專利名稱：基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向ct造影劑的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬靶向CT造影劑的制備領域，特別涉及一種基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備。
背景技術：
癌癥(醫(yī)學術語亦稱惡性腫瘤)，現(xiàn)在已直接或間接地影響許多人的生活，成為影響人類健康的頭號殺手。因此，對癌癥的防治和治療成為各國生物醫(yī)學領域研究者的關注對象。由于癌細胞具有局部浸潤性和遠處轉移特性，晚期往往難以治療和控制。因此，早期的診斷和治療成為治愈癌癥的關鍵。對于身體特定部位或組織的病變，研究者們認為不需要全身給藥或是全身輻射治療。因此，新型的治療需要精確控制藥物在特定部位釋放，以及對藥物行為進行持續(xù)監(jiān)測。對醫(yī)藥發(fā)展的迫切需求使得多學科領域的研究偏向于制備能精確控制的材料。納米材料的出現(xiàn)，特別是具有靶向功能的納米材料的發(fā)展，使得腫瘤部位的早期檢測和診斷成為可能。由于腫瘤細胞具有不同于正常細胞的特性，其吞噬能力大為提高，可通過內吞作用內化納米顆粒。同時，其細胞表面具有不同于正常細胞的受體，使得特異性靶向結合具有可能性。CT技術因其優(yōu)良的空間和密度分辨率而成為最為廣泛的分子影像學手段之一，在臨床上受到廣泛的使用。為了提高造影效果，目前臨床上多使用基于碘的小分子造影劑。這種造影劑存在體內循環(huán)時間短、不具備靶向性、及高濃度時的腎臟毒性等缺點。因此，開發(fā)新型的造影劑體系非常必要。至今，新型造影劑的開發(fā)更多關注的是無機納米顆粒。金納米顆粒因其較高的X-射線吸收系數(shù)、良好的生物相容性，以及表面易修飾性等獨特的性質和明顯的優(yōu)勢正受到越來越廣泛的關注。同時，納米顆粒本身顯示出的延長的體內循環(huán)時間進一步使腫瘤靶向造影成為可能。目前，關于具有靶向性能的CT造影劑的石開究鮮有報道° Wang 等[Wang, H.，et al. , Folic acid-modified dendrimer-entrappedgold nanoparticles as nanoprobes for targeted CT imaging of human lungadencarcinoma. Biometarials, 2012. 23(42) :p. 1-11.]以葉酸修飾的第五代聚酸胺-胺樹狀大分子為模板包裹金納米顆粒，制備具有肺癌腫瘤模型靶向性能的靶向CT造影劑。但使用的高代數(shù)的樹狀大分子價格昂貴，從而限制了其應用。樹狀大分子是一類商業(yè)化的、結構可精確控制的有機大分子，是一類比較常見的金屬納米顆粒的模板和穩(wěn)定劑。目前研究多關注于高代數(shù)的樹狀大分子，其較多的內部空腔和豐富的表面基團可用于制備和穩(wěn)定金屬納米顆粒。相比之下，低代數(shù)樹狀大分子用于制備金屬納米顆粒的研究鮮有報道。低代數(shù)樹狀大分子內部空腔少，表面基團也不夠豐富，故制備金屬納米顆粒有一定的難度。但低代數(shù)樹狀大分子的價格相對低廉，結構更加精確可控等獨特性質，也使其具有潛在的研究價值。鑒于此，本專利采用末端氨基的第二代聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子為金納米顆粒的穩(wěn)定劑，隨后修飾葉酸賦予納米顆粒靶向性能，研究該復合納米顆粒的靶向CT造影效果。檢索國內外有關金納米顆粒用于CT造影方面的文獻和專利結果發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明完成之前，還沒有發(fā)現(xiàn)基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備及其CT造影性能研究方面的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備，該方法原料價格相對低廉，制備過程溫和，簡單易行，制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性、水溶液分散性和生物相容性，具有增強的靶向腫瘤CT造影效果，具有潛在的靶向CT造影應用前景。本發(fā)明的一種基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備，包括(I)稱取末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子，配制濃度為5-15mg/mL的水溶液，預熱，之后按照樹狀大分子/金摩爾投料比為I :3，加入氯金酸溶液，磁力攪拌反應3-4h，反應結束后，透析、冷凍干燥處理，得到氨基末端的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒；(2)稱取氨基末端的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒,配制顆粒濃度為5_15mg/mL的二甲基亞砜溶液。