專利名稱：一種從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酪氨酸酶抑制劑的提取方法，特別涉及一種從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
酪氨酸酶是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的、催化黑色素合成的關(guān)鍵限速酶，與生物體的重要生理過程密切關(guān)系，其活性的異常過量表達(dá)可導(dǎo)致人體的色素沉著性疾病(如雀斑、黃褐斑、老年斑等)產(chǎn)生。酪氨酸酶抑制劑已作為重要的添加劑添加到美白化妝品。目前，市場(chǎng)上常用主要美白化妝品添加劑有含汞化合物及氫醌、曲酸等，由于含汞化合物有毒性，氫醌有致敏性，而曲酸有潛在的致癌性，所以，這些化合物在商用產(chǎn)品中已愈來愈少被使用和添加。近年來人們對(duì)“組分天然化”和“回歸大自然”的呼聲越來越高，從植物中尋找高效、安全的酪氨酸酶活性抑制劑已成為重要研究方向，其生物活性和作用也將越來越受到人們的重視。某些具有美白祛斑效果等特殊藥理藥性的中藥已證明是潛在酪氨酸酶抑制劑的來源，例如，當(dāng)歸、甘草、蘆薈、紅景天、銀杏、白芷、槐花、青梅花、白附子、血桐、烏飯等。千日紅具有調(diào)整內(nèi)分泌紊亂、解郁降火、補(bǔ)血、健脾胃、通經(jīng)絡(luò)、消炎、祛斑等功效，特別是治療內(nèi)分泌紊亂引起的黃褐斑、雀斑、肝斑、色斑、暗瘡等有明顯療效。而且，千日紅是一種具有明顯美白祛斑作用的天然植物，作外用時(shí)能防止皮膚皸裂，使皮膚變得白嫩、紅潤(rùn)。目前，已從千日紅中分離香豆素、阿魏酸和一些黃酮類物質(zhì)等，但是，由于已有研究并不以從千日紅研究開發(fā)酪氨酸酶為目的。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù) 的上述缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，包括以下步驟將干燥的千日紅和提取溶劑按固液比1:2(Tl: 100 (g/mL)混合，在2(T80°C下提取
O.5 4h，提取攪拌速度為10(T250r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液在4(T60°C下減壓濃縮干燥，得到含有酪氨酸酶抑制組分千日紅粗提取物。所述的從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，還包括以下步驟將千日紅粗提取物用水混懸至密度為1. Γ1. 2g/cm3，在20-40°C下用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，所獲得的萃取部位在35飛5°C下減壓濃縮干燥，得到含有酪氨酸酶抑制組分千日紅粗提取物的萃取部位。所述的從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，還包括以下步驟(I)柱層析一次分離對(duì)千日紅粗提取物的萃取部位進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚和乙酸乙酯以體積比從9 :1至4 :6進(jìn)行混合梯度洗脫，流動(dòng)相流速為20-30mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性超過50%的組分；(2)柱層析二次分離將經(jīng)柱層析一次分離后收集的組分進(jìn)行羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，采用水、甲醇或甲醇-氯仿進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為O. 5-1. 5mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性超過50%的組分或具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分；其中甲醇-氯仿中甲醇與氯仿的體積比為1:0. 95^1 1.05；(3)柱層析三次分離將經(jīng)柱層析二次分離后收集的組分采用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化，采用甲醇-水或甲醇-氯仿進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為O. 5^1. 5mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性超過50%的組分或具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分；其中甲醇-水中甲醇與水的體積比為1:0. 95^1 :1. 05，甲醇-氯仿中甲醇與氯仿體積比為1:
O.95^1 :1. 05 ；(4)柱層析純化將經(jīng)柱層析三次分離后收集的非單一化合物組分采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱層析進(jìn)行純化，采用甲醇水溶液從甲醇濃度100%(v/v)至10%(v/v)進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為O. 5^1. 5mL/min，收集具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分。所述提取溶劑為水、45-55%(v/v)的甲醇水溶液、2(Γ80%(ν/ν)的乙醇水溶液、甲
醇或乙醇。所述有機(jī)溶劑為石油醚、乙酸乙酯或正丁醇。所述具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分為香草酸、麥黃酮、對(duì)羥基肉桂酸或?qū)籽趸夤鹚帷?br>
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、本發(fā)明所獲得的酪氨酸酶抑制劑來源于傳統(tǒng)美容祛斑中藥千日紅，為源自天然產(chǎn)物的活性成分。2、本發(fā)明采用不同溶劑提取的千日紅粗提物，不但具有較好的酪氨酸酶抑制活性，而且，所獲得的粗提物溶液含有天然色素，呈現(xiàn)出不同顏色。3、本發(fā)明采用提前溶劑提取、有機(jī)溶劑萃取分離和柱層析分離純化相結(jié)合的方法提取分離千日紅中的酪氨酸酶抑制組分，各個(gè)提取分離階段獲得了多種不同純度的酪氨酸酶抑制組分，在豐富了千日紅來源酪氨酸酶抑制組分的同時(shí)，可以根據(jù)不同要求調(diào)節(jié)提取分離流程獲得相應(yīng)的酪氨酸酶抑制組分。4、本發(fā)明從千日紅中獲得了香草酸、麥黃酮、對(duì)羥基肉桂酸、對(duì)甲氧基肉桂酸單一組分酪氨酸酶抑制劑，其對(duì)酪氨酸酶活性抑制的半抑制濃度分別為510、455、16、20μ g/mL ；首次發(fā)現(xiàn)了麥黃酮的酪氨酸酶抑制活性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1將5g干燥的千日紅加入500mL水混合，在80°C下提取4h，提取攪拌速度為IOOr/min,提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈淡紅色，在60°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥的千日紅粗提物加入50% (v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為 33%。