專利名稱：一種豬Ⅱ型細環(huán)病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表達及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及獸藥領域，具體涉及一種豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達及應用。
背景技術：
輸血傳播病毒(Transufson Transmitted Viurs, TTV)是一類無囊膜，二十面體，單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，電鏡觀察病毒顆粒直徑約為30-32nm。TTV首次由日本學者從一例未知病原的非甲-非戊型輸血后肝炎病人的血清中發(fā)現(xiàn)，隨后人們在非靈長類以及豬、牛、羊、犬，貓、家禽等多種家養(yǎng)及野生動物體內也發(fā)現(xiàn)了 TTV的感染。2009年，國際病毒分類協(xié)會(ICTV)將豬的TTV劃分到指環(huán)病毒科(AnelIoviridae)細環(huán)病毒屬(Iotatorquevirus), 并進一步劃分為兩個種豬I型細環(huán)病毒(Torque teno sus virus1:TTSuVl)和豬II型細環(huán)病毒(Torque teno sus virus I1:TTSuV2)。作為一種較為新型的病毒，TTSuV2的致病機理知之甚少。2004年，McKeown對中國，愛荷華州，泰國，安大略，韓國，西班牙，魁北克和薩斯喀徹溫省這六個不同國家地區(qū)的154份豬血清進行檢測，TTSuV2陽性率可高達66. 2%(102/154)。Aramouni等證實了 TTSuV2與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)之間有一定的聯(lián)系并發(fā)現(xiàn)TTSuV2與其他已知的豬病原體協(xié)同感染可以導致疾病加重。近年來，關于TTSuV2和TTSuV2的報道逐漸增多，TTSuV2的感染具有廣泛性和普遍性，這一特點引起了諸多科研工作者的關注。因此，加強對TTSuV2的流行病學調查，確定其抗原性位點，對TTSuV2的防治有十分重要的意義。

發(fā)明內容
為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達，獲得酵母表達的TTSuV2-0RFl截短蛋白作為包被抗原在用于TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中，提高試劑盒的特異性、重復性及穩(wěn)定性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種酵母表達的TTSUV2-0RF1截短蛋白在TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中的應用。本發(fā)明的又一目的在于提供一種TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，采用本發(fā)明的酵母表達的TTSUV2-0RF1截短蛋白作為包被抗原，以獲得具有良好特異性、重復性和穩(wěn)定性的TTSuV2抗體診斷試劑盒。本發(fā)明的目的之四在于提供一種酵母表達的TTSUV2-0RF1截短蛋白在豬II型細環(huán)病毒亞單位疫苗中的應用。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達，其包括以下步驟I) TTSuV2 ORFl待表達片段的選擇以TTSuV2陽性樣品的核酸為模板，在病毒基因序列的保守區(qū)設計引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，應用LATaqDNA聚合酶擴增目的片段；對擴增產(chǎn)物進行電泳，切下目的條帶，利用OMEGA膠回收試劑盒回收DNA，對純化的片段進行測序，使用ClustalX軟件包對測序結果進行序列匹配和多重序列比對，獲取TTSuV2ORFl 序列 SEQ IDNO: 3 ；2) TTSuV2 ORFr片段的選擇應用ProtScale氨基酸分析軟件在上述的TTSuV2ORFl序列SEQ ID NO:3中選出預測抗原性較強且抗原區(qū)較為集中的TTSuV2 0RF1’序列為SEQ ID NO:4的蛋白片段；3)TTSuV2 0RF1’的酵母表達構建插入TTSuV2 0RF1’的pPICZ a A重組質粒，電轉化P. pastoris X-33酵母菌，篩選重組TTSuV2 0RF1’的高拷貝子，獲取真核表達的TTSuV20RF1，目的蛋白片段；4)TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段的鑒定與純化篩選出的高拷貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，應用親和層析的方法純化重組TTSuV2ORFl ’，在PBS中透析后，應用BCA法進行定量，純化后獲得酵母表達的TTSuV2_0RFl截短蛋 白。