎn)入的(tg) Cisd2mRNA的Northern blot 分析，探針為小鼠 Cisd2cDNA ； (C)分別對(duì) 3 月齡(3_mo)、12 月齡(12_mo)和24月齡(24-mo)的野生型(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的骨骼肌中的Cisd2蛋白水平的Western blot定量分析，其中*p < 0.05，**p < 0.005 ； (D) (E)雄性小鼠和雌性小鼠的Cisd2劑量依賴的壽命調(diào)節(jié)，Cisd2缺陷縮短了小鼠的壽命，并導(dǎo)致雄性和雌性Cisd2基因敲除小鼠的早衰；相比之下，提高的Cisd2水平延長(zhǎng)了小鼠的壽命，并提高了雄性和雌性Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的存活率。圖2、Cisd2在毛發(fā)外觀、皮脂腺和水排斥的效果；(A)Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的延遲的褪色，34月齡(34-mo)的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠上的老化毛發(fā)的數(shù)量少于15月齡(15-mo)的野生型小鼠(WT) ； (B) (C) 3月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的馬森氏毛狀體皮膚切片染色，HF:毛囊，SG:皮脂腺，結(jié)締組織、大部分的膠原都被馬森氏毛狀體染色法染成藍(lán)色；(D) (E) 24月齡(24-mo)的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的馬森氏毛狀體皮膚切片染色；(F)每條毛發(fā)的皮脂腺(SG)中的細(xì)胞核數(shù)量；(G)具有一個(gè)或兩個(gè)皮脂腺的毛發(fā)所占總毛發(fā)的百分比；在斤)和(G)中，每組有3至6只小鼠，每只小鼠檢查4(Γ180根毛發(fā)，結(jié)果顯示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差Zp < 0.05 ;(Η)24月齡(24-mo)的Cisd轉(zhuǎn)基因小鼠具有更好的水排斥能力，野生型小鼠的毛發(fā)相較于Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的毛發(fā)來說保留更多的水分，這反映出相對(duì)體重的大量增加。圖3、Cisd2保護(hù)線粒體免于老化相關(guān)的結(jié)構(gòu)損傷，延遲肌肉的退化冰提高了胰島素敏感性；(A) (B) 3月齡(3-mo)的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的骨骼肌橫截面的HE染色，在這個(gè)月齡沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)別；(C) (D) 24月齡(24-mo)的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(GT)的骨骼肌橫截面的HE染色，星型表示替代肌肉纖維的白色脂肪組織，退化的纖維和白色置放沒有在24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測(cè)到；(E)在老化的野生型小鼠的骨骼肌中代替肌肉纖維的白色脂肪通過圍脂滴蛋白IHC染色被確認(rèn)，圍脂滴蛋白是表達(dá)在脂滴外周的脂肪的標(biāo)記，藍(lán)色為核DAPI染色；(F)為(E)中檢測(cè)的肌肉纖維的一系列切片HE染色圖；(G)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌中被肌肉纖維占據(jù)的區(qū)域明顯增加；(H) 24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌中纖維數(shù)量明顯增加；(I) 24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌中白色脂肪組織區(qū)域明顯減少；(J)通過握力分析檢測(cè)肌肉強(qiáng)度的功能性檢查，*P < 0.05 ； (K) (L) 24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡檢查，其中，AL:自噬性溶酶體，M:線粒體，Myf:肌絲；(M) 24月齡小鼠的具有自噬小體和退化區(qū)域的骨骼肌的百分比；(N) 24月齡的小鼠的骨骼肌中被線粒體占據(jù)的區(qū)域的百分比，在(M)和(N)中，每個(gè)組中有3只小鼠，每只小鼠檢查10至12張顯微照片(5000倍)；(O) 12月齡(12-mo)和24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的提高的胰島素敏感性，分別對(duì)3月齡、12月齡和24月齡的小鼠進(jìn)行胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(0.75單位/千克體重)，每組中有3至6只小鼠，每只 小鼠進(jìn)行3次獨(dú)立的測(cè)量，*p < 0.05。圖4、Cisd2保護(hù)小鼠免于老化相關(guān)的神經(jīng)退化和髓鞘崩解，(A) (B) 24月齡的野生型小鼠(WT)的坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)明顯的髓鞘崩解和軸突元件退化；(C) (D) 24月齡的野生型小鼠的視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)明顯的髓鞘崩解和軸突元件退化；(E) (F)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)；(G) (H)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)；(I) (J) 24月齡的小鼠的坐骨神經(jīng)掃描電鏡定量檢查，每組中有3只小鼠，每只小鼠檢查3至5張顯微照片(5000倍);(K) (L) 24月齡的小鼠的視神經(jīng)掃描電鏡定量檢查，每組中有3只小鼠，每只小鼠檢查10張顯微照片(10000倍)，結(jié)果顯示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，*p < 0.05 ；**p < 0.005。圖5、Cisd2減少老化相關(guān)的線粒體DNA損傷并減弱老化相關(guān)的線粒體電子傳輸活性衰減；(A) mtDNA基因組圖譜和用于檢測(cè)缺失所使用的引物對(duì)的位置，NDl:NADH脫氫酶亞基1，CO倍1:細(xì)胞色素c氧化酶亞基I，ATP6，ATP合成酶H)亞基6，CYTB，細(xì)胞色素b ;
(B)mtDNA片段的長(zhǎng)距離PCR (Long PCR) (13.6kb)，該P(yáng)CR用以監(jiān)控從肝臟提取的基因組DNA的線粒體基因組的完整性；(C) 24月齡(24-mo)的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)之間的13.6kb長(zhǎng)距離PCR產(chǎn)物和缺失的mtDNA PCR信號(hào)的相對(duì)百分比的比較；(D)D-17缺失的PCR檢測(cè)，該檢測(cè)覆蓋肝臟提取的基因組DNA的NDl及ND2基因，Manba是一種核編碼蛋白；(E) 24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠之間的D-17缺失的相對(duì)水平的比較；(F)NDUFA、UQCRC2和ATP5B的蛋白水平的Western blot定量檢測(cè)；(G)24月齡的野生型小鼠的骨骼肌中線粒體內(nèi)容物(重量)明顯減少，然而，Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠中的此種減少較少；(H) 24月齡的野生型小鼠的骨骼肌中的mtDNA拷貝數(shù)明顯增加，然而，在Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠中未檢測(cè)到此種增加；(I) 24月齡的野生型小鼠的骨骼肌中的TFAM明顯增加，然而，此現(xiàn)象在Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠中并不明顯；(J)以在休眠狀態(tài)的耗氧率(納摩爾氧氣每分鐘每克骨骼肌)表示的分離的線粒體的呼吸活性，即谷氨酸蘋果酸鹽支持的呼吸和ADP活化的呼吸，*p < 0.05 ；**p < 0.005。圖6、Cisd2降低了老化相關(guān)的全身能量代謝衰弱；(A-C) 24月齡(24-mo)的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)在光/暗周期內(nèi)的以小時(shí)為單位的平均全身耗氧量(VO2) (A), CO2產(chǎn)生量(VCO2) (B)和產(chǎn)熱量(C)5(D-F)在光和暗周期內(nèi)，3月齡(3-mo)及24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的全身(VO2) (D)、(VCO2) (E)和產(chǎn)熱量(F)的定量比較；在(D-F中)，計(jì)算定量結(jié)果的數(shù)據(jù)采集自光周期的中間(11:00-13:00)和暗周期的中間(23:00 1:00)，以上所有結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*p < 0.05 ； **p < 0.005。圖7、年輕(3月齡)和中年(17月齡)的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的Cisd2mRNA的表達(dá)；
(A)用等位基因特異性的RT-PCR檢測(cè)來自內(nèi)源(endo)Cisd2和轉(zhuǎn)入的(tg) Cisd2基因的mRNA ； (B)用3月齡和17月齡的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的不同組織的總RNA進(jìn)行Cisd2mRNA的RT-PCR檢測(cè)，BAT:褐色脂肪組織；WAT:白色脂肪組織；Sk:肌肉、骨骼肌。圖8、轉(zhuǎn)入的Cisd2基因的表達(dá)幫助維持轉(zhuǎn)基因小鼠中Cisd2的蛋白量；而在野生型小鼠中內(nèi)源Cisd2的表達(dá)隨著月齡的增長(zhǎng)而自然的降低；(A) 3月齡(3-mo)、12月齡(12-mo)和24月齡(24-mo)的自然老化的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的骨骼肌內(nèi)的Cisd2蛋白水平的Western blot檢測(cè)分析,一個(gè)共同的對(duì)照是來自3月齡的骨骼肌，該共同對(duì)照置于每個(gè)蛋白膠中用來在不同的Western blot之間進(jìn)行對(duì)比和校正信號(hào)；
