專利名稱：過(guò)山蕨總黃酮在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于過(guò)山蕨總黃酮應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及過(guò)山蕨總黃酮作為賴氨酸氧化酶抑制劑，在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用，如預(yù)防化學(xué)致癌(如肺癌、乳腺癌和紫外線引起的皮膚癌等)，阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤化療效果等。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種嚴(yán)重危害人體健康的重大疾病，雖然傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、化療和放療對(duì)早期腫瘤控制有了很大提高，但由于腫瘤早期癥狀的隱蔽性，多數(shù)惡性腫瘤一發(fā)現(xiàn)即處于中晚期，加上目前腫瘤發(fā)生的病因不完全清楚，進(jìn)一步探索腫瘤發(fā)生的原因和發(fā)現(xiàn)新的治療藥物仍是腫瘤研究的重要任務(wù)。低氧是實(shí)體腫瘤的一個(gè)典型特征，利用這個(gè)現(xiàn)象創(chuàng)造的2-(18F)-D-脫氧葡萄糖-正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)(FDG-PET)已廣泛用于腫瘤影像·學(xué)診斷，其在鑒別腫塊良、惡性及評(píng)價(jià)其惡性程度、判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、輔助臨床分期和評(píng)估治療療效及預(yù)后等方面均發(fā)揮著重大作用。低氧微環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡和基因異質(zhì)性，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移均有促進(jìn)作用，也降低腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，是制約腫瘤患者治療效果的主要障礙之一，靶向低氧微環(huán)境已經(jīng)成為發(fā)展腫瘤治療新方法的重要措施。賴氨酸氧化酶是一種以銅離子為輔酶、催化細(xì)胞外環(huán)境中膠原和彈性蛋白共價(jià)交聯(lián)的氨基氧化酶，決定著細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織的機(jī)械性能，也是腫瘤低氧微環(huán)境主要的調(diào)控因子-低氧誘導(dǎo)因子的執(zhí)行者，在多種腫瘤中都有明顯上調(diào)，對(duì)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，是目前腫瘤治療潛在的重要靶點(diǎn)之一。過(guò)山蕨，又名馬蹬草、還陽(yáng)草、過(guò)橋草，為鐵角蕨科植物過(guò)山蕨(Camptosorus sibiricus Rupr.)的地上全草,主產(chǎn)于東北、華北、西北、內(nèi)蒙古等地，歷代本草未見(jiàn)有關(guān)其藥用記載，民間用于治療外傷出血、子宮出血、血栓閉塞性脈管炎、神經(jīng)性皮炎、腦栓塞引起的偏癱以及糖尿病并發(fā)癥等?，F(xiàn)代藥理研究表明過(guò)山蕨水醇提取液對(duì)兔耳血管、蟾蜍后肢血管以及家兔肢體后肢血管有擴(kuò)張作用，其有效部位為黃酮和有機(jī)酸。本申請(qǐng)首次發(fā)現(xiàn)過(guò)山蕨總黃酮是一個(gè)賴氨酸氧化酶抑制劑，具有很好的預(yù)防和治療腫瘤作用，進(jìn)而對(duì)其在腫瘤中潛在的臨床應(yīng)用進(jìn)行了深入的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供過(guò)山蕨總黃酮作為賴氨酸氧化酶抑制劑，在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
過(guò)山蕨總黃酮作為賴氨酸氧化酶抑制劑，在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用進(jìn)一步的，過(guò)山蕨總黃酮在制備抗癌藥物方面的應(yīng)用，尤其是過(guò)山蕨總黃酮在制備抗皮膚癌、肺癌和乳腺癌藥物方面的應(yīng)用。過(guò)山蕨總黃酮作為一個(gè)賴氨酸氧化酶抑制劑，可以在腫瘤預(yù)防和治療方面有廣泛作用，包括腫瘤預(yù)防、治療、輔助化療及術(shù)后應(yīng)用。其動(dòng)物有效劑量范圍為口服IO-IOOOmg/kg體重/日、注射5-500mg / kg體重/日，優(yōu)選劑量為口服50-500mg /kg體重/日、注射20-200mg /kg體重/日。推算的人用有效劑量范圍為口服80-8000mg /日、注射50_5000mg/日，優(yōu)選劑量為口服O. 5-5g/日、注射O. 2-2g/日。所述過(guò)山蕨總黃酮可按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)進(jìn)行提取即可。如，在本發(fā)明中，過(guò)山蕨總黃酮可按下述方法獲取將洗凈、烘干、粉碎過(guò)的過(guò)山蕨地上全草經(jīng)石油醚脫脂后，用體積濃度50 — 60%的乙醇水溶液按液料比25 — 35 I于85±5°C提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并提取液并濃縮至每ml相當(dāng)于O. Ig原藥材，分別用95%乙醇(指體積濃度，下同)、70%乙醇各醇沉I次，過(guò)濾，濾液再經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂吸附、60%乙醇洗脫，洗脫液真空干燥后即得。