雞傳染性支氣管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雞傳染性支氣管炎弱毒株S1基因及含有該弱毒株S1基因的弱毒株。該弱毒株S1基因編碼的多肽能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，含有該弱毒株S1基因的傳染性支氣管炎YB160株，可用于制備雞傳染性支氣管炎疫苗組合物或亞單位疫苗，能夠有效防制IB流行毒株攻擊，對腺胃型傳染性支氣管炎具有較好保護力。本發(fā)明還涉及一種由本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎弱毒株制得的雞傳染性支氣管炎診斷藥劑。本發(fā)明另外還涉及一種與本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎弱毒株S1基因同源的雞傳染性支氣管炎強毒株S1基因及含有該強毒株S1基因的雞傳染性支氣管炎強毒株，該強毒株可用于抗傳染性支氣管炎疫苗或亞單位疫苗或疫苗組合物的效力檢驗。
【專利說明】雞傳染性支氣管炎弱毒株Si基因及其弱毒株和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于禽類生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因、含有該弱毒株Si基因的雞傳染性支氣管炎弱毒株及該弱毒株在制備疫苗方面的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是雞的一種急性，高度接觸傳染性的病毒性疾病。我國從1953年開始有呼吸道病變型IB的發(fā)病報道，1982年在廣東首次發(fā)現(xiàn)腎病變型IB，近年來全國各地均有IB的流行，其中多以腎病變型為主。自1995年以來我國江蘇、山東、山西、安徽等省發(fā)生了一種以生長阻滯、極度消瘦、拉稀為主要癥狀，以腺胃腫大為主要病理特征的腺胃病變型IB。該病發(fā)病率為30%~50%，病死率達30%以上?；疾‰u體重出現(xiàn)負增長，飼料報酬顯著下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。
[0003]王玉東等于1997年對腺胃型傳染性支氣管炎做了如下報道:1996年9月以來在青島及附近地區(qū)養(yǎng)雞場25~70日齡育成雞連續(xù)發(fā)生了一種以流淚、眼腫、伴有呼吸道癥狀，極度消瘦、拉稀、死亡為特征的傳染病，主要剖檢癥狀為:腺胃腫大如球狀，腺胃壁增厚，腺胃粘膜出血潰瘍，胰腺腫大出血。發(fā)病率可達100%，死亡率為3%~95%不等。不同品種雞都有發(fā)病。研究表明，病原為冠狀病毒，我們將該病暫定名為雞腺胃型傳染性支氣管炎。
[0004]免疫接種是防治雞傳染性支氣管炎病毒的最有效手段。目前，市場上已經(jīng)有一些弱毒疫苗在臨床上應用，也有一些新的毒株被分離。由于IBV血清型眾多，且流行毒株與疫苗株相比在基因水平上存在較大變異，致使已有疫苗株不能夠有效防制IB流行毒株攻擊，IB的防制效果并不理想。例如，中國專利CN 101514334A公開了一種雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株及其應用；中國專利CN 102220287A公開了一種雞傳染性支氣管炎冷適應致弱疫苗株及其應用；中國專利CN101100656A公開了一種雞腎型傳染性支氣管炎HN99株病毒株。以上專利均涉及到一些新的雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗株，可用于制備活疫苗，但這些毒株均未表明可以對腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒有良好的保護作用。
[0005]因此，目前存在的問題是需要研究開發(fā)一種可以能夠有效防制IB流行毒株攻擊，對腺胃型傳支具有較好保護力的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因，該弱毒株SI基因編碼的多肽能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體。
[0007]本發(fā)明還進一步提供了一種含有該SI基因的弱毒株，該弱毒株可用于制備抗雞傳染性支氣管炎疫苗組合物，能夠有效防止腺胃型傳支病毒的攻擊，對腺胃型傳染性支氣管炎具有較好保護力。
[0008]本發(fā)明還提供了一種雞傳染性支氣管炎弱毒株制得的亞單位疫苗。
[0009]特別地，本發(fā)明提供了一種由本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎弱毒株制得的雞傳染性支氣管炎診斷藥劑。
