一種具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制備方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物領域，公開了一種具有抗凝活性的菲牛蛭素多肽及含該多肽的臨床制劑。本發(fā)明所述菲牛蛭素多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明還提供所述菲牛蛭素活性肽的制備方法與用途。
【專利說明】一種具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制備方法與用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制備方法與用途。
【背景技術】
[0002]水蛭素(hirudin)是由60多個氨基酸組成的小分子量蛋白質(zhì)，相對分子量為7kDa左右，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凝血酶特異性抑制劑。天然水蛭素最早是從歐洲醫(yī)蛭唾液腺中分離出來的，至少有20多種突變體，其中由全身提取的水蛭素稱為HV1，由頭部提取的水蛭素稱為HV2，二者氨基酸序列同源性為86%。
[0003]天然水蛭素的N端由疏水性氨基酸組成，3個二硫鍵組成穩(wěn)定的構象。C端富含帶負電荷的酸性氨基酸殘基，可與凝血酶的正電荷部位結合，以靜電作用阻止凝血酶與纖維蛋白原的識別位點結合。中間部位的Pro46-Lys47-Pro48與凝血酶的Arg環(huán)結合,是水蛭素與凝血酶結合的催化位點。此外，63位Try殘基的硫酸化提高了它與凝血酶的結合能力，增強了水蛭素抗凝血作用的特異性。
[0004]由于醫(yī)蛭食性較 雜，人們逐漸把注意力轉(zhuǎn)向以哺乳動物為主要吸血對象的東南亞菲牛蛭(Hirudinariamanillensis),希望獲得更適合人類的抗凝血物質(zhì)。1992年Steiner等首次從產(chǎn)自馬尼拉的菲牛蛭中提取了 2種水蛭素。1993年Scacheri等從菲牛蛭中分離出了 2種水蛭素變異體(菲牛蛭素HMl和HM2)，并測定其氨基酸序列，cDNA克隆和表達，表達產(chǎn)物有抗凝活性。菲牛蛭素(HMl及HM2)的活性與醫(yī)蛭來源的水蛭素(HVl及HV2)相似，但是二者同源性低于60%，且前者不存在硫酸化位點。
[0005]由于水蛭來源有限，從醫(yī)蛭中提取天然水蛭素滿足不了臨床的大量需求，繼續(xù)尋求大量合成具有抗凝活性的多肽的解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明以我國廣西菲牛蛭為原材料，通過基因重組的方法擴增菲牛蛭素基因片段，并在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行活性表達，采用中國藥典的凝血酶滴定法測定本發(fā)明所述菲牛蛭素活性肽的抗凝血活性，活性高達20080ATU/g。
[0007]本發(fā)明提供的菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]本發(fā)明還提供編碼所述菲牛蛭素活性肽的基因。優(yōu)選地，所述基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供所述菲牛蛭素活性肽的制備方法。
[0010]在【具體實施方式】中，本發(fā)明所述的制備方法包含以下步驟:
[0011]步驟1:以編碼所述菲牛蛭素活性肽的CDNA為模板，設計引物進行PCR擴增，上游引物如SEQ ID N0.3所示，下游引物如SEQ IDN0.4所示；
[0012]步驟2:對擴增產(chǎn)物與質(zhì)粒進行重組構建原核表達載體；將所得原核表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞E.coliBL21 (DE3)進行蛋白表達；[0013]步驟3:收集菌體，離心棄沉淀，收上清；向上清中加硫酸銨達硫酸銨飽和度，靜置后離心棄上清，取沉淀用pH 7.4PBS溶解；
[0014]步驟4:將步驟3所得溶解液超濾除雜，用0.1M NaCl溶液洗膜，收集穿過液；穿過液用G-25柱脫鹽，收集層析圖譜中第一個吸收峰，即得。
[0015]所述模板核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述PCR擴增反應條件為:95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s, 30 次；72°C IOmin0
[0016]作為優(yōu)選，所述質(zhì)粒為Pet22b。更優(yōu)選地,步驟2所述蛋白表達經(jīng)IPTG誘導。
[0017]作為優(yōu)選，所述超濾為用0.45 μ m醋酸纖維濾膜過濾后，用30kDa超濾管，于4°C、4000rpm超濾。在本發(fā)明的【具體實施方式】中，是將溶解上清液用13000g離心10min,收上清，用0.45 μ μ m醋酸纖維濾膜過濾上清；后用30kDa MilliPore超濾管，于4?, 4000rpm超濾。