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)分光光度測(cè)定總黃酮含量>90%。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)山蕨總黃酮能抑制誘癌組織和腫瘤組織賴氨酸氧化酶，其作為賴氨酸氧化酶抑制劑可用于預(yù)防和治療多種腫瘤，并有化療增效作用。過(guò)山蕨總黃酮對(duì)UVB引起的小鼠皮膚癌、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚癌及烏拉坦引起的小鼠肺癌均有顯著降低發(fā)病率作用(見(jiàn)圖I、圖2);對(duì)小鼠lewis肺癌皮下腫瘤及小鼠4T1乳腺癌 原位腫瘤均有明顯抑制生長(zhǎng)和阻止自發(fā)轉(zhuǎn)移及人工被動(dòng)轉(zhuǎn)移作用(見(jiàn)圖3、圖4、圖5)，能抑制誘癌組織和腫瘤組織賴氨酸氧化酶(見(jiàn)圖6)。過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌和小鼠4T1乳腺癌人工被動(dòng)轉(zhuǎn)移均有顯著抑制作用(見(jiàn)圖7)。過(guò)山蕨總黃酮對(duì)阿霉素、環(huán)磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤均有增效作用(見(jiàn)圖8、圖9)、可以阻止小鼠4T1乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)(見(jiàn)圖10、圖11)。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明內(nèi)容可概括以下幾個(gè)方面①過(guò)山蕨總黃酮對(duì)誘癌組織和瘤組織賴氨酸氧化酶有抑制作用，是一個(gè)較好的賴氨酸氧化酶抑制劑。②過(guò)山蕨總黃酮對(duì)UVB引起的小鼠皮膚癌、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚癌及烏拉坦引起的小鼠肺癌均有抑制作用，可以預(yù)防腫瘤發(fā)生。③過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌皮下腫瘤及小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤生長(zhǎng)和2種腫瘤自發(fā)肺轉(zhuǎn)移均有阻止作用，可以抑制腫瘤生長(zhǎng)和自發(fā)轉(zhuǎn)移。④過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌和小鼠4T1乳腺癌人工被動(dòng)轉(zhuǎn)移也有抑制作用，可以阻止腫瘤被動(dòng)轉(zhuǎn)移。⑤過(guò)山蕨總黃酮對(duì)阿霉素、環(huán)磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤均有協(xié)同生長(zhǎng)抑制作用，可以提高腫瘤化療效果。⑥過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠4T1乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)有阻止作用，可以預(yù)防腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)。


圖I代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)UVB引起的小鼠皮膚癌、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚癌及烏拉坦引起的小鼠肺癌發(fā)病率的影響；
圖2代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)UVB引起的小鼠皮膚腫瘤數(shù)、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮膚腫瘤數(shù)及烏拉坦引起的小鼠肺癌結(jié)節(jié)數(shù)的影響(n=20);注與模型組比較1ZXO. 05，2ZXO. 01 ；
圖3代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響(n=10);注與模型組比較 2ZXO. 01 ；
圖4代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤生長(zhǎng)的影響(n=10);注與模型組比較 2ZXO. 01 ；
圖5代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌皮下腫瘤及小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤大小及肺轉(zhuǎn)移的影響(n=10);注與模型組比較2ZXO-Ol ；
圖6代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)誘癌組織和腫瘤組織賴氨酸氧化酶的影響(n=3);注與模型組比較2ZXO. 01 ；
圖7代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌和小鼠4T1乳腺癌人工被動(dòng)轉(zhuǎn)移的影響(n=10);注與模型組比較2/X0. 01 ； 圖8代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)阿霉素、環(huán)磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響(n=10);注與模型組比較2ZXO-Ol ；