以葉酸摩爾數(shù)5-10倍的I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽活化葉酸3-5h ;按照葉酸與樹狀大分子摩爾比為I. 5 :1，加入已活化的葉酸溶液。磁力攪拌反應1-4天后，加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)6-12倍的三乙胺，攪拌10-30min ;之后加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)5-10倍的乙酸酐，進行乙?；磻?，攪拌反應12-36h;隨后透析和冷凍干燥，得到乙酰化后的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒。所述步驟(I)中的預熱溫度為50_70°C，時間為20-30分鐘。所訴步驟(2)中的制備得到的產品為靶向CT造影劑，應用于裸大鼠腫瘤模型靶向CT造影。配制活性元素(金、碘)摩爾濃度為O. lmol/L的樣品，以碘海醇作為對照，以葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒為靶向CT造影劑進行體外X-射線衰減性能測試和裸大鼠腫瘤模型體內CT造影性能評價。使用NMR (核磁共振)、UV-Vis (紫外可見光譜)、TEM (透射電子顯微鏡)、CT機表征本發(fā)明獲得的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的結果分別如下(I) NMR測試結果1H NMR圖譜表明樹狀大分子表面基團的類型以及數(shù)量。參照說明書附圖I。附圖Ia中出現(xiàn)在6-9ppm間的峰為葉酸的質子峰，表明葉酸成功修飾于樹狀大分子表面。附圖Ib中出現(xiàn)在I. 87ppm處的化學位移峰為乙?；屑谆奶卣鞣濉Ｓ纱丝勺C明樹狀大分子表面的剩余氨基已通過乙?；磻晦D化為了乙酰基。(2) UV-Vis 測試結果UV-Vis測試結果表明本發(fā)明中制備得到的納米顆粒在525nm左右出現(xiàn)了明顯的吸收峰。參照說明書附圖2。這是金納米顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰，表明本發(fā)明中成功制備得到了金納米顆粒。所得納米顆粒在不同PH (5-8)和溫度(4-50°C)條件下具有良好的穩(wěn)定性。參照說明書附圖3。(3) TEM測試結果TEM測試結果顯示了金納米顆粒的尺寸及尺寸分布。參照說明書附圖4。乙?；敖鸺{米顆粒的平均尺寸為5. 6nm，；乙酰化后平均尺寸為6. 5nm。乙酰化后，金納米顆粒的尺寸略有增大。(4)細胞毒性試驗結果細胞毒性試驗結果表明在200-3000nM范圍內，乙?；蟮募{米顆粒顯示良好的細胞相容性，與乙酰化前的產品相比有明顯的提高。參照說明書附圖5。(5)體外X-射線衰減性能測試結果體外X-射線衰減性能測試結果表明，葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相比，表現(xiàn)出優(yōu)于碘海醇的X-射線衰減系數(shù)。參照說明書附圖6。與細胞共培養(yǎng)后，對細胞顯示出優(yōu)于未修飾葉酸納米顆粒的CT增強造影作用。參照說明書附圖7。(6)體內CT造影測試結果體內CT造影測試結果表明，葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒與未修飾葉酸納米顆粒相比，表現(xiàn)出增強的靶向腫瘤造影效果。參見說明書附圖8和圖9。本發(fā)明通過水熱合成法制備金納米顆粒，隨后修飾靶向試劑葉酸。所得產品具有良好的穩(wěn)定性和靶向腫瘤CT造影效果。以第二代聚酰胺-胺樹狀大分子為穩(wěn)定劑，通過水熱合成法及表面修飾制備具有靶向CT造影功能的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒，本發(fā)明涉及了三個基本原理(I)聚酰胺-胺樹狀大分子末端氨基具有弱還原性，可以還原合成納米金顆粒，其還原性在加熱條件下有所增強。 (2)水熱合成法簡單、易操作，不需要外加其它還原劑，綠色環(huán)保。(3)葉酸的修飾賦予納米顆粒靶向特性。有益效果(I)本發(fā)明的制備原料價格相對低廉，制備過程溫和，具有擴大規(guī)模生產的可能(2)本發(fā)明方法制備的金納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性；(3)制備得到的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒具有增強的靶向腫瘤CT造影效果，為新型靶向造影劑的開發(fā)打下了良好的實驗基礎。


