專利名稱：具有血管化能力的組織工程骨及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及工程骨(人工骨)制造技術領域，尤其涉及的是一種具有血管化能力的組織工程骨及其制備方法。
背景技術：
大段骨缺損的修復是臨床面臨的一大難題，目前尚未得到很好地解決。近年來組織工程的發(fā)展有望成為治療大段骨缺損的新方法，但目前組織工程化的人工骨用于大段骨缺損的治療時有一個關鍵性的問題尚未克服，即人工骨血管化的問題。但目前的人工骨由于不能解決自身血管化的問題，至使其無法有效修復大段的骨缺損。

發(fā)明內容
血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成素(Ang-1)是兩個在血管形成及塑型過程中起重要作用的兩個細胞因子，本發(fā)明使用這兩個具有高效促血管形成能力的細胞因子與I型膠原改性的多孔支架材料復合，構建新型的雙基因修飾的組織工程化人工骨，以期在采用組織工程化人工骨治療大段骨缺損時能促進人工骨的血管化，進而有效修復大段骨缺損。本發(fā)明的技術方案如下一種具有血管化能力的組織工程骨的制備方法，包括以下步驟A1，VEGF, Ang-1基因質粒的獲取及擴增、純化；A2，VEGF、Ang_l基因質粒與I型膠原混合溶液的制備；具體方法為1型膠原蛋白粉末置于O. 2mol/L醋酸溶液中，PH = 3. 2，配成O. 3wt%的I型膠原溶液，4°C中充分攪拌12h，以使其充分溶解；然后將得到的VEGF、Ang-1的質粒與I型膠原溶液混合，質粒濃度按照各20ug/ml配制；A3，將上述獲得的支架材料在真空環(huán)境下置于所述的I型膠原混合溶液中抽吸4h，使原始支架孔洞中充分浸入I型膠原溶液；混合物于-80°C冷凍12h后，在真空凍干機中凍干48-72h以使孔洞中形成膠原海綿結構；37°C下用I %戊二醛溶液對膠原海綿結構進行交聯(lián)IOmin ;用去離子水反復洗滌后置于凍干機中凍干，構建成具有雙基因修飾的新型人工骨。所述的方法，所述步驟Al中，擴增VEGF所用弓丨物對為Primerl GGAAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCT ；Primer2 ACGCGTCGACCCGCCTCGGCTTGTCACA ；上游引物Primerl引入Bgl II位點，下游引物Primer2引入Sal I位點。所述的方法，所述步驟Al中，擴增Ang-1基因所用引物對為首輪PCR引物primer3 AGAGGTCAGAAGAAAGGAGCAA ；primer4 GCCCGACAGTCAGTGGAGT ；第二輪PCR引物
primer5 ATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGC ；
primer6 :TCAAAAATCTAAAGGTCGAATCATC。
將構建的組織工程人工骨用于動物體內節(jié)段性骨缺損的修復，具有良好的修復效果O


圖1為細胞在支架材料中的增殖情況(η = 4);
圖2為X ray檢測結果；(a)-(d).術后即刻X ray檢測結果(a):實驗組A;(b) 實驗組B; (c):實驗組C;(d):實驗組D。(e)-(h).術后4w X ray檢測結果(e):實驗組A; (f):實驗組B;(g):實驗組C;(h):實驗組D。(i)-(l).術后8w X ray檢測結果⑴實驗組A;(j):實驗組B;(k):實驗組C;(l):實驗組D。
圖3為術后8w MciroCT檢測結果；(a):實驗組A三維重建結果及層面截圖；(b) 實驗組B三維重建結果及層面截圖；(C):實驗組C三維重建結果及層面截圖4為術后Iw硬組織切片改良麗春紅三色法染色。(a):實驗組A，(b)實驗組B， (C)實驗組C ；
圖5為術后IW硬組織切片⑶34染色。(a):實驗組A，(b):實驗組B，(c):實驗組 Co
圖6為術后4、8w改良I 春紅三色染色；(a) :A組4w時，(b) A組8w時，(c) B組 4w 時，(d) B 組 8w 時，(e) C 組 4w 時，(f) C 組 8w 時；
圖7 為·術后 4、8W H. E.染色。(a) A 組 4w 時，(b) A 組 8w 時，(c) B 組 4w 時， (d ) B 組 8w 時；具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