(B)3月齡、12月齡和24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌中的Cisd2蛋白相對(duì)水平的比較；在12月齡和24月齡的自然老化的野生型小鼠中檢測(cè)到Cisd2蛋白水平的明顯下降，然而，來自年輕(3月齡)至年老(24月齡)的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的Cisd2蛋白表達(dá)水平具有顯著不同。圖9、月齡和性別匹配的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠之間的雌性生殖能力、體重和體溫的對(duì)比；(A)野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(GT)的雌性生育能力沒有明顯的不同，所產(chǎn)幼崽窩數(shù)和總數(shù)記錄自2至12月齡的雌性小鼠；(B)體重?cái)?shù)據(jù)采自6月齡(6-mo)、12月齡(12-mo)和24月齡(24_mo); (C)12月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的體溫沒有顯著性差異，身體核心溫度的測(cè)量所使用的儀器為微電腦體溫計(jì)MODEL 7000H(JENCO ELECTRONICS.LTD)。圖10、中年的(12月齡(12-mo))月齡和性別匹配的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)之間的代謝指數(shù)沒有顯著的差異；(A)食物消耗量；(B)飲水量；(C)產(chǎn)尿量；(D)糞便量。圖ll、Cisd2持續(xù)表達(dá)對(duì)年輕(3月齡，3_mo)和年老小鼠(24月齡，24_mo)水排斥能力和體溫的影響；(A)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)相比同月齡的野生型小鼠(WT)具有更好的水排斥能力，野生型小鼠的毛皮比Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的毛皮保存更多的水，反映自相對(duì)體重的增加；3月齡的小鼠的水排斥能力沒有顯著差異；每組中有4只小鼠(n=4)，*p
<0.05 ； (B)3月齡和24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠在水浸后的體溫沒有顯著差異。圖12、組織病理學(xué)分析表明老年(24月齡，24-mo)的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的皮層厚度沒有顯著差異；(A)3月齡(3-mo)的野生型小鼠的皮膚切片的HE染色的典型顯微照片；(C)3月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚切片的HE染色的典型顯微照片；(B) 24月齡的野生型小鼠的皮膚切片的HE染色的典型顯微照片；(D) 24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚切片的HE染色的典型顯微照片；(E)皮膚厚度的定量分析，包括真皮、月旨肪和肌肉；(E)真皮層厚度的定量分析；(G)皮下脂肪層的厚度定量分析；(H)肌肉層厚度的定量分析；SP0T圖像軟件Advance (DIAGNOSTIC設(shè)備有限公司)用于定量分析；在化)至(H)中，野生型小鼠每組3只，轉(zhuǎn)基因小鼠每組4只，每只小鼠檢查3至9張顯微照片(400倍)。圖13、中年(12月齡)Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)與相同月齡和性別的野生型小鼠(WT)相比具有更高的毛發(fā)再生速率，將12月齡的雄性Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠和相同月齡的雄性野生型小鼠的背部的毛發(fā)去除后在3、6、9、12、15、18和21天后的典型照片。圖14、Cisd2保護(hù)中年(15月齡，15_mo)和老年(24月齡，24_mo)的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌免于老化相關(guān)的退化；(A) (B)分別為3月齡(3-mo)的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的骨骼肌的橫截面的HE染色，在年輕的小鼠身上沒有檢測(cè)到區(qū)別；
(C)(D)分別為15月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌的橫截面的HE染色，箭頭標(biāo)示15月齡的纖維退化區(qū)域，該纖維退化區(qū)域主要出現(xiàn)在野生型小鼠，而沒有出現(xiàn)在Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠；(E) (F)分別為原始放大100倍的24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌的橫截面的HE染色；(G) (H)分別為原始放大400倍的24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌的橫截面的HE染色；星號(hào)標(biāo)示代替肌肉纖維的白色脂肪組織，而在15月齡和24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有檢測(cè)到退化的纖維和白色脂肪組織。圖15、Cisd2保護(hù)Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌的線粒體免于老化相關(guān)的退化；(A-C)原始放大5000倍(A)UOOOO倍(B)和30000倍(C)的24月齡(24_mo)的野生型小鼠(WT)的骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡檢測(cè)，箭頭顯示伴隨退化的線粒體產(chǎn)生的自噬泡；(D-F)原始放大5000倍(D、10000倍(E)和30000倍(F)的24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(Cisd2TG)的骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡檢測(cè)，AL:自噬性溶酶體，M:線粒體，Myf:肌絲。圖16、Cisd2幫助保持老化過程中I型(慢收縮)和II型(快收縮)纖維的分布和比例；(A)月齡性別匹配的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌的I型和II型纖維的免疫熒光染色，老年(24月齡，24-mo)的野生型小鼠(WT)中可觀察到兩型纖維的明顯分組，在年輕(3月齡)的肌肉中可普遍觀察到兩種纖維為群集分布而非隨機(jī)分布；(B) 3月齡和24月齡的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的骨骼肌的I型和II型纖維的定量分析，老年(24月齡)的野生悉尼港小鼠的I型纖維選擇性的增加，II型纖維萎縮；而以8(12轉(zhuǎn)基因小鼠的I型和II型纖維的分布和比例并未隨著月齡的增加而改變，每組中有3只小鼠，每只小鼠檢查3至5張顯微照片，結(jié)果顯示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，*p < 0.05 ；**p < 0.005。
圖17、年輕(3月齡，3-mo)、中年(12月齡，12_mo)和老年(24月齡-mo)的月齡和性別匹配的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的口腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(GTT)沒有顯著差異；(A) 3月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的GTT ； (B) 12月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的GTT ； (C)24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的GTT ;動(dòng)物數(shù)目表示每組的小鼠數(shù)量，每只小鼠進(jìn)行三次獨(dú)立的測(cè)量。圖18、在戶外運(yùn)動(dòng)測(cè)試中，Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)相對(duì)于相同月齡和性別的野生型小鼠(WT)在中年(12月齡，12-mo)和老年(24月齡，24_mo)階段具有更好的運(yùn)動(dòng)機(jī)能；(A)在60分鐘內(nèi)由地板平面上的傳感器環(huán)檢測(cè)的總的移動(dòng)距離；(B)在空房間的中心區(qū)域內(nèi)的移動(dòng)距離；(C)由垂直平面上的傳感器環(huán)檢測(cè)的飼喂頻率表示小鼠的探索活力Zp< 0.05被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是重要的。圖19、在旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)測(cè)試中，Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)相對(duì)于相同月齡和性別的野生型小鼠(WT)在老年(24月齡，24-mo)階段具有更好的運(yùn)動(dòng)機(jī)能；(A) 3月齡(3_mo)和24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)的前3天；(B) 3月齡和24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠分別 進(jìn)行了三種條件的試驗(yàn)(Tl、T2和T3)，*p < 0.05被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是重要的。圖20、月齡性別匹配的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的骨骼肌的D-環(huán)氧化性損傷、核編碼線粒體蛋白和mtDNA拷貝數(shù)的比較；(八)3月齡(3-!110)、15月齡(15-mo)和24月齡(24-mo)的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠之間的D-環(huán)氧化性損傷沒有顯著差異；(B)NDUFA9 (復(fù)合物I的一個(gè)組分)蛋白水平的定量分析，與24月齡的野生型小鼠相比，同月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的NDUFA9有顯著的增長(zhǎng)；(C)SDHB (復(fù)合物II的一個(gè)組分)蛋白水平的定量分析，3月齡、15月齡和24月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠之間沒有顯著差異；(D)UQCRC2 (復(fù)合物III的一個(gè)組分)蛋白水平的定量分析，野生型小鼠的UQCRC2蛋白水平隨月齡增長(zhǎng)而降低，此外，與24月齡的野生型小鼠相比，同月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的UQCRC2有顯著的增長(zhǎng)；(E) ATP5B (復(fù)合物V的一個(gè)組分)蛋白水平的定量分析，與24月齡的野生型小鼠相比，同月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的ATP5B有顯著的增長(zhǎng)；在(13)至(E)中，每組有3只小鼠,通過使用特異性抗體的western blot對(duì)相關(guān)蛋白水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差Zp < 0.05 ；**p < 0.005 ； (F)在24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠中未觀察到老化相關(guān)的mtDNA拷貝數(shù)的擴(kuò)增，24月齡的野生型小鼠的mtDNA拷貝數(shù)顯著增加；這個(gè)現(xiàn)象是由于老化的野生型小鼠的骨骼肌的線粒體損傷誘導(dǎo)mtDNA補(bǔ)償性的擴(kuò)增，D-環(huán)氧化損傷、mtDNA拷貝數(shù)的檢測(cè)和蛋白質(zhì)水平的Western blot分析的具體方法在此描述。圖21、制備自月齡性別匹配的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠的骨骼肌的線粒體呼吸酶復(fù)合物的電子轉(zhuǎn)移活性的比較；(A) NADH脫氫酶活性測(cè)量，代表復(fù)合物I ;