[0018]本發(fā)明還提供所述菲牛蛭素活性肽在制備抗凝藥物中的用途。
[0019]本發(fā)明還提供臨床制劑，包括所述的菲牛蛭素活性肽及藥學上可接受的輔料。
[0020]所述的臨床制劑包括口服制劑或注射制劑，口服制劑優(yōu)選為膠囊劑或片劑、顆粒劑；注射制劑優(yōu)選為注射液或凍干粉針劑。
[0021]發(fā)明人經(jīng)過大量實驗發(fā)現(xiàn)，含有pET22b質(zhì)粒的大腸桿菌的對照組誘導后的培養(yǎng)基組分和破碎細胞的上清液沒有或者幾乎沒有活性。而含有4種異構體的重組大腸桿菌的培養(yǎng)基組分和破碎細胞的上清液均表現(xiàn)出不同程度的抗凝血活性，4種異構體的氨基酸序列，兩兩比較僅有一個氨基酸序列存在差異。含有pET22b-HMb-l重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌誘導后的培養(yǎng)基組分呈現(xiàn)出最高的抗凝血活性，為300ATU/mL。而采用中國藥典的凝血酶滴定法對該培養(yǎng)基組分中的菲牛蛭素活性肽(I峰)的抗凝血活性進行測定，活性高達20080ATU/g,較之天然菲牛蛭素干粉`活性1300ATU/g。
[0022]動物實驗顯示，白兔灌胃給予本發(fā)明所述菲牛蛭素活性肽FNZ后，于給藥前及給藥后不同時間點采血，觀察FNZ的抗凝效應。結果表明，口服4mg/kg劑量本發(fā)明所述菲牛蛭素活性肽FNZ能顯著延長TT、APTT，但對PT無延長作用，說明FNZ主要作用于內(nèi)源性凝血通路，而對外源性凝血通路無作用。FNZ對TT的延長時間較短，量效關系的線性范圍較窄，而FNZ對APTT延長時間較長且線性范圍較寬。以上結果說明本發(fā)明所述菲牛蛭素活性肽FNZ在體內(nèi)具有抗凝活性，具有良好的臨床應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明所述質(zhì)粒載體的構建過程；
[0024]圖2為pET22b-HMb_l誘導表達結果；其中M:marker (紅箭頭表示為7.8kDa)；I:pET22b-HMb-l-l 誘導前全菌；2:pET22b-HMb-l-l 誘導后全菌；3:pET22b-HMb-l-l 誘導后破碎上清；4:pET22b-HMb-l-l誘導后破碎沉淀；5:pET22b-HMb-l-2誘導前全菌；6:pET22b-HMb-l-2 誘導后全菌；7:pET22b-HMb-l-2 誘導后破碎上清；8:pET22b-HMb-l-2 誘
導后破碎沉淀。
[0025]圖3為菲牛蛭素G-25柱脫鹽處理層析圖譜；
[0026]圖4為口服不同劑量FNZ對兔PT延長的時-效曲線；
[0027]圖5為口服不同劑量FNZ對兔APTT延長的時-效曲線；[0028]圖6為口服不同劑量FNZ對兔TT延長的時-效曲線。
【具體實施方式】
[0029]本發(fā)明公開了一種抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制備方法與用途，本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0030]為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0031]實施例1 =RT-PCR擴增菲牛蛭素基因片段
[0032]取廣西菲牛蛭活體，切取菲牛蛭頭部組織(大約l_2cm),采用TRIzol( Invitrogen)法提取組織的總RNA。以提取的總RNA為模板，首先進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設計上游引物Hmgx up (如 SEQ ID N0.3 所示)(ATGTTCTCTCTCAAGTTGTTCG)和下游引物 Hmgxdn (如 SEQID N0.4所示)(TTAATTCAATATATCTTCATCTGGG),以cDNA為模板，PCR擴增菲牛蛭素基因，反應條件為:95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s (30 次)；72°C IOmin0 擴增產(chǎn)物如 SEQID N0.2 所示。
[0033]實施例2:表達質(zhì)粒構建
[0034]對實施例1所得基因進行改造，上游加上起始密碼子ATG，且?guī)в蠱sc I識別位點，下游帶有Xho I識別位點。為了避免重組表達過程中引入的序列對菲牛蛭素活性的影響，所以在構建表達載體時均未加任何標簽，同時去除菲牛蛭素自身的信號肽系列?；蚱尾捎孟拗菩詢?nèi)切酶Msc I和Xho I·雙酶切，同樣的質(zhì)粒Pet22b采用相同的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，T4連接酶連接線性化質(zhì)粒和基因片段，得到pet22b-hmb-l，載體構建過程如圖1。
[0035]實施例3:蛋白表達純化和檢測
[0036]3.1蛋白表達
