專利名稱：北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
目前由于環(huán)境污染的加劇，生活節(jié)奏的加快，生活壓力的增大，癌癥的發(fā)生率處于上升的趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，到2020年前，全球癌癥發(fā)病率將增加50%，而近幾年我國癌癥發(fā)病率則以每年2. 5%的速度增加，所以加快抗癌藥物的研究顯得更為緊迫。
目前臨床上抗腫瘤的藥物主要為化學(xué)合成藥物，雖對腫瘤疾病的治療大有改善， 但這些抗腫瘤治療化學(xué)藥物普遍存在毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性等缺點。與之相比，中藥在臨床上所表現(xiàn)的不良反應(yīng)相對較小，治療費用相對較低，并且能保持用藥的連續(xù)性，在預(yù)防和治療腫瘤方面有較明顯的優(yōu)勢。自20世紀(jì)50年代，逐漸出現(xiàn)中醫(yī)藥防治腫瘤的文獻報道，規(guī)范的藥物實驗研究，中醫(yī)藥開始廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的防治。近年來，國內(nèi)外對來源于天然的抗腫瘤藥物的研究高度重視，對現(xiàn)有的中藥資源進行了體內(nèi)外抗腫瘤篩選試驗研究，實驗結(jié)果顯示，很多中藥具有不同程度的抗腫瘤作用。
專裙子(SemenDescurainiae. Semen Zepit/ii)為十字花科(frwci/krae)兩種基源植物，即獨行菜apetalum和播娘蒿(Pescurainia SophiaL. Vebb ex PrantI)的干燥成熟種子。前者習(xí)稱為北葶藶子，主要分布在我國的東北、河北、山東、山西、四川、內(nèi)蒙古等地；后者習(xí)稱為南葶藶子或華東葶藶子，主要分布在我國的東北、河南、山東、浙江、甘肅、內(nèi)蒙古等地。臨床上主要用于治療痰涎壅肺、喘咳痰多、胸脅脹滿、不得平臥、胸腹水腫、小便不利、肺源性心臟病心力衰竭等(中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.《中國藥典》.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2010.)。
現(xiàn)代藥理研究表明，葶藶子具有止咳平喘、強心、利尿、抗菌、抗癌(國家醫(yī)藥管理中草藥情報中心站·植物藥有效成分手冊:119,411,556-557,962-963,998.)、調(diào)血脂 (劉忠良.藥學(xué)實踐雜志，2000，18 (I) :15-17.)等作用。其中白芥子為止咳有效成分， 芐基芥子油具有廣譜抗菌作用，而其強心、利尿作用主要與其含有的強心苷類毒毛旋花子配基(strophanthidine)、伊夫雙苷(evobioside)、伊夫單苷(evomonoside)、葶藶苷 (helveticoside)及糖芥苷(erysimoside)有關(guān)(陳毓群，李榮 Ε,王云雯.藥學(xué)學(xué)報， 1981，16 (I) :62-64. C. A. :1974 :81,166395.)。葶藶子對人鼻咽癌細胞和千田子宮頸癌細胞株有極強的抑制作用，對艾氏腹水癌小鼠的癌細胞有明顯的抑制作用，且?guī)缀鯚o毒副反應(yīng)(常敏毅.抗癌中藥482-483;湖南科學(xué)技術(shù)出版社.)。孫凱研究發(fā)現(xiàn)毒毛旋花子配基對人體鼻咽癌(9KB)細胞具有明顯的抑制作用，ED5tl < I μ g/ml (孫凱.南葶藶子的化學(xué)成分研究[D].沈陽藥科大學(xué)，2005)。中國專利200810226062. 9《葶藶子提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用》涉及了葶藶子提取物的提 取溶劑及功效但未涉及葶藶子抗腫瘤作用具體有效部位及詳細品名
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是，提供北葶藶子(炒)抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法。本發(fā)明的目的之二是，提供所說有效組分提取物在制備抗腫瘤及相關(guān)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物，它是由炒制的北葶藶子粉碎后，用水于90-100°C加熱提取，提取液濃縮，醇沉，離心除去沉淀，減壓濃縮除去乙醇，用乙酸乙酯及水飽和正丁醇依次萃取，收集水飽和正丁醇部位，過硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)進行梯度洗脫，收集二氯甲烷與甲醇體積比為5:1的洗脫液，蒸去溶劑得到的北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物。 一種制備上述北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物的方法，它包括如下步驟
