專利名稱：豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學皮膚組織工程技術領域，特別是涉及豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料及其制備方法。
背景技術：
近些年來，隨著工業(yè)的發(fā)展，人身事故傷害也不可避免地呈遞增趨勢，另外人們在生活和工作中對自身形象的要求也不斷提高，因此需要進行皮膚修復的人更是越來越多?，F有技術中，在創(chuàng)面修復領域，已發(fā)現真皮能夠促進組織的修復，減少愈合過程中瘢痕的形成，因此真皮組織的選擇、提取、制備以及應用一直是皮膚修復領域的研究熱點。
但是，由于真皮組織在修復過程中很容易出現一系列的免疫排斥反應，產生免疫排斥反應的原因主要來自于細胞，由此就推動了對真皮組織的無細胞化技術的研究。而現有技術中限于自體皮以及異體皮的來源極為有限，異種(如豬等)脫細胞真皮就成為了當今皮膚修復技術研究的一大主題?，F有技術中，豬脫細胞真皮基質的制備方法主要有酶消化法、高滲鹽-SDS法、平衡鹽溶液法等。而在實際操作中發(fā)現高滲鹽-SDS法中十二烷基硫酸鈉(SDS)作為去污劑脫除細胞時，強度過大，會造成部分支架結構的破壞。因此，通常選用較溫和的TritonX-IOO非離子型表面活性劑進行后期細胞脫除。平衡鹽溶液法由于要輔以較繁瑣的物理方法處理，如Y射線照射、反復凍融等。使得處理過程比較復雜，處理時間也相對較長，相對于其他化學方法處理時間過長，費時費力。且平衡鹽溶液法處理中會使真皮中的膠原蛋白和基質膜受到相當程度的損傷。酶消化法也存在操作復雜，不易控制等缺陷。
因此針對現有技術的不足，提供一種細胞去除徹底、真皮纖維支架完整、可制備具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率的異種脫細胞真皮基質包被膠原的應用產品及其制備技術以克服現有技術不足甚為必要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料及其制備方法，該發(fā)明具有細胞去除徹底、真皮纖維支架完整、所制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率的特點。
本發(fā)明的目的通過以下技術措施實現。一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，包括下列步驟
(1)清洗，具體是將皮片在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；
(2)分離表皮與真皮，具體是將步驟(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；
(3)脫真皮細胞，具體是將步驟(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；
(4)超聲清洗，具體是將步驟(3)得到的皮片進行超聲清洗，然后浸泡于磷酸緩沖鹽溶液中暫存；
(5)膠原包被，具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，灌裝密封；或者 將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，進行凍干處理，將凍干物密封包裝。上述步驟(I)具體是，將皮片在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。上述步驟(2)具體是，將步驟(I)得到的皮片在濃度為2. 0-3. OU/mL DispaseII溶液中浸泡，并在3-6°C條件下消化40-60小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮；然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘，清洗干凈。優(yōu)選的，上述步驟(2)具體是，將步驟(I)得到的皮片在濃度為2. 5U/mLDispaseII溶液中浸泡，并在4°C條件下消化48小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮； 然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘，清洗干凈。上述步驟(3)具體是，將步驟(2)得到的皮片在體積分數為0.3-0.8%的TritonX-IOO溶液中浸泡40-60小時，進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。優(yōu)選的，上述步驟(3)具體是，將步驟(2)得到的皮片在體積分數為O. 5%的TritonX-IOO溶液中浸泡48小時，進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。上述步驟(4)具體是，將步驟(3)得到的皮片放在超聲波清洗機中，在50-150小時z的頻率下震蕩洗滌4-8小時，然后浸泡于磷酸緩沖鹽溶液中暫存。上述步驟(5)膠原包被具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于濃度為1-5 mg/mL的I型膠原中，灌裝密封制得成品；或者
將步驟(4)得到的皮片浸泡于濃度為1-5 mg/mL的I型膠原中，置于_20°C至_50°C條件下冷卻1-5小時，然后在-20°C至_50°C循環(huán)凍干20-50小時，接著進行室溫回溫5_10小時.，然后將凍干物密封包裝制得成品。更佳的，上述步驟(I)之前還包括取皮步驟，具體是將健康白豬的整張皮浸泡于O. 1%新潔爾滅溶液中，消毒15-30分鐘，用鑷子夾除豬皮上殘留的毛，用取皮刀取O. 3mm-0. 5mm厚的皮片。本發(fā)明同時提供一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料，該豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料通過上述的方法制備而成。