(B)NCCR活性的測(cè)量，代表復(fù)合物I至III ; (C) SCCR活性的測(cè)量，代表復(fù)合物II至III ；(D) CCO活性，代表復(fù)合物IV;在(A)至(D)中，每組的小鼠數(shù)目多于4，呼吸酶活性的測(cè)量的具體方法在此描述，*P < 0.05。圖22、年輕的(3月齡，3-mo)月齡性別匹配的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)的全身能量代謝沒有顯著差異；(A)3月齡的小鼠在光/暗周期(Light cycle, Darkcycle)中的以小時(shí)為單位的全身氧氣消耗量(VO2); (B) 3月齡的小鼠在光/暗周期中的以小時(shí)為單位的全身CO2產(chǎn)生量(VCO2) ; (C) 3月齡的小鼠在光/暗周期中的以小時(shí)為單位的全身產(chǎn)熱量；(D) 3月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠在光周期(Light)和暗周期(Dark)中的全身VO2定量分析；(E)3月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠在光周期和暗周期中的全身VCO2定量分析；(F) 3月齡的野生型小鼠和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠在光周期和暗周期中的全身產(chǎn)熱量定量分析；在(D)至(F)中，計(jì)算定量結(jié)果的數(shù)據(jù)采集自光周期的中間(11:00-13:00)和暗周期的中間(23:0(Tl:00)，以上所有結(jié)果顯示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差Zp
<0.05 ；**ρ < 0.005。圖23、年輕(3月齡，3-mo)和年老(24月齡，24_mo)的野生型小鼠(WT)和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)之間的細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平和去除活性氧(ROS)的酶的mRNA水平?jīng)]有顯著差異；(A)骨骼肌的細(xì)胞內(nèi)GSH水平的定量分析:(B)骨骼肌過氧化氫酶、SODl(CuZn-SOD)和S0D2 (Mn-SOD)的mRNA水平的基于實(shí)時(shí)定量RT-PCR的定量分析，所有結(jié)果顯示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，并指示有每組的實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)目。圖24、兩個(gè)獨(dú)立的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠系(A161和A214)的存活率；A214在A161建立兩年后建立；兩個(gè)小鼠系的背景均為C57BL/6 ;我們已經(jīng)準(zhǔn)備了足夠數(shù)量的雄性和磁性小鼠來復(fù)制A214的抗衰老表型；A214的存活率已經(jīng)記錄了 22個(gè)月(從2011年7月22起算)；(A)A214雄性小鼠的存活率(藍(lán)色方塊)，A214的雄性小鼠的存活率與A161的雄性小鼠的存活率重疊，并在18月齡的時(shí)候與野生型的雄性小鼠分開；(B)在22個(gè)月(22-mo)，只有85%的野生型雄性小鼠存活，而對(duì)于Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠來說，A161雄性小鼠的存活率有93.3%，A214雄性小鼠的存活率為100% ； (C)A214雌性小鼠的存活率(紅色圓)，A214雌性小鼠的存活率與A161雌性小鼠的存活率重疊，冰在20月齡的時(shí)候與野生型的雌性小鼠分開；
(D)在22個(gè)月，只有87.5%的野生型雌性小鼠存活，而對(duì)于Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠來說，A161雌性小鼠和A214雌性小鼠的存活率均為100%。圖25、Cisd2在兩個(gè)獨(dú)立的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(Cisd2 TG)系中保護(hù)骨骼肌免于老化相關(guān)的退化；(A) (B)24月齡(24-mo)的野生型小鼠(WT)的骨骼肌橫截面HE染色，放大倍數(shù)分別為100倍和400倍；(C) (D) 24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A161的骨骼肌橫截面HE染色，放大倍數(shù)分別為100倍和400倍；(E) (F)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A214的骨骼肌橫截面HE染色，放大倍數(shù)分別為100倍和400倍；星型表示替代肌肉纖維的白色脂肪組織，在24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A161和A214中均未觀察到退化的纖維和白色脂肪組織。圖26、Cisd2在兩個(gè)獨(dú)立的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(Cisd2TG)系中保護(hù)骨骼肌的線粒體免于老化相關(guān)的退化；(A) (B) 24月齡的野生型小鼠(WT)的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)透射電鏡檢測(cè)，放大倍數(shù)分別為10000倍和30000倍，箭頭表示伴隨退化的線粒體產(chǎn)生的自噬小體；(C) (D)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A161的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)透射電鏡檢測(cè)，放大倍數(shù)分別為10000倍和30000倍；(E) (F)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A214的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)透射電鏡檢測(cè)，放大倍數(shù)分別為10000倍和30000倍;AL:自噬性溶酶體，M:線粒體，Myf:肌絲。圖27、Cisd2保護(hù)小鼠免于老化相關(guān)的神經(jīng)退化和髓鞘崩解，Cisd2的神經(jīng)保護(hù)作用在兩個(gè)獨(dú)立的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(Cisd2TG)系中(A161和A214)被觀察到；(A) (B) 24月齡的野生型小鼠(WT)的坐骨神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)，其中有明顯的髓鞘崩解和軸突元件退化；
(C)(D) 24月齡的野生型小鼠的視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)，其中也有明顯的髓鞘崩解和軸突元件退化；(E) (F) 24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A161的坐骨神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)；(G) (H) 24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A161的視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)；(I)(J)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A214的坐骨神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)；(K) (L)24月齡的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠A214的視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)。圖28、Cisd2同源序列比對(duì)和進(jìn)化分析；(A) Cisd2同源序列比對(duì),該比對(duì)從哺乳動(dòng)物到昆蟲是在進(jìn)化上保守的，黃色表示所有序列的相同堿基，紫色表示觀察到保守的替換，綠色表示觀察到相似的替換；29個(gè)物種的Cisd2同源序列比對(duì)是通過Vector NTISuite 8的AlignX軟件進(jìn)行的;(B)進(jìn)化分析:UPGMA樹(Mega 5, Tamura等,2011)構(gòu)建自29個(gè)物種的Cisd2氨基酸的多序列比對(duì)(ClustalW)，比例尺顯示10%的序列趨異。本發(fā)明的詳細(xì)說明除非特別說明，所有在這里出現(xiàn)的術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍理解的意思一致。為了便于理解本發(fā)明和便于參考，將多個(gè)使用的術(shù)語和縮略詞定義如下:如本文所用，術(shù)語“治療”慣常的意思是將治療劑給藥或應(yīng)用于治療對(duì)象，或?qū)⑦^程或方式執(zhí)行于治療對(duì)象，以獲得疾病治療有益效果或健康相關(guān)的狀態(tài)。如本文所用，術(shù)語“預(yù)防”、“抑制”、“減低”或這些術(shù)語的變形，包括任何為獲得所希望的結(jié)果的可測(cè)量的減少或完全抑制。例如，可能降低5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或更多，或任何包含在其中的范圍，與正常相比活動(dòng)或癥狀的減少。如本文所用，術(shù)語“給藥”和“輸送”慣常用于描述將本發(fā)明的一化合物施予治療對(duì)象、靶細(xì)胞的過程，或?qū)⒃摶衔锓胖迷诎屑?xì)胞的附近，“給藥”和“輸送”可互相替換。

