專利名稱：穩(wěn)定化的藥物肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及穩(wěn)定的藥物組合物的制備方法，該組合物由在高于中性pH的pH下處理的大量肽產(chǎn)物制備。
背景技術(shù)：
治療肽廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實踐。要求這種治療肽的藥物組合物的保存期為數(shù)年，以適于常規(guī)應(yīng)用。但是，肽組合物天生是不穩(wěn)定的，因為它們對化學(xué)和物理降解敏感?；瘜W(xué)降解涉及共價鍵的變化，例如氧化、水解、外消旋化或交聯(lián)。物理降解包括相對于肽的天然結(jié) 構(gòu)，即二級和三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，例如聚集、沉淀或吸附至表面。胰高血糖素已在醫(yī)學(xué)實踐中應(yīng)用于糖尿病數(shù)十年，且許多胰高血糖素樣肽正被研制用于多種治療適應(yīng)癥。前高血糖素原基因編碼胰高血糖素以及胰高血糖素樣肽I (GLP-I)和胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)。GLP-I類似物和衍生物以及同源性晰蜴肽(lizardpeptide)、exendin-4正被研制用于治療II型糖尿病的高血糖癥。GLP-2潛在地可用于治療胃腸疾病。但是，所有這些包含29-39個氨基酸的肽具有高度同源性，且它們共同具有許多特性，特別是它們聚集和形成不溶性原纖維的傾向。這種性質(zhì)似乎包括從主要的α-螺旋構(gòu)象向β_折疊的轉(zhuǎn)變(BlundellT. L. (1983)。胰高血糖素的構(gòu)象。在:LefebvreP. J. (Ed)Glucagon I. Springer Verlag, pp 37-55, Senderoff R. I.等人,J. Pharm.Sci. 87 (1998) 183-189, WO 01/55213)。胰高血糖素樣肽的聚集主要在攪拌或振蕩肽溶液時、在溶液和氣相(空氣)之間的界面以及在與疏水表面如Teflon 接觸時看到。因此，經(jīng)常必須將多種賦形劑添加到胰高血糖素樣肽的藥物組合物中，以改善它們的穩(wěn)定性。這些肽的液體腸胃外制劑的保存期限必須為至少一年，優(yōu)選更長?？梢悦刻煸谑覝叵罗D(zhuǎn)運并振蕩的產(chǎn)物的使用期間優(yōu)選應(yīng)該為數(shù)周。因此，需要穩(wěn)定性得到改善的胰高血糖素樣肽的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
我們已意外地發(fā)現(xiàn)，已在高于8. O的pH下處理的大量肽產(chǎn)物可以增加由這些大量肽產(chǎn)物制備的藥物組合物的穩(wěn)定性。定義以下是用于說明書的術(shù)語的詳細(xì)定義。本文所用的術(shù)語“有效量”意指與不進(jìn)行治療相比足以有效地治療患者的劑量。本文關(guān)于藥物組合物所用的術(shù)語“重構(gòu)的(reconstituted)”意指已通過將水或適宜的水溶液添加到包含活性藥物成分的固體材料中而形成的組合物水溶液。在不能生產(chǎn)具有可接受的保存期限的液體組合物時，會使用用于重構(gòu)的藥物組合物。重構(gòu)的藥物組合物的實例是在將水或適宜的水溶液加到凍干的組合物時產(chǎn)生的溶液。該溶液通常用于腸胃外給藥，因此可以使用注射用水或任何其它適宜的溶劑以重構(gòu)該固體材料。本文所用的術(shù)語“治療疾病”意指控制或護(hù)理已患疾病、癥狀或病癥的患者。治療的目的是抗擊疾病、癥狀或病癥。治療包括施用活性化合物以消除或控制該疾病、癥狀或病癥和緩解與該疾病、癥狀或病癥有關(guān)的癥狀或并發(fā)癥。本文所用的術(shù)語“胰高血糖素樣肽”指由前高血糖素原基因、exendins及其類似物和衍生物衍生的同源肽。由前高血糖素原基因衍生的肽為胰高血糖素、胰高血糖素樣肽I (GLP-I)、胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)和oxynthomodulin (OXM)。在Gila畸形中發(fā)現(xiàn)的exendins與GLP-1同源，也發(fā)揮促胰島素作用。Exendins的實例為exendin-4和exendin_30胰高血糖素樣肽具有以下序列
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胰高HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMNT-NH2
GLP l HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR GGLP-2 HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK IlDExendin-4 HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2Exendin-3 HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2
OXMHSOGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA本文關(guān)于肽所用的術(shù)語“類似物”意指被修飾的肽，其中該肽的一個或多個氨基酸殘基已被其它氨基酸殘基取代，和/或其中該肽上缺失一個或多個氨基酸殘基，和/或其中該肽上缺失一個或多個氨基酸殘基，和/或其中已將一個或多個氨基酸殘基添加到該肽上。這種氨基酸殘基的添加或缺失可以在肽的N-末端和/或在肽的C-末端發(fā)生。通常用兩種不同和簡單的系統(tǒng)描述類似物例如Arg34-GLP-I (7-37)或K34R-GLP-1 (7_37)指這樣的GLP-I類似物，其中1-6位的氨基酸殘基缺失，且在34位的天然存在的賴氨酸已被精氨酸取代(根據(jù)IUPAC-IUB命名法使用的氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫)。本文關(guān)于母體肽所用的術(shù)語“衍生物”意指化學(xué)修飾的母體蛋白或其類似物(其中在該母體蛋白或其類似物上不存在至少一個取代基)，即已被共價修飾的母體蛋白。典型的修飾是酰胺、糖類、烷基、?；Ⅴ?