圖I為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒乙?；?a)、后(b)的1H NMR譜圖；圖2為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒乙酰化前后的UV-Vis 譜圖；圖3為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒在不同pH (5-8)(a)和溫度(4-50°C) (b)條件下的UV-Vis圖譜；
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圖4為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒TEM圖片，以及相應的尺寸分布圖。其中，乙?；?a，b)、乙酰化后(c，d)；圖5為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的細胞毒性試驗
結果;圖6為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒與碘海醇的體外X-射線衰減性能比較；圖7為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒與未修飾葉酸的納米顆粒的體外細胞CT值比較；圖8為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒(a)與未修飾葉酸的納米顆粒(b)對裸大鼠腫瘤模型靶向CT造影圖片比較；圖9為本發(fā)明制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒與未修飾葉酸的納米顆粒靜脈注射后的腫瘤部位CT值。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I取HAuCl430mg，溶于蒸餾水中，磁力震蕩使之充分溶解均勻，配制成濃度為30mg/mL的溶液。取第二代聚酰胺-胺樹狀大分子(G2. NH2) 150. OOmg,溶于15mL蒸餾水中，磁力震蕩使之充分溶解均勻。將該溶液置于60°C水浴中預熱20min。取HAuCl4溶液I. 897mL，加入預熱好的樹狀大分子溶液中。溫度維持在60°C，磁力攪拌反應3. Oh。反應結束后，對所得溶液進行蒸餾水(6次，2L/次)透析。然后進行冷凍干燥處理，得到乙?；暗臉錉畲蠓肿臃€(wěn)定的金納米顆粒，_20°C保存。實施例2稱取葉酸20. 05mg，溶于5mL 二甲基亞砜中。磁力攪拌中，加入I-(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液(3. 483mL, 12. 50mg/mL)，攪拌反應3. Oh。取實施例I制備的乙?；暗臉錉畲蠓肿臃€(wěn)定的金納米顆粒100. OOmg，溶于IOmL二甲基亞砜溶液中。隨后，加入活化好的葉酸溶液7. 282mL，磁力攪拌反應3d。反應結束后，對所得溶液進行透析，蒸餾水(6次，2L/次)。然后進行冷凍干燥處理，得到乙?；暗娜~酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒，_20°C保存。1H NMR譜圖結果顯示6_9ppm間出現(xiàn)了葉酸的質子峰，表明葉酸成功修飾于樹狀大分子表面。(附圖la)。UV-Vis測試結果表明譜圖中出現(xiàn)的吸收峰位于525nm左右(附圖2)。這表明金納米顆粒的成功制備。TEM測試結果表明制備得到的金納米顆粒的尺寸分布為 5. 6± I. 9nm (附圖 4)。實施例3取實施例2制備好的葉酸修飾的乙酰化前的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒80. 30mg,溶于8mL蒸懼水中。加入三乙胺O. 245mL,攪拌O. 5h。之后，加入乙酸酐O. 139mL,攪拌反應24h。反應結束后，用PBS緩沖液(3次，2L/次)和蒸餾水(3次，2L/次)對反應混和液進行透析。然后進行冷凍干燥處理，得到葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒，-200C保存。1H NMR譜圖結果顯示乙?；磻蟪霈F(xiàn)了乙酰甲基的峰(I. 87ppm)，表明乙?；磻某晒M行(附圖I)。UV-Vis測試結果表明譜圖中出現(xiàn)的吸收峰位于525nm左右(附圖2)。這表明乙?；螅鸺{米顆粒的尺寸沒有發(fā)生明顯的改變。TEM測試結果表明制備得到的金納米顆粒的尺寸分布為6.5±2.7nm (附圖4)。葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒具有良好的單分散性，未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。實施例4取實施例3制備得到的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒，配制為O. 5mg/mL的水溶液。之后，以O. IM的鹽酸或氫氧化鈉調節(jié)其pH值(5.0、6.0、7.0、8.0)。室溫放置20min后，進行紫外測試。取實施例3制備得到的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒，配制為O. 5mg/mL的水溶液。之后，放置于不同溫度條件(4、室溫20、37、50°C)下。穩(wěn)定半小時后，進行紫外測試。該產品在不同pH (5-8)和溫度(4_50°C)條件下的紫外圖譜沒有發(fā)生明顯的偏移和改變，表明其具有良好的穩(wěn)定性(附圖3)。實施例5取實施例2制備得到的乙?；昂蛯嵤├?制備的乙?；蟮娜~酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒各5. 24mg和5. 05mg，用無菌PBS緩沖液配置成60000nM的母液。之后梯度稀釋為2000，5000,10000, 20000, 30000nM的樣品溶液。取培養(yǎng)好的KB細胞種于96孔板中，按照I萬細胞/孔的密度接種，每孔體積200 μ L0培養(yǎng)過夜后，加入上述各稀釋梯度的樣品，與細胞共培養(yǎng)24h。每個梯度用培養(yǎng)液稀釋10倍，即每孔終濃度分別為200，500，1000, 2000, 3000nM。每個梯度做5個平行孔，以PBS緩沖液作為空白對照。隨后用MTT法檢測細胞活力。每孔加MTT溶液(5mg/mL)20 μ L，37°C孵化4h。之后除去孔中液體，加入二甲亞砜溶液200 μ L。搖床混勻20min。之后用酶標儀檢測570nm處吸光度值。MTT測試結果顯示，乙?；暗漠a品在試驗濃度范圍內，顯示出一定的細胞毒性。同樣以PBS作為空白對照，乙?；蟮漠a品在此范圍內均不顯示出細胞毒性。表明乙?；茱@著提高納米顆粒的細胞相容性(附圖5)。實施例6取實施例3制備得到的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒，以蒸餾水為溶劑，配制金濃度為O. IM的母液。之后梯度稀釋出O. 08，O. 06，O. 04，O. 02，O. 01和O. 005M的樣品。同時，以臨床用碘海醇為對照材料，以蒸餾水稀釋出相應碘濃度的樣品。之后，對這兩組材料進行CT成像測試。CT成像測試結果顯示，在試驗濃度范圍內，葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒表現(xiàn)出明顯優(yōu)于碘海醇的X-射線衰減系數(shù)，具有較好的CT造影應用潛力(附圖6)。實施例7取培養(yǎng)好的KB細胞種于6孔板中，按照150萬細胞/孔的密度接種，每孔體積2.5mL。培養(yǎng)過夜后，加入上述實施例5中各稀釋梯度的樣品，與細胞共培養(yǎng)3h。同時，以對比例I中未修飾葉酸的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒為對照，配制相應的濃度梯度。每個梯度稀釋10倍，即每孔終濃度分別為200，500，1000，2000，3000nM。之后PBS洗三次，胰酶消化，分散于O. ImL PBS緩沖液中，進行CT成像測試。 CT成像測試結果顯示，與對比例I中制備的未修飾葉酸的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒相比，葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒更易被KB細胞吞噬，使CT值有更為明顯的提高(附圖7)。這主要是由于KB細胞表面具有較高的葉酸受體表達，因而葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆?？商禺愋园邢駽T造影。實施例8取裸大鼠兩只，建立KB腫瘤模型。對裸大鼠腋下接種培養(yǎng)好的KB細胞，每只接種約700萬個KB細胞。三周后，腫瘤可見，體積約I. 3cm3。取實施例3制備得到的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒220mg，分散于無菌PBS緩沖液中，制備得到金濃度為O. IM的溶液。取大鼠一只(約120g)，按照每千克體重O. 47mmol金的劑量，尾靜脈注射造影劑，進行腫瘤模型靶向CT成像實驗。間隔時間點CT掃描。對掃描圖片測量各主要器官的CT值。以對比例中未修飾葉酸的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒為對照，注射金的劑量保持一致。