本發(fā)明的一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料及其制備方法，制備方法包括下列步驟(1)清洗，具體是將皮片在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；(2)分離表皮與真皮，具體是將步驟(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；(3)脫真皮細胞，具體是將步驟(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；(4)超聲清洗，具體是將步驟(3)得到的皮片進行超聲清洗，然后浸泡于磷酸緩沖鹽溶液中暫存；(5)膠原包被，具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，灌裝密封；或者將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，進行凍干處理，將凍干物密封包裝。本發(fā)明采用DispaseII >TritonX-100系統(tǒng)，處理過程中對真皮的支架結構破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期上皮細胞的粘附與生長。此外，本發(fā)明增加I型膠原包被步驟，可根據具體情況適用于不同的創(chuàng)面，適用性強，敷用效果好。
具體實施例方式結合以下實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例I。一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，包括下列步驟。( I)清洗，具體是將皮片在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌。 (2)分離表皮與真皮，具體是將步驟(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮，然后再在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌。(3)脫真皮細胞，具體是將步驟(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液進一步去除真皮細胞成分，然后再在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌。(4)超聲清洗，具體是將步驟(3)得到的皮片進行超聲清洗，然后浸泡于PBS磷酸緩沖鹽溶液中暫存。(5)膠原包被，具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，灌裝密封制得成品O本發(fā)明采用Dispasell、TritonX-IOO系統(tǒng),此系統(tǒng)性質溫和，處理過程中對真皮的支架結構破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期上皮細胞的粘附與生長，采用該系統(tǒng)細胞去除徹底。此外，本發(fā)明增加I型膠原包被步驟采用浸泡灌裝密封形式，使用時為濕態(tài)，有利于干燥創(chuàng)面的保濕濕潤。 實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
實施例2。一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，具體包括下列步驟。(I)清洗，將皮片在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。(2)分離表皮與真皮，具體是將步驟(I)得到的皮片在濃度為2. 0-3. OU/mLDispaseII溶液中浸泡，并在3_6°C條件下消化40-60小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮；然后再在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘，清洗干凈。(3)脫真皮細胞，具體是將步驟(2)得到的皮片在體積分數為O. 3-0.8%的TritonX-IOO溶液中浸泡40-60小時，進一步去除真皮細胞成分，然后再在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。(4)超聲清洗，具體是將步驟(3)得到的皮片放在超聲波清洗機中，50-150HZ震蕩洗滌4-8小時，然后浸泡于PBS磷酸緩沖鹽溶液中暫存。(5)膠原包被，具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于濃度為1-5 mg/mL的I型膠原中，灌裝密封制得成品。本發(fā)明采用Dispasell、TritonX-IOO系統(tǒng),此系統(tǒng)性質溫和，處理過程中對真皮的支架結構破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期上皮細胞的粘附與生長。此外，本發(fā)明增加I型膠原包被步驟采用浸泡灌裝密封形式，使用時為濕態(tài)，有利于干燥創(chuàng)面的保濕濕潤。實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
實施例3。一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，包括下列步驟。(I)清洗，將皮片在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。(2)分離表皮與真皮，具體是將步驟(I)得到的皮片在濃度為2. 5U/ml Dispasell溶液中浸泡，并在4°C條件下消化48小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮；然后再在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘，清洗干凈。(3)脫真皮細胞，具體是將步驟(2)得到的皮片在體積分數為O. 5%的TritonX-IOO溶液中浸泡48小時，進一步去除真皮細胞成分，然后再在PBS磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。 (4)超聲清洗，具體是將步驟(3)得到的皮片放在超聲波清洗機中，50-150HZ下震蕩洗滌4-8小時，然后浸泡于PBS磷酸緩沖鹽溶液中暫存。(5)膠原包被，具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于濃度為I -5 mg/mL的I型膠原中，灌裝密封制得成品。本發(fā)明采用Dispasell、TritonX-IOO系統(tǒng),此系統(tǒng)性質溫和，處理過程中對真皮的支架結構破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期上皮細胞的粘附與生長。此外，本發(fā)明增加I型膠原包被步驟采用浸泡灌裝密封形式，使用時為濕態(tài)，有利于干燥創(chuàng)面的保濕濕潤。實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
