專利名稱：一種靶向egfr受體的肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向EGFR受體的多肽及其應(yīng)用，尤其涉及其在修飾的納米脂質(zhì)載體中的應(yīng)用，屬藥物制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上，是一種多功能跨膜糖蛋白，屬受體型酪氨酸蛋白激酶(RTK)。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞特別是EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的生長明顯依賴于EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且有顯著的降調(diào)節(jié)機(jī)制缺陷，其EGFR表達(dá)水平可比正常細(xì)胞高幾千倍。EGFR的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的形成和發(fā)展過程中占據(jù)了重要地位，是治療腫瘤的一個(gè)很有前景的靶分子，是研究的熱點(diǎn)。
然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，以單克隆抗體或其片段作為配基介導(dǎo)腫瘤靶 向治療， 因靶向配基具有免疫原性在臨床應(yīng)用具有一定局限性。目前，人源化、小型化的小分子多肽幾乎不被免疫系統(tǒng)注意，且能有效穿透組織并具有被癌細(xì)胞選擇性結(jié)合和內(nèi)化的能力使其在提高腫瘤治療靶向性方面具有較大優(yōu)勢。
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR含有3個(gè)可以調(diào)控EGFR活性的主要自磷酸化作用位點(diǎn)，分別為 Y1068, Y1148和Y1173。采用序列比較/結(jié)構(gòu)分析的方法設(shè)計(jì)和篩選了來源于三個(gè)主要作用位點(diǎn)的氨基酸序列作為靶向EGFR小分子多肽配體。
納米脂質(zhì)載體(Nanostructrued lipid carries, NLC)是由固體脂質(zhì)納米粒 (Solid lipid nanoparticles, SLN)發(fā)展而來的一種新型載藥系統(tǒng)。NLC采用生物相容性好、毒性低的類脂材料為載體，制備過程中通過向固態(tài)脂質(zhì)中加入化學(xué)差異很大的液態(tài)油， 使納米粒以結(jié)晶缺陷型或無定型結(jié)構(gòu)存在，可避免放置過程中脂類由高能態(tài)的α、β型結(jié)晶向規(guī)則的β型轉(zhuǎn)變，避免或減小SLN放置過程中藥物外排的現(xiàn)象，提高藥包封率及穩(wěn)定性。
普通納米粒如SLN或聚合物納米粒進(jìn)入體內(nèi)后，被機(jī)體視為異物，易被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)識(shí)別并吞噬，在靜脈給藥時(shí)只能作用于吞噬細(xì)胞比較豐富的器官，如肝臟、脾等。但若病灶部位不在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，該類制劑則會(huì)增加藥物對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的毒性。長循環(huán)納米脂質(zhì)載體(long-circulating NLC)是以PEG對NLC表面進(jìn)行修飾，PEG鏈與水分子的相互作用可在NLC表面形成一層固定水化層，由于血漿蛋白不能與親水表面結(jié)合，因此，固定水化層的形成可以防止調(diào)理素及蛋白的吸附，避免RES吞噬，延長納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，使其進(jìn)入腫瘤等病變部位的機(jī)會(huì)增加，提高藥物在病灶靶部位的療效。
靶向EGFR的多肽作為靶向配基，并將其與包載抗腫瘤藥物的長循環(huán)納米脂質(zhì)載體偶聯(lián)，基于肽配體可與腫瘤細(xì)胞表面過度分泌的EGFR特異性結(jié)合的原理，將包載化療藥物的長循環(huán)納米脂質(zhì)載體靶向濃集于腫瘤組織，經(jīng)部分生物降解后，NLC通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織，對腫瘤進(jìn)行特異性治療，改善化療藥物的治療效果，降低對正常組織的毒副作用。發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明的目的是提供與EGFR具有親和性的小分子肽，并提供該相關(guān)小肽的分子結(jié)構(gòu)。