圖9代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)阿霉素、環(huán)磷腺癌、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤大小及肺轉(zhuǎn)移的影響(n=10);注與模型組比較2/X0. 01 ；
圖10代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠4T1乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的影響(n=20);注與模型組比較2ZXO. 01 ；
圖11代表過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠4T1乳腺癌術(shù)后小鼠存活的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對(duì)過(guò)山蕨總黃酮作為一個(gè)賴氨酸氧化酶抑制劑及其在腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)行了試驗(yàn)，過(guò)山蕨總黃酮口服、注射均有效，下面各試驗(yàn)以過(guò)山蕨總黃酮口服為例。試驗(yàn)中用到的過(guò)山蕨總黃酮按下述方法獲取將洗凈、烘干、粉碎過(guò)的過(guò)山蕨地上全草經(jīng)石油醚脫脂后，用體積濃度55%的乙醇水溶液按液料比30 : I于85°C提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并提取液并濃縮至每ml相當(dāng)于O. Ig原藥材，分別經(jīng)95%乙醇(添加量以乙醇濃度占溶液體積總量的80%為宜)、70%乙醇(添加量以乙醇濃度占溶液體積總量的50%為宜)各醇沉I次，過(guò)濾，濾液再經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂吸附、60%乙醇洗脫，洗脫液真空干燥后即得黃色的粉狀固體過(guò)山蕨總黃酮。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)分光光度測(cè)定總黃酮含量>90%。實(shí)驗(yàn)I.過(guò)山蕨總黃酮對(duì)UVB引起小鼠皮膚癌的影響
實(shí)驗(yàn)方法將100只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組，模型組，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(25mg/kg體重/日、50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日)。正常組和模型組飲正常水和食正常飼料。過(guò)山蕨總黃酮各劑量組按每只小鼠日食量將過(guò)山蕨總黃酮按所需劑量濃度摻入飼料中喂飼小鼠，從實(shí)驗(yàn)分組后開(kāi)始到處死小鼠全程喂飼。除正常對(duì)照組小鼠外，將其他實(shí)驗(yàn)組小鼠用理發(fā)電推除去背部毛發(fā)，放入固定鼠背的裝置中，用紫外線(UVB 275-390nm) 30 mj/cm2照射小鼠背部剃毛區(qū)2次/周，連續(xù)44周。第45周計(jì)數(shù)各組出現(xiàn)皮膚腫瘤的小鼠數(shù)和每只小鼠皮膚出現(xiàn)的腫瘤數(shù)。頸椎脫臼法處死全部小鼠，切取照射部位凍存于_80°C用于致癌組織賴氨酸氧化酶檢測(cè)。結(jié)果模型組20只小鼠全部發(fā)生皮膚癌，平均每鼠發(fā)生皮膚腫瘤的數(shù)目為4. 8個(gè)；過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組20只小鼠發(fā)生皮膚癌的小鼠分別為12只、10只、9只，平均每鼠發(fā)生皮膚腫瘤的數(shù)目分別為3個(gè)、2. 6個(gè)、2. 2個(gè)(見(jiàn)圖I、圖2)。實(shí)驗(yàn)2.過(guò)山蕨總黃酮對(duì)二甲基苯蒽/巴豆油引起小鼠皮膚癌的影響
實(shí)驗(yàn)方法將100只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組，模型組，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(25mg/kg體重/日、50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日)。正常組和模型組飲正常水和食正常飼料。過(guò)山蕨總黃酮各劑量組按每只小鼠日食量將過(guò)山蕨總黃酮按所需劑量濃度摻入飼料中喂飼小鼠，從實(shí)驗(yàn)分組后開(kāi)始到處死小鼠全程喂飼。除正常對(duì)照小鼠外，將其他實(shí)驗(yàn)組小鼠用理發(fā)電推除去背部毛發(fā)，于實(shí)驗(yàn)第I天背部脫毛區(qū)涂二甲基苯蒽丙酮液200 μ I (150 μ g)，每周I次，共4次；第22天起在相同部位涂O. 25%巴豆油丙酮液200 μ 1，每周2次，連續(xù)20周。第40周計(jì)數(shù)各組出現(xiàn)皮膚腫瘤的小鼠數(shù)和每只小鼠皮膚出現(xiàn)的腫瘤數(shù)。頸椎脫白法處死全部小鼠，切取誘癌部位凍存于-80°C用于致癌組織賴氨酸氧化酶檢測(cè)。結(jié)果模型組20只小鼠全部發(fā)生皮膚癌，平均每鼠發(fā)生皮膚腫瘤的數(shù)目為3. 5個(gè)；過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組20只小鼠發(fā)生皮膚癌的小鼠分別為13只、12只、10只，平均每鼠發(fā)生皮膚腫瘤的數(shù)目分別為I. 8個(gè)、I. 5個(gè)、I. I個(gè)(見(jiàn)圖I、圖2)。實(shí)驗(yàn)3 :過(guò)山蕨總黃酮對(duì)烏拉坦引起小鼠肺癌的影響
