新型鈉肽、制備方法及其在制備基因工程藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型鈉肽，該新型鈉肽由腦鈉肽和蛇鈉肽連接組成；腦鈉肽位于所述新型鈉肽的N端，且蛇鈉肽位于新型鈉肽的C端；其中，腦鈉肽包括由兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵環(huán)狀結構。其制備方法包括：獲取腦鈉肽基因和蛇鈉肽基因，通過PCR方法拼接合成新型鈉肽基因；構建包括新型鈉肽基因的表達質粒；將表達質粒轉化至適宜表達菌株中進行誘導培養(yǎng)，誘導新型鈉肽的表達。本發(fā)明的新型鈉肽同時具有腦鈉肽及蛇鈉肽的特性，特異性作用顯著增強，藥物半衰期明顯延長；本發(fā)明的制備方法工藝簡單、切實可行；具有新型鈉肽的基因工程藥物可有效作用心臟、血管及腎臟等效應器官，并有效保護上述器官的功能、預防和治療心臟及腎臟衰竭等疾病。
【專利說明】新型鈉肽、制備方法及其在制備基因工程藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥【技術領域】，涉及一種基于基因工程技術制備的新型鈉肽。更具體地，本發(fā)明涉及由腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)和蛇鈉肽(dendroaspisnatriuretic peptide,DNP)組成的基因工程新型鈉肽(BDNP)、制備方法及其在制備用于治療心血管疾病和腎臟疾病等方面的基因工程藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]迄今為止已發(fā)現(xiàn)多種利鈉肽，例如心鈉肽、腦鈉肽、C型鈉肽、尿鈉肽及蛇鈉肽等等。它們雖然有一些結構上的區(qū)別，但具有以下共同的生理作用:利鈉肽通過與血管壁上的過氧化物酶體增殖物活化受體結合，激活鳥苷酸環(huán)化酶，引起心臟、血管、腎臟等組織細胞內環(huán)化鳥苷酸(cGMP)的濃度升高和平滑肌細胞的舒張；作為第二信使，cGMP能擴張動脈和靜脈，并可快速降低全身外周動脈壓、肺毛細血管楔壓、肺動脈壓、右房壓，從而降低心室的前后負荷；利鈉肽治療能拮抗內皮素、去甲腎上腺素和醛固酮過度激活產生的心臟毒性，從而擴張腎小球的入球小動脈、抑制近曲小管對鈉的吸收，使腎小球濾過率和鈉排泄增加，產生明顯的利尿和利尿鈉作用，但不增加尿鉀排泄，對腎臟的直接作用是有益的。通過上述機制利鈉肽可降低心室后負荷，通過減少腎素和醛固酮的分泌和拮抗垂體后葉加壓素和交感神經活性，起到排鈉、利尿、降壓的作用，使循環(huán)血容量降低，減輕了心室的前負荷，改善血管和腎臟的血流動力學平衡。另外，利鈉肽抑制轉化生長因子誘導的心肌纖維化、抑制炎性因子基因的上調表達及心肌纖維母細胞繁殖分化和膠原合成，進而逆轉心室重構。
[0003]腦鈉肽(BNP)最初從豬腦中分離得到，BNP前體的多肽序列在物種間具有高度同源性。人的腦鈉肽由32個氨基酸組成(圖1所示)，并包含由兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵環(huán)狀結構。正常心肌細胞合成分泌BNP，病變心肌(例如心肌肥厚、心肌梗死和心力衰竭)也可誘導其產生。BNP與利鈉妝受體A (Natriuretic peptide Areceptor, NPRA)結合，激活鳥苷酸環(huán)化酶，提高胞內cGMP水平，從而產生多種生理效應，包括利鈉、利尿、血管舒張作用；還可抑制血管平滑肌細胞和成纖維細胞增殖等。但是，BNP分泌和清除的半衰期較短，分別約為2分鐘和18分鐘。
[0004]蛇鈉肽(DNP)是一種從蛇毒中提取的利鈉肽，由38個氨基酸組成(圖2)。由于在人和大鼠的血和組織中也可測得DNP的表達，提示DNP可能是另一類內源性利鈉肽。同樣，DNP也具有促進水鈉排泄，誘導血管舒張和抑制血管平滑肌細胞增殖的功能。DNP的羧基末端(即C端)由15個氨基酸組成，可增加cGMP的刺激效應，其刺激心肌細胞產生cGMP的能力是 ANP 的 10 倍。NPRC (Natriuretic peptide C receptor, NPRC)是細胞表面的利鈉肽清除受體，DNP與NPRC的親和力低于ANP和BNP，對中性內肽酶有較強的抵抗力，提示DNP在循環(huán)中并不像其他利鈉肽那樣被快速清除。因此，DNP的半衰期較長。