其中，酪氨酸酶抑制活性得測(cè)試以L-酪氨酸為底物，采用分光光度法測(cè)定酪氨酸酶活性抑制率。具體測(cè)定方法參見以下文獻(xiàn)1.鄢貴龍，劉乃森.葛根提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)·2009，21:96-98.2. Prasad KN, Yang B, Yang S.1dentification of phenolic compoundsandappraisal of antioxidant and antityrosinase activities from litchi(Litchisinensis Sonn. ) seeds[J]. Food Chemistry. 2009, 116.實(shí)施例2將5g干燥的千日紅加入甲醇400mL混合，在20°C下提取0. 5h，提取攪拌速度為250r/min,提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈深藍(lán)色，在40°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為40%。實(shí)施例3將5g干燥的千日紅加入55%(v/v)甲醇水溶液300mL混合，在30°C下提取3h，提取攪拌速度為150r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈亮紅色，在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干 燥的千日紅粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為43%。實(shí)施例4將5g干燥的千日紅加入45%(v/v)甲醇水溶液300mL混合，在30°C下提取3h，提取攪拌速度為150r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈亮紅色，在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥的千日紅粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為45%。將上述千日紅粗提物用水混懸至密度為1. lg/cm3，在20°C下用石油醚萃取，所得石油醚相在35°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物石油醚萃取部位，所得石油醚萃取部位加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為30%。實(shí)施例5將5g干燥的千日紅加入乙醇IOOmL混合,在50°C下提取1. 5h,提取攪拌速度為200r/min,提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈亮藍(lán)色，在45°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為28%。將上述乙醇千日紅粗提物用水混懸至密度為1. 2g/cm3，在40°C下用正丁醇萃取，所得正丁醇在55°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物正丁醇萃取部位，所得正丁醇萃取部位加入50% (v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為26%。實(shí)施例6將5g干燥的千日紅加入20%(v/v)乙醇水溶液200mL混合，在65°C下提取3h，提取攪拌速度為150r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈暗紅色，在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥的千日紅粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為38%。將上述千日紅粗提物用水混懸至密度為1. 15g/cm3，在35°C下用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物乙酸乙酯萃取部位，所得乙酸乙酯萃取部位加入50% (v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為42%。將上述乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(9 :1 — 4 :6)進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為20mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為53%的組分后；用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，采用甲醇-水進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為O. 5mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為52%的組分后；繼續(xù)用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱層析進(jìn)一步純化，采用甲醇-水(甲醇濃度100%(v/v) — 10%(v/v))進(jìn)行梯度洗脫,流動(dòng)相流速為O. 5mL/min,分部收集一種具有酪氨酸酶抑制活性的單一組分，采用核磁共振譜分析，所獲得的譜圖數(shù)據(jù)如下1H NMR (CD3OD, δ , p. p. m.) 3. 76 (s, 3H)，6. 34 (d, 1H, J=16Hz)，6. 80 (m, 2H, J=12Hz, 7. 45 (d, 2H，J=8. 8Hz)，7. 63 (d, 1H, 8Hz) ; 13C NMR (CD30D, δ , p. p. m.) 52. 17, 115. 14，117. 03，127. 36，131.32，146. 74，161.47，169. 94)，鑒定為對(duì)甲氧基肉桂酸，經(jīng)檢測(cè)，其對(duì)酪氨酸酶活性抑制的半抑制濃度為20 μ g/mL。實(shí)施例7將5g干燥的千日紅加入50%(v/v)乙醇水溶液200mL混合，在60°C下提取3h，提取攪拌速度為150r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈暗紅色，在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥的千日紅粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為50%。將上述千日紅粗提物用水混懸至密度為1. 15g/cm3，在35°C下用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物乙酸乙酯萃取部位，所得乙酸乙酯萃取部位加入50% (v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為47%。