實施例1、VEGF、Ang-1質粒的獲取及擴增、純化
1. VEGF的獲取、擴增及純化
1.1引物設計
在Genebank上查詢VEGF165的序列，其序列號為AF486837。根據(jù)此序列設計引物
Primerl GGAAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCT(Bgl II, Forward)
Primer2 ACGCGTCGACCCGCCTCGGCTTGTCACA(Sal I, Reverse)
上游引物引入Bgl II位點，下游引物引入Sal I位點。
1. 2RNA的提取及cDNA的獲得
使用PolyAtract systemlOOO試劑盒從胎盤組織中提取mRNA提取步驟按照說明書進行，將提取的mRNA使用反轉錄酶PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反轉錄為 cDNA，步驟按照說明書進行。
1. 3PCR 擴增 VEGF165 基因片段
以上述獲得的cDNA為模板，進行PCR反應。
權利要求
1.一種具有血管化能力的組織工程骨的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:Al，VEGF、Ang-1基因質粒的獲取及擴增、純化； A2，VEGF、Ang-l基因質粒與I型膠原混合溶液的制備；具體方法為1型膠原蛋白粉末置于O. 2mol/L醋酸溶液中，PH = 3. 2，配成O. 3被％的I型膠原溶液，4°C中充分攪拌12h，以使其充分溶解；然后將得到的VEGF、Ang-1的質粒與I型膠原溶液混合，質粒濃度按照各20ug/ml 配制； A3，將上述獲得的支架材料在真空環(huán)境下置于所述的I型膠原混合溶液中抽吸4h，使原始支架孔洞中充分浸入I型膠原溶液；混合物于_80°C冷凍12h后，在真空凍干機中凍干48-72h以使孔洞中形成膠原海綿結構；37°C下用I %戊二醛溶液對膠原海綿結構進行交聯(lián)IOmin ;用去離子水反復洗滌后置于凍干機中凍干，構建成具有雙基因修飾的新型人工骨。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Al中，擴增VEGF所用引物對為Primerl GGAAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCT ；Primer2 ACGCGTCGACCCGCCTCGGCTTGTCACA ； 上游引物Primerl引入Bgl II位點，下游引物Primer2引入Sal I位點。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟Al中，擴增Ang-1基因所用引物對為首輪PCR引物primer3 AGAGGTCAGAAGAAAGGAGCAA ；primer4 GCCCGACAGTCAGTGGAGT ； 第二輪PCR引物primer5 ATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGC ；primer6 TCAAAAATCTAAAGGTCGAATCATC。
4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的方法制備的具有血管化能力的組織工程骨。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有血管化能力的組織工程骨的制備方法，包括以下步驟A1，VEGF、Ang-1基因質粒的獲取及擴增、純化；A2，VEGF、Ang-1基因質粒與I型膠原混合溶液的制備；A3，將上述獲得的支架材料在真空環(huán)境下置于所述的I型膠原混合溶液中抽吸4h，使原始支架孔洞中充分浸入I型膠原溶液；混合物于-80℃冷凍12h后，在真空凍干機中凍干48-72h以使孔洞中形成膠原海綿結構；37℃下用1％戊二醛溶液對膠原海綿結構進行交聯(lián)10min；用去離子水反復洗滌后置于凍干機中凍干，構建成具有雙基因修飾的新型人工骨。將構建的組織工程人工骨用于動物體內節(jié)段性骨缺損的修復，具有良好的修復效果。
文檔編號A61L27/24GK103007360SQ201210488049
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權日2012年11月27日
發(fā)明者段春光, 劉建, 孟國林 申請人:段春光