、聚乙二醇化(pegylation)等。GLP-1 (7_37)衍生物的實例為 Arg34, Lys26 (NE-(y -Glu (Na-十六烷?；?))-GLP-I (7-37)。本文所用的術(shù)語“GLP-1肽”意指GLP-I (7-37)、GLP-I類似物、GLP-I衍生物或GLP-I類似物的衍生物。本文所用的術(shù)語“GLP-2肽”意指GLP-2 (1-33)、GLP-2類似物、GLP-2衍生物或GLP-2類似物的衍生物。本文所用的術(shù)語“exendin-4肽”意指 exendin-4(1-39)、exendin-4 類似物、exendin-4衍生物或exendin-4類似物的衍生物。本文所用的術(shù)語“穩(wěn)定的exendin-4化合物”意指化學(xué)修飾的exendin-4 (1_39),即通過以下方法測定在人身上表現(xiàn)出至少10小時的體內(nèi)血漿消除半衰期的類似物或衍生物。exendin-4化合物在人體內(nèi)的血楽;消除半衰期的測定方法是將該化合物溶于等滲緩沖液，PH 7.4，PBS或任何其它適宜的緩沖液。外周注射該劑量，優(yōu)選在腹部或上部大腿進(jìn)行。以頻繁的時間間隔取血樣用于測定活性化合物，并持續(xù)充足的時間，以覆蓋末期消除部分(例如服藥前、服藥后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小時)。如Wilken等人，Diabetologia43 (51) :A143, 2000所述測定活性化合物的濃度。使用非隔室方法，利用可商購得到的軟件WinNonlin Version 2. I (Pharsight, Cary, NC, USA)由各個單獨的受試者的濃度-時間數(shù)據(jù)計算導(dǎo)出藥代動力學(xué)參數(shù)。通過對濃度-時間曲線的末期log-線性部分進(jìn)行l(wèi)og-線性回歸分析來估算末期消除速率常數(shù)，并用于計算消除半衰期。 本文所用的術(shù)語“DPP-IV保護(hù)的exendin-4化合物”意指已被化學(xué)修飾以使該化合物耐受血漿肽酶-二肽基氨肽酶_4 (DPP-IV)的exendin-4化合物。
本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)的exendin-4化合物”意指作為與exendin-4 (1-39)相比在人體內(nèi)的免疫反應(yīng)減小的exendin-4 (1_39)的類似物或衍生物的exendin-4化合物。評價免疫反應(yīng)的方法是測定在治療患者4周后與該exendin-4化合物有反應(yīng)性的抗體的濃度。本文所用的術(shù)語“大量產(chǎn)物”或“大量肽產(chǎn)物”意指將用于制備藥物組合物的純化肽產(chǎn)物。因此，大量肽一般以來自最后的純化、干燥或調(diào)制步驟的產(chǎn)物形式得到。該大量產(chǎn)物可以是結(jié)晶、沉淀、溶液或懸浮液。該大量產(chǎn)物在本技術(shù)中還已知為藥物。本文所用的術(shù)語“等電點”意指大分子如肽的總凈電荷為零時的pH值。在肽中可以存在許多帶電的基團(tuán)，在等電點處，所有這些電荷的總和為零，即負(fù)電荷數(shù)與正電荷數(shù)平衡。在高于等電點的PH下，肽的總凈電荷為負(fù)電荷，而在低于等電點的pH值下，肽的總凈電荷為正電荷。肽的等電點可以通過等電聚焦測定，或者它可以通過本領(lǐng)域中已知的計算算法由肽的序列估計。發(fā)明描述在一方面，本發(fā)明涉及一種用于增加包含胰高血糖素樣肽、藥學(xué)上可接受的緩沖劑和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在PH8. 1-9. 6范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種增加包含胰高血糖素樣肽和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在PH8. 1-9. 6范圍內(nèi)處理過的大量肽制備該藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種增加包含肽、藥學(xué)上可接受的緩沖劑和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在PH8. 1-9.6范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種增加包含肽和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在PH8. 1-9. 6范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于增加包含胰高血糖素樣肽、藥學(xué)上可接受的緩沖劑和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8. 5-9. 6范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。在一方面，本發(fā)明涉及一種用于增加包含胰高血糖素樣肽、藥學(xué)上可接受的緩沖劑和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在PH9. 0-9. 6范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。在一方面，本發(fā)明涉及一種用于增加包含胰高血糖素樣肽、藥學(xué)上可接受的緩沖劑和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在PH8. 1-11. 5范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。在一個實施方案中，該大量肽產(chǎn)物已在pH8. 1-10. O范圍內(nèi)處理過。在另一個實施方案中，該大量肽產(chǎn)物已在pH8. 5-11. 5范圍內(nèi)處理過。