[0010]本發(fā)明還進一步提供了一種與本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因同源的雞傳染性支氣管炎強毒株SI基因及含有該強毒株SI基因的雞傳染性支氣管炎強毒株,該強毒株可用于抗傳染性支氣管炎疫苗或亞單位疫苗或疫苗組合物的效力檢驗。
[0011]為此，本發(fā)明提供了一種雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。
[0012]本發(fā)明中雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因是病毒在演化過程中最容易發(fā)生變異的基因，其編碼的多肽能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，且其高變區(qū)主要位于SI基因內(nèi)。通過對本發(fā)明中雞傳染性支氣管炎弱毒株Si基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)了雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因的序列總長度為1562bp。
[0013]在本發(fā)明的一個具體的實施例中，對雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因進行分離純化。先從雞傳染性支氣管炎弱毒株病毒液中提取核酸，并以此為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，用特異性引物進行PCR擴增，之后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，即獲得純化的雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因。
[0014]從GenBank中下載IBV H52、Hl20和W93疫苗株SI基因序列，用DNAStar軟件與本發(fā)明中雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因序列進行多重比對，比對方法為:打開DNAStar軟件，選用MegAlign功能,在“File”中載入需比對序列，選擇“Align”中“By ClustalVmethod”進行比對,選擇“view”下的“Sequence Distances”即可看到比對序列的核苷酸遺傳距離(見圖1)。通過比對發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中雞傳染性支氣管炎弱毒株Si基因與常見的雞傳染性支氣管炎病毒疫苗 株H52株、H120株和W93株SI基因的同源性分別為71.4%,71.6%和 71.3%。
[0015]本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明所述弱毒株SI基因的雞傳染性支氣管炎弱毒株。該弱毒株可用于制備抗雞傳染性支氣管炎疫苗組合物，能夠有效防止腺胃型傳支病毒的攻擊，對腺胃型傳染性支氣管炎具有較好保護力。
[0016]本發(fā)明中所用術(shù)語“病毒疫苗株”是指用于制備疫苗的病毒株。
[0017]本發(fā)明中所用術(shù)語“SI蛋白”是指SI基因的表達產(chǎn)物。
[0018]所謂“基因的表達”是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA序列中的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。
[0019]本發(fā)明中，所用術(shù)語“腺胃型傳染性支氣管炎病毒，簡稱腺胃型傳支”(Avianinfectious bronchitis, IB)是指本發(fā)明中所述傳染性支氣管炎病毒為腺胃型傳染性支氣管炎弱毒株，其具有如下特征:
[0020](I)發(fā)病雞腺胃腫大如球狀，腺胃壁增厚，腺胃粘膜乳頭出血潰瘍；
[0021](2)病毒分離物對NDV LaSota株病毒的繁殖產(chǎn)生干擾；
[0022](3)病毒分離物對I %雞紅細胞不產(chǎn)生凝集；
[0023](4)特異性血清中和試驗結(jié)果標明，病雞的病毒分離物與YB160陽性血清呈陽性反應，而與NDV LaSota株、IBDV B87株、AIV H9N2株、EDS76的陽性血清均呈陰性反應。
[0024]在本發(fā)明中，“雞傳染性支氣管炎弱毒株”應該從廣義上加以理解，其包括含有SEQID N0.1核苷酸序列的弱毒株SI基因或含有與SEQ ID N0.1的核苷酸序列的弱毒株SI基因的同源性在80%以上的核苷酸序列的SI基因的雞傳染性支氣管炎弱毒株，優(yōu)選含有與SEQ ID N0.1的核苷酸序列的弱毒株SI基因的同源性在90%以上的核苷酸序列的SI基因的雞傳染性支氣管炎弱毒株，更為優(yōu)選的是，含有與SEQ ID N0.1的核苷酸序列的弱毒株SI基因的同源性在95%~99%以上的核苷酸序列的SI基因的雞傳染性支氣管炎弱毒株。