2.本發(fā)明的另一目的是提供上述小肽在構(gòu)建腫瘤靶向給藥系統(tǒng)中的用途。
3.本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)施首先設(shè)計(jì)來自于EGFR主要自磷酸化作用位點(diǎn)的小肽 EY1ci68INQ ( SEQ ID NO:1), PDY1148QQD (SEQ ID NO:2)，AEY1173LR (SEQ ID N0:3),選擇 LARLLT (Shuxian Song, et al. Novel peptide ligand directs liposomes toward EGFR high-expressing cancer cells in vitro and in vivo, FASEB J. 23(2009) 1396-1404.)作為對照，對上述各肽進(jìn)行FITC標(biāo)記。采用流式細(xì)胞術(shù)分析上述各肽與表達(dá) NC1-H1299及K562不同細(xì)胞系的結(jié)合率。獲得與EGFR高表達(dá)的NC1-H1299細(xì)胞具有較高的親和活性的肽AEY1173LR,包含氨基酸序列Ala Glu Tyr Leu Arg (以下簡稱PE5)的肽。
4.經(jīng)體內(nèi)外親和性及靶向性評價(jià)，結(jié)果證實(shí)，所述的小肽具有與EGFRG高表達(dá)的細(xì)胞特異親和的特性；所述的小肽用于修飾載藥納米粒、脂質(zhì)體、泡囊或膠束，構(gòu)建成腫瘤靶向給藥系統(tǒng)，該類系統(tǒng)能夠提高藥物在腫瘤組織的濃度，增強(qiáng)治療效果，降低全身性的毒副作用。
5.本發(fā)明的小肽可用本領(lǐng)域熟知的多肽合成儀或固相方法進(jìn)行合成。如采用有機(jī)化學(xué)固相合成Fmoc法合成小分子肽，由C端至N端合成，即將該小肽C端的第一個(gè)Fmoc-AA 的羧基活化后與HMP樹脂結(jié)合，再脫去Fmoc-保護(hù)基，與第二個(gè)羧基活化的Fmoc-AA結(jié)合， 再脫去Fmoc-保護(hù)基，循環(huán)重復(fù)，直至合成得到肽樹脂，然后用TFA將肽從肽樹脂上切下，得到粗品小肽。
采用高效液相色譜法對小肽粗品進(jìn)行純化和純度檢測。洗脫系統(tǒng)為①A液: O. 1%TFA的水溶液。②B液B為 含O. 1%TFA的乙腈溶液。用95%A, 5%B 60%A, 40%B，手動(dòng)進(jìn)樣，1 mL/次,流速4 mL/min,線性梯度,20 min內(nèi)。275.5 nm處檢測紫外吸收,按峰收集組分，凍干，進(jìn)行純度檢測，貯藏在-20 ° C冰箱中備用。純化后的肽以質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定。
通過液相色譜純化，純度在98%以上，外觀為白色粉末，并通過質(zhì)譜進(jìn)結(jié)構(gòu)鑒定 本發(fā)明小肽的分子量是650. 74，質(zhì)譜特征峰651. 27。
6.本發(fā)明的肽與納米脂質(zhì)載體(NLC)的結(jié)合為通過接頭的共價(jià)結(jié)合。
接頭為能夠共價(jià)連接本發(fā)明的肽和納米脂質(zhì)載體的物質(zhì)的交聯(lián)劑。交聯(lián)劑通常與本發(fā)明的肽和納米脂質(zhì)載體上存在的功能基團(tuán)(例如-NH2，-C00H，-mal)反應(yīng)。由于不同交聯(lián)劑與不同功能基團(tuán)反應(yīng)的能力不同，可以選擇不同的交聯(lián)劑。
所述的本發(fā)明的肽偶聯(lián)的納米脂質(zhì)載體的制備方法為首先采用具有 DSPE-PEG-C00H、DSPE-PEG-NH2、DSPE-PEG-mal的脂質(zhì)制備納米脂質(zhì)載體，然后加入交聯(lián)劑將PE5連接到納米粒上。
具體步驟如下(1)將固態(tài)脂質(zhì)材料、液態(tài)油、脂溶性乳化劑溶于有機(jī)溶劑中，該有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醇或異丙醇，并加熱至60 100°C熔融，以構(gòu)成有機(jī)相；(2)將PEG修飾的脂類、水溶性乳化劑、附加劑溶于注射用水中，并加熱至60 100°C， 以構(gòu)成水相；(3)在60 100°C的溫度下，在攪拌或/和高剪切條件下將所述有機(jī)相和水相混合，以制備初乳；(4)對所述初乳進(jìn)行超聲或高壓均質(zhì)處理，并傾入冰水中，從而制得長循環(huán)納米脂質(zhì)載體。
(5)長循環(huán)納米脂質(zhì)載體混懸于適當(dāng)緩沖液中(pH 4. O 6. O)中，分別加入 EDC和S · NHS的水溶液，室溫下反應(yīng)10 15m in。然后調(diào)pH至7. O 8. 5，加入PE5， 室溫孵育過夜，除去游離PE5，即得PE5修飾的長循環(huán)納米脂質(zhì)載體。