如本文所用，術(shù)語“患者”、“對(duì)象”和“個(gè)體”可互相替代使用，意思一個(gè)哺乳動(dòng)物(例如人)，對(duì)該哺乳動(dòng)物進(jìn)行給藥和/或從其中提取樣本。如本文所用，術(shù)語“有效的”意思是可以得到一個(gè)期望的、預(yù)期的或想要的結(jié)果。例如，一“有效的量”的意思是一足夠產(chǎn)生治療有益效果的化合物的量。如本文所述，術(shù)語“有療效的”或“在治療上有益的”意思是用藥物治療癥狀使得對(duì)象的舒適度改善或提高。這包括，但不限于疾病癥狀或征兆的嚴(yán)重程度的起始、頻率、持續(xù)或降低。如本文所述，術(shù)語“有療效的劑量”意思是一本文所述的可以取得期望治療反應(yīng)的的化合物的量。如本文所述，術(shù)語“診斷”意思是識(shí)別一病理情況的表現(xiàn)或性質(zhì)。如本文所述，術(shù)語“安全有效劑量”是指在本文中可以產(chǎn)生期望的治療反應(yīng)而沒有毒性、刺激和過敏反應(yīng)等副作用的一成分的量，與一合理的有益效果/風(fēng)險(xiǎn)比例相應(yīng)。特定的安全有效劑量或有治療效果的量將隨著治療的特別條件、患者的身體條件、用于治療的哺乳動(dòng)物的類型、治療的持續(xù)時(shí)間、并行治療的性質(zhì)(如果有的話)和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)或所使用的特定的構(gòu)型等因素而變化。盡管與本發(fā)明描述的方法和化合物相似或等同的方法或化合物可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用或?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行測(cè)試，適當(dāng)?shù)姆椒ê突衔锩枋鋈缦隆Ｌ乇魂P(guān)注的是，對(duì)于相對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例討論的任何限制可適用于本發(fā)明的其他實(shí)施例。此外，本發(fā)明的任何化合物可以用在本發(fā)明的任何方法中，本發(fā)明的任何方法可以產(chǎn)生或利用本發(fā)明的任何化合物。 本發(fā)明并不限于下述詳細(xì)的實(shí)施例。本發(fā)明的目的在于提供新穎的包括Cisd2基因化合物和治療劑及其在治療或/和預(yù)防老化相關(guān)癥狀的應(yīng)用。Cisd2基因編碼一種進(jìn)化上保守的線粒體外膜蛋白。值得注意的是，Cisd2基因位于染色體4q的候選區(qū)域中，一人類長(zhǎng)壽遺傳組件位于該候選區(qū)域中。先前的研究表明Cisd2缺陷縮短小鼠的壽命并導(dǎo)致小鼠的提前老化。此外，老化相關(guān)的Cisd2表達(dá)降低在正常的老化過程中被檢測(cè)到。本發(fā)明首次通過小鼠轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)提供持續(xù)表達(dá)水平的Cisd2，在沒有明顯有害副作用條件下延長(zhǎng)了小鼠的平均和最長(zhǎng)壽命。本發(fā)明還提出Cisd2改善了皮膚、骨骼肌和神經(jīng)的老化相關(guān)的退化。此外，本發(fā)明還提出Cisd2保護(hù)線粒體免于老化相關(guān)的損傷和功能下降并降低了全身能量代謝的老化相關(guān)的下降。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示Cisd2是壽命的一個(gè)基礎(chǔ)的重要的調(diào)節(jié)者，并提供了一個(gè)為人類長(zhǎng)壽探索CISD2候選者的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Cisd2 基因這里所用的 術(shù)語“Cisd2”包括小鼠⑶GSH鐵硫區(qū)域2、人類⑶GSH鐵硫區(qū)域2及包括 Gret, ZCD2、Minerl、Noxp70、AI848638、1500009M05Rik、1500026J14Rik、1500031D15Rik和B630006A20Rik的同源基因。Cisd2編碼一端進(jìn)化上保守的線粒體外膜蛋白，該蛋白位于染色體4q的候選區(qū)域中，而人類長(zhǎng)壽的一個(gè)遺傳組件位于該候選區(qū)域中。本發(fā)明提出在壽命的不同階段保持一個(gè)持續(xù)的Cisd2表達(dá)水平延長(zhǎng)壽命并改善小鼠的老化相關(guān)表型。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因小鼠的功能獲得研究來提出證據(jù)，該研究展示了中年和老年Cisd2蛋白水平的增加能夠延緩衰老并延長(zhǎng)健康的壽命。本發(fā)明得到兩個(gè)獨(dú)立的包含Pol II_Cisd2轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠系A(chǔ)161和A214。本發(fā)明的附圖和表格中所展示的結(jié)果制備于A161。當(dāng)A161開始顯示出老化過程的延緩時(shí)，A214在A161建立兩年后創(chuàng)立。這是為了確定A161中的Cisd2介導(dǎo)的抗老化表型是否能夠在第二獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因小鼠系中重現(xiàn)；因此我們還展示了 A214的表型特征。A214的存活率延續(xù)22個(gè)月并且A214的雄性和雌性的存活曲線開始與野生型小鼠對(duì)照區(qū)分開并顯不出更長(zhǎng)的壽命(圖24).
如實(shí)施例2所展示的，Cisd2基因表達(dá)的提高和持續(xù)延長(zhǎng)了壽命。Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命延長(zhǎng)(I擴(kuò)20%)與MCAT小鼠(17^21%,該小鼠過量表達(dá)人類的以線粒體為靶的過氧化氫酶)相似，但比卡路里攝入限制(3(Γ50%)或侏儒癥(26飛8%)或在其他遺傳模型中觀察到的延遲和減速老化要小(Fontana等,2012 ;Chen等,2010b)。盡管如此，Cisd2的壽命延長(zhǎng)作用沒有伴隨成長(zhǎng)、繁殖、食物攝入和新陳代謝的可見的有害副作用。Cisd2在中年或老年的表達(dá)的延長(zhǎng)看起來沒有明顯的對(duì)整體有害的副作用。關(guān)于哺乳動(dòng)物的壽命延長(zhǎng)，最顯著的延長(zhǎng)報(bào)道于侏儒小鼠。例如，埃姆斯侏儒小鼠的壽命很長(zhǎng)，與它們的野生型對(duì)照相比多活49飛8%并表現(xiàn)出許多延緩衰老相關(guān)的表型特征。盡管如此，這些侏儒小鼠具有生長(zhǎng)激素信號(hào)通路的遺傳缺陷，導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩(侏儒癥)、生育力低下和垂體前葉發(fā)育/功能受損(Bartke和Brown-Borg, 2004)。在繁殖方面，繁殖力與壽命負(fù)相關(guān)。大多數(shù)長(zhǎng)壽的變異小鼠顯示出遲滯的生殖發(fā)育和生殖能力的顯著降低(Chen等，2010b)。除了侏儒小鼠具有嚴(yán)重的生殖力下降以外，與同窩小鼠相比壽命長(zhǎng)19 31%的klotho轉(zhuǎn)基因小鼠也表現(xiàn)出生殖能力的下降(Kurosu等,2005)。與之前的延長(zhǎng)小鼠壽命的發(fā)現(xiàn)相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠強(qiáng)有力的說明Cisd2的持續(xù)表達(dá)能夠延長(zhǎng)健康的壽命并且沒有在發(fā)育和生理功能可檢測(cè)的缺陷。 本發(fā)明因此提供了一種表達(dá)Ci sd2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠是任何非人類的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選小鼠。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可以是其他任何非人類的哺乳動(dòng)物，如大鼠、兔、山羊、豬、狗、奶?；蚍侨祟惖撵`長(zhǎng)目動(dòng)物。可以理解的是，本發(fā)明所公開的表達(dá)Cisd2基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或其他增加或提高Cisd2表達(dá)的變種均適用于本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)基因小鼠。在本發(fā)明的其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種其基因組包含一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)導(dǎo)致小鼠Cisd2的與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比的過量表達(dá)。在本發(fā)明 的其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞包含一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)導(dǎo)致小鼠細(xì)胞CiSd2的與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相比的過量表達(dá)。在本發(fā)明的其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種其基因組包含一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出降低的皮膚退化、降低的骨骼肌退化、降低的神經(jīng)退化、降低的線粒體損傷、增強(qiáng)的新陳代謝和延長(zhǎng)的壽命的特征。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠包含編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因，該轉(zhuǎn)入基因可操作的與一 RNA聚合酶II大亞基(Pol II)啟動(dòng)子相連。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，包括將編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因引入胚胎干細(xì)胞或生殖細(xì)胞的步驟。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的后代，其中，該后代表達(dá)編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因。本發(fā)明再一步提供了一種分離自或來源于本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞，在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種得到自或來源于本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞表達(dá)一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因。該細(xì)胞或細(xì)胞系可以是選自干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞的細(xì)胞。治療應(yīng)用本發(fā)明提供了全壽命的Cisd2表達(dá)水平持續(xù)的維持，當(dāng)通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)后，在基因組DNA保護(hù)小鼠免于老化相關(guān)的線粒體損傷和在超微結(jié)構(gòu)水平降低老化相關(guān)的能量代謝和線粒體氧化磷酸化功能下降。在組織水平，該Cisd2介導(dǎo)的保護(hù)在多種組織上(包括皮膚、肌肉和神經(jīng))減緩老化相關(guān)的表型改變。此外，Cisd2在轉(zhuǎn)基因小鼠中幫助改善胰島素敏感性和保持全身能量代謝。