實施例4?！N豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，包括下列步驟。首先進行取皮，具體是選取3月齡健康的白豬，屠宰、剝皮、脫毛，將整張皮泡在O. 1%新潔爾滅溶液中，消毒15分鐘，用鑷子夾除豬皮上殘留的毛，取皮刀取O. 3mm厚8cm X 8cm的皮片。接著進行如下步驟
(I)清洗將取好的皮片在PBS中洗滌10分鐘。(2)分離表皮與真皮用IL的燒杯配制400ml 2. 5U/mL的Dispasell溶液,將皮片浸泡在溶液里，4°C條件下消化48小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，快速分離表皮與真皮。然后再在PBS溶液中洗滌10分鐘，清洗干凈。(3)脫細胞配制400ml O. 5%的TritonX-IOO溶液，將皮片浸泡在溶液中，室溫下持續(xù)震蕩48小時，進一步去除真皮細胞成分。然后再在PBS溶液中洗滌10分鐘。(4)超聲清洗將處理好的皮片放在超聲波清洗機中，浸泡在PBS中，在50-150HZ頻率下震蕩洗滌5小時。(5)1型膠原包被將豬脫細胞真皮基質浸泡在濃度為I -5 mg/mL I型膠原中，灌裝密封制得成品。本發(fā)明采用Dispasell、TritonX-IOO系統(tǒng)，此系統(tǒng)性質溫和，處理過程中對真皮的支架結構破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期上皮細胞的粘附與生長。此外，本發(fā)明增加I型膠原包被步驟采用浸泡灌裝密封形式，使用時為濕態(tài)，有利于干燥創(chuàng)面的保濕濕潤。實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
實施例5。一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其他方法與實施例I至4中任意一種相同，不同之處在于步驟(5) I型膠原包被的方式不同。本實施例中，步驟(5) I型膠原包被具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，進行凍干處理，將凍干物密封包裝制得成品。本實施例采用凍干方式，在使用時適于應用于滲液較多的創(chuàng)面，有利于吸收導出的滲液。實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
實施例6。一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其他方法與實施例I至 4中任意一種相同，不同之處在于步驟(5) I型膠原包被的方式不同。本實施例中，步驟(5) I型膠原包被具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于濃度為I-5 mg/mL的I型膠原中，置于_20°C至_50°C條件下冷卻1_5小時，然后在-20°C至_50°C循環(huán)凍干20-50小時，接著進行室溫回溫5-10小時，然后將凍干物密封包裝制得成品。本實施例采用凍干方式，在使用時適于應用于滲液較多的創(chuàng)面，有利于吸收導出的滲液。實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
實施例7。一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，包括下列步驟。首先進行取皮處理，具體是選取3月齡健康的白豬，屠宰、剝皮、脫毛，將整張皮泡在O. 1%新潔爾滅溶液中，消毒15分鐘，用鑷子夾除豬皮上殘留的毛，取皮刀取O. 3mm厚8cm X 8cm的皮片。接著進行如下步驟
(I)清洗將取好的皮片在PBS中洗滌10分鐘。(2)分離表皮與真皮用IL的燒杯配制400ml 2. 5U/mL的Dispasell溶液，將皮片浸泡在溶液里，4°C條件下消化48小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，快速分離表皮與真皮。PBS洗滌10分鐘，清洗干凈。(3)脫細胞將皮片浸泡在400ml體積分數為O. 5%的TritonX-100中，室溫下持續(xù)震蕩48小時，進一步去除真皮細胞成分。PBS清洗10分鐘。(4)超聲清洗將處理好的皮片放在超聲波清洗機中，浸泡在PBS中，50-150HZ震蕩洗滌5小時。(5) I型膠原包被凍干將豬脫細胞真皮基質浸泡在濃度為I -5 mg/mL I型膠原中，在_20°C至_50°C遇冷1-5小時，再在_20°C至_50°C循環(huán)凍干20-50小時，室溫回溫5-10小時，將凍干物密封包裝制得成品。本發(fā)明采用Dispasell、TritonX-100系統(tǒng)，此系統(tǒng)性質溫和，處理過程中對真皮的支架結構破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期上皮細胞的粘附與生長。此外，本發(fā)明增加I型膠原包被步驟采用凍干方式，在使用時適于應用于滲液較多的創(chuàng)面，有利于吸收導出的滲液。實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
實施例9。
一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料，采用如上實施例I至8中任意一種方式制備而成。該豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料，采用Dispasell、TritonX-100系統(tǒng)制備，細胞去除徹底，更重要的是此系統(tǒng)性質溫和，處理過程中對真皮的支架結構破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期上皮細胞的粘附與生長。該復合敷料采用I型膠原包被，采用浸泡灌裝密封形式，使用時為濕態(tài)，有利于干燥創(chuàng)面的保濕濕潤；采用凍干方式，在使用時適于應用于滲液較多的創(chuàng)面，有利于吸收導出的滲液。實踐證明，該方法制備的產品具有良好的生物相容性和合適的生物降解速率。