[0037]構建好的菲牛蛭素原核表達載體pET22b_HM轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，并進行誘導表達。誘導條件為0.5mM IPTG，37°C 5h。誘導表達的電泳結果見下圖2，誘導后均未見明顯目的條帶?；钚詼y定發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基組分的活性為300ATU/mL。培養(yǎng)基組分的抗凝血活性要比破碎細胞上清液的抗凝血活性高，推測可能菲牛蛭素分子量較小，大部分被分泌到培養(yǎng)基中。
[0038]將RT-PCR產(chǎn)物切膠回收，連接T載體，挑取不同的轉(zhuǎn)化子進行測序，篩選不同的異構體。挑取10個轉(zhuǎn)化子，最終得到4種異構體(HMb-l，HMb-2，HMb-3，HMb-4)。比較這4種異構體的氨基酸序列，可以看出，兩兩比較僅有一個氨基酸序列存在差異。
[0039]參照實施例1，分別以4種異構體的基因為模板，進行PCR擴增，反應條件為950C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s(30 次)；72°C IOmin0 酶切后連接載體 pET22b，得到重組子 pET22b-HMb-l、pET22b-HMb-2、pET22b-HMb_3、pET22b-HMb_4。
[0040]由于重組菲牛蛭素的表達量相對較低，無法通過電泳檢測到，而且考慮到天然的菲牛蛭素的含量也相對較少，而活性并不低的現(xiàn)象，所以對重組菌的不同組分進行凝血酶抗凝功能驗證，以確定菲牛蛭素是否成功表達并且定位重組多肽。
[0041]樣品為含有pET22b 質(zhì)粒以及含有 pET22b-HMb_l、pET22b-HMb_2、pET22b-HMb_3、pET22b-HMb-4重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌誘導前后的培養(yǎng)基組分和破碎細胞的上清液。重組菲牛蛭素的活性測定采用中國藥典的凝血酶滴定法測定。天然的菲牛蛭素干粉活性為1300ATU/g，重組菌的活性數(shù)據(jù)見表1。
[0042]表1重組菲牛蛭素凝血酶抗凝功能驗證
[0043]
【權利要求】
1.一種菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.編碼權利要求1所述菲牛蛭素活性肽的基因。
3.根據(jù)權利要求2所述基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.權利要求1所述的菲牛蛭素活性肽的制備方法。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，包含以下步驟: 步驟1:以編碼權利要求1所述菲牛蛭素活性肽的cDNA為模板，優(yōu)選模板的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；設計引物進行PCR擴增，上游引物如SEQ ID N0.3所示，下游引物如 SEQ ID N0.4 所示； 步驟2:對擴增產(chǎn)物與質(zhì)粒優(yōu)選質(zhì)粒Pet22b進行重組構建原核表達載體；將所得原核表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞E.coli BL21 (DE3)進行蛋白表達優(yōu)選經(jīng)IPTG誘導； 步驟3:收集菌體，離心棄沉淀，收上清；向上清中加硫酸銨達硫酸銨濃度65-80%，靜置后離心棄上清，取沉淀用pH 7.4PBS溶解； 步驟4:將步驟3所得溶解液超濾除雜，用0.1M NaCl溶液洗膜，收集穿過液；穿過液用G-25柱脫鹽，收集層析圖譜中第一個吸收峰，即得。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述PCR擴增反應條件為:950C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s, 30 次；72°C IOmin0
7.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述超濾為用0.45 μ m醋酸纖維濾膜過濾后，用30kDa超濾管,于·4°C、4000rpm進行超濾。
8.臨床制劑，包括權利要求1所述的菲牛蛭素活性肽及藥學上可接受的輔料。
9.根據(jù)權利要求8所述的臨床制劑，其特征在于，其為口服制劑或注射制劑，口服制劑優(yōu)選為膠囊劑或片劑、顆粒劑；注射制劑優(yōu)選為注射液或凍干粉針劑。
10.權利要求1所述菲牛蛭素活性肽在制備抗凝藥物中的用途。
【文檔編號】A61K38/58GK103848914SQ201210504718
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年11月29日 優(yōu)先權日:2012年11月29日
【發(fā)明者】賈繼明, 王宏濤, 趙韶華, 鄭春楊, 張會欣, 鮑蓬, 馮建敏, 姜新剛, 王海榮 申請人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司