可用于實(shí)施本發(fā)明的抗腫瘤藥物包括但不限于羥基喜樹堿、阿霉素。
7.本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果(I)本發(fā)明得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，與EGFR親和力高，特異性強(qiáng)。
(2)本發(fā)明得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于構(gòu)建靶向治療EGFR高表達(dá)的腫瘤的載體。


圖1為流式細(xì)胞術(shù)測定肽與腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合圖；圖2為腫瘤細(xì)胞對FITC標(biāo)記肽的內(nèi)吞圖；圖3為非小細(xì)胞肺癌組織免疫熒光圖； 圖4為人非小細(xì)胞肺癌組織冰凍切片圖；圖5為AEYLR與NLC偶聯(lián)的電鏡圖；圖6為AEYLR與NLC偶聯(lián)的粒徑分布圖；圖7為NC1-H1299細(xì)胞對納米粒的攝取及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；A. FITC-AEYLR-PEG-NLC, B. FITC-RALEL-PEG-NLC, C. FITC- PEG-NLC0具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1EGFR含有3個(gè)可以調(diào)控EGFR活性的主要自磷酸化作用位點(diǎn)，分別為Y1068，Y1148和 Y1173。采用序列比較/結(jié)構(gòu)分析的方法設(shè)計(jì)來源于三個(gè)主要作用位點(diǎn)的氨基酸序列作為靶向 EGFR 小分子肽配體EY1ci68INQ , PDY1148QQD , AEY1173LR。
為篩選與EGFR結(jié)合的特異性強(qiáng)的活性小肽，我們合成了 FITC標(biāo)記的 EYINQ、PDYQQD, AEYLR、RALEL (無關(guān)肽)、NYQQN (Mineo Abe, et al.1nhibition of Autophosphorylation of Epidermal Growth Factor Receptor by a Small Peptide Not Employing an ATP-Competitive Mechanism, Biopolymers 89 (2007) 40-51.)，并選擇了 LARLLT作為對照，對LARLLT也進(jìn)行了 FITC標(biāo)記。釆用流式細(xì)胞術(shù)分析上述各肽與表達(dá) EGFR(NC1-H1299)(圖1A)及幾乎不表達(dá)EGFR (K562)(圖1B)的不同細(xì)胞系的結(jié)合率。
如圖1C，結(jié)果表明，上述肽與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合率隨著濃度的增加而增加， FITC-AEYLR (箭頭I所示曲線)與NC1-H1299細(xì)胞的結(jié)合率都高于FITC-EHNQ、 FITC-PDYQQD，F(xiàn)ITC-NYQQN，F(xiàn)ITC-RALEL (箭頭之外的 4 條曲線)以及對照肽 FITC-LARLLT (箭頭I所示曲線XFITC-LARLLT與NC1-H1299細(xì)胞的結(jié)合率都高于FITC-EHNQ、FITC-PDYQQD，F(xiàn)ITC-NYQQN, FITC-RALEL。圖1D現(xiàn)顯示上述FITC標(biāo)記的肽與K562細(xì)胞均無顯著的結(jié)合。 說明FITC-AEYLR與高表達(dá)EGFR的細(xì)胞具有較高的結(jié)合活性。
實(shí)施例2為進(jìn)一步考察各肽與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合情況，我們進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)(FITCSE 的肽10 μ M與NC1-H1299及Κ562細(xì)胞37 °C孵育I小時(shí))，如圖2所示，F(xiàn)ITC-AEYLR與 FITC-LARLLT均能有效介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞，而K562細(xì)胞則無此作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1 一致。
實(shí)施例3為進(jìn)一步鑒別這種靶向配體是否對人肺癌活檢標(biāo)本有親和力，我們用免疫組化測試了 AEYLR和RALEL與肺癌患者肺腺癌的反應(yīng)性。制備人肺腺癌石蠟切片，封閉內(nèi)源性過氧化酶活性，然后與生物素標(biāo)記的AEYLR和RALEL —起保溫，用HRP-str印tavidin以常規(guī)免疫組化染色來檢測，以EGFR單克隆抗體做對照。