這些變化一起使得小鼠具有與健康壽命的延長(zhǎng)和老化相關(guān)疾病的延遲相關(guān)的長(zhǎng)壽的表型。特別如實(shí)施例3所展示的，Cisd2基因的提高和持續(xù)表達(dá)延緩了皮膚老化，更具體的說，延緩了皮脂腺的老化依賴性的萎縮。Cisd2的表達(dá)還延緩了肌肉的老化，具體來說，就像實(shí)施例4所展示的那樣，延緩老化依賴性的質(zhì)量損失和預(yù)防脂肪滲透。Cisd2的表達(dá)保護(hù)肌肉內(nèi)的線粒體免于老化相關(guān)的退化。實(shí)施例4進(jìn)一步的展示了在持續(xù)Cisd2表達(dá)下胰島素敏感性得到改善。如實(shí)施例5所展示的，Cisd2基因的持續(xù)表達(dá)還延緩了神經(jīng)老化,具體來說，延緩了神經(jīng)的老化相關(guān)的損傷。實(shí)施例6進(jìn)一步展示了 Cisd2基因的持續(xù)表達(dá)保護(hù)線粒體免于老化相關(guān)的損傷，降低了老化相關(guān)的線粒體功能和全身能量代謝的下降。本發(fā)明因此提供了一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其中該治療劑包含一載一 Cisd2基因的運(yùn)載工具。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Cisd2基因選自人Cisd2基因和鼠科動(dòng)物Cisd2基因。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述運(yùn)載工具為一載體、一脂質(zhì)體、一聚合物、一藥學(xué)上可接受的組分、或一能夠促進(jìn)上述運(yùn)載工具的運(yùn)載的裝置。具體來說，所述載體可以為腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒群載體、單純性皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小核糖核酸病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體、甲病毒載體、一助劑依賴的腺病毒或一質(zhì)粒。本發(fā)明所提供的治療劑在治療或/和預(yù)防老化相關(guān)損傷中是有效的。本發(fā)明所述的老化相關(guān)損傷為細(xì)胞損傷、組織損傷、器官功能紊亂、老化相關(guān)的壽命縮短和癌變。本發(fā)明進(jìn)一步提出所述老化相關(guān)的損傷為與皮膚、神經(jīng)、肌肉、胰腺、大腦、腎臟、肺、胃、腸、脾臟、心臟、脂肪組織、睪丸、卵巢、子宮、肝臟和骨相關(guān)的組織損傷，其中皮膚包括真皮層、表皮層、脂肪層、毛囊、毛發(fā)以及皮脂腺。本發(fā)明提出Cisd2基因在通過延緩生理衰退和預(yù)防老化相關(guān)疾病的發(fā)生減慢老化過程的里面扮演重要的角色。這就依次改善了整體的健康并保持老年時(shí)期更好的生活質(zhì)量。激發(fā)Cisd2表達(dá)的能力和/或減輕如肌肉和神經(jīng)退化的老化相關(guān)表型的活動(dòng)引起健康壽命的延長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的治療劑在預(yù)防和/或治療任何組織或器官的老化相關(guān)損傷中是有用的，這些組織或器官包括皮膚、神經(jīng)、肌肉、胰腺、大腦、腎臟、肺、胃、腸、脾臟、心臟、脂肪組織、睪丸、、卵巢、 子宮、肝臟和骨，其中皮膚包括真皮層、表皮層、脂肪層、毛囊、毛發(fā)以及皮脂腺。本發(fā)明還提供了一種包括多核苷酸的表達(dá)框，該表達(dá)框包括一段與一段在宿主細(xì)胞內(nèi)具有功能的啟動(dòng)子可操作的連接的編碼Cisd2多肽的序列。所述Cisd2多肽選在人Cisd2多肽和鼠科動(dòng)物Cisd2多肽。所述啟動(dòng)子為一組織特異性啟動(dòng)子。多個(gè)以病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)被發(fā)展起來用于將基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了一個(gè)對(duì)基因轉(zhuǎn)入系統(tǒng)來說方便的平臺(tái)。選擇的序列能被插入一載體中并利用現(xiàn)有技術(shù)被包裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。該重組的病毒能夠被分離并被轉(zhuǎn)移至體內(nèi)或體外的受體細(xì)胞。多個(gè)腺病毒載體也在此被描述。不行整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒存在于染色體之外，因此最小化了伴隨插入的基因變異的風(fēng)險(xiǎn)。此外，多種腺相關(guān)病毒(AAV)載體系統(tǒng)也為了基因轉(zhuǎn)移而被發(fā)展起來。AAV載體能夠用現(xiàn)有技術(shù)中為人熟知的技術(shù)被輕易的構(gòu)建。分子結(jié)合物載體，如Michael 等在 1993 年的 J.Biol.Chem.雜志 268:6866-6869及Wagner等在1992年的Pr0.Natl.Acad.Sc1.USA雜志89:6099-6103中所描述的腺病毒嵌合載體也可以被用來進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。甲病毒屬的成員，例如但不限于來源于Sindbis、Semliki森林和委內(nèi)瑞拉的馬腦炎病毒載體，也將能夠作為轉(zhuǎn)移本發(fā)明的多核苷酸的病毒載體。
一種基于牛痘的感染/轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能夠方便的被用來在宿主細(xì)胞中提供感興趣的編碼序列的可誘導(dǎo)的、短暫的表達(dá)。在這個(gè)系統(tǒng)中，先在體外用重組有噬菌體T7RNA聚合酶的牛痘病毒感染細(xì)胞。該聚合酶展示出極高的特異性，該聚合酶只轉(zhuǎn)錄具有T7啟動(dòng)子的模板。在接下來的感染過程中，細(xì)胞被由T7啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的目的多核苷酸所轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的來自于牛痘病毒的聚合酶將轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，該RNA隨后被宿主的翻譯機(jī)制翻譯成蛋白質(zhì)。該方法提供高水平、短時(shí)間、在細(xì)胞質(zhì)中大量產(chǎn)生的RNA及其翻譯產(chǎn)物。作為用重組牛痘或禽痘病毒感染，或利用其他病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的可替代的方法，一擴(kuò)增系統(tǒng)能夠被用來在將目的基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)高水平的表達(dá)。特別地，一個(gè)在T7RNA聚合酶的編碼區(qū)域之前的T7RNA聚合酶啟動(dòng)子能夠被設(shè)計(jì)來達(dá)到上述目的。來自該模板的RNA的翻譯將產(chǎn)生T7RNA聚合酶，該聚合酶反過來轉(zhuǎn)錄更多的模板，相應(yīng)的，就會(huì)有一 cDNA的表達(dá)處于T7啟動(dòng)子的控制之下。因此，一些來自擴(kuò)增模板RNA翻譯而來的T7RNA聚合酶將導(dǎo)致目的基因的轉(zhuǎn)錄。由于一些T7RNA聚合酶對(duì)起始擴(kuò)增來說是必需的，T7RNA聚合酶能夠隨著模板被轉(zhuǎn)入細(xì)胞中來起始轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。該聚合酶可以以蛋白質(zhì)或以編碼了 RNA聚合酶的質(zhì)粒的方式被轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。目的基因的合成表達(dá)框也能夠不通過病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)移。例如,合成表達(dá)框能夠被包裹成脂質(zhì)體前體中的DNA或RNA，在被轉(zhuǎn)移至該脂質(zhì)體來源的細(xì)胞或?qū)ο笾?。脂質(zhì)封裝一般通過脂質(zhì)體完成，該脂質(zhì)體能夠穩(wěn)定的結(jié)合或陷入并保存核酸。濃縮DNA和脂質(zhì)制劑的比例能夠改變，但一般為1:1 (mg DNA:mmol脂質(zhì))，或更多的脂質(zhì)。本發(fā)明中所使用的脂質(zhì)體制劑包括陽離子型(帶正電荷)、陰離子型(帶負(fù)電荷)和中性型制劑，其中優(yōu)選陽離子型脂質(zhì)體。陽離子型的脂質(zhì)體已經(jīng)被公開用于介導(dǎo)有功能的質(zhì)粒DNA、mRNA和純化的轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。所述脂質(zhì)體能夠包括多層囊泡(MLVs)、小單層囊泡(SuVs)或大單層囊泡(LUVs)。用現(xiàn)有技術(shù)中的方法即可制備 多種不同的脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。目的基因的合成表達(dá)框還可以是被密封在、被吸收入顆粒載體中或與顆粒載體相關(guān)聯(lián)。顆粒載體的例子包括那些來源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的，還包括來源于多聚(丙交酯)和多聚(丙交酯-乙交酯)的小顆粒，也就是PLG。此外，其他顆粒系統(tǒng)和聚合物能夠被用來對(duì)目的基因進(jìn)行體內(nèi)或體內(nèi)間接轉(zhuǎn)移。例如，像多熔素、多聚精氨酸、多聚鳥氨酸、精胺、亞精胺，以及上述分子的結(jié)合物的聚合物可被用在目的核苷酸的轉(zhuǎn)移中。類似的，DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀或其它像磷酸鍶、包括膨潤(rùn)土和高嶺土的硅酸鋁、三氧化而鉻、硅酸鎂、滑石和類似物的無機(jī)鹽沉淀可用本發(fā)明的方法進(jìn)行應(yīng)用。負(fù)載本發(fā)明的合成表達(dá)框的重組載體為轉(zhuǎn)移進(jìn)對(duì)象而被表達(dá)成合成物。這些合成物要么是預(yù)防性的(用來預(yù)防疾病)，要么是治療性的(用來治療疾病)。該合成物將包括一個(gè)目的基因的在治療上有效的量使得目的基因能夠在給藥對(duì)象的體內(nèi)產(chǎn)生。必要的精確的量將依賴給藥對(duì)象、給藥對(duì)象的年齡和綜合情況、被治療的癥狀的嚴(yán)重程度、所選特定基因及其給藥模式及其他因素而改變；一個(gè)合適的有效的劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來輕易的確定。因此，一個(gè)治療上有效的量能夠落在通過平常的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定的一個(gè)相對(duì)寬的范圍內(nèi)。該合成物通常包括擴(kuò)一個(gè)或多個(gè)“藥學(xué)上可接受的賦形劑或工具”，像水、鹽水、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸和乙醇等。此外，輔助的物質(zhì)，像濕化或乳化劑，pH緩沖物質(zhì)，表面活性劑和類似物，也可以出現(xiàn)在上述工具中。