在另一個實施方案中，該大量肽產(chǎn)物已在pH8. 5-10. O范圍內(nèi)處理過。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該大量肽產(chǎn)物已在指定的pH范圍內(nèi)和高于該大量肽的成核(作為不均勻或均勻的成核)的溫度至大約25°C的溫度下處理大約I分鐘至大約12小時。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該大量肽產(chǎn)物已在指定的pH范圍和大約5°C至大約25°C的溫度下處理大約I分鐘至大約30分鐘。應(yīng)該理解，本發(fā)明可以通過pH值、溫度和時間的多種組合實現(xiàn)。這三個變量可以在上述范圍內(nèi)相組合。但是,若一個或二個變量可以適宜地在該范圍的高端選擇,則剩下的一個或兩個變量一般取低值。例如，如果使用高PH值(如pHIO)，則優(yōu)選將它與較低的溫度(如大約5-10°C )和/或短時間(如少于大約I分鐘至大約6小時)相組合。變量的有用組合為pH 10. 0、5°C下大約3小時，pH 10. O、15°C下大約I小時，或者pH 11.0、5°C下大約I小時。不管是作為單一晶體還是作為多晶體，冰晶的生長是最初的成核過程，在緩慢和快速冷凍時，在低壓下冷凍水或水溶液均只產(chǎn)生冰。溶液的成核可以兩種方式發(fā)生，這取決于溶質(zhì)的濃度和溫度。如果將飽和溶液冷卻，則它不僅針對于冰相而言變得過度冷卻，還針對于溶質(zhì)而言變得過飽和。在缺少適宜冷凍核的情況下，該溶液可以是過冷卻的。因此，在多數(shù)情況下，使在較高PH下處理肽時的溫度保持高于肽的成核溫度。成核溫度對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，且通?？梢酝ㄟ^在不同的溫度下進(jìn)行實驗來測定相關(guān)肽的這一溫度。在一個實施方案中，該藥物組合物為溶液。在另一個實施方案中，該藥物組合物為懸浮液。在另一個實施方案中，該藥物組合物為固體，例如凍干制劑，在使用前由醫(yī)師或患者向其中加入溶劑。用于重構(gòu)的溶劑可以是注射用水或其它適宜的溶劑。在另一個實施方案中，該大量肽產(chǎn)物由在該pH下凍干該胰高血糖素樣肽的溶液或懸浮液而制備。在另一個實施方案中，在制備該藥物組合物期間，在該pH下處理該大量肽產(chǎn)物。在另一個實施方案中，在制備過程中，在最終的純化步驟之后，在該pH下處理該大量肽產(chǎn)物。在另一個實施方案中，在與該藥學(xué)上可接受的緩沖液混合前在該pH下處理該大
量肽產(chǎn)物。
在另一個實施方案中，該藥物組合物的pH低于處理該大量肽的溶液或懸浮液時的pH。在另一個實施方案中，該藥物組合物的pH比處理該大量肽的溶液或懸浮液時的pH低至少O. 8pH單位。在另一個實施方案中，該藥物組合物的pH比處理該大量肽的溶液或懸浮液時的pH低至少I. 5pH單位。包含根據(jù)本發(fā)明的胰高血糖素樣肽的藥物組合物可以經(jīng)腸胃外途徑施用于需要這種治療的患者。腸胃外給藥可以通過皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，借助注射器，可選地筆狀注射器來完成?？勺兺ǖ?可以通過輸注,例如通過使用輸液泵來完成給藥。在一個實施方案中，該藥物組合物或該藥物組合物的重構(gòu)溶液的pH為pH 7. O至pH 8.0，優(yōu)選pH 7. 2至pH 7.8。在另一個實施方案中，該藥物組合物或該藥物組合物的重 構(gòu)溶液的pH為pH 7. 2至pH 7. 6。在另一個實施方案中，該藥物組合物或該藥物組合物的重構(gòu)溶液的pH為pH 7. 4至pH 7. 8。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽的等電點為3. 0-7. 0，優(yōu)選4. 0-6. O。在一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為胰高血糖素、胰高血糖素類似物或其衍生物。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為oxynthomodulin。在一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為GLP-I、GLP-I類似物、GLP-I衍生物或GLP-I類似物的衍生物。在另一個實施方案中，該GLP-I類似物選自下述中=Gly8-GLP-I (7-36)-酰胺、Gly8-GLP-I (7-37)、Val8-GLP-I (7-36)-酰胺、Va 18_GLP - I (7-3 7)、Val8Asp22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-I (7-37)、Val8Glu22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Lys22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-I (7-37)、Val8Arg22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-I (7-37)、Val8His22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-I (7-37)、Val8Trp19Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-I (7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Glu22His37-GLP-I (7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-I (7-37)及其類似物。在另一個實施方案中，該GLP-I類似物的衍生物為Arg34，Lys26 (Νε-(γ -Glu (Na-十六烷?；?))-GLP-I (7-37)。GLP-1、其類似物以及GLP-I衍生物的制備方法可以見于例如WO 99/43706、WO00/55119、WO 00/34331 和 WO 03/18516。在另一個實施方案中，在pH 9. 5下處理該大量肽產(chǎn)物的溶液或懸浮液，且該藥物組合物的pH為7.4。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為GLP-I肽，而該藥物組合物或其重構(gòu)的組合物中胰高血糖素樣肽濃度為 O. lmg/mL-50mg/mL>0. lmg/mL-25mg/mL>lmg/mL-25mg/mL、lmg/mL-lOmg/mL 或 3mg/mL-8mg/mL0在一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為GLP-2、GLP_2類似物、GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物。