將上述乙酸乙酯萃取部分`進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(9 :1 — 4 :6)進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為25mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為58%的組分后；用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，采用甲醇-水(體積比1:1. 05)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為L(zhǎng)OmL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為97%的組分后；繼續(xù)用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化，采用甲醇-水(體積比為1:1. 05)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為1.0mL/min，分部收集兩種具有酪氨酸酶抑制活性的單一組分，分別采用核磁共振譜鑒定分析，所獲得的譜圖數(shù)據(jù)如下(I)1H NMR(CD3OD, δ , p. p. m.) 6. 30 (d, 1H, J=8Hz)，6. 80 (m, 2H, J=8Hz, 7. 45 (d, 2H, J=8Hz)，7. 61 (d, 1H, 16Hz)，鑒定為對(duì)羥基肉桂酸。(2) 1H NMR(CDCl3, δ , p. p. m.) 7. 56 (d, 1H)，7. 55 (d, 1H)，6. 8 (t, 1H)，3. 90 (s, 3H)；13CNMR (CDCl3, δ , p. p. m. ) 170. 211，152. 855，148. 852，125. 477，123. 287，116. 039，114. 083，56. 626，鑒定為香草酸。實(shí)施例8將5g干燥的千日紅加入80%(v/v)乙醇水溶液200mL混合，在50°C下提取3h，提取攪拌速度為150r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈暗紅色，在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL，測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為35%。將上述乙醇千日紅粗提物用水混懸至密度為1. 15g/cm3，在35°C下用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物乙酸乙酯萃取部位，所得乙酸乙酯萃取部位加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為38%。將上述乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(9 :1 — 4 6)進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為30mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為70%的組分后；用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，采用甲醇-氯仿(體積比為1:0. 95)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為1.5mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為55%的組分后；繼續(xù)用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化，采用甲醇-氯仿(體積比為1:0. 95)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為1.5mL/min，分部收集一種具有酪氨酸酶抑制活性的單一組分，經(jīng)質(zhì)譜分析，其m/z為329.1 (M-);經(jīng)核磁共振譜經(jīng)分析，所獲得的譜圖數(shù)據(jù)如下=1H NMR(CDC13，S，p.p.m.)3.97(s，3H，H-7’)，3. 97 (s, 3H, H-8，)，6· 23 (d, 1Η, 2Ηζ, Η_6)，6. 50 (t, 1Η, 2Ηζ, Η_8)，6· 69 (s, 1Η, Η_3)，7. 28 (s, 2Η, Η-2，)，7· 28 (s, 2Η, Η_6，) ；13C 麗 R(CDC13, δ , p. p. m. ) 57. 24 (C_7，)，57.24 (C-8，)，95. 15(C_8)，100. 24(C_6)，104. 69(C_3)，105. 51(C-1O)，105. 72(C_2，)，105. 72(C-6，)，122. 85(C_l，)，141. 51(C_4，)，149. 78(C_3，)，149. 78 (C_5，)，159.47 (C_9)，163. 36 (C-5)，165. 97 (C_2)，166. 08 (C_7)，183. 87 (C_4)，鑒定為麥黃酮。
·
實(shí)施例9將5g干燥的千日紅加入50%(v/v)乙醇水溶液200mL混合，在60°C下提取3h，提取攪拌速度為150r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈暗紅色，在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥的千日紅粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為50%。將上述千日紅粗提物用水混懸至密度為1. 15g/cm3，在35°C下用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物乙酸乙酯萃取部位，所得乙酸乙酯萃取部位加入50% (v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為47%。將上述乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(9 :1 — 4 :6)進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為25mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為58%的組分后；用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，采用甲醇-水(體積比為1:0. 95)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為L(zhǎng)OmL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為97%的組分后；繼續(xù)用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化，采用甲醇-水(體積比為1:0. 95)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為1.0mL/min，分部收集對(duì)羥基肉桂酸和香草酸，經(jīng)檢測(cè)，對(duì)羥基肉桂酸對(duì)酪氨酸酶活性抑制的半抑制濃度為510μ g/mL，香草酸對(duì)酪氨酸酶活性抑制的半抑制濃度為16 μ g/mL。