本發(fā)明中，步驟I)應用LA TaqDNA聚合酶擴增目的片段的反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸120s,共30個循環(huán);72°C延伸8min ;反應完成后用1. 0%的瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳。本發(fā)明中，步驟3)的具體過程為應用Primer Premier5. O設計引物SEQ IDNO: 5和引物SEQ ID N0:6,以TTSuV2陽性核酸為模板，應用Kod plus高保真酶的PCR擴增反應獲得目的條帶，電泳、純化目的條帶；雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pPICZ α Α，連接，轉化E. coli DH5a后測序驗證載體正確性，提取構建正確的重組質粒pPICZ a - TTSuV2 ORFI’，Sac I單酶切線性化；將酵母菌X -33制備成感受態(tài)細胞，取出80 μ I感受態(tài)細胞與5 10 μ g線性化的重組表達質?；旌?，轉入O. 2cm電轉杯，電轉化，將菌液用Iml冰浴山梨醇10倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養(yǎng)基選擇平板上，置于30°C培養(yǎng)2 3d，在200-1000 μ g/ml濃度段的Zeocin的YPD平板上篩選具有1000 μ g/ml Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25ml BMGY培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)至OD6tltol ^ 4.0，離心、收集菌體，用IOOmlBMMY培養(yǎng)基重懸培養(yǎng),每日取樣Iml,并補加純甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為O. 5%,誘導表達5d,取樣品離心收集上清作SDS-PAGE分析，以Ant1-HIS_antibody為第一抗體，WesternBlotting獲得真核表達的TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段。本發(fā)明中，所述Kod plus高保真酶的PCR擴增反應程序為94°C預變性5min ；94°C變性30s，52°C退火30s，68°C延伸40s,設置30個循環(huán)；68°C延伸8min。本發(fā)明所述的酵母表達的豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白作為包被抗原在TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中的應用。一種TTSUV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，其包括用本發(fā)明所述的酵母表達的豬II型細環(huán)病毒TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原包被的酶標板，100 μ 1TTSuV2陽性對照血清，100 μ I TTSuV2陰性對照血清，100 μ I HRP標記兔抗豬二抗，100 μ I抗體稀釋液、100 μ I顯色液、100 μ I終止液以及洗脫液。上述TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中，所述HRP標記兔抗豬二抗液是兔抗豬二抗與HRP保護液按照體積比為1: 2000-5000的比例稀釋；所述抗體稀釋液為O. 1%BSA1. Og 加入 PBS 至 IOOOrnl ;所述顯色液為 50mg TMB, IOmLDMSO, 9. 8g 檸檬酸和1. 2ml30%H202加蒸餾水定容至IOOOml ;所述終止液為雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. 7mL混
口 O上述TTSUV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中所述酵母表達的豬II型細環(huán)病毒TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原的包被濃度為O. 25-1 μ g/ml。本發(fā)明所述的酵母表達的TTSUV2-0RF1截短蛋白在豬II型細環(huán)病毒亞單位疫苗中的應用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明獲得酵母表達的TTSUV2-0RF1截短蛋白作為包被抗原在用于TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中，提高試劑盒的特異性、重復性及穩(wěn)定性。本發(fā)明獲得的酵母表達的TTSuV2 ORFl截短蛋白還可以應用于豬II型細環(huán)病毒亞單位疫苗 中。下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1 :酵母表達的 TTSuV2 ORFl 截短蛋白的 SDS-PAGE 及 Western-blotting 圖a)泳道1:畢赤酵母分泌表達TTSuV2 0RF1’后的上清SDS-PAGE圖(50%硫酸銨沉淀);泳道2 :畢赤酵母分泌表達TTSuV2 ORFr后的上清SDS-PAGE圖(未濃縮上清);泳道
