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利用釀酒酵母穩(wěn)定表達(dá)重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素(1-34)<sub>ab</sub>二聯(lián)體融合蛋白的制作方法

文檔序號(hào):920274閱讀:465來源:國(guó)知局
專利名稱:利用釀酒酵母穩(wěn)定表達(dá)重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素(1-34)<sub>ab</sub>二聯(lián)體融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域,是包括用DNA重組技術(shù)合成人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素基因、含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主、制備融合蛋白的方法。
背景技術(shù)
甲狀旁腺激素(human Parathyroid Hormone, hPTH)是由人甲狀旁腺主細(xì)胞合成和分泌的一種單鏈多肽激素,成熟hPTH含84個(gè)氨基酸殘基,分子量約為9.5kD,是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨轉(zhuǎn)換的最為重要的激素之一。小劑量、間歇性應(yīng)用hPTH對(duì)骨質(zhì)疏松癥有一定的治療效果。作為一種蛋白類藥物,分子量若小于20kD在代謝過程中就易被腎小球?yàn)V過,導(dǎo)致體內(nèi)半衰期較短,為了達(dá)到治療效果,一般需要頻繁或大劑量用藥,給患者帶來極大的不便。因此長(zhǎng)效蛋白藥物的開發(fā)已成為對(duì)第一代基因工程產(chǎn)品進(jìn)行二次開發(fā)的一個(gè)重要方向,而增加其分子量則是一個(gè)通用的策略。由于人血清白蛋白(HSA)是一個(gè)穩(wěn)定的“惰性”蛋白,同時(shí)也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體,藥物與其融合后,可以減緩自身的生物利用速度,延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期達(dá)19d之久。陳靜等在畢赤酵母中表達(dá)HSA-hPTH(l-34)融合蛋白,檢測(cè)到HSA-hPTH(l_34)具有生物活性,表達(dá)量可達(dá)400 mg/L,分子量約為70kD,與理論值相似。此項(xiàng)研究雖然成功的表達(dá)了具有生物學(xué)活性的融合蛋白HSA-hPTH(l-34),但是融合蛋白在畢赤酵母中表達(dá)后,其N端的PTH肽中氨基酸會(huì)被隨機(jī)偶然修飾,影響了融合蛋白的質(zhì)量,從而影響融合蛋白的實(shí)際應(yīng)用,本發(fā)明利用釀酒酵母穩(wěn)定完整的表達(dá)具有生物活性的融合蛋白HSA-hPTH(l-34)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是使融合蛋白能較完整的表達(dá),提出一種構(gòu)建重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白釀酒酵母基因工程菌的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案(以pYX212釀酒酵母表達(dá)載體為例描述)1.重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白基因在大腸桿菌中的構(gòu)建及克隆:a.重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白基因的構(gòu)建:利用引物設(shè)計(jì)軟件,根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)并合成a -PTH (1-34) ab_HSA引物,上游引物:ACCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATT ;下游引物:ATCGTCGACTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG,實(shí)線處分別是BamH I和Sal I酶切位點(diǎn),通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成a-PTH(l_34)ab-HSA基因。b.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成a-PTH(l-34)ab_HSA基因,經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切后與經(jīng)過相同酶切的PYX212大片斷連接,將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliJM109進(jìn)行ρΥΧ-α-PTH(1-34) ab-HSA 的克隆。2.將重組質(zhì)粒pYX-a-PTH(l-34)ab-HSA轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中表達(dá),并進(jìn)行鑒定。本發(fā)明采用大腸桿菌-釀酒酵母穿梭表達(dá)質(zhì)粒PYX212,a Factor為分泌信號(hào)肽,在釀酒酵母中穩(wěn)定完整的表達(dá)融合蛋白。所表達(dá)的融合蛋白PTH(l-34)ab-HAS檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)N端的PTH肽中氨基酸被隨機(jī)偶然修飾的現(xiàn)象。