實(shí)驗(yàn)方法將100只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組，模型組，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(25mg/kg體重/日、50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日)。正常組和模型組飲正常水和食正常飼料。過(guò)山蕨總黃酮各劑量組按每只小鼠日食量將過(guò)山蕨總黃酮按所需劑量濃度摻入飼料中喂飼小鼠，從實(shí)驗(yàn)分組后開(kāi)始到處死小鼠全程喂飼。除正常對(duì)照小鼠外，其他實(shí)驗(yàn)組小鼠于實(shí)驗(yàn)第I天腹腔注射烏拉坦1000mg/kg，每周I次，共5次。第30周頸椎脫臼法處死全部小鼠，計(jì)數(shù)各組出現(xiàn)肺腫瘤的小鼠數(shù)和每只小鼠肺表面出現(xiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，并取小鼠肺臟凍存于_80°C用于致癌組織賴氨酸氧化酶檢測(cè)。結(jié)果模型組20只小鼠全部發(fā)生皮膚癌，平均每鼠發(fā)生肺腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目為11.8個(gè)；過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組20只小鼠發(fā)生皮膚癌的小鼠分別為15只、13只、11只，平均每鼠發(fā)生肺腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目分別為7. 5個(gè)、6. I個(gè)、4. 5個(gè)(見(jiàn)圖I、圖2)。實(shí)驗(yàn)4 :過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌皮下腫瘤、小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤及兩種腫瘤自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響
實(shí)驗(yàn)方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺癌細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)細(xì)胞數(shù)5X IO5個(gè)/ml，以
0.2ml/只接種于40只雌性C57BL /6小鼠右前肢腋部皮下；或取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1乳腺癌細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)細(xì)胞數(shù)3 X IO5個(gè)/ml，以0. Iml/只接種于40只雌性BALB/c小鼠右側(cè)第2乳頭脂肪墊下。將腫瘤接種小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為模型組，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(25mg/kg體重/日、50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日)，另設(shè)10只未接種腫瘤的小鼠平行飼養(yǎng)為正常對(duì)照組。腫瘤接種后次日，模型組和正常組小鼠灌胃生理鹽水10ml/kg，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組小鼠分別灌胃相應(yīng)劑量的過(guò)山蕨總黃酮水溶液，每日I次，連續(xù)4周，腫瘤長(zhǎng)出后每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑2次。腫瘤大小按下式計(jì)算腫瘤體積(mm3)=腫瘤長(zhǎng)度X腫瘤寬度X腫瘤寬度/ 2。末次給藥后次日頸椎脫白法處死全部小鼠，剝離接種部位腫瘤，稱重，取部分瘤組織凍存于-80°C用于瘤組織賴氨酸氧化酶檢測(cè)。另剝離小鼠肺臟，檢測(cè)出現(xiàn)肺腫瘤的小鼠數(shù)和每只小鼠肺表面出現(xiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，評(píng)價(jià)過(guò)山蕨總黃酮對(duì)兩種腫瘤自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果模型組小鼠肺癌皮下腫瘤及原位乳腺腫瘤生長(zhǎng)較快，并全部出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。與模型組比較，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組小鼠肺癌皮下腫瘤及原位乳腺腫瘤生長(zhǎng)均有不同程度明顯減緩，同時(shí)可阻止兩種腫瘤肺轉(zhuǎn)移(見(jiàn)圖3、圖4、圖5)。實(shí)驗(yàn)5 :過(guò)山蕨總黃酮對(duì)誘癌組織及瘤組織賴氨酸氧化酶的影響實(shí)驗(yàn)方法將收集凍存的致癌組織和瘤組織用RIPA強(qiáng)裂解液(50 mMTris - HCl, pH7. 4，150 mM NaCl, l%TritonX-100, I mM EDTA, 100 mM NaV03, I mM PMSF, O. 1% SDS,1%去氧膽酸鈉，另加蛋白酶抑制劑混合物)提取蛋白。