3:畢赤酵母陰性對照上清SDS-PAGE圖(轉化分泌表達空質粒的陰性對照)；ml :非預染蛋白marker ；b)m2 :蛋白預染marker ;泳道1:畢赤酵母分泌表達TTSuV2 0RF1’后的上清Western-blotting圖；泳道2 :畢赤酵母陰性對照上清Western-blotting圖；泳道3 :純化后的酵母表達的TTSuV2 0RF1’ Western-blotting鑒定圖；c)泳道1:純化后的酵母表達的TTSuV2 ORFl’SDS-PAGE圖；泳道2 陰性對照；ml 非預染蛋白marker,圖中箭頭所指均為重組TTSuV2 0RF1’ ；圖2為本發(fā)明的免疫后血清OD值。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的具體實施例，豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達，包括以下步驟I) TTSuV2 ORFl待表達片段的選擇以TTSuV2陽性樣品的核酸為模板，在病毒基因序列的保守區(qū)設計引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，應用LATaqDNA聚合酶擴增目的片段，反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸120s，共30個循環(huán)；72°C延伸8min ;反應完成后用1. 0%的瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳；對擴增產(chǎn)物進行電泳，切下目的條帶，利用OMEGA膠回收試劑盒回收DNA，對純化的片段進行測序，使用ClustalX軟件包對測序結果進行序列匹配和多重序列比對，獲取TTSuV2 ORFl序列SEQIDNO:3 ；2) TTSuV2 0RF1’片段的選擇應用ProtScale氨基酸分析軟件在上述的TTSuV2ORFl序列SEQ ID NO:3中選出預測抗原性較強且抗原區(qū)較為集中的TTSuV2 0RF1’序列為SEQ ID NO:4的蛋白片段；3)TTSuV2 0RF1’的酵母表達構建插入TTSuV2 0RF1’的pPICZ a A重組質粒，電轉化P. pastoris X - 33酵母菌，篩選重組TTSuV2 0RF1’的高拷貝子，獲取真核表達的TTSuV2 0RF1，目的蛋白片段；具體程序為應用PrimerPremier5. O設計引物SEQ ID NO: 5和引物SEQ ID N0:6,以TTSuV2陽性核酸為模板，應用Kod plus高保真酶的PCR擴增反應獲得目的條帶，反應程序為94°C預變性5min ;94°C變性30s，52 °C退火30s，68 °C延伸40s，設置30個循環(huán)；68°C延伸8min ;電泳、純化目的條帶；雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pPICZ α A，連接，轉化E. coli DH5a后測序驗證載體正確性，提取構建正確的重組質粒pPICZ a -TTSuV2ORFr , Sac I單酶切線性化；將酵母菌X-33制備成感受態(tài)細胞，取出80 μ I感受態(tài)細胞與5 10 μ g線性化的重組表達質?；旌?轉入O. 2cm電轉杯，電轉化，將菌液用Iml冰浴山梨醇10倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養(yǎng)基選擇平板上，置于30°C培養(yǎng)2 3d，在200-1000 μ g/ml濃度段的Zeocin的YPD平板上篩選具有1000 μ g/ml Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25ml BMGY培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)至OD6tltlnm 4. 0，離心、收集菌體，用100ml BMMY培養(yǎng)基重懸培養(yǎng),每日取樣Iml,并補加純甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為O. 5%，誘導表達5d，取樣品離心收集上清作SDS-PAGE分析，以Ant1-HIS-antibody為第一抗體，Western Blotting獲得真核表達的TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段； 4)TTSuV2 0RF1’目的蛋白片段的鑒定與純化篩選出的高拷貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，應用親和層析的方法純化重組TTSuV2ORFl ’，在PBS中透析后，應用BCA法進行定量，純化后獲得酵母表達的TTSuV2_0RFl截短蛋白。