某些免疫原性促進(jìn)劑或核酸攝取和/或表達(dá)促進(jìn)劑也能夠被包含在該合成物中或與丁哌卡因、心臟毒素和蔗糖共給藥，但不限于這些。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防至少一種老化相關(guān)癥狀的方法，該方法包括將一治療上有效劑量的Cisd2基因給藥于需要這種治療的哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Cisd2基因選自人Cisd2基因和鼠科動(dòng)物Cisd2基因。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括一給藥步驟，所述給藥步驟包括使用一運(yùn)載工具。例如，所述運(yùn)載工具為一載體、一脂質(zhì)體、一聚合物、一藥學(xué)上可接受的組分、或一能夠促進(jìn)上述運(yùn)載工具的運(yùn)載的裝置。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體為腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒群載體、單純性皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小核糖核酸病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體、甲病毒載體、一助劑依賴的腺病毒或一質(zhì)粒。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，Cisd2基因的治療上有效的劑量可以通過下述方式來給藥于需要治療的哺乳動(dòng)物，所述給藥步驟為對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行靜脈給藥、皮下給藥、骨髓內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、心臟內(nèi)給藥、大腦內(nèi)給藥、脊柱內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、腸胃外給藥、直腸內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、皮膚內(nèi)給藥、表皮給藥、口服或上述給藥方式的混合。在本 發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，包括給予需要治療的一哺乳動(dòng)物多倍有效劑量的Cisd2基因的量。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，劑量治療可以是一單一的劑量安排或一多重的劑量安排。在本發(fā)明的另一些優(yōu)選實(shí)施方案中，包括將Cisd2基因與其他治療劑聯(lián)合給藥于哺乳動(dòng)物。例如，該哺乳動(dòng)物可以為人。本發(fā)明進(jìn)一步展示了一種篩選能夠調(diào)節(jié)Cisd2表達(dá)的化合物的方法,包括如下步驟:(a)提供一種待測(cè)化合物；(b)將該待測(cè)化合物與權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要去所述的一種轉(zhuǎn)基因小鼠或獲得自或來源于權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞接觸；(C)檢測(cè)該化合物是否能夠調(diào)節(jié)Cisd2的表達(dá)。本發(fā)明還展示了一種識(shí)別調(diào)節(jié)一老化相關(guān)癥狀的一特征的藥劑的方法，該方法包括:(a)提供一種轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組包括一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因，并且與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出如下之一特征:皮膚退化減少、骨骼肌退化減少、神經(jīng)退化減少、線粒體損傷減少、新陳代謝加快和壽命的延長(zhǎng)；(b)評(píng)價(jià)所述轉(zhuǎn)基因小鼠的特征；(C)將(b)中的評(píng)價(jià)特征與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相同特征進(jìn)行比較；(d)給予步驟Ca)的轉(zhuǎn)基因小鼠一待測(cè)藥劑；(e)測(cè)定該待測(cè)藥劑是否調(diào)節(jié)所述一老化相關(guān)癥狀的所述特征。下述具體的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。這些實(shí)施例僅僅用來闡述本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明范圍進(jìn)行任何限定。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建Pol II_Cisd2轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建在本文中描述。特別地，小鼠Cisd2編碼區(qū)域由RNA聚合酶II大亞基啟動(dòng)子(Pol II ；NCBI登記號(hào)M14101堿基1-712)驅(qū)動(dòng)。0.33kb的合成內(nèi)含子和0.28kb的牛生長(zhǎng)激素polyA信號(hào)(PA)來源于pIRES_EGFP質(zhì)粒(CL0NTECH#6064-1)。兩個(gè)雞HS4絕緣子的直接重復(fù)序列(NCBI登記號(hào)U78775堿基10-1199)位于polyA信號(hào)的下游，用以阻斷位置效應(yīng)。Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠是通過對(duì)C57BL/6的受精卵進(jìn)行生殖核顯微注射而得到的。小鼠的基因型通過Tail-DNA確定。小鼠在無病原的設(shè)施中喂養(yǎng)；所用動(dòng)物協(xié)議經(jīng)陽明大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。存在兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因小鼠系，即A161和A214 ;A214于A161建立兩年后建立。Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的兩個(gè)系均為C57BL/6背景。一些在本文中呈現(xiàn)的結(jié)果來自A161，包括附圖和表格。A214的結(jié)果呈現(xiàn)于附圖2Γ27，其目的在于確定由Cisd2介導(dǎo)的抗老化表型的再現(xiàn)性。RNA 分析總RNA 通過 TRIzol 試劑(Life Technology)提取自小鼠組織。Northern blot 雜交像先前描述過的那樣進(jìn)行(Sambrook和Russell, 2001)。我們用Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，同時(shí)使用在Universal ProbeLibrary (Roche應(yīng)用科學(xué))和LightCycler TaqMan Master (Roche應(yīng)用科學(xué))中搜索的TaqMan探針。每個(gè)RNA樣品和每個(gè)引物對(duì)均進(jìn)行三次擴(kuò)增，且所有實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所使用的RNA樣品均來自三只獨(dú)立的小鼠?？偟妮斎氲腸DNA的量通過設(shè)定Hprt為內(nèi)參而被標(biāo)準(zhǔn)化。Western Blotting組織樣本在細(xì)胞裂解緩沖液[20mMTris, pH7.4，150mM NaCl，IOmMEDTA,l%Triton X-1OO和完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche)]中勻漿并在沸水中變性5分鐘。提取的蛋白通過13%的SDS聚丙烯酰胺凝膠分離后，再電轉(zhuǎn)移至Amersham HybondN+膜(GE Healthcare)。電轉(zhuǎn)以后，該膜用5%的脫脂奶粉封閉，加入一抗孵育、水洗并用 VisualizerTM Kit (Upstate 64-201BP)檢測(cè)。下述抗體用于 western blot 分析:TFAM(1:500 ；LifeSpan, LS-C30101) ；NDUFA9(1:1000 ；Molecular Probes, A21344)；SDHB(1:1000 ；Molecu lar Probes, A21345) ；UQCRC2(1:1000 ；Molecular Probes,459220)；ATP5B (1:1000 ；Molecular Probes, A21351) ；Gapdh (1:5000, abeam ab9482)。兔抗小鼠Cisd2多克隆抗體通過以前描述過的方法進(jìn)行制備(Chen等,2009a)。組織病理學(xué)收集不同的小鼠組織，并用10%磷酸福爾馬林固定再包埋入石蠟中。組織切片(3 4μπι)用蘇木精-伊紅(HE)和馬森氏毛狀體染色法依照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行染色(Young和Health,2003)。免疫組織化學(xué)染色(IHC)對(duì)石蠟包埋的骨骼肌切片(3 μ m)進(jìn)行圍脂滴蛋白的染色。肌肉切片充分吸收含有IOmM檸檬酸鈉(pH6.0)的抗原恢復(fù)緩沖液并在微波爐(Sunpentown SM-1220，650W)中加熱兩次，每次10分鐘。然后將切片與抗圍脂滴蛋白的一抗(1:100，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)D418兔多克隆看題)在40°C共孵育18 24小時(shí),再用二抗(invitrogen Flour 570-共軛山羊抗兔抗體)檢測(cè)。通過熒光顯微鏡(OLYPUS BX51)觀察切片;用DP ControllerVer.3.1.1.267軟件捕獲圖片。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染(4’ -6’ -雙脒基-2-苯基吲哚，Sigma)。透射電子顯微鏡(TEM)不同的小鼠組織與pH7.3的磷酸緩沖液混合，該緩沖液中混有1.5%的戊二醛和1.5%的多聚甲醒。之后，再用I%0s04和1.5%六高鐵酸鉀(potassium hexanoferrate)固定，固定后用甲次砷酸鹽和0.2M的馬來酸鈉緩沖液(pH6.0)沖洗，并用1%醋酸鈾酰終止染色。脫水過后，不同的組織用環(huán)氧樹脂包埋并照先前的方法進(jìn)行超薄切片(Kao等，1995)。水排斥實(shí)驗(yàn)將小鼠浸于37°C的水浴中3分鐘，再用紙巾吸掉多余的水分。然后將該小鼠置于室溫中；在水浸5飛O分鐘內(nèi)記錄體重和溫度(Chen等，2002)。用微電腦溫度計(jì)MODEL7000H (JENCO ELECTRONICS LTD)檢測(cè)體溫。肌肉力量用Popular Model數(shù)字測(cè)力計(jì)(DS2，IMADA C0.，LTD)確定前肢的握力。抓握失效點(diǎn)的最大緊握力被記錄為握力。每只小鼠進(jìn)行10次試驗(yàn),每次之間休息15秒(Lichtenwalner等，2006 ;Loy等，2011)。每組中小鼠的數(shù)目多于三只，每只小鼠獨(dú)立進(jìn)行三次測(cè)量?？诜咸烟悄土吭囼?yàn)(GTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)在10個(gè)小時(shí)的禁食后(下午十點(diǎn)至早上八點(diǎn))，用喂養(yǎng)針(Juan等，2004)給小鼠口服葡萄糖溶液(1.5g/g體重)。在指示的時(shí)間點(diǎn)(在喂給葡萄糖之前O分鐘和之后)通過尾部取血提取小鼠血液樣本。用葡萄糖測(cè)試條(LifeScan, Johnson&Johnson)和SureStepTMBrand Meter對(duì)血液中的葡萄糖水平進(jìn)行測(cè)量。用ELISA試劑盒(Mercodia，烏普薩拉，瑞典)對(duì)血清中的胰島素水平進(jìn)行確定。在2小時(shí)的禁食后(下午9點(diǎn)至下午11點(diǎn))進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)，該試驗(yàn)是通過腹腔注射胰島素來進(jìn)行的(0.75單位/kg體重，Novolin人普通胰島素，Novo Nordisk) (Tran等，2008)。每組中有三只小鼠，每只小鼠獨(dú)立進(jìn)行三次測(cè)量。