圖1為pYX212-a -PTH(1-34)ab_HSA重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖2為a -PTH(1-34) ab-HSA克隆至pYX212酶切驗(yàn)證圖譜其中,1:重組質(zhì)粒 pYX212-a-PTH(l-34)ab_HSA 雙酶切 BamH I/Sal I ;2:pYX212雙酶切 BamH I/Sal I ;Μ: λ -Hind III Marker/bp圖3為釀酒酵母重組菌菌落PCR的驗(yàn)證圖其中,M: λ-Hind III Marker/bp ; 1,2,3: a-PTH(1_34) ab_HSAPCR擴(kuò)增圖譜;4:空白質(zhì)粒pYX212菌株a -PTH(l-34)ab-HSAPCR擴(kuò)增圖譜圖4為重組釀酒酵母表達(dá)胞外蛋白驗(yàn)證圖其中,M:Marker/KDa ;1,2:重組菌胞外蛋白;3:空白質(zhì)粒酵母對(duì)照
具體實(shí)施例方式本發(fā)明選用了 a Factor信號(hào)肽,以使目標(biāo)蛋白在胞外高效表達(dá),下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的說明。通過下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征做詳細(xì)的描述,但不限制本發(fā)明。實(shí)例I生產(chǎn)融合蛋白人血清白蛋白和人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建材料與來源:菌株與質(zhì)粒:釀酒酵母W303-1A(Saccharomyces cerevisiae W303, Ieu2_3ura3_ltrpl-1 his3-ll ade2_l canl-100)由本實(shí)驗(yàn)室保藏;大腸桿菌(E.coli JM109)由本研究中心保藏;表達(dá)載體PYX212、重組大腸桿菌JM109/pMD-a -PTH(1-34) ab-HSA由本實(shí)驗(yàn)室保藏;a -Factor信號(hào)肽來自pPIC α 9Κ。酶及試劑盒:質(zhì)粒小量提取試劑盒,膠回收試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司);限制性內(nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、T4連接酶其它試劑:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)(寶生物工程有限公司);抗生素(生工生物工程上海有限公司)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺(上海朝瑞生物技術(shù)有限公司)。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR引物:由生工生物工程上海有限公司合成a -PTH(1-34)ab-HSA 上游引物:ACCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATT(實(shí)線處為 BamHI酶切位點(diǎn))a -PTH(1-34) ab_HSA 下游引物:ATCGTCGACTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG,實(shí)線處為 SalI酶切位點(diǎn))
實(shí)驗(yàn)方法:
重組表達(dá)質(zhì)粒ρΥΧ212- a -PTH(1-34) ab_HSA的構(gòu)建過程如圖1所示。以pMD-α -PTH(1-34)ab_HSA 質(zhì)粒為模板,以 a -PTH(1-34)ab_HSA 上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得a -PTH(1-34) ab_HSA抗性基因,分別取pMD- a -PTH(1-34) ab_HSA質(zhì)粒2 μ L,上游引物下游引物各0.5 μ L,再加入10 X PCR緩沖液5 μ L,IOmmoI/L dNTPMIX4 μ L,Taq酶0.5 μ L,補(bǔ)充水至50 μ L15PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s,56°C退火30s,72°C延伸2min,共30個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin。通過I %瓊脂糖凝膠電泳分析得到預(yù)期為2.3kb的條帶,用BamHI/Sal I雙酶切,I %瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的片段,并與同樣用BamH I/Sal I雙酶切得到的pYX212大片段用Τ4連接酶連接。取連接液轉(zhuǎn)化至Ε.Coli JM109中,用BamH I/Sal I雙酶切雙酶切陽(yáng)性克隆,經(jīng)測(cè)定,酶切產(chǎn)物約2300,與目標(biāo)基因大小基本一致,質(zhì)粒中插入的a-PTH(1-34) ab-HSA基因測(cè)序正確(圖2)實(shí)施例2.