專利名稱：表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別涉及一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(reticuloendotheliosis，RE)是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)群的反轉(zhuǎn)錄病毒引起的禽類的病理綜合征，包括急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤形成、矮小綜合征和淋巴組織與其它組織慢性腫瘤。
REV屬于哺乳動(dòng)物C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，基因大小為9. Okb,主要編碼核心蛋白 (gag)、酶蛋白(pol)和囊膜蛋白(env)。其中env基因編碼兩種糖蛋白gp90和gp20, gp90 為表面蛋白，是病毒的免疫原蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。RE不僅能引起禽生長(zhǎng)遲緩、 廢棄淘汰率升高和死亡，還能引起免疫抑制，干擾其它禽病疫苗的免疫效應(yīng)，引起免疫失敗，并易繼發(fā)感染其它禽病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)已引起廣大研究者的高度重視。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為
本發(fā)明的一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中含有SEQ ID NO.1所示的序列。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的DNA疫苗是通過(guò)將SEQ ID NO.1所示的序列克隆入 PCAGGS表達(dá)載體中得到的。
進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA 疫苗的構(gòu)建方法，其 特征在于包括以下步驟
(I)根據(jù)雞偏嗜密碼子將REV gp90基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的REV gp90基因序列如SEQ ID NO.1所示，在優(yōu)化后的基因兩端分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，合成基因；
(2)將合成的基因克隆到PUC19載體中，構(gòu)建pUC19-optigp90重組質(zhì)粒；
(3)將pUC19-optigp90重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得optigp90基因；
(4 )將opt i gp90基因克隆到用同樣酶酶切后的pCAGGS表達(dá)載體中，構(gòu)建得到 pCAGoptigp90重組表達(dá)質(zhì)粒，即為所述的DNA疫苗。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，步驟(I)中所述的酶切位點(diǎn)為EcoR1、ClaI。
在本發(fā)明中，更優(yōu)選的，所述的構(gòu)建方法還包括對(duì)所述重組表達(dá)質(zhì)粒 pCAGoptigp90進(jìn)行提取純化。
更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的DNA疫苗在制備治療或預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病藥物中的應(yīng)用。
與傳統(tǒng)疫苗相比，本發(fā)明DNA疫苗既擁有亞單位疫苗和滅活疫苗的安全性，又具有只有弱毒疫苗或重組疫苗才有的同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。


圖1為重組質(zhì)粒pCAGoptigp90PCR和酶切鑒定結(jié)果；
圖2為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48h后間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果；
圖3為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48h后Western blot檢測(cè)結(jié)果；
圖4為REV DNA疫苗pCAGoptigp90免疫后各周雞體內(nèi)抗體滴度檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，絕不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施列I表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的構(gòu)建及表達(dá)
I材料和方法
1.1病毒株和細(xì)胞
REV HLJR0901株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病課題組分離鑒定并保存。PUC19載體、pCAGGS載體和DF-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買得到。
1. 2儀器與試劑
質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自omega公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司；紫外分 光光度計(jì)購(gòu)自GE公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自invitrogen ;RIPA裂解液購(gòu)自碧云天公司；血液基因組提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司； REVgp90單克隆抗體、大腸桿菌感受態(tài)ToplOF’有本實(shí)驗(yàn)室保存。
1. 3表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增增病病毒gp90基因的DNA疫苗的構(gòu)建步驟
(I)根據(jù)雞偏嗜密碼子將REV gp90基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的REV gp90基因的序列如SEQ ID NO.1所示，在優(yōu)化后的基因的兩端設(shè)計(jì)有EcoRI和ClaI酶切位點(diǎn)，送金斯特公司合成。
(2)將合成的REV gp90基因片段與載體pUC19分別用EcoRI和ClaI雙酶切，回收。將載體與外源片段以摩爾比1:3的比例混合，用T4DNA連接酶于22°C連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，以EcoRI和ClaI雙酶切及PCR進(jìn)行鑒定，并測(cè)序確證，鑒定陽(yáng)性克隆，獲得重組質(zhì)粒pUC19-optigp90。