腫瘤模型靶向CT成像實驗結果顯示，未修飾葉酸的納米顆粒在30min內顯示逐漸增加的腫瘤造影效果，隨后效果持平。相比之下，葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的增加趨勢更為明顯，一直持續(xù)到60min。隨后，造影效果持平至90min。120min時，二者造影效果均略有降低。結果表明，葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆?？赏ㄟ^靶向作用，特異性的持續(xù)進入腫瘤部位，提供更為明顯的腫瘤部位CT造影效果?？傊?，本發(fā)明制備的產品在體內可持續(xù)被腫瘤組織吞噬，表現(xiàn)出優(yōu)于非靶向材料的靶向CT造影效果。對比例I取實施例I中制備的未經透析的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒溶液(G2. NH2,37. 24mg)，冷卻至室溫。加入三乙胺O. 154mL,攪拌O. 5h。之后，加入乙酸酐O. 087mL,攪拌反應24h。反應結束后，用PBS緩沖液(3次，2L/次)和蒸餾水(3次，2L/次)對反應混和液進行透析，然后進行冷凍干燥處理，得到未修飾葉酸的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒，-200C保存，將作為對照材料用于細胞和動物實驗。
權利要求
1.一種基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備，包括(1)稱取末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子，配制濃度為5-15mg/mL的水溶液，預熱，之后按照樹狀大分子/金摩爾投料比為I :3，加入氯金酸溶液，磁力攪拌反應3-4h，反應結束后，透析、冷凍干燥處理，得到氨基末端的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒；(2)稱取氨基末端的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒,配制顆粒濃度為5-15mg/mL的二甲基亞砜溶液；以葉酸摩爾數(shù)5-10倍的I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽活化葉酸3-5h ;按照葉酸與樹狀大分子摩爾比為I. 5 :1，加入已活化的葉酸溶液。磁力攪拌反應1-4天后，加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)6-12倍的三乙胺，攪拌10-30min ;之后加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)5-10倍的乙酸酐，進行乙酰化反應，攪拌反應12-36h ;隨后透析和冷凍干燥，得到乙酰化后的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備，其特征在于所述步驟(I)中的預熱溫度為50-70°C，時間為20-30分鐘。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備，其特征在于所訴步驟(2)中的制備得到的產品為靶向CT造影劑，應用于裸大鼠腫瘤模型靶向CT造影。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于葉酸修飾的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒的靶向CT造影劑的制備方法，包括以氨基末端的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子為穩(wěn)定劑，在水浴條件下制備金納米顆粒；透析干燥處理后，在納米顆粒表面樹狀大分子的氨基上共價鍵修飾靶向試劑葉酸，隨后對樹狀大分子表面剩余的氨基進行全部乙酰化處理；將反應后的溶液進行透析，冷凍干燥處理得到終產品；對產品進行體外、體內CT造影性能進行評價。本發(fā)明該方法原料價格相對低廉，制備過程溫和，簡單易行，制備的葉酸修飾的樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性、水溶液分散性和生物相容性，具有增強的靶向腫瘤CT造影效果，具有潛在的靶向CT造影應用前景。
文檔編號A61K49/12GK102940894SQ20121051277
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權日2012年12月4日
發(fā)明者史向陽, 劉輝, 張貴祥, 許艷紅 申請人:東華大學, 上海市第一人民醫(yī)院