在另一個實施方案中，該GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，例如一個賴氨酸，其中親脂性取代基連接到該賴氨酸的ε氨基上(可選地經(jīng)過間隔基)。GLP-2、其類似物以及以及GLP-2衍生物的制備方法例如可見于WO 99/43361和WO00/55119。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為a GLP-2肽，而該藥物組合物或其重構(gòu)的組合物中胰高血糖素樣肽濃度為O. lmg/mL-1OOmg/mL>O. lmg/mL-25mg/mL或Img/mL-25mg/mL0在一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為exendin-4、exendin-4類似物、exendin-4的衍生物或exendin-4類似物的衍生物。 在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為exendin-4。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為穩(wěn)定的exendin-4。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為DPP-IV保護(hù)的exendin-4。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為免疫調(diào)節(jié)的exendin-4。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為ZP-10 ([Ser38Lys39] Exendin-4 (1-39)LysLysLysLysLys-酉先胺)。exendin-4、其類似物以及exendin-4衍生物的制備方法可以例如見于WO99/43708、WO 00/41546 和 WO 00/55119。在另一個實施方案中，該胰高血糖素樣肽為exendin-4肽，而該藥物組合物或其重構(gòu)的組合物中胰高血糖素樣肽的濃度為5 μ g/mL-10mg/mL、5 μ g/mL-5mg/mL、5 μ g/mL-5mg/mL、0. lmg/mL-3mg/mL 或 0. 2mg/mL_lmg/mL。適用于藥物組合物的緩沖液對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，它包括但不限于正磷酸鹽、TRIS、甘氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、乙酸朽1檬酸鈉(citrate sodium acetate)、碳酸鈉、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸鈉和檸檬酸鈉或其混合物。在一個實施方案中，該藥物組合物包含Tris的緩沖液。在另一個實施方案中，該藥物組合物包含Bicine的緩沖液。用于藥物組合物的防腐劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，包括但不限于苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、芐醇、氯丁醇和硫柳汞或它們的混合物。 在一個實施方案中，該藥物組合物包含等滲劑。在另一個實施方案中，該藥物組合物包含等滲劑，它是氯化鈉、木糖醇、甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸、二甲砜、聚乙二醇、丙二醇或其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該藥物組合物還包含穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該制劑還包含選自高分子量聚合物或低分子量化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、不同的鹽(例如氯化鈉)、L-甘氨酸、L-組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物。這些特定的穩(wěn)定劑中的每一種均構(gòu)成本發(fā)明的可選擇的實施方案。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，該穩(wěn)定劑選自L-組氨酸、咪唑和精氨酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該穩(wěn)定劑選自PEG 3350、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、氯化鈉、L-甘氨酸、L-組氨酸、咪唑、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-異亮氨酸、L-天冬氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸及其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該制劑還包含螯合劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸的鹽，以及它們的混合物。這些特定的螯合劑中的每一種均構(gòu)成本發(fā)明的可替代選擇的實施方案。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該藥物組合物還包含表面活性劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，該表面活性劑選自去污劑、乙氧基化蓖麻油、聚二醇化甘油酯、乙?；视鸵凰狨ァ⒚撍嚼娲贾舅狨?