線粒體DNA (mtDNA)拷貝數(shù)用分離自骨骼肌的全基因組DNA的定量PCR對(duì)相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行確定(Trinei 等，2006 ；Masuyama 等，2005)。將 50ng DNA 通過 LightCycler-FastStar DNAMaster SYBR Green I 試劑盒(Roche Applied Sciences)進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。用特異引物對(duì)NADH脫氫酶亞基I (NDl)基因(核基因編碼，該基因作為計(jì)算參考)進(jìn)行擴(kuò)增。用RelQuant軟件(Roche Applied Sciences)對(duì)相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定。線粒體DNA缺失用分離自肝臟的基因組DNA進(jìn)行用于監(jiān)測(cè)線粒體基因組完整性的mtDNA片段長(zhǎng)距離 PCR (13.6kb) (Santos 等，2006)。長(zhǎng)距離PCR 的引物是:5’-GCCAGCCTGACCCATAGCCATAATAT-3’ 和5’ -ATTAATAAGGCCAGGACCAAACCT-3’。在野生型和Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠之間進(jìn)行13.6kb長(zhǎng)距離PCR和缺失的mtDNA PCR信號(hào)的相對(duì)百分比的對(duì)比。如前所述(Tanhauser和Laipis,1995)，用分離自肝臟的基因組DNA進(jìn)行D-17缺失的PCR監(jiān)測(cè)。D環(huán)氧化性損傷用監(jiān)控8-0HdG的內(nèi)容來確定mtDNA的D環(huán)的氧化性損傷(Lin等，2008)。分離自骨骼肌的基因組DNA用8-羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶(0GG1)處理以去除8_0HdG殘基并在DNA模板中形成apuine位點(diǎn)。mtDNA中8_0HdG的比例越高，OGGl消化后的mtDNA越不完整；這將導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的低產(chǎn)出。每500ngDNA先用或不用I單位hOGGl于37°C處理I小時(shí)，再用D環(huán)特異性引物對(duì)這兩組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。OGGl處理的DNA組相對(duì)于未處理DNA組的擴(kuò)增效率被計(jì)算為mtDNA D環(huán)損傷水平。線粒體耗氧量的測(cè)定如前所述(Chen等，2009a)，從小鼠組織中提取線粒體。用782氧氣測(cè)量?jī)x(Strathkelvin Instrument,蘇格蘭，英國(guó))對(duì)耗氧率進(jìn)行測(cè)定。一份300 μ L包含大約75μ g線粒體的試驗(yàn)緩沖液(125mM蔗糖，65mM KCl, 2mMMgCl2, 20mM Na+，K+-磷酸緩沖液，PH7.2)被送入37°C的氧氣測(cè)量?jī)x的關(guān)閉的腔體內(nèi)，用以測(cè)定線粒體的恒定的耗氧率(Chen等，2008)。為了進(jìn)一步評(píng)估線粒體的呼吸功能，我們順序加入IOmM谷氨酸鹽/蘋果酸鹽(Sigma Aldrich)和ImM ADP，并在每個(gè)階段同時(shí)測(cè)定耗氧率。最后，通過骨骼肌重量對(duì)分離的線粒體的耗氧率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。呼吸酶復(fù)合物活性如前所述，復(fù)合物I的NADH脫氫酶的活性通過隨后鐵氰化鉀的下降來測(cè)定(Lu等，2000)。一份提取自骨骼肌的總蛋白溶解產(chǎn)物與分析混合劑(2mMKCN，0.5mM β-NADH，20mM K2HPO4, pH7.4)共孵育。在混合劑中加入K3Fe (CN) 6后，420nm處的吸收改變被UV/可見光分光光度計(jì)所記錄下來。另一方面，魚藤酮，一種特異性的復(fù)合物I抑制劑，被加入到反應(yīng)中以測(cè)定除了復(fù)合物I以外的NADH脫氫酶活性。通過從總活性中減去該活性，就得到復(fù)合物I的活性。復(fù)合物ι-1n、復(fù)合物I1-1II和復(fù)合物IV的活性分析如前所述的進(jìn)行(Wei等，1998)。NADH細(xì)胞色素c還原酶活性(NCCR，表示復(fù)合物1-1II的活性)和琥珀酸細(xì)胞色素c還原酶(SCCR，表示復(fù)合物I1-1II的活性)通過隨后外源氧化的細(xì)胞色素c的降低而被測(cè)定。一份2(Γ50 μ g的亞線粒體顆粒(SMP)在含有β -NADH或琥珀酸鹽的分析緩沖液(1.5mM KCN, 50mM K2HPO4, pH7.4)中預(yù)先孵育，孵育溫度為37°C，孵育時(shí)間15分鐘。將細(xì)胞色素c加入該混合物中后，550nm處的吸收改變被UV/可見光分光光度計(jì)所記錄下來。細(xì)胞色素c氧化酶(CC0，表示復(fù)合物IV)活性通過隨后外源還原的細(xì)胞色素c的氧化而被確定。一份2(Γ50 μ g的SMP在分析緩沖液(5mM K2HPO4, pH7.4)中預(yù)孵育，孵育溫度為300C，孵育時(shí)間10分鐘。將亞 鐵細(xì)胞色素c加入到分析混合物中后，550nm處的吸收改變被UV/可見光分光光度計(jì)所記錄下來。全身能量代謝全身能量代謝通過間接測(cè)熱法測(cè)定。LabMaster系統(tǒng)的TSE量熱模塊被用來確定小實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的耗氧率(VO2), 二氧化碳產(chǎn)率(VCO2)和能量(熱)消耗。用間接測(cè)熱法對(duì)小鼠進(jìn)行24小時(shí)監(jiān)控(Kuo等，2011)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。兩組之間的比較用學(xué)生試驗(yàn)進(jìn)行。小鼠存活率用Kaplan-Meier方法計(jì)算，小鼠的不同組的存活差異用log-rank (Mental-Cox)試驗(yàn)確定。當(dāng)分析小鼠的不同組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)Zp < 0.05被認(rèn)為是重要的。實(shí)施例2:Cisd2促進(jìn)長(zhǎng)壽為了研究提高的Cisd2表達(dá)是否可延長(zhǎng)壽命，延緩衰老并幫助保持隨老化而喪失的功能性能力，我們以C57BL/6小鼠為背景建立了搭載有由RNA聚合酶II大亞基(Pol II)啟動(dòng)子控制的Cisd2的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠(圖1A)。用Northern blot和RT-PCR進(jìn)行的RNA分析顯示了內(nèi)源的和轉(zhuǎn)入的Cisd2mRNA表達(dá)的一個(gè)相似的模式(圖1B，圖7)。在野生型小鼠中(WT )，Ci sd2的水平在老化過程中呈現(xiàn)隨老化降低的模式(Chen等，201Oa)。在目前的研究中，我們顯示出與年輕小鼠(3月齡)相比，Cisd2蛋白水平在野生型中年小鼠(12月齡)和野生型老年小鼠(24月齡)的骨骼肌中分別降低38%和57%然而，在Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠中，從年輕小鼠(3月齡)通過中年小鼠(12月齡)至老年小鼠(24月齡)的過程中，Cisd2單邊的表達(dá)水平持續(xù)穩(wěn)定(圖1C，圖8)。這顯示在老化過程中，轉(zhuǎn)入的Pol II啟動(dòng)子在驅(qū)動(dòng)Cisd2表達(dá)時(shí)展現(xiàn)出其基本的活性。兩種性別的Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命均得到明顯的延長(zhǎng)，兩性之間不存在任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上重要的性別差異(表I)。在雄性小鼠中(圖1D，表1)，Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命中間值相對(duì)野生型小鼠增加了 5.25個(gè)月(19.4%，從27個(gè)月至32.25個(gè)月，p < 0.001)，同時(shí)最長(zhǎng)壽命(在一群小鼠中，10%的最長(zhǎng)壽命的平均值)增加了 3.66個(gè)月(11.7%，p=0.043)。在雌性小鼠中(圖1E，表l)，Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命中間值相對(duì)野生型小鼠增加了 5.1個(gè)月(18.7%，從27.15個(gè)月至32.25個(gè)月，P < 0.001)，同時(shí)最長(zhǎng)壽命(在一群小鼠中，10%的最長(zhǎng)壽命的平均值)增加了 8.75個(gè)月(29.6%，p=0.032)。表1、Cisd2轉(zhuǎn)基因小鼠的延長(zhǎng)的壽命中間值和最大值
權(quán)利要求
1.一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其特征在于所述治療劑包括一負(fù)載一 Cisd2基因的運(yùn)載工具。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其特征在于:所述Cisd2基因選自人Cisd2基因和鼠科動(dòng)物Cisd2基因。
3.如權(quán)利要求1所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其特征在于:所述運(yùn)載工具為一載體、一脂質(zhì)體、一聚合物、一藥學(xué)上可接受的組分、或一能夠促進(jìn)上述運(yùn)載工具的運(yùn)載的裝置。