重組表達(dá)質(zhì)粒ρΥΧ212- a -PTH (1-34) ab_HSA轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303-1A取釀酒酵母菌W303-1A在YETO培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到1.3 1.5,離心收集細(xì)胞(3000r/min, 5min, 4°C ),用 25mL 無菌 H2O 洗漆細(xì)胞(4°C, 3000r/min 離心 5min),棄上清;力口 ImL 0.lmol/L LiAC于細(xì)胞中,轉(zhuǎn)移細(xì)胞混懸液至1.5mLEppendorf離心管中,離心5s,棄上清;加0.5mL 0.lmol/L LiAC,輕輕混勻細(xì)胞,各取50 μ L混懸液于標(biāo)記的離心管中;按照Gietz的LiAC/SS-DNA/PEG轉(zhuǎn)化DNA方法,將50 μ L酵母感受態(tài)細(xì)胞混懸液6000 8000r/min 離心 5s,棄上清;小心依次加入:240μ L50% PEG4000, 36 μ Llmol/L LiAC,25y L2g/LSS-DNA (煮沸5min后快速冷卻),0.1 10 μ g質(zhì)粒DNA (重組質(zhì)粒/對(duì)照質(zhì)粒)加H2O稀釋至50 μ L ;劇烈震蕩每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)管lmin,30°C保溫30min,42°C熱休克20min,6000 8000r/min離心15s,吸去上清;加500 μ L無菌H2O,輕輕混懸細(xì)胞,取200 μ L,涂SC平板,300C,培養(yǎng)2 4天,至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。用無菌接種針從SC平板上挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落少許,懸浮于含18 μ L無菌H2O的0.5mL Eppendorf離心管中,然后分別加入10mmol/LdNTP2 μ L,10XBuffor2.5μ L, 10 μ mol/L上下游引物各I μ L,TaqDNA聚合酶0.5 μ L,進(jìn)行菌落PCR快速鑒定(圖3)。`實(shí)施例3融合蛋白PTH (1-34) ab_HSA的表達(dá)與鑒定將驗(yàn)證后的轉(zhuǎn)化子接種到新鮮的SC培養(yǎng)基,30°C培養(yǎng)約18h,離心收集細(xì)胞,轉(zhuǎn)接到新鮮的YEro培養(yǎng)基中,30°C培養(yǎng)約24h,離心收集上清,用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白。融合蛋白PTH (1-34) ab_HSA進(jìn)行Western Blotting鑒定,與PTH多抗和HSA多抗都能發(fā)生特異性交叉反應(yīng)的條帶,表明表達(dá)的融合蛋白同時(shí)具有PTH和HSA的抗原性,為PTH和HSA的融合體,并能夠檢測(cè)到生物活性,說明融合蛋白hPTH(1-34) ab_HSA在釀酒酵母中得到成功表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種利用釀酒酵母穩(wěn)定表達(dá)重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白(PTH(1-34)ab-HAS,以下簡(jiǎn)稱融合蛋白)的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白基因首先在大腸桿菌中克隆,其特征在于,將所述的重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白基因克隆至釀酒酵母表達(dá)載體,得到包含PTH (1-34) ab-HAS基因的重組質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá),其特征在于表達(dá)權(quán)利要求I融合蛋白的宿主是釀酒酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白屬于分泌蛋白,其特征在于利用aFactor分泌表達(dá)到細(xì)胞外。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá),其特征在于N端的PTH肽中氨基酸不會(huì)被隨機(jī)偶然修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素二聯(lián)體融合蛋白,主要用于治療 骨質(zhì)疏松癥和甲狀旁腺激素不足癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用釀酒酵母穩(wěn)定、完整表達(dá)重組人血清白蛋白-人甲狀旁腺激素(1-34)ab二聯(lián)體融合蛋白的方法,屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明以大腸桿菌-釀酒酵母穿梭表達(dá)質(zhì)粒(附加型)作為表達(dá)載體,在釀酒酵母中分泌表達(dá)PTH(1-34)ab-HSA融合蛋白,提高了融合蛋白的穩(wěn)定性及生物活性,確保其實(shí)際應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P5/18GK103173477SQ20121047907
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者諸葛斌, 劉青霞, 方慧英, 諸葛健, 宗紅, 金堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)
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