、泊洛沙姆如188和407、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯衍生物如燒基化和燒氧基化衍生物(tweens、例如Tween-20或Tween-80)、甘油一酸酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酸酯或其聚氧乙烯衍生物、甘油、膽酸或其衍生物、卵 磷脂、醇和磷脂、甘油磷脂(卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰絲氨酸)、甘油糖脂(吡喃半乳糖苷)、鞘磷脂(神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin))和鞘糖脂(神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、DSS(多庫酯鈉、CAS登記號[577-11-7])、多庫酯鈣、CAS登記號[128-49-4])、多庫酯鉀、CAS登記號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、二棕櫚酰基磷脂酸、辛酸鈉、膽酸及其鹽和甘氨酸或?；撬峋Y合物、熊去氧膽酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-胺基-I-丙磺酸酯、陰離子(烷基-芳基-磺酸酯)一價表面活性劑、棕櫚酰基溶血磷脂?；?L-絲氨酸、溶血磷脂(例如乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的I-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)、溶血磷脂?；土字；憠A的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)_衍生物、例如溶血磷脂?；憠A、二棕櫚酰基磷脂?；憠A的月桂酰基和肉豆蘧?；苌?，以及極性頭基的修飾，即膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇和帶正電的DODAC、DOTMA, DCP、BISHOP、溶血磷脂?；z氨酸和溶血磷脂?；K氨酸，兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N，N- 二甲基胺基-I-丙磺酸酯、3-膽酰胺基-I-丙基二甲基胺基-I-丙磺酸酯、十二烷基磷酸膽堿、肉豆蘧?；苎字；憠A、雞蛋溶血卵磷脂)、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如十六烷基-三甲基溴化銨、十六烷基吡啶氯化物)、非離子表面活性劑、聚環(huán)氧乙烷/聚環(huán)氧丙烷嵌段共聚物(Pluronics/Tetronics, TritonX-100,十二燒基β -D-卩比喃葡萄糖苷)或聚合表面活性劑(Tween-40, Tween-80, Brij-35)、梭鏈孢酸衍生物_(例如牛磺-二氫梭鏈孢酸鈉等)、長鏈脂肪酸及其鹽C6-C12(例如油酸和辛酸)、?；舛緣A和衍生物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的N°-酰基化衍生物，或者賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈酰基化衍生物，包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸與中性或酸性氨基酸的任意組合的二肽的N°-?；苌?、包含中性氨基酸和兩個帶電氨基酸的任意組合的三肽的N° -?；苌?，或者該表面活性劑可以選自咪唑啉衍生物或其混合物。這些特定的表面活性劑中的每一種均構(gòu)成本發(fā)明的可替代的實施方案。在藥物組合物中使用賦形劑如防腐劑、等滲劑和表面活性劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。為方便起見，參見 Remington:TheScience and Practice of Pharmacy, 19thedition, 1995。在另一方面，本發(fā)明涉及包含胰高血糖素樣肽、藥學(xué)上可接受的緩沖液和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由根據(jù)本發(fā)明的方法制備的。
在另一方面，本發(fā)明涉及pH為大約7. 2至大約7. 8的藥物組合物，該組合物包含胰高血糖素樣肽和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該組合物在保存方面是穩(wěn)定的，這是通過該組合物于37°C下儲存I個月后該組合物中所含的胰高血糖素樣肽在硫黃素(thioflavin) T試驗中的突光增加小于2倍所測得的。在另一方面，本發(fā)明涉及包含肽、藥學(xué)上可接受的緩沖液和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由根據(jù)本發(fā)明的方法制備的。在另一方面，本發(fā)明涉及一種治療高血糖癥的方法，所述方法包括腸胃外施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。該母體胰高血糖素樣肽可以通過肽合成，例如固相肽合成，使用t-Boc或F-Moc化學(xué)法或其它已確定的技術(shù)來生產(chǎn)。該母體胰高血糖素樣肽還可以通過這樣一種方法生產(chǎn)，該方法包括培養(yǎng)含有該編碼多肽的DNA序列并能夠在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基上、在允許表達(dá)肽的條件下表達(dá)該多肽的宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基中回收所得的肽。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于宿主細(xì)胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基，例如含有適宜添加物的基本或復(fù)合培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基可購自商業(yè)供貨商或者可以根據(jù)已公開的配方(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。然后可以通過包括以下步驟的常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞產(chǎn)生的肽通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，通過鹽(如硫酸銨)沉淀上清液或濾液中的蛋白質(zhì)組分，通過多種色譜方法，例如離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法、親合色譜法等進(jìn)行純化，這取決于所討論的肽的類型。