4.如權(quán)利要求3所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其特征在于:所述載體為腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒群載體、單純性皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小核糖核酸病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體、甲病毒載體、一助劑依賴的腺病毒或一質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求1所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑在治療老化相關(guān)損傷中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑在預(yù)防老化相關(guān)損傷中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5或6所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其特征在于:所述老化相關(guān)損傷為細(xì)胞損傷、組織損傷、器官功能紊亂、老化相關(guān)的壽命縮短和癌變。
8.如權(quán)利要求5或6所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其特征在于:所述老化相關(guān)的損傷為與皮膚、神經(jīng)、肌肉、胰腺、大腦、腎臟、肺、胃、腸、脾臟、心臟、脂肪組織、睪丸、卵巢、子宮、肝臟和骨相關(guān)的組織損傷，其中皮膚包括表皮層、真皮層、脂肪層、毛囊、毛發(fā)和皮脂腺。
9.如權(quán)利要求1所述的一種用于治療和/或預(yù)防老化相關(guān)損傷的治療劑，其特征在于:所述運(yùn)載工具與另一個(gè)不相關(guān)的治療聯(lián)合。
10.一種包括多核苷酸的表達(dá)框，該表達(dá)框包括一段與一段在宿主細(xì)胞內(nèi)具有功能的啟動(dòng)子可操作的連接的編碼Cisd2多肽的序列。
11.如權(quán)利要求10所述的一種包括多核苷酸的表達(dá)框，其特征在于:所述Cisd2多肽選在人Cisd2多肽和鼠科動(dòng)物Cisd2多肽。
12.如權(quán)利要求10所述的一種包括多核苷酸的表達(dá)框,其特征在于:所述啟動(dòng)子為一組織特異性啟動(dòng)子。
13.一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法包括給予需要這種治療的一哺乳動(dòng)物有療效的Cisd2基因的量。
14.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法:其特征在于:所述Cisd2基因選自人Cisd2基因和鼠科動(dòng)物Cisd2基因。
15.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述給藥步驟包括使用一運(yùn)載工具。
16.如權(quán)利要求15所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述運(yùn)載工具為一載體、一脂質(zhì)體、一聚合物、一藥學(xué)上可接受的組分、或一能夠促進(jìn)上述運(yùn)載工具的運(yùn)載的裝置。
17.如權(quán)利要求16所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述載體為腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒群載體、單純性皰疹病毒載體、SV40載體、多瘤病毒載體、乳頭瘤病毒載體、小核糖核酸病毒載體、牛痘病毒載體、慢病毒載體、甲病毒載體、一助劑依賴的腺病毒或一質(zhì)粒。
18.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述給藥步驟為對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行靜脈給藥、皮下給藥、骨髓內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、心臟內(nèi)給藥、大腦內(nèi)給藥、脊柱內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、腸胃外給藥、直腸內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、皮膚內(nèi)給藥、表皮給藥、口服或上述給藥方式的混合。
19.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述老化相關(guān)癥狀為細(xì)胞損傷、組織損傷、器官功能紊亂、老化相關(guān)的壽命縮短和癌變。
20.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述老化相關(guān)癥 狀為與皮膚、神經(jīng)、肌肉、胰腺、大腦、腎臟、肺、胃、腸、脾臟、心臟、脂肪組織、睪丸、卵巢、子宮、肝臟和骨相關(guān)的組織損傷，其中皮膚包括表皮層、真皮層、脂肪層、毛囊、毛發(fā)和皮脂腺。
21.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述給藥步驟包括給予需要治療的一哺乳動(dòng)物多倍有效劑量的Cisd2基因的量。
22.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述給藥步驟包括將Cisd2基因與其他治療劑聯(lián)合給藥。
23.如權(quán)利要求13所述的一種治療和預(yù)防至少一個(gè)老化相關(guān)癥狀的方法，其特征在于:所述哺乳動(dòng)物為人。
24.一種表達(dá)小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)基因小鼠。
25.—種基因組包括一段編碼一小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于:該轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)導(dǎo)致該種轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的Cisd2相較于非轉(zhuǎn)基因小鼠過量表達(dá)。
26.如權(quán)利要求25所述的一種基因組包括一段編碼一小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于:所述轉(zhuǎn)入基因可操作的與能夠增加小鼠體內(nèi)Cisd2表達(dá)量的啟動(dòng)子相連接。
27.一種體細(xì)胞和生殖細(xì)胞內(nèi)均包含一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于:該轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)導(dǎo)致該種轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的Cisd2相較于非轉(zhuǎn)基因小鼠過量表達(dá)。
28.如權(quán)利要求27所述的一種體細(xì)胞和生殖細(xì)胞內(nèi)均包含一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于:所述轉(zhuǎn)入基因可操作的與能夠增加小鼠體內(nèi)Cisd2表達(dá)量的啟動(dòng)子相連接。
29.—種基因組包含一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于:所述轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出如下之一特征:皮膚退化減少、骨骼肌退化減少、神經(jīng)退化減少、線粒體損傷減少、新陳代謝加快和壽命的延長(zhǎng)。
30.如權(quán)利要求29所述的一種基因組包含一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于:所述轉(zhuǎn)入基因可操作的與能夠增加小鼠體內(nèi)Cisd2表達(dá)量的啟動(dòng)子相連接。
31.一種制備權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，包括將編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因引入一胚胎干細(xì)胞或一生殖細(xì)胞的步驟。
32.—種權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的后代，其特征在于該后代表達(dá)一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因。
33.一種分離自或來源于權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞。
34.一種分離自或來源于權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞，其特征在于:所述細(xì)胞表達(dá)編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因。
35.一種篩選能夠調(diào)節(jié)Cisd2表達(dá)的化合物的方法，其特征在于包括如下步驟: Ca)提供一種待測(cè)化合物； (b)將該待測(cè)化合物與權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要去所述的一種轉(zhuǎn)基因小鼠或獲得自或來源于權(quán)利要求24至30中任一權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞接觸； (c)檢測(cè)該化合物是否能夠調(diào)節(jié)Cisd2的表達(dá)。
36.一種識(shí)別調(diào)節(jié)一老化相關(guān)癥狀的一特征的藥劑的方法，其特征在于包括如下步驟: (a)提供一種轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組包括一編碼小鼠Cisd2的轉(zhuǎn)入基因，并且與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，該轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出如下之一特征:皮膚退化減少、骨骼肌退化減少、神經(jīng)退化減少、線粒體損傷減少 、新陳代謝加快和壽命的延長(zhǎng)； (b)評(píng)價(jià)所述轉(zhuǎn)基因小鼠的特征； (C)將(b)中的評(píng)價(jià)特征與非轉(zhuǎn)基因小鼠的相同特征進(jìn)行比較； (d)給予步驟(a)的轉(zhuǎn)基因小鼠一待測(cè)藥劑； (e)測(cè)定該待測(cè)藥劑是否調(diào)節(jié)所述一老化相關(guān)癥狀的所述特征。
全文摘要
本發(fā)明公開了新穎的組分和治療劑及它們的使用方法。本發(fā)明具體涉及表達(dá)Cisd2基因及增加Cisd2蛋白活性的新穎的組分和治療劑及其在治療和預(yù)防老化相關(guān)癥狀中的使用方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103203027SQ201210433128
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者蔡亭芬, 陳怡帆, 吳家瑜, 王志豪, 蔡世峰 申請(qǐng)人:陽明大學(xué)