(3)將重組質(zhì)粒pUC19-optigp90和表達(dá)載體pCAGGS分別用EcoRI和ClaI雙酶切，回收基因片段optigp90和載體片段pCAGGS，凝膠回收操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將載體與外源片段以摩爾比1:3的比例混合，用T4DNA連接酶于22°C連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，以EcoRI和ClaI雙酶切及PCR進(jìn)行鑒定，并測(cè)序確證， 鑒定陽(yáng)性克隆，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGGSoptigp90。
(4)使用Endofree質(zhì)粒大題試劑盒對(duì)重組質(zhì)粒pCAGGSoptigp90進(jìn)行提取純化,按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1. 4體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)
將DF-1細(xì)胞飼養(yǎng)于六孔板內(nèi)，所用培養(yǎng)液是含10%PAA胎牛血清的DMEM。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60-80%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，用無(wú)雙抗的Hank’s液將細(xì)胞洗三次，再用少量的opti_MEM 培養(yǎng)基將待轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞洗一次，然后每孔加入1. 5mL opt1-MEM，于37°C CO2培養(yǎng)箱孵育lh， 將4 μ L重組質(zhì)粒pCAGoptigp90 (質(zhì)粒濃度為I μ g/ μ L)稀釋于246 μ L opt1-MEM中；同時(shí)，取10 μ L Lipofectamine 2000稀釋于240 μ L opt1-MEM中，輕微混勻，室溫孵育5min ； 將稀釋的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000在一個(gè)EP管中輕微混勻，室溫孵育20min ;將質(zhì)粒和 Lipofectamine 2000混合液滴加于剛才處理過(guò)的DF-1細(xì)胞單層上，置37°C C02培養(yǎng)箱孵育；IOh后，吸去培養(yǎng)液，用含雙抗的Hank’ s液將細(xì)胞洗二次，每孔細(xì)胞加入2mL DMEM (含 10%PAA胎牛血清和100U/mL雙抗)置37°C CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。48h后收獲細(xì)胞，進(jìn)行 Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立pCAGGS空載體轉(zhuǎn)染孔和正常細(xì)胞孔兩個(gè)陰性對(duì)照。
2 結(jié)果
2.1重組質(zhì)粒pCAGoptigp90的構(gòu)建
PCR及雙酶切鑒定均顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGoptigp90構(gòu)建正確(圖1)，測(cè)序結(jié)果表明目的片段及讀碼框均正確。
2. 2重組質(zhì)粒pCAGoptigp90在DF-1細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
重組質(zhì)粒pCAGoptigp90在轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后，經(jīng)間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)特異的的熒光，兩種陰性對(duì)照均未見(jiàn)特異的熒光(圖2)。收集轉(zhuǎn)染后48h的DF-1細(xì)胞，用gp90單抗進(jìn)行western blot分析，結(jié)果pCAGoptigp90質(zhì)粒轉(zhuǎn)染孔可檢測(cè)出分子量約為44-62kDa的gp90蛋白，陰性對(duì)照孔未檢測(cè)到特異性條帶(圖3)。其中44KDa的條帶為未糖基化的gp90蛋白，62KDa條帶為正確糖基化的gp90蛋白，44_62KDa之間的條帶為部分糖基化的gp90蛋白。
實(shí)施例2本發(fā)明的DNA疫苗的免疫試驗(yàn)
I材料和方法
1.1 試劑
REV抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司。
1. 2SPF 雞
SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，3周齡SPF雞試驗(yàn)期間飼養(yǎng)于禽病感染實(shí)驗(yàn)室的負(fù)壓隔離器中
1. 3、方法
將3周齡SPF雞隨機(jī)分為2組，12只/組，第I組注射100 μ g重組質(zhì)粒 pCAGoptigp90，第2組注射100 μ g pCAGGS,體積均為200 μ L，腿肌兩點(diǎn)注射。3周齡首次免疫，首次免疫后3周以同樣劑量和方式加強(qiáng)免疫。免疫后每周采集血清，用REV抗體檢測(cè)試劑盒(IDEXX)檢測(cè)REV抗體滴度。在二免后3周各組均攻毒REV(HLJR0901株)IO4TCID50/ 只，攻毒后7天采集抗凝血，提取DNA，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)血液病毒載量。
2、結(jié)果