步驟1.將炒制的北葶藶子粉碎，用水回流提取，冷卻，離心，濃縮提取液，用95%乙醇進行醇沉，離心除去沉淀，濃縮除去乙醇，得提取液；
步驟2.將步驟I所得的提取液依次用乙酸乙酯、水飽和的正丁醇溶液進行萃取，收集水飽和正丁醇萃取液，用硅膠柱進行層析，洗脫劑為不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷與甲醇體積比為5:1比例的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收有機溶劑后，即得北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物。本發(fā)明進一步提供了北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。以抑制U251、HepG2, SGC、mcf-7、SCLC增殖能力為活性指標(biāo)進行抗腫瘤活性實驗。實驗結(jié)果表明，在體外細胞毒實驗中，可以明顯抑制U251、HepG2、SGC、mcf-7、SCLC的增殖，具有細胞毒作用，可用于制備抗腫瘤治療藥物。有益效果1、本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于采用溶劑提取、萃取等常規(guī)方法，從北葶藶子中提取得到了新的具有抗腫瘤作用的有效部位，該有效部位經(jīng)實驗證明具有體外抑制U251、HepG2,SGC、mcf-7、SCLC生長的活性。2、本發(fā)明拓展了抗腫瘤藥物的原料來源，擴大了北葶藶子的用途，使北葶藶子發(fā)展成為抗腫瘤藥物的新原料，可顯著提高葶藶子的附加值。
具體實施例方式以下所列實施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1.北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物的制備
將中藥材北葶藶子(炒)粉碎，用10倍質(zhì)量的水回流提取3h，離心后的殘渣重復(fù)提取I次，離心，合并所有水提取液，濃縮提取液至原藥材質(zhì)量數(shù)(克)的80%的體積(ml )，加95%乙醇進行醇沉，藥液中乙醇的濃度約為609Γ70%，靜置過夜，離心，棄去沉淀，減壓回收乙醇，加等體積的乙酸乙酯萃取至有機相接近無色，剩下的水液用水飽和的正丁醇萃取6次，回收正丁醇，得水飽和正丁醇提取物。取適量水飽和正丁醇提取物過硅膠柱，以不同體積比例的二氯甲烷-甲醇(100:0，50:1，20:1，10:1，5:1，1:1及0:100)進行梯度洗脫，每個梯度所用洗脫液體積為4倍柱體積，收集體積比為5:1的二氯甲烷-甲醇洗脫液，濃縮，真空干燥，即得北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物。
取北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物進行高效液相色譜分析。具體條件為色譜柱為島津shimpack C18柱(4. 6X 150mm),流速為1. Oml/min。梯度洗脫A相0. 01%甲酸-水；B相甲醇，洗脫程序為O. Omin 45. OOmin B 2% 50%。北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物在此色譜條件下，主要出現(xiàn)5個保留峰，保留時間分別為t1=2. 8min, t2=9. 6min, ts=30. 4min, t4=39. 6min, t3=41. 2min。
實施例2.北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物的制備將北葶藶子(炒)粉碎，用8倍質(zhì)量的水回流提取2h，離心后的殘渣重復(fù)提取2次，離心，合并所有水提取液，濃縮提取液至原藥材質(zhì)量數(shù)(克)的體積(ml)，加95%乙醇進行醇沉，藥液中乙醇的濃度約為60%，靜置過夜，離心，棄去沉淀，減壓回收乙醇，加等體積的乙酸乙酯萃取至有機相接近無色，剩下的水液用正丁醇萃取至有機相接近無色，收集正丁醇萃取部分。取適量正丁醇提取物過硅膠柱，以不同比例的二氯甲烷-甲醇(20:1，10:1，5:1， I I)進行梯度洗脫，每個梯度所用洗脫液體積為4倍柱體積，收集5:1的洗脫液，濃縮，真空干燥，即得北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物。
取北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物進行高效液相色譜分析，色譜條件同實施例1。 結(jié)果表明，北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物在高效液相色譜上的保留情況與實施例1的一致。