應用實施例1酵母表達的TTSuV2 ORFl截短蛋白在TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中的應用，具體步驟如下I)抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定采用棋盤滴定法，將純化的酵母表達的TTSuV2 ORFl截短蛋白在酶標板上從左到右以起始濃度為4 μ g/ml按照在后的孔濃度為在先孔濃度的1/2的梯度濃度稀釋包被酶標板，最后一列作為空白對照；每孔100μ L，37°C放置I小時；用PBST洗板I次，每孔加入10%羔羊血清，37°C封閉I小時，陽性對照血清和陰性對照血清分別進行梯度稀釋，自上而下加入到反應板中，每孔加入100 μ 1，最后一行為無血清對照，37°C反應I小時，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ I的HRP標記兔抗豬二抗，37°C反應I小時，PBST洗滌3次，，每孔加入底物顯色液100 μ 1，避光顯色10分鐘，每孔加入100 μ I終止液，于450nm處讀數(shù)儀讀取OD值，620nm作為參考波長。結果確立包被抗原的最佳包被濃度為0. 25-1 μ g/ml，血清最佳稀釋倍數(shù)為10-100倍；2)試劑盒的組裝與優(yōu)化將純化的酵母表達的TTSuV2 ORFl截短蛋白稀釋到O. 25-1 μ g/mL,加到酶標板上，每孔100 μ L，4°C包被6-8小時或37°C I小時，用PBST洗板I次，每孔加入含10%羔羊血清的PBST，37°C封閉I小時。將待檢血清樣品用PBST稀釋10-100倍，加到酶標板上，每孔100 μ L，設置陰性和陽性對照，37°C反應I小時，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ L 2000-5000倍稀釋的HRP標記兔抗豬二抗，37°C反應I小時，PBST洗滌3次，每孔加入底物顯色液100 μ L，避光顯色3-10分鐘，每孔加入100 μ I終止液，于450nm處讀數(shù)儀讀取OD值，620nm作為參考波長。應用實施例2
應用本發(fā)明的TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒檢測血清(I)將酵母表達的TTSuV2-0RFl截短蛋白用稀釋至O. 25 μ g/mL，加到酶標板上，每孔100μ 1，4°C包被過夜6-8小時，用PBST洗板I次，每孔加入含10%羔羊血清的PBST，37°C封閉I小時；(2)將待檢血清樣品用PBST稀釋40倍，加到酶標板上，每孔100 μ 1，設置陰性和陽性對照，37°C反應I小時，所有樣本均設置兩個重復；(3)PBST洗滌3次，每孔加入100 μ I 3000倍稀釋的HRP標記兔抗豬二抗，37°C反應I小時，PBST洗滌3次，每孔加入底物顯色液100 μ I，避光顯色8分鐘，每孔加入100 μ I終止液，于450nm處讀數(shù)儀讀取OD值，重復實驗兩次，結果如下表1:表1:應用TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒檢測72份血清樣品所對應的平均OD值
權利要求
1.一種豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于其包括以下步驟 1)TTSuV2 ORFl待表達片段的選擇以TTSuV2陽性樣品的核酸為模板，在病毒基因序列的保守區(qū)設計引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，應用LA TaqDNA聚合酶擴增目的片段；對擴增產(chǎn)物進行電泳，切下目的條帶，利用OMEGA膠回收試劑盒回收DNA，對純化的片段進行測序，使用Clustal X軟件包對測序結果進行序列匹配和多重序列比對，獲取TTSuV2ORFl 序列 SEQ ID NO:3 ； 2)TTSuV2ORFr片段的選擇應用ProtScale氨基酸分析軟件在上述的TTSuV2 ORFl序列SEQ ID NO:3中選出預測抗原性較強且抗原區(qū)較為集中的TTSuV2 ORFI’序列為SEQID N0:4的蛋白片段； 3)TTSuV2ORFr的酵母表達構建插入TTSuV2 0RF1’的pPICZ a A重組質粒，電轉化P. pastoris X-33酵母菌，篩選重組TTSuV2 0RF1’的高拷貝子，獲取真核表達的TTSuV20RF1，目的蛋白片段； 4)TTSuV2 ORFr目的蛋白片段的鑒定與純化篩選出的高拷貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，應用親和層析的方法純化重組TTSuV2 ORFr,在PBS中透析后，應用BCA法進行定量，純化后獲得酵母表達的TTSuV2-0RFl截短蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于步驟I)應用LA TaqDNA聚合酶擴增目的片段的反應程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸120s，共30個循環(huán)；72°C延伸8 min ;反應完成后用1. 0%的瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳。