[0005]目前市場上已經有基于基因工程制備的BNP，其主要用于治療急性心衰。但是，由于作用位點單一且半衰期短等原因，BNP對急性心衰的治療效果還不夠理想。
【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題在于，針對現(xiàn)有技術中將腦鈉肽應用于治療急性心衰時，由于其作用位點特異性結合作用有限且藥物半衰期短而造成的對急性心衰防治效果不理想的缺陷，提供一種基于基因工程技術制備的新型鈉肽，這種新型鈉肽同時具有腦鈉肽及蛇鈉肽的特性，特異性作用顯著增強，藥物半衰期顯著延長，可有效作用于心臟、血管及腎臟等效應器官，并有效保護心臟、腎臟及其他器官的功能，達到保護、預防和治療心臟、腎臟及其他器官衰竭疾病的目的。
[0007]本發(fā)明要解決的技術問題通過以下技術方案得以實現(xiàn):提供一種基因工程新型鈉肽，所述新型鈉肽由腦鈉肽和蛇鈉肽連接組成；所述腦鈉肽位于所述新型鈉肽的N端，且所述蛇鈉肽位于所述新型鈉肽的C端；所述腦鈉肽包括由兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵環(huán)狀結構。
[0008]在上述基因工程新型鈉肽中，所述新型鈉肽由41個氨基酸組成，其中位于N端的腦鈉肽具有26個氨基酸，位于C端的蛇鈉肽具有15個氨基酸。
[0009]在上述基因工程新型鈉肽中，所述腦鈉肽為人腦鈉肽且包括一個完整的人腦鈉肽的環(huán)狀功能區(qū)，所述蛇鈉肽具有完整的蛇鈉肽C端的15個氨基酸。
[0010]在上述基因工程新型鈉肽中，所述新型鈉肽具有序列表中的SEQ ID No:7所示的氨基酸序列。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種上述基因工程新型鈉肽的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0012]A:分別獲取腦鈉肽基因和蛇鈉肽基因；
`[0013]B:通過PCR方法將步驟A中的所述腦鈉肽基因和蛇鈉肽基因拼接合成新型鈉肽基因；所述新型鈉肽基因由位于其N端的所述腦鈉肽基因和位于其C端的所述蛇鈉肽基因連接組成；
[0014]C:采用原核表達載體構建包括所述新型鈉肽基因的表達質粒；以及
[0015]D:將步驟C中形成的表達質粒轉化至表達菌株中進行誘導培養(yǎng)，表達所述新型鈉肽。
[0016]在上述新型鈉肽的制備方法中，獲取的所述腦鈉肽基因為人腦鈉肽基因。
[0017]在上述新型鈉肽的制備方法中，所述步驟A包括以下子步驟:
[0018]獲取全長人腦鈉肽基因；
[0019]從所述全長人腦鈉肽基因獲取所述人腦鈉肽基因的N末端基因片段:構建引物序列 3:5，-GAA TTC GTT CGT GGT CCG CGT AGC CCG AAG ATGGTG CAA-3，和引物序列 4:5’ -AGC GTT CGG ACG CGG GTC ACG CAG GCTCGG GCA GCC CAG GCC ACT GGA-3’:以及
[0020]獲取所述蛇鈉肽基因的C末端基因片段:構建引物序列5:5’-GT GGA TCCTCA AGCGCT AGT GCT CGG AGC GTT CGG ACG CGG GTC ACG-3’。
[0021]在上述新型鈉肽的制備方法中，在所述步驟D之后，所述方法還包括步驟E:離心收集所述表達菌株的菌體，進行純化后得到所述新型鈉肽。
[0022]在上述新型鈉肽的制備方法中，在所述步驟C中，所述原核表達載體為PGEX-4T-1或pCW ;在所述步驟D中，所述表達菌株為DH5 a、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種上述基因工程新型鈉肽在制備用于保護、預防及治療心血管疾病和腎臟疾病的基因工程藥物中的應用。