編碼母體肽的DNA序列可以適宜地來源于基因組或cDNA，例如通過以下方法獲得制備基因組或cDNA文庫，并通過雜交法，使用合成寡核苷酸探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如參見 Sambrook, J, Fritsch, EF 和 Maniatis, T, Molecular Cloning:A LaboratoryManual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)篩選編碼所述妝的全部或部分的DNA序列。還可以通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如Beaucage和Caruthers, TetrahedronLetters 22 (1981), 1859 - 1869 所述的 phosphoamidite 方法或者 Matthes 等人,EMBOJournal 3(1984), 801 - 805所述的方法來合成制備編碼肽的DNA序列。DNA序列還可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用特異性引物，例如按照US 4，683，202或Saiki等人，Science239(1988), 487-491中所述來制備?？梢詫NA序列插到可以方便地完成重組DNA過程的任何載體內(nèi)，載體的選擇一般取決于待引入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制型載體，即作為染色體外實體存在的載體，它的復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。作為可替代的選擇，該載體可以是這樣的載體它在被引入宿主細(xì)胞時將整合至宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并與已經(jīng)整合了它的染色體
一起復(fù)制。該載體優(yōu)選為表達(dá)載體，其中編碼肽的DNA序列可操作地連接了 DNA轉(zhuǎn)錄所需的額外片斷，例如啟動子。該啟動子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可以源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。用于在多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明的肽的DNA轉(zhuǎn)錄的適宜啟動子的實例在本領(lǐng)域中是已知的，例如參考Sambrook等人，上文。如果需要的話，編碼肽的DNA序列還可以可操作地連接適宜的終止子、聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄增強子序列和翻譯增強子序列。本發(fā)明的重組載體還可以包含能使該載體在所討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。該載體還可以包含可選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物能彌補宿主細(xì)胞中的缺陷的基因或者賦予對藥物(例如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤)的耐受性的基因。為了指導(dǎo)本發(fā)明母體肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(還已知為前導(dǎo)序列、prepro序列或pre序列)。該分泌信號序列以正確的閱讀框中與編碼該肽的DNA序列相連接。該分泌信號序列通常位于編碼該肽的DNA序列的5’偵U。該分泌信號序列可以是正常與該肽相關(guān)聯(lián)的序列，或者可以來自編碼另一種分泌蛋白的基因。用于分別連接編碼本發(fā)明肽、啟動子和可選地終止子和/或分泌信號序列的DNA序列的方法，和將它們插入含有用于復(fù)制所需信息的適宜載體的方法，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的(例如參見Sambrook等人，上文)。
引入DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞可以是任何能夠產(chǎn)生本發(fā)明肽的細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。在本領(lǐng)域中熟知并使用的適宜宿主細(xì)胞的實例有、但不限于大腸桿菌、釀酒酵母或哺乳動物BHK或CHO細(xì)胞系。
具體實施例方式通過以下實施例進(jìn)一步例示本發(fā)明，但這些實施例不應(yīng)被理解為對本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行限定。前面的說明和以下實施例公開的特征單獨或者任意組合方式均可以構(gòu)成以不同方式實現(xiàn)本發(fā)明的實質(zhì)。實施例在下面，“化合物I”意指Arg34，LyS26(NE-U-Glu(N°-十六烷酰基)))-GLP-l(7-37)。在凍干該肽的溶液或懸浮液之前，將其pH調(diào)節(jié)至目標(biāo)pH。在凍干藥物制劑后，根據(jù)一般方法I和2制備藥物制劑。一般方法I將防腐劑、等滲劑和緩沖液溶于水，并將pH調(diào)節(jié)至7. 4。然后將凍干的肽溶解，同時緩慢攪拌。用氫氧化鈉和/或鹽酸將PH調(diào)節(jié)至7. 4。最后通過0.22 μ m濾器過濾制劑。一般方法2將防腐劑、等滲劑和緩沖液溶于水，并將pH調(diào)節(jié)至7. 4。將肽溶于水，同時緩慢攪拌。將兩種溶液混合，并用氫氧化鈉和/或鹽酸調(diào)節(jié)PH至7. 4。最后通過0.22 μ m濾器過濾制劑。另一種制備穩(wěn)定的藥物制劑的方法是在包含藥物的溶液中將pH升至高于中性PH (>8)。該藥物制劑如一般方法3所述制備。一般方法3將防腐劑、等滲劑和緩沖液溶于水，并將pH調(diào)節(jié)至7. 4或更低。將化合物I溶于水，同時緩慢攪拌，并通過加入氫氧化鈉而將PH調(diào)節(jié)至11. 5。在大約5分鐘后，將兩種溶液混合，并用氫氧化鈉和/或鹽酸調(diào)節(jié)PH至7. 4。最后通過O. 22 μ m濾器過濾制劑。通過硫黃素T-試驗評價制劑的物理穩(wěn)定性。不同制劑的物理穩(wěn)定性由它們形成原纖維的趨勢來表征。確定原纖維存在的方法是硫黃素T-試驗。組織學(xué)噻唑染料硫黃素T(ThT)用作淀粉樣原纖維形成的指示劑。該方法基于ThT的熒光特性。在存在淀粉樣原纖維的情況下，ThT的突光在450nm處表現(xiàn)出激發(fā)最大值,并在482nm處表現(xiàn)出增強的發(fā)射。已表明ThT熒光強度與淀粉樣原纖維濃度的增加成線性關(guān)系。在該制劑作為完全填充的玻璃柱體儲存不同的時間之后由ThT-試驗評價制劑的物理穩(wěn)定性。用在凍干前調(diào)節(jié)至高于中性pH(>8)的pH的藥物制備的藥物制劑的結(jié)果在開始時(t=0)和在37°C下儲存I個月之后的ThT-試驗的結(jié)果可見于表I。表I.在加速穩(wěn)定性試驗的I周或I個月后ThT-試驗的結(jié)果(熒光單位)。