結(jié)果如圖3所示，生物素標(biāo)記的AEYLR能識(shí)別人肺腺癌活檢標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞， 所顯示的顏色與EGFR單克隆抗體接近，而生物素標(biāo)記的無關(guān)肽RALEL不能結(jié)合肺腺癌活檢標(biāo)本，無明顯顏色變化。這些數(shù)據(jù)表明，AEYLR能識(shí)別肺腺癌患者癌細(xì)胞表面的EGFR。
實(shí)施例4制備人肺腺癌冰凍切片，封閉內(nèi)源性過氧化酶活性，然后與FITC標(biāo)記的AEYLR和RALEL 顯色，用FITC標(biāo)記的EGFR抗體做對照。
結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)ITC-AEYLR能識(shí)別人肺腺癌活檢標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞,所顯示的熒光比FITC標(biāo)記的EGFR抗體稍弱，而無關(guān)肽FITC-RALEL不能結(jié)合肺腺癌患者癌細(xì)胞表面的EGFR，未見有明顯熒光。
實(shí)施例5為進(jìn)一步檢測AEYLR作為靶向配基的安全性，進(jìn)行了 MTT實(shí)驗(yàn)，將NC1-H1299細(xì)胞以 5000個(gè)/孔的密度接種與96孔板，以不同濃度的AEYLR接種于96孔板，培養(yǎng)96小時(shí)。結(jié)果顯示AEYLR對細(xì)胞沒有明顯的促進(jìn)增殖和抑制的作用，是一個(gè)比較安全的靶向配基。
實(shí)施例6為進(jìn)一步檢驗(yàn)AEYLR的靶向性，我們采用近紅外染料Cy5. 5標(biāo)記AEYLR和無關(guān)肽 RALEL,通過尾靜脈向 NC1-H1299 移植荷瘤小鼠注射 PBS、Cy5. 5、AEYLR- Cy5. 5、RALEL-Cy5. 5，隨后在不同時(shí)間點(diǎn)麻醉小鼠，并用Optix體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)(GE Healthcare)成像。 每組至少3只鼠。注射后不同時(shí)間點(diǎn)對小鼠體內(nèi)Cy5. 5的熒光分布成像。
Cy5. 5染料注射的小鼠中，腫瘤區(qū)域的熒光信號(hào)與背景一致，但是在AEYLR-Cy5. 5注射的小鼠中，注射后I到6小時(shí)之間，與周圍組織相比，腫瘤組織的熒光信號(hào)更強(qiáng)， 而無關(guān)肽RALEL- Cy5. 5注射的小鼠在腫瘤區(qū)域內(nèi)未顯示出任何熒光聚集。
實(shí)施例7將輕基喜樹堿O. 5mg,單硬脂酸甘油酯40mg,大豆油IOmg,磷脂15mg, DSPE-PEG2000-C00H 6mg加入適量乙醇溶解，旋轉(zhuǎn)蒸干除去有機(jī)溶劑，80°C熔融作為油相。 將PEG分子量為2000的硬脂酸酯18mg溶于4. 7ml注射用水中，加熱至80°C作為水相。在 600r/min攪拌條件下緩慢將水相加至有機(jī)相中，制備初乳；滴加后繼續(xù)攪拌lOmin，探頭超聲(20%功率，20s)，然后至冰浴中迅速攪拌冷卻，制得長循環(huán)納米脂質(zhì)載體。
長循環(huán)納米脂質(zhì)載體混懸于Mes buffer ( pH 5.0)中，分別加入EDC和S *NHS的水溶液，室溫下反應(yīng)10 m in，超濾；加入pH7.4 PBS重懸，加入PE5，室溫孵育過夜，透析除去游離PE5，即得PE5修飾的長循環(huán)納米脂質(zhì)載體。
實(shí)施例8按上述納米粒的方法制備過程中加入DSPE-PEG-biotin，滴加avidin_FITC制備熒光標(biāo)記的NLC。NC1-H1299細(xì)胞加入12孔板中過夜培養(yǎng)，加入上述FITC標(biāo)記的納米粒，37°C 孵育I小時(shí)，熒光顯微鏡觀察形態(tài)，流式細(xì)胞技術(shù)測定納米粒與細(xì)胞的結(jié)合率。
如圖7所示，AEYLR連接的納米粒可有效地使NLC進(jìn)入細(xì)胞，無關(guān)肽RALEL連接的納米粒與沒有連接肽的納米粒相比，沒有顯著性差異。
實(shí)施例9將PE5與對照肽RALEL溶解在PBS-EDTA中，N-琥珀酰亞胺-3- (2-吡啶二硫代)-丙酸酯(STOP)溶解于DMSO中，室溫下與肽以1. 2:1的摩爾比混合I小時(shí)后凍干，得到硫化的肽。DSPE-PEG2000-Mal溶于氯仿中，蒸干形成薄膜，在Ifepes緩沖液(pH7. 4)中水化，濃度大約為0.4馳。將已經(jīng)硫化的肽加到三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中，室溫下加氮?dú)夥跤齀 小時(shí)，立刻與DSPE-PEG2000-Mal膠束以5:1的摩爾比混合，在氮?dú)饬飨?0°C保持?jǐn)嚢璺磻?yīng)過夜。通過HPLC分析，幾乎所有的DSPE-PEG2000-Mal都被修飾。過量的肽可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)除去，凝膠過濾、透析等。