[0025]在本發(fā)明中所用術(shù)語“同源性”是指兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通過本領(lǐng)域公知的任何適當?shù)姆椒ㄓ嬎愕玫剑?，可以將目標氨基?或核苷酸)序列與參比氨基酸(或核苷酸)序列進行序列比對，必要時可以引入空缺，使得兩條比對的序列間相同的氨基酸(或核苷酸)數(shù)目達到最優(yōu)化，并在此基礎上計算兩條氨基酸(或核苷酸)序列之間相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比對和同源性的計算可以通過本領(lǐng)域公知的軟件實現(xiàn)，例如，但不限于，BLAST軟件(在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的網(wǎng)址上可獲得:http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi,或者見，例如，Altschul S.F.et al, J.Mol.Biol.,215:403-410(1990) !Stephen F.et al, Nucleic Acids Res.，25:3389-3402 (1997))，Clustalff2軟件(在歐洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得)。
[0026]在一個【具體實施方式】中，一種根據(jù)本發(fā)明所述的弱毒株,其中,所述弱毒株為雞傳染性支氣管炎病毒YB160株(Avian infectious virus strain YB160)，其保藏編號為:CCTCC NO:V201235，保藏日期:2012年08月29日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)。
[0027]本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明所述的雞傳染性支氣管炎弱毒株的抗雞傳染性支氣管炎疫苗組合物。
[0028]在一個優(yōu)選實施例中，所述疫苗組合物包括傳染性支氣管炎病毒YB160株。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗組合物還進一步含有凍干保護劑。所述凍干保護劑包括但不限于含有明膠和蔗糖 。
[0030]在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述疫苗組合物由傳染性支氣管炎病毒YB160株和凍干保護劑組成:取傳染性支氣管炎病毒YB160株的生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水稀釋10萬倍,接種于9~10日齡SPF(specific pathogen free,無特定病原體)雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚接種0.1ml，接種后密封針孔，置于37°C條件下孵育。棄去24h死胚，雞胚觀察至72h，將30~72h的雞胚氣室向上，置于4°C條件下冷卻4~24h。收獲雞胚尿囊液，將6~8個雞胚尿囊液混合為一組，置于滅菌瓶中，在2~8°C條件下保存，同時做無菌檢驗，測得病毒含量應為107_°EID5(i/0.1ml。經(jīng)無菌檢驗和病毒含量測定合格的雞胚尿囊液混合后再與蔗糖明膠保護劑按1: l(v/v)配苗,凍干保護劑以8% (w/v)明膠、40% (w/v)鹿糖保護劑,經(jīng)115°C高壓滅菌40min，放4°C保存，72h內(nèi)用完。在添加過程中應不斷搖動病毒液，充分混勻后，即為疫苗組合物原液。將疫苗組合物原液進行無菌定量分裝，迅速冷凍真空干燥，加蓋密封。本發(fā)明所制備的雞傳染性支氣管炎疫苗組合物每羽份中IBV為104_%ID5(i。
[0031 ] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述疫苗組合物還包括其他弱毒疫苗株。其中，所述其他弱毒疫苗株包括但不限于雞新城疫病毒弱株和/或法氏囊弱毒株等諸如此類。優(yōu)選所述其他弱毒疫苗株為雞新城疫弱毒株。
[0032]本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述的雞傳染性支氣管炎弱毒株在預防和治療雞腺胃型支氣管炎的應用。所述應用應該理解為在制備用于預防和治療雞腺胃型支氣管炎的疫苗及其組合物中的應用。[0033]本發(fā)明提供了一種雞傳染性支氣管炎亞單位疫苗，其特征在于:所述亞單位疫苗實質(zhì)上含有序列表中SEQ ID N0.3的氨基酸序列。