最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范 圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。
權利要求
1.一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于，包括有下列步驟 (1)清洗，具體是將皮片在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌； (2)分離表皮與真皮，具體是將步驟(I)得到的皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌； (3)脫真皮細胞，具體是將步驟(2)得到的皮片浸泡在TritonX-IOO溶液進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌； (4)超聲清洗，具體是將步驟(3)得到的皮片進行超聲清洗，然后浸泡于磷酸緩沖鹽溶液中暫存； (5)膠原包被，具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，灌裝密封制得成品；或者 將步驟(4)得到的皮片浸泡于I型膠原中，進行凍干處理，將凍干物密封包裝制得成品O
2.根據權利要求I所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(I)具體是，將皮片在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。
3.根據權利要求2所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)具體是，將步驟(I)得到的皮片在濃度為2. 0-3. OU/mL DispaseII溶液中浸泡，并在3-6°C條件下消化40-60小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮；然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘，清洗干凈。
4.根據權利要求3所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)具體是，將步驟(I)得到的皮片在濃度為2. 5U/mLDispaseII溶液中浸泡，并在4°C條件下消化48小時，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮；然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘，清洗干凈。
5.根據權利要求3所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(3)具體是，將步驟(2)得到的皮片在體積分數為O. 3-0. 8%的TritonX-IOO溶液中浸泡40-60小時，進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。
6.根據權利要求5所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(3)具體是，將步驟(2)得到的皮片在體積分數為O. 5%的TritonX-IOO溶液中浸泡48小時，進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌10-15分鐘。
7.根據權利要求5所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(4)具體是，將步驟(3)得到的皮片放在超聲波清洗機中，在50-150HZ的頻率下震蕩洗滌4-8小時，然后浸泡于磷酸緩沖鹽溶液中暫存。
8.根據權利要求7所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(5)膠原包被具體是將步驟(4)得到的皮片浸泡于濃度為I -5 mg/mL的I型膠原中，灌裝密封制得成品；或者 將步驟(4)得到的皮片浸泡于濃度為1-5 mg/mL的I型膠原中，置于_20°C至_50°C條件下冷卻1-5小時，然后在-20°C至_50°C循環(huán)凍干20-50小時，接著進行室溫回溫5_10小時，然后將凍干物密封包裝制得成品。
9.根據權利要求I至8任意一項所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法，其特征在于所述步驟(I)之前還包括取皮步驟，具體是將健康白豬的整張皮浸泡于O. 1%新潔爾滅溶液中，消毒15-30分鐘，用鑷子夾除豬皮上殘留的毛，用取皮刀取O.3mm-0. 5mm厚的皮片。
10.一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料，其特征在于通過如權利要求I至9中任意一項所述的豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料的制備方法制備而成。
全文摘要
一種豬脫細胞真皮基質包被膠原的復合敷料及其制備方法，制備方法包括(1)清洗，將皮片在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；(2)分離表皮與真皮，將皮片在DispaseII溶液中浸泡消化，分解IV型膠原和纖維黏蛋白，分離表皮與真皮，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；(3)脫真皮細胞，將皮片浸泡在TritonX-100溶液進一步去除真皮細胞成分，然后再在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌；(4)超聲清洗，然后浸泡于磷酸緩沖鹽溶液中暫存；(5)膠原包被，將皮片浸泡于I型膠原中灌裝密封；或者浸泡于I型膠原中進行凍干處理，將凍干物密封包裝制得成品。本發(fā)明細胞去除徹底，纖維支架完整，適用性強，敷用效果好。
文檔編號A61L15/40GK102921034SQ20121050983
公開日2013年2月13日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權日2012年12月4日
發(fā)明者遲妍妍, 雷靜, 鐘翠紅, 盛曉曉, 黃冬晶 申請人:廣州創(chuàng)爾生物技術有限公司