將阿霉素O. 5mg,單硬脂酸甘油酯40mg,大豆油IOmg,磷脂15mg, DSPE-PEG2000-PE5 6mg加入適量乙醇溶解，旋轉(zhuǎn)蒸干除去有機(jī)溶劑，80°C熔融作為油相。將 PEG分子量為2000的硬脂酸酯18mg溶于4. 7ml注射用水中，加熱至80°C作為水相。在 600r/mi n攪拌條件下緩慢將水相加至有機(jī)相中，制備初乳；滴加后繼續(xù)攪拌lOmin，探頭超聲(20%功率，20s)，然后至冰浴中迅速攪拌冷卻，制得PE5修飾的長循環(huán)納米脂質(zhì)載體。
權(quán)利要求
1.一種靶向EGFR受體的肽，其特征在于靶向EGFR受體的肽的序列如SEQ ID NO:1、 SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其由SEQID NO:3組成。
3.—種靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于，所述的修飾的納米脂質(zhì)載體包含下列的序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于，其包含位于所述納米脂質(zhì)載體與所述肽之間的交聯(lián)劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于，所述的納米脂質(zhì)載體包括固態(tài)脂質(zhì)材料、液態(tài)油、脂溶性乳化劑、PEG修飾的脂類、水溶性乳化劑、附加劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于，所述的 PEG 修飾的脂類選自 DSPE-PEG-C00H，DSPE-PEG-NH2, DSPE-PEG-mal。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于所述固態(tài)脂質(zhì)材料為硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蘧酸甘油酯、蜂蠟、十六醇、十六醇酯、山崳酸甘油酯、卵磷脂、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯中的任意一種或任意兩種的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于所述液態(tài)油為大豆油、油酸、花生油、三油酸甘油酯、Miglyol 812、維生素E、維生素A中的一種或任意兩種的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于所述脂溶性乳化劑選自磷脂類、脂肪酸山梨坦類、聚山梨酯類、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物類、聚氧乙烯脂肪酸脂類、聚氧乙烯脂肪醇醚類或其任意組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質(zhì)載體，其特征在于還包含一種選自下列的藥物羥基喜樹堿或阿霉素。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種靶向EGFR受體的多肽及其應(yīng)用，本發(fā)明的設(shè)計(jì)來自于EGFR主要自磷酸化作用位點(diǎn)的小肽EY1068INQ(SEQ ID NO:1)，PDY1148QQD(SEQ ID NO:2)，AEY1173LR(SEQ ID NO:3)，所述的肽用于修飾納米脂質(zhì)載體，所述的納米脂質(zhì)載體包括固態(tài)脂質(zhì)材料、液態(tài)油、脂溶性乳化劑、PEG修飾的脂類、水溶性乳化劑、附加劑。本發(fā)明具有如下特點(diǎn)(1)得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，與EGFR親和力高，特異性強(qiáng)。(2)本發(fā)明得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于構(gòu)建靶向治療EGFR高表達(dá)的腫瘤的載體。
文檔編號(hào)A61K47/42GK102993272SQ201210491720
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者潘衛(wèi)三, 韓翠艷, 楊星鋼, 太玲鈺, 孫明爽, 李靜 申請人:沈陽藥科大學(xué)