[0034]在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述亞單位疫苗的制備方法，包括下述步驟:
[0035](I)利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法克隆YB160株SI蛋白的編碼基因；
[0036](2)構(gòu)建包含SI基因的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PFASTYB160S1 ；
[0037](3)構(gòu)建重組桿狀病毒rAcYB160Sl ；
[0038](4)重組桿狀病毒rAcYB160Sl感染昆蟲細胞及昆蟲細胞的培養(yǎng)；
[0039](5)重組桿狀病毒的雞傳染性支氣管炎病毒重組SI基因表達雞傳染性支氣管炎病毒重組SI蛋白，收獲和純化雞傳染性支氣管炎重組SI蛋白；
[0040](6)利用雞傳染性支氣管炎病毒重組SI蛋白，輔以佐劑，經(jīng)乳化，制備雞傳染性支氣管炎病毒亞單位疫苗。
[0041]本發(fā)明另外還提供了一種與本發(fā)明所述弱毒株的SI基因同源的雞傳染性支氣管炎強毒株SI基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
[0042]本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明所述強毒株SI基因的雞傳染性支氣管炎強毒株，其特征在于:所述強毒株為雞傳染性支氣管炎病毒YBX株(Avian infectious virusstrain YBX)，其保藏編號為:CCTCCN0:V201236，保藏日期:2012年08月29日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)。
[0043]本發(fā)明還進一步提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述強毒株在抗傳染性支氣管炎疫苗或亞單位疫苗或疫苗組合物的效力檢驗中的應用。其采用傳染性支氣管炎病毒YBX株作為強毒株進行攻毒試驗。
[0044]在本發(fā)明中，上述強毒株除用于抗傳染性支氣管炎疫苗或亞單位疫苗或疫苗組合物的效力檢驗外，其還是本發(fā)明中雞傳染性支氣管炎弱毒株及雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因的重要來源。本發(fā)明中雞傳染性支氣管炎弱毒株是由本發(fā)明所述強毒株SI基因的雞傳染性支氣管炎強毒株經(jīng)傳代致弱獲得的。而雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因則是從本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎弱毒株經(jīng)分離純化獲得的。
[0045]本發(fā)明還特別提供了一種由雞傳染性支氣管炎弱毒株制得的雞傳染性支氣管炎診斷藥劑，其可用于雞傳染性支氣管炎疫苗效力檢驗中抗體水平的測定。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因是病毒在演化過程中最容易發(fā)生變異的基因，其編碼的多肽能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，且其高變區(qū)主要位于SI基因內(nèi)。由含有該弱毒株SI基因的雞傳染性支氣管炎弱毒株所制得的雞傳染性支氣管炎疫苗組合物或亞單位疫苗均能夠有效防治IB流行病毒的攻擊，尤其對腺胃型傳染性支氣管炎具有較好保護力。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的雞傳染性支氣管炎弱毒株制得的雞傳染性支氣管炎診斷藥劑可用于雞傳染性支氣管炎疫苗效力檢驗中抗體水平的測定。本發(fā)明的傳染性支氣管炎強毒株可用于抗傳染性支氣管炎疫苗或亞單位疫苗或疫苗組合物的效力檢驗。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1為實施例1中本發(fā)明雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因與IBV常見疫苗株H120、H52和W93株SI基因的核苷酸序列比對結(jié)果。
[0049]圖2為實施例2中本發(fā)明傳染性支氣管炎病毒YB160株第F115、F125、F145、F160、F170代病毒液SI基因的核苷酸序列比對結(jié)果。
[0050]圖3為實施例5中IBV SI基因的PCR擴增產(chǎn)物鑒定結(jié)果。
[0051]圖3中的附圖標記的含義如下:1IBV SI基因擴增產(chǎn)物；2DNAMarker2000。
[0052]菌種保藏