3.根據(jù)權利要求1所述的豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于步驟3)的具體過程為應用Primer Premier5. O設計引物SEQ ID NO:5和引物SEQID NO: 6，以TTSuV2陽性核酸為模板，應用Kod plus高保真酶的PCR擴增反應獲得目的條帶，電泳、純化目的條帶；雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pPICZ αΑ，連接，轉化E. coli DH5 α后測序驗證載體正確性，提取構建正確的重組質粒pPICZ a - TTSuV2 ORFI’，Sac I單酶切線性化；將酵母菌X-33制備成感受態(tài)細胞，取出80 μ I感受態(tài)細胞與5 10 μ g線性化的重組表達質?；旌?，轉入O. 2 cm電轉杯，電轉化，將菌液用I ml冰浴山梨醇10倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養(yǎng)基選擇平板上，置于30°C培養(yǎng)2 3d，在200-100(^g/ml濃度段的Zeocin的YPD平板上篩選具有l(wèi)OOOPg/ml Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25 ml BMGY培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)至0D6(l(lmi 4. 0，離心、收集菌體，用100 ml BMMY培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，每日取樣Iml,并補加純甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為O. 5%,誘導表達5d,取樣品離心收集上清作 SDS -PAGE 分析，以 Ant1-HIS -antibody 為第一抗體,Western Blotting獲得真核表達的TTSuV2 ORFr目的蛋白片段。
4.根據(jù)權利要求3所述的豬II型細環(huán)病毒TTSUV2-0RF1截短蛋白的酵母表達，其特征在于所述Kod plus高保真酶的PCR擴增反應程序為94°C預變性5min ;94°C變性30s，52°C退火30s，68°C延伸40s,設置30個循環(huán)；68°C延伸8min。
5.權利要求1所述的酵母表達的TTSuV2-0RFl截短蛋白作為包被抗原在TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒中的應用。
6.一種TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于其包括用權利要求1所述的酵母表達的TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原包被的酶標板，100 μ I TTSuV2陽性對照血清，100 μ I TTSuV2陰性對照血清，100 μ I HRP標記兔抗豬二抗，100 μ I抗體稀釋液、100 μ I顯色液、100 μ I終止液以及洗脫液。
7.根據(jù)權利要求6所述的TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于所述HRP標記兔抗豬二抗液是兔抗豬二抗與HRP保護液按照體積比為1: 2000-5000的比例稀釋；所述抗體稀釋液為O. 1%BSA1. Og加入PBS至IOOOml ;所述顯色液為50mg TMB，IOmL DMSO,.9.8g檸檬酸和1. 2ml 30% H2O2加蒸餾水定容至IOOOml ;所述終止液為雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. 7mL混合。
8.根據(jù)權利要求6所述的TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于所述酵母表達的TTSuV2-0RFl截短蛋白包被抗原的包被濃度為O. 25-1 μ g/ml。
9.權利要求1所述的酵母表達的TTSUV2-0RF1截短蛋白在豬II型細環(huán)病毒亞單位疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種豬Ⅱ型細環(huán)病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白TTSuV2ORF1’的酵母表達及應用。本發(fā)明通過獲取TTSuV2ORF1基因全序列、TTSuV2ORF1蛋白抗原性分析、對截短TTSuV2ORF1’序列的酵母表達、TTSuV2ORF1’截短蛋白的鑒定與純化，獲得真核表達的截短蛋白TTSuV2ORF1’，將該蛋白作為包被抗原用于TTSuV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，試劑盒具有較高的特異性、重復性及穩(wěn)定性。本發(fā)明獲得的截短表達的TTSuV2ORF1’重組蛋白還可以應用于豬Ⅱ型細環(huán)病毒亞單位疫苗中。
文檔編號A61P31/20GK103014056SQ20121048662
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權日2012年11月23日
發(fā)明者李中圣, 陳軼雯, 賴芳芳, 趙焱 申請人:廣東現(xiàn)代農業(yè)集團研究院有限公司