實施例3.北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物的制備將北葶藶子(炒)粉碎，用8倍質(zhì)量的水回流提取2h，離心后的殘渣重復(fù)提取2次，離心，合并所有水提取液，濃縮提取液至原藥材質(zhì)量數(shù)(克)的體積(ml)，加95%乙醇進行醇沉，藥液中乙醇的濃度約為60%，靜置過夜，離心，棄去沉淀，減壓回收乙醇，加等體積的乙酸乙酯萃取至有機相接近無色，剩下的水液用正丁醇萃取至有機相接近無色，收集正丁醇萃取部分。取適量正丁醇提取物過硅膠柱，以不同比例的二氯甲烷-甲醇(100:0，10:1，5:1， I I)進行梯度洗脫，每個梯度所用洗脫液體積為4倍柱體積，收集5:1的洗脫液，濃縮，真空干燥，即得北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物。
取北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物進行高效液相色譜分析，色譜條件同實施例1。 結(jié)果表明，北葶藶子抗腫瘤有 效組分提取物在高效液相色譜上的保留情況與實施例1的一致。
實施例4.抗腫瘤活性實驗以實施例1得到的北葶藶子有效部位為受試藥物，體外培養(yǎng)U251、HepG2, SGC、mcf-7、 SCLC，取指數(shù)生長期的細胞，用胰酶消化后，1500r . mirT1離心5min，將細胞重懸于培養(yǎng)基中，細胞濃度調(diào)至2X IO4個/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ 1，放置細胞培養(yǎng)箱 (37°C，5%C02)中培養(yǎng)24h，之后加入受試藥物20 μ 1，陰性對照組加入終濃度為O. 5%DMS0， 各組均設(shè)3個復(fù)孔。在加藥48h后，每孔加入5mg . Hir1MTT試劑20 μ 1，繼續(xù)置于37°C培養(yǎng)4h。每孔加入DMSOlOOy 1，振蕩混勻，測定各孔在波長570nm處的吸光度值。計算細胞增殖抑制率抑制率(％) = (1-實驗組吸光度/對照組吸光度)X 100%。
表I北葶藶子提取物對U251的抑制作用
權(quán)利要求
1.北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物，其特征是它是由炒制的北葶藶子粉碎后，用水于90-100°C加熱提取，提取液濃縮，醇沉，離心除去沉淀，減壓濃縮除去乙醇，用乙酸乙酯及水飽和正丁醇依次萃取，收集水飽和正丁醇部位，過硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)進行梯度洗脫，收集二氯甲烷與甲醇體積比為5:1的洗脫液，蒸去溶劑，即得北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物。
2.一種制備上述北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物的方法，其特征是它包括如下步驟 步驟1.將炒制的北葶藶子粉碎，用水回流提取，冷卻，離心，濃縮提取液，用95%乙醇進行醇沉，離心除去沉淀，濃縮除去乙醇，得提取液； 步驟2.將步驟I所得的提取液依次用乙酸乙酯、水飽和的正丁醇溶液進行萃取，收集水飽和正丁醇萃取液，用硅膠柱進行層析，洗脫劑為不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷與甲醇體積比為5 I比例的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收有機溶劑后，即得北葶藶子抗腫瘤有效部位提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北葶藶子抗腫瘤有效組分提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤藥物為抗U251，HepG2,SGC、mcf-7或SCLC腫瘤細胞的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了北葶藶子提取物抗腫瘤有效組分及其制備方法和抗腫瘤方面的應(yīng)用，北葶藶子(炒)通過水提取，依次用乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，收集水飽和的正丁醇萃取物，用硅膠(200-300目)柱進行分離，以不同比例的二氯甲烷-甲醇進行梯度洗脫，其二氯甲烷-甲醇(5:1)洗脫部位為北葶藶子抗腫瘤有效部分。該部位具有明顯的抑制U251(膠質(zhì)瘤細胞)、HepG2(人肝癌細胞)、SGC(人胃癌細胞)、mcf-7(人乳腺癌細胞)、SCLC(肺癌細胞)的作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61P35/00GK103006741SQ20121046713
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者余江南, 奚超群, 徐希明, 童姍姍, 易承學(xué), 曹霞 申請人:江蘇大學(xué)