REV DNA疫苗pCAGoptigp90以100 μ g劑量免疫3周齡SPF雞，二免之前REV抗體為陰性，二免后抗體滴度和陽(yáng)轉(zhuǎn)率迅速升高，并于二免后2周達(dá)到最高。二免后3周，REV抗體滴度為3924，抗體陽(yáng)性率為83% (圖4)。pCAGGS空載體免疫組在試驗(yàn)期間REV抗體均為陰性。二免后3周，各組雞均攻毒REV (HLJR0901株)IO4TCID50/只，攻毒后7天，采集抗凝血檢測(cè)病毒血癥，結(jié)果表明，在每組12只雞中，pCAGGS免疫組有11只為陽(yáng)性，pCAGoptigp90 免疫組僅有3只為陽(yáng)性，保護(hù)率為75%。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅是說(shuō)明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)?！?br> 序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱膂醫(yī)研究所<120>表達(dá)禽兩狀內(nèi)皮組織增牛.病病毒gp90基西的DNA疫莆及其構(gòu)建方法和應(yīng)<130>KLPI120888<170>PatentIn 3. 5<210>I<211>1191bp<212>DNA<213>優(yōu)化后的gp90基H的核皆酸序列<400>Iatqqactgcctgaccaacctacqcaqccfccgaqggcaaqgtgcratcaagctgacaagacc60ctgatcctgctggtcgtgtggtgqfggcttcgqfcaccaccgccgagggctaccccctgcag120cacfctcftgqgacctgccctgcgactcfcacfcggcggctacgtgttcagcatccccacctac·180tacaccaactctctcjgactcfccfgcagcaqcacccfcctacctcfacctaccfcjcagcggcaca240ggcagctggggctggggcggcggcttcccfccaqcaqtcrqgagtgcatqttcaagcccaag300atcatccccagcgtgcaggcjccaqrcccggcccctqfccccagcgagtgcctcfaccatcgcc360acccagatgcacagcacctgctacgaqfaaqfgctcaggagtQcacoctgctgcfgcaagacc420tacttcaccgccatcctcrcaaaagaccaagctaggcaqctacqaaaacggccccaacaag480ctgctgcaggccagctgcacaggcaccatcgqfcaagccccrtgtgctgggaccccgtggct540cccgtcftacgtgagcgacggcgacgaccccaccgacatcratccgccfacrqaqaacqtq·600gagacfactgcjacjgacjatcatccgccacagctaccGcagccftqcagtaccacccactcf y、6G0ctacccagacccagaagcqtagatctgqacccccaqaccagccracattctggaggccacc720catcaggtgctgaacgccaccaacccccaqrctgqfccqfagaactgctggctcftgcatcfaca780ctcfcfgcacccccatccccgccgccatccccgGcaacgcfcaaccftqacactggacqqcaac540tgcagcctgagcotqcccttccgcgtqfcaqfcccacaggcagfcatcgacgtgaactgctac900qctagcgaqgccqacaaccgcacagqcatccccatcgqctacqtcfcacttcaccaactgc960accagcattcaggaggtgagcaacgagaccagfccacatccgcaacctgacccgcctgtgc1020ccaccacccgcfccaccrtcfttcgtgtcfccrcfcaacaacatcrgcctacaccgccct.gcccaac1080aagtqgatcggcctcjtcfcattotQCfccaqcatccftgccccfacatgacjcatcatcagcgqc1140qaaqaacccatccccctgcccagcatcgagtacaccgctggccgccacaag119權(quán)利要求
1.一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA 疫苗中含有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗是通過(guò)將SEQIDNO.1所示的序列克隆入pCAGGS表達(dá)載體中得到的。
3.—種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)根據(jù)雞偏嗜密碼子將REVgp90基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的REV gp90基因序列如SEQ ID NO.1所示，在優(yōu)化后的基因兩端分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，合成基因；(2)將合成的基因克隆到pUC19載體中，構(gòu)建pUC19-optigp90重組質(zhì)粒；(3)將pUC19-optigp90重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得optigp90基因；(4)將optigp90基因克隆到用同樣酶酶切后的pCAGGS表達(dá)載體中，構(gòu)建得到 pCAGoptigp90重組表達(dá)質(zhì)粒，即為所述的DNA疫苗。
4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(I)中所述的酶切位點(diǎn)為EcoR1、 Clal。
5.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于還包括對(duì)所述重組表達(dá)質(zhì)粒 pCAGoptigp90進(jìn)行提取純化。
6.權(quán)利要求1或2所述的DNA疫苗在制備治療或預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒gp90基因的DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明將REV gp90基因根據(jù)雞偏嗜密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化，基因兩端設(shè)計(jì)兩個(gè)酶切位點(diǎn)，克隆入pUC19載體中，得到pUC19-optigp90重組質(zhì)粒，將其進(jìn)行雙酶切，將獲得的optigp90基因亞克隆至pCAGGS表達(dá)載體中，構(gòu)建了pCAGoptigp90重組表達(dá)質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒免疫SPF雞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該DNA疫苗可以誘導(dǎo)SPF雞產(chǎn)生REV抗體，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為83%，免疫保護(hù)率為75%。本發(fā)明DNA疫苗既有亞單位疫苗和滅活疫苗的安全性，又具有弱毒疫苗或重組疫苗同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102988969SQ20121049538
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者王笑梅, 高宏雷, 祁小樂(lè), 高玉龍, 秦立廷, 王永強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所