[0053]雞傳染性支氣管炎病毒YB 160 株(Avian infectious virus strain YB160)，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012年08月29日，保藏編號:CCTCC NO:V201235o
[0054]雞傳染性支氣管炎病毒YBX株(Avian infectious virus strainYBX),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012年08月29日，保藏編號:CCTCC NO:V201236o
【具體實施方式】
[0055]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應用范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
[0056]實施例
[0057]實施例1:本發(fā)明雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株(IBV)的制備
[0058]IBV強毒株為雞傳染性支氣管炎病毒YBX株
[0059]傳染性支氣管炎病毒株傳代致弱，使用9~10日齡SPF(specific pathogenfree，無特定病原體)雞胚對株進行連續(xù)傳代致弱，每代次通過尿囊腔接種3枚雞胚，連續(xù)傳至170代，進行致弱評價試驗。將F30、F65、F90、Fl 15、F125、F145、F160和F170代毒株分別接種I日齡SPF雞，每只雞滴鼻、口服、肌肉注射1ml，其中F145、F160和F170代毒接種的雛雞，未發(fā)現(xiàn)發(fā)病和死亡，說明該毒株在F145、F160和F170代毒已經(jīng)完全致弱，對雞只具有較好的安全性。同時用本發(fā)明弱毒株免疫15日齡雛雞，于免疫后15天，用同源強毒進行攻擊，發(fā)現(xiàn)免疫組雞只狀態(tài)良好，無發(fā)病癥狀。而對照組發(fā)病明顯，其在攻毒后約30%(6-7/20)雞死亡。以上實驗經(jīng)過2次重復，得到一致的結(jié)果，說明致弱毒株具有良好的免疫保護性，選取F160代毒作為疫苗研制的候選毒株。
[0060]實施例2:本發(fā)明弱毒疫苗株雞傳染性支氣管炎病毒YB160株的培育及其基因穩(wěn)定性
[0061]1.材料與方法
[0062]1.1病毒株YBX傳代致弱
[0063]使用9~10日齡SPF雞胚對YBX株進行連續(xù)傳代致弱。每個代次毒通過尿囊腔接種3枚雞胚，每胚接種0.1ml，置37°C孵育72h (棄去24h內(nèi)死胚)，每日觀察雞胚兩次，如果雞胚在24~72h死亡，則置4°C保存。72h后將所有接胚取出置4°C，4~24h，觀察記錄雞胚病變情況，無菌收集雞胚尿囊液進行下一代傳代。選擇72h未死，但病變典型，尿囊液清亮的雞胚進行傳代。
[0064]1.2病毒滴度測定
[0065]取F30、F65、F90、Fl 15、F125、F145、F160和F170代次毒的雞胚尿囊液，分別依次作10倍系列稀釋；選擇4個稀釋倍數(shù)(IO4~IO7或IO5~IO8)的病毒懸液分別接種5枚9~10日齡SPF雞胚，每枚雞胚接種0.1ml，將雞胚置37°C溫箱中孵育I周，每天照胚，記錄I周內(nèi)雞胚的感染數(shù)和生存數(shù)，按Reed-Muench法計算EID5(I。
[0066]1.3無菌檢驗和支原體檢驗
[0067]將YB 株 F30、F65、F90、Fl 15、F125、F145、F160 和 F170 代次毒按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行無菌檢驗和支原體檢驗。
[0068]1.4外源病毒檢驗
[0069]將YB160 株 F30、F65、F90、F115、F125、F145、F160 和 F170 代次毒進行外源病毒檢測。
[0070]1.5 YB 160株的致弱評價
[0071]180只I日齡SPF雞隨機分為9組(每組20只)，分別將9組雞飼養(yǎng)于9個負壓隔離器中，雛雞自由采食飲水。在15日齡時，I~8組雛雞分別用雞胚代次毒F30 (106.5EID50)、F65 (IO7-2EID50)、 F90 (IO7-5EID50)、F115 (IO7-8EID50)、F125 (108.0EID50)、F145 (108.2EID50)、F160 (IO8-3EID50)和F170 (IO8 2EID5tl)進行接種，每只滴鼻0.1ml ;第9組雛雞作為對照組，每只滴鼻0.1ml正常尿囊液。自接種之日起，每日觀察、記錄雞群的發(fā)病情況、死亡情況，對死亡雞進行剖檢，觀察IBV靶器官、組織的病理變化并于接種后14日，使用同源強毒YBX進行攻擊，每只點眼滴鼻0.1ml ;攻毒后，每日觀察、記錄雞群發(fā)病情況、死亡情況，對死亡雞進行剖檢，觀察靶器官、組織的病理變化。