上樣50 μ g蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(德國(guó))，4°C、5%脫脂奶粉-Tris鹽酸緩沖液(TBS)封閉，將兔抗(鼠)賴氨酸氧化酶C末端單克隆抗體(Anti-lysyl oxidase, 1:100, Sigma-Aldrich)或兔抗(鼠)β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Anti-β-Actin, 1:100,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)加入含5%脫脂奶粉的TBS中，室溫下與PVDF膜結(jié)合孵育lh，再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的鼠抗IgG (1:200) 二抗室溫下在含5%脫脂奶粉的TBS中結(jié)合孵育30mins?？乖贵w結(jié)合物檢測(cè)用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)底物試劑盒進(jìn)行，光帶的相對(duì)光密度用賴氨酸氧化酶和β肌動(dòng)蛋白的光密度比值表示。結(jié)果誘癌組織與其相應(yīng)的正常組織比較，賴氨酸氧化酶的光密度值明顯升高，過(guò)山蕨總黃酮治療后誘癌組織賴氨酸氧化酶的光密度值均有不同程度降低，其中過(guò)山蕨總黃酮50mg/kg體重/日和100mg/kg體重/日組使誘癌組織賴氨酸氧化酶的光密度值降到相應(yīng)的正常組織。小鼠lewis肺癌皮下腫瘤及小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤經(jīng)不同劑量過(guò)山蕨總 黃酮治療后瘤組織中賴氨酸氧化酶的光密度值比未經(jīng)過(guò)山蕨總黃酮治療的腫瘤組織顯著降低(見(jiàn)圖6)。實(shí)驗(yàn)6 :過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌和4T1乳腺癌人工被動(dòng)肺轉(zhuǎn)移的影響
實(shí)驗(yàn)方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺癌細(xì)胞或4T1乳腺癌細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)細(xì)胞數(shù)I X IO5個(gè)/ml，以O(shè). 2ml/只尾靜脈注射接種于40只雌性C57BL /6小鼠或BALB/c小鼠。將腫瘤接種小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為模型組，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(25mg/kg體重/日、50mg/kg體重/日、lOOmg/kg體重/日)。腫瘤接種后次H，模型組和正常組灌胃生理鹽水10ml/kg，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組分別灌胃相應(yīng)劑量的過(guò)山蕨總黃酮水溶液，每日I次，連續(xù)4周。末次給藥后次日頸椎脫白法處死全部小鼠，剝離小鼠肺臟，檢測(cè)出現(xiàn)肺腫瘤的小鼠數(shù)和每只小鼠肺表面出現(xiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，評(píng)價(jià)過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠lewis肺癌和4T1乳腺癌人工被動(dòng)肺轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果小鼠lewis肺癌和4T1乳腺癌模型組人工被動(dòng)肺轉(zhuǎn)移后10只小鼠肺部均出現(xiàn)多處腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。與模型組比較，過(guò)山蕨總黃酮中劑量和高劑量組小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的小鼠數(shù)和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均有明顯減少。過(guò)山蕨總黃酮低劑量組小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的小鼠數(shù)雖無(wú)降低，但肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)也明顯減少(見(jiàn)圖7)。實(shí)驗(yàn)7 :過(guò)山蕨總黃酮對(duì)阿霉素、環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響
實(shí)驗(yàn)方法取生長(zhǎng)良好的lewis肺癌傳代實(shí)體瘤，用生理鹽水制備瘤細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，按0. 2ml/只接種于80只雌性C57BL /6小鼠右前肢腋部皮下。將腫瘤接種小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為模型組，過(guò)山蕨總黃酮組(50mg/kg體重/日)，阿霉素組(5mg/kg體重/日)、環(huán)磷酰胺組(10mg/kg體重/日)、氟尿卩密唳組(15mg/kg體重/日)、過(guò)山蕨總黃酮+阿霉素組、過(guò)山蕨總黃酮+環(huán)磷酰胺組、過(guò)山蕨總黃酮+氟尿嘧啶組。腫瘤接種后次日，模型組和正常組灌胃生理鹽水10ml/kg，過(guò)山蕨總黃酮組灌胃相應(yīng)劑量的過(guò)山蕨總黃酮水溶液，環(huán)磷酰胺組和氟尿嘧啶組腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物，每日I次，連續(xù)3周；阿霉素組尾靜脈注射相應(yīng)劑量的藥物，每周I次，共3次；兩種藥物聯(lián)用組按2種藥物單獨(dú)使用時(shí)的劑量和方式聯(lián)合治療。腫瘤長(zhǎng)出后每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑2次，腫瘤大小按下面公式計(jì)算腫瘤體積(mm3)=腫瘤長(zhǎng)度X腫瘤寬度X腫瘤寬度/