實(shí)施例10將5g干燥的千日紅加入80%(v/v)乙醇水溶液200mL混合，在50°C下提取3h，提取攪拌速度為150r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液呈暗紅色，在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物，所得干燥粗提物加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL，測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為35%。將上述乙醇千日紅粗提物用水混懸至密度為1. 15g/cm3，在35°C下用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相在50°C下減壓濃縮干燥后獲得千日紅粗提物乙酸乙酯萃取部位，所得乙酸乙酯萃取部位加入50%(v/v)乙醇溶液溶解定容至IOOmL,測(cè)得酪氨酸酶抑制活性為38%。將上述乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(9 :1 — 4 :6)進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為30mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為70%的組分后；用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，采用甲醇-氯仿(體積比為1:1. 05)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為1.5mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性為55%的組分后；繼續(xù)用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化，采用甲醇-氯仿(體積比為1:1. 05)進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為1.5mL/min，分部收集麥黃酮，經(jīng)檢測(cè)，麥黃酮對(duì)酪氨酸酶活性抑制的半抑制濃度為455 μ g/mL。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受所述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟 將干燥的千日紅和提取溶劑按固液比1:2(Tl: 100 (g/mL)混合，在2(T80 °C下提取O.5 4h，提取攪拌速度為10(T250r/min，提取后經(jīng)過濾分離，濾過液在4(T60°C下減壓濃縮干燥，得到含有酪氨酸酶抑制組分千日紅粗提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，還包括以下步驟 將千日紅粗提取物用水混懸至密度為1. Γ1. 2g/cm3，在2(T40°C下用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，所獲得的萃取部位在35飛5°C下減壓濃縮干燥，得到含有酪氨酸酶抑制組分千日紅粗提取物的萃取部位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，還包括以下步驟 (1)柱層析一次分離對(duì)千日紅粗提取物的萃取部位進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚和乙酸乙酯以體積比從9 :1至4 :6進(jìn)行混合梯度洗脫，流動(dòng)相流速為20-30mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性超過50%的組分； (2)柱層析二次分離將經(jīng)柱層析一次分離后收集的組分進(jìn)行羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，采用水、甲醇或甲醇-氯仿進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為O. 5-1. 5mL/min，分部收集酪氨酸酶抑制活性超過50%的組分或具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分；其中甲醇-氯仿中甲醇與氯仿的體積比為1:0. 95^1 1.05； (3)柱層析三次分離將經(jīng)柱層析二次分離后收集的組分采用羥丙基葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化，采用甲醇-水或甲醇-氯仿進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相流速為O. 5^1. 5mL/min,分部收集酪氨酸酶抑制活性超過50%的組分或具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分；其中甲醇-水中甲醇與水的體積比為1:0. 95^1 :1.05,甲醇-氯仿中甲醇與氯仿體積比為1:O. 95^1 :1. 05 ； (4)柱層析純化將經(jīng)柱層析三次分離后收集的非單一化合物組分采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱層析進(jìn)行純化，采用甲醇水溶液從甲醇濃度100%(v/v)至10%(v/v)進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為O. 5^1. 5mL/min，收集具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述提取溶劑為水、45-55%(v/v)的甲醇水溶液、2(Γ80%(ν/ν)的乙醇水溶液、甲醇或乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為石油醚、乙酸乙酯或正丁醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，其特征在于，所述具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物組分為香草酸、麥黃酮、對(duì)羥基肉桂酸或?qū)籽趸夤鹚帷?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種從千日紅中提取分離酪氨酸酶抑制劑的方法，以水、甲醇或乙醇及其混合溶液從中提取具有酪氨酸酶抑制活性的千日紅粗提物，采用有機(jī)溶劑從千日紅粗提物中獲得萃取部位，進(jìn)一步采用硅膠柱層析、羥丙基葡聚糖凝膠柱層析、十八烷基硅烷鍵合硅膠柱層析從萃取部位中精制獲得具有酪氨酸酶抑制活性的單體化合物。本發(fā)明在豐富了千日紅來源酪氨酸酶抑制組分的同時(shí)，可以根據(jù)不同要求調(diào)節(jié)提取分離流程獲得相應(yīng)的酪氨酸酶抑制組分，而且采用不同溶劑提取的千日紅粗提物不但具有較好的酪氨酸酶抑制活性，其溶液還呈現(xiàn)出不同顏色。
文檔編號(hào)A61K8/368GK103044243SQ20121051333
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者胡松青, 穆燕, 張婷婷, 李琳, 張喜梅, 侯軼, 劉光毅 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)