權(quán)利要求
1.一種用于增加包含胰高血糖素樣肽、藥學(xué)上可接受的緩沖劑和藥學(xué)上可接受的防腐劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在PH 8. I 9.6范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。
2.一種用于增加包含胰高血糖素樣肽、藥學(xué)上可接受的緩沖劑和藥學(xué)上可接受的防腐 劑的藥物組合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH 8. 5 9. 6范圍內(nèi)處理過的大量肽產(chǎn)物制備該藥物組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述pH在9.O 9. 6范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中所述大量肽產(chǎn)物已在指定的pH范圍內(nèi)、大約5°C至大約25°C的溫度下處理10分鐘至12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其中所述大量肽產(chǎn)物已在指定的pH范圍內(nèi)、大約5°C至大約25 °C的溫度下處理I分鐘至30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5之任一項的方法，其中所述藥物組合物為溶液。1
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一項的方法，其中所述藥物組合物為懸浮液。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 5之任一項的方法，其中所述藥物組合物為固體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述藥物組合物將用注射用水或其它適宜的溶劑重構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求I 9之任一項的方法，其中所述大量肽產(chǎn)物通過在該pH下凍干該胰高血糖素樣肽的溶液或懸浮液制備。
11.根據(jù)權(quán)利要求I 9之任一項的方法，其中在制備該藥物組合物期間在所述pH下處理該大量肽產(chǎn)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求I 9之任一項的方法，其中在與該藥學(xué)上可接受的緩沖劑混合之前在該PH下處理該大量肽產(chǎn)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求I 12之任一項的方法，其中所述藥物組合物的pH低于處理該大量肽的溶液或懸浮液時的pH。
14.根據(jù)權(quán)利要求I 13之任一項的方法，其中所述藥物組合物的pH比處理該大量肽的溶液或懸浮液時的PH低至少O. 8pH單位。
15.根據(jù)權(quán)利要求I 14之任一項的方法，其中所述藥物組合物的pH比處理該大量肽的溶液或懸浮液時的PH低至少I. 5pH單位。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其中所述藥物組合物適于腸胃外給藥，例如通過注射或輸注給藥。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其中所述藥物組合物或該藥物組合物的重構(gòu)溶液的PH為pH 7. O至pH 8. 0，優(yōu)選pH 7. 2至pH 7. 8。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求之任意項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽的等電點為3.O 7.0，優(yōu)選 4. O 6. O。
19.根據(jù)權(quán)利要求I 18之任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽為胰高血糖素、胰高血糖素類似物或其衍生物。
20.根據(jù)權(quán)利要求I 18之任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽為GLP-1、GLP-I類似物、GLP-I衍生物或GLP-I類似物的衍生物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述GLP-I類似物選自=Gly8-GLP-I(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-I (7-37)、Val8-GLP-I (7-36)-酰胺、Va 18_GLP - I (7-3 7)、Val8Asp22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-I (7-37)、Val8Glu22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Lys22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-I (7-37)、Val8Arg22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-I (7-37)、Val8His22-GLP-I (7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-I (7-37)、Val8Trp19Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-I (7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-I (7-37)、Val8Glu22His37-GLP-I (7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-I (7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-I (7-37)，以及它們的類似物。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述GLP-I類似物的衍生物為Arg34, Lys26 (NE-(y -Glu (Na-十六烷?；?))-GLP-I (7-37)。