2。腫瘤接種后22日頸椎脫臼法處死全部小鼠，剝離接種部位腫瘤，稱重。另剝離小鼠肺臟，檢測(cè)出現(xiàn)肺腫瘤的小鼠數(shù)和每只小鼠肺表面出現(xiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，評(píng)價(jià)過(guò)山蕨總黃酮對(duì)阿霉素、環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶治療的小鼠lewis肺癌皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果模型組小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)較快，并全部出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。與模型組比較，阿霉素、環(huán)磷酰胺和氟尿嘧啶組小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)雖均明顯減緩，但腫瘤肺轉(zhuǎn)移并無(wú)減輕。過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)抑制作用雖比阿霉素、環(huán)磷酰胺和啶氟尿嘧啶弱，但可同時(shí)可阻止腫瘤肺轉(zhuǎn)移。過(guò)山蕨總黃酮與阿霉素、環(huán)磷酰胺和氟尿嘧聯(lián)用后對(duì)小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)抑制作用明顯增強(qiáng)，且能顯著降低肺轉(zhuǎn)移(見(jiàn)圖8，圖9)。實(shí)驗(yàn)8 :過(guò)山蕨總黃酮對(duì)小鼠4T1乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。實(shí)驗(yàn)方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1乳腺癌細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)細(xì)胞數(shù)3X 105/ml，以
O.Im I/只接種于80只雌性BALB/c小鼠右側(cè)第2乳頭脂肪墊下。腫瘤接種后2周(腫瘤直徑約IOmm)手術(shù)切除腫瘤。將腫瘤切除后小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為模型組，過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組(25mg/kg體重/日、50mg/kg體重/日、100mg/kg體重/日)。腫瘤切除后次日，模型組飲正常水和食正常飼料，過(guò)山蕨總黃酮各劑量組按每只小鼠日食量將過(guò)山蕨總黃酮按所需劑量濃度摻入飼料中喂飼小鼠，觀察腫瘤切除后26周內(nèi)各組小鼠腫瘤復(fù)發(fā)和死亡情況。小鼠死后檢測(cè)手術(shù)切除部位腫瘤及肺轉(zhuǎn)移灶，統(tǒng)計(jì)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率。結(jié)果模型組小鼠腫瘤手術(shù)切除后20只中有17只腫瘤復(fù)發(fā)，腫瘤復(fù)發(fā)小鼠全部有肺轉(zhuǎn)移，中位存活時(shí)間為11周。經(jīng)過(guò)山蕨總黃酮低劑量、中劑量、高劑量治療后的小鼠腫瘤復(fù)發(fā)率均有不同程度降低，且腫瘤復(fù)發(fā)小鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的比率降低，小鼠中位存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)(見(jiàn)圖10、圖11)。
權(quán)利要求
1.過(guò)山蕨總黃酮作為賴氨酸氧化酶抑制劑，在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，過(guò)山蕨總黃酮在制備抗癌藥物方面的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，過(guò)山蕨總黃酮在制備抗皮膚癌藥物方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，過(guò)山蕨總黃酮在制備抗肺癌藥物方面的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，過(guò)山蕨總黃酮在制備抗乳腺癌藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于過(guò)山蕨總黃酮應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及過(guò)山蕨總黃酮作為賴氨酸氧化酶抑制劑，在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用，如預(yù)防化學(xué)致癌(如肺癌、乳腺癌和紫外線引起的皮膚癌等)，阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤化療效果等。
文檔編號(hào)A61K36/11GK102935096SQ20121048611
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者杜鋼軍, 盧琳琳, 楊義明, 林海紅, 張亞平, 孫婷, 劉偉杰, 李佳桓, 劉迎輝, 趙貝, 李鴻儒, 侯西棟 申請(qǐng)人:河南大學(xué)