[0072]1.6 YB160株的免疫效力評價
[0073]1.6.1 15日齡的SPF雞免疫效力試驗
[0074]40只I日齡SPF雞隨機分為2組(每組20只)，分別飼養(yǎng)于負壓隔離器中，雛雞自由采食飲水。15日齡時，其中一組雛雞使用YB160株進行接種，每只滴鼻0.1ml ;另一組雛雞則作為對照組，每只滴鼻0.1ml正常尿囊液。自接種之日起，每日觀察、記錄接種雞群的發(fā)病情況、死亡情況，并于免疫后15天，對每組采集血清進行特異性抗體檢測,具體方法參照傳染性支氣管炎病毒抗體檢測試劑盒說明書進行；同時將2組雛雞用同源強毒YBX進行滴鼻攻擊，每只0.1ml ;攻毒后，每日觀察、記錄雞群的發(fā)病情況、死亡情況。
[0075]1.6.2 3日齡SPF雞免疫效力試驗
[0076]方法同1.6.1, SPF雞為3日齡。
[0077]1.7 YB 160株基因穩(wěn)定性試驗
[0078]將F115、F125、F145、F160、F170株SI基因測序，比較其基因穩(wěn)定性。
[0079]2 結(jié)果
[0080]2.1 YB 160株的傳代致弱
[0081]我們利用IBV-YBX強毒株在SPF雞胚上連續(xù)傳代170代，培育出了一株毒力明顯減弱，并且具有良好免疫原性的IBV弱毒株。試驗證實IBV-YB160 F160代毒力明顯下降，以IO5 5EID5tl接種I日齡SPF雞5/5無不良反應。IBV-YB160 F160代毒連續(xù)通過I日齡SPF雞體5代，未見毒力返強。以IO3EID5tl免疫I日齡SPF雞，攻毒后10/10保護，對照10/10發(fā)病。
[0082]2.2病毒滴度測定結(jié)果
[0083]YB 160株可高度適應雞胚，F(xiàn)30代的EID5tl為106 5/0.1ml，傳代后病毒滴度逐漸升高，F(xiàn)65 ~F125 代≥107 0EID50A).1ml，F(xiàn)145 ~F160 代趨于穩(wěn)定，滴度約為 108 2EID50/0.1ml。
[0084]表1 YB160株雞胚傳代毒滴度測定結(jié)果
[0085]
【權(quán)利要求】
1.一種雞傳染性支氣管炎弱毒株SI基因,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所/Jn ο
2.—種含有權(quán)利要求1所述弱毒株SI基因的雞傳染性支氣管炎弱毒株。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的弱毒株，其特征在于:所述弱毒株為雞傳染性支氣管炎病毒 YB160 株(Avian infectious virus strain YB160)，其保藏編號為:CCTCC NO:V201235，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
4.一種含有權(quán)利要求2或3所述的雞傳染性支氣管炎弱毒株的抗雞傳染性支氣管炎疫苗組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于:所述疫苗組合物還進一步含有凍干保護劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的疫苗組合物，其特征在于:所述疫苗組合物還包括其他弱毒疫苗株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于:所述其他弱毒疫苗株為雞新城疫署層
8.一種雞傳 染性支氣管炎亞單位疫苗，其特征在于:所述亞單位疫苗實質(zhì)上含有序列表中SEQ ID N0.3的氨基酸序列。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的雞傳染性支氣管炎弱毒株在預防和治療雞腺胃型支氣管炎的應用。
10.一種與權(quán)利要求1所述弱毒株的SI基因同源的雞傳染性支氣管炎強毒株SI基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
11.一種含有權(quán)利要求10所述強毒株SI基因的雞傳染性支氣管炎強毒株，其特征在于:所述強毒株為雞傳染性支氣管炎病毒YBX株(Avian infectious virus strain YBX),其保藏編號為=CCTCC NO:V201236，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11所述強毒株在抗傳染性支氣管炎疫苗或亞單位疫苗或疫苗組合物的效力檢驗中的應用。
【文檔編號】A61K49/00GK103849632SQ201210519405
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月6日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司