23.根據(jù)權(quán)利要求I 22之任一項的方法，其中所述大量肽產(chǎn)物的溶液或懸浮液在pH9. 5下處理，且該藥物組合物的pH為7. 4。
24.根據(jù)權(quán)利要求19 23之任一項的方法，其中所述藥物組合物中該胰高血糖素樣肽的濃度為 O. lmg/mL 50mg/mL、0. lmg/mL 25mg/mL、lmg/mL 25mg/mL、lmg/mL IOmg/mL 或 3mg/mL 8mg/mL。
25.根據(jù)權(quán)利要求I 18之任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽為GLP-2、GLP-2類似物、GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述GLP-2的衍生物或GLP-2類似物的衍生物具有賴氨酸殘基，例如一個賴氨酸，其中親脂性取代基(可選地通過間隔基)連接到該賴氨酸的ε氨基上。
27.根據(jù)權(quán)利要求25 26之任一項的方法，其中所述藥物組合物中所述胰高血糖素樣月太的濃度為 O. lmg/mL 100mg/mL、0. lmg/mL 25mg/mL 或 lmg/mL 25mg/mL。
28.根據(jù)權(quán)利要求I 18之任一項的方法，其中所述胰高血糖素樣肽為exendin-4、exendin-4類似物、exendin-4的衍生物或exendin-4類似物的衍生物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述肽為exendin-4。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述肽為穩(wěn)定的exendin-4化合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述肽為DPP-IV保護(hù)的exendin-4化合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述肽為免疫調(diào)節(jié)的exendin-4化合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述肽為ZP-10,即[Ser38Lys39]Exendin-4(1-39)LysLysLysLysLys-酉先胺。
34.根據(jù)權(quán)利要求28 33之任一項的方法，其中所述藥物組合物中所述肽的濃度為5 μ g/mL 10mg/mL、5 μ g/mL 5mg/mL、5 μ g/mL 5mg/mL、0. lmg/mL 3mg/mL 或 0. 2mg/mL lmg/mL。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其中所述緩沖劑選自正磷酸鹽、TRIS、甘氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、乙酸檸檬酸鈉、碳酸鈉、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸鈉和檸檬酸鈉或其混合物。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其中所述防腐劑選自苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、芐醇、氯丁醇和硫柳汞，或者它們的混合物。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其中包括等滲劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述等滲劑為氯化鈉、木糖醇、甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸、二甲砜、聚乙二醇、丙二醇或其混合物。
39.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其中包括表面活性劑。
40.包含胰高血糖素樣肽的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是根據(jù)權(quán)利要求I 39之任一項的方法制備的。
41.pH為大約7. 2至大約7. 8的藥物組合物，該組合物包含胰高血糖素樣肽和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該組合物在保存方面是穩(wěn)定的，這是通過該組合物于37°C下儲存I個月后該組合物中所含的胰高血糖素樣肽在硫黃素T試驗中的熒光增加小于2倍測得的。
42.有效量的根據(jù)權(quán)利要求40 41之任一項的藥物組合物在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于通過腸胃外施用治療高血糖癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的藥物肽組合物。具體地說，本發(fā)明提供了一種增加用于腸胃外給藥的包含胰高血糖素樣肽的藥物組合物的保存期限的方法，所述藥物組合物中由已在高于中性pH的pH下處理的肽產(chǎn)物制備而來。
文檔編號A61K9/08GK102940879SQ20121049750
公開日2013年2月27日 申請日期2004年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者C·尤爾-莫滕森, D·K·恩格倫德 申請人:諾沃挪第克公司