[0024]實施本發(fā)明的技術方案，可以獲得以下技術效果:BDNP具有由BNP構成的N端和由DNP構成的C端，構成N端的BNP與利鈉肽受體A的結合能力強，同時DNP對中性內肽酶的酶解具有較強的抵抗力；特異性結合以及生物學作用的強度和作用時間顯著增加，從而顯著增加了 cGMP的刺激效應，實現(xiàn)雙重增強利鈉肽的生理、藥理效能；本發(fā)明的新型鈉肽能有效作用心臟、血管及腎臟等效應器官，并有效保護心臟及腎臟及其他器官的功能；本發(fā)明的制備方法工藝簡單、切實可行；具有本發(fā)明的新型鈉肽基因工程藥物可有效作用于效應器官，達到預防和治療心臟及腎臟及其他器官衰竭疾病的目的。本發(fā)明的新型鈉肽基因工程藥物還可以用于治療急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，以及高血壓(包括妊娠高血壓)、糖尿病、肥胖癥等疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]以下將結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。附圖中:
[0026]圖1是人腦鈉肽的示意圖；
[0027]圖2是蛇鈉肽的示意圖；以及
[0028]圖3是本發(fā)明實施例中制備得到的新型鈉肽的示意圖。
【具體實施方式】
[0029]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0030]本發(fā)明的基因工程新型鈉肽(BDNP)由腦鈉肽和蛇鈉肽連接組成。參見圖3，腦鈉肽位于該新型鈉肽的N端，而蛇鈉肽位于該新型鈉肽的C端，其中腦鈉肽包括由兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵環(huán)狀結構。更具體地，本發(fā)明的新型鈉肽由41個氨基酸組成，其中N端為腦鈉肽N端的26個氨基酸，C端為蛇鈉肽C端的15個氨基酸。該C端結構對中性內肽酶的酶解具有較強的抵抗力，可延長最終制備得到的新型鈉肽的半衰期。本發(fā)明的基因工程新型鈉肽可用于制備能保護、預防及治療心血管疾病和腎臟疾病的基因工程藥物；當然其也可應用于治療其他多器官功能不全的藥物的制備。
[0031]本發(fā)明的基因工程新型鈉肽(BDNP)的制備方法包括以下步驟:A:分別獲取腦鈉肽基因和蛇鈉肽基因；B:通過PCR方法將步驟A中的腦鈉肽基因和蛇鈉肽基因拼接合成新型鈉肽基因；新型鈉肽基因由位于其N端的腦鈉肽基因和位于其C端的蛇鈉肽基因連接組成；C:采用原核表達載體構建包括新型鈉肽基因的表達質粒；D:將步驟C中形成的表達質粒轉化至表達菌株中進行誘導培養(yǎng)，表達新型鈉肽。誘導表達之后，上述方法還包括步驟E:離心收集表達菌株的菌體，進行純化后得到基因工程新型鈉肽。該方法操作簡便、便于實現(xiàn)上述基因工程新型鈉肽(BDNP)的擴大化生產。
[0032]優(yōu)選地，本發(fā)明所采用的腦鈉肽為人腦鈉肽。以下將具體說明本發(fā)明如何通過人腦鈉肽和蛇鈉肽構建上述基因工程新型鈉肽。
[0033]進一步地，上述步驟A具體包括以下步驟:
[0034]Al:人全長腦鈉肽基因的釣取[0035]設計合適的引物，從人心臟cDNA中釣取全長人腦鈉肽基因(pre-BNP)。在美國國立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)等數(shù)據(jù)庫中找到人腦鈉肽(BNP)基因序列，并進行相應的生物信息學分析。
[0036]全長人腦鈉肽基因(pre-BNP)的釣取:在美國國立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)等數(shù)據(jù)庫中查找人腦鈉肽基因序列，設計上游和下游引物，分別為:
[0037]上游引物的引物序列1:5，-ATG GAT CCC CAG ACA GCA CCT TCC CGGGCG-3，，
[0038]下游引物的引物序列2:5，-TTA ATG CCG CCT CAG CAC TTT GCA GCCCAG GCC-3，。
[0039]以人心臟cDNA為模板，以全長人腦鈉肽基因(pre-BNP)的上游和下游引物擴增，獲得約400bp大小的基因片段。隨后，將擴增得到的基因片段裝入T載體，經基因測序分析證實基因片段為所需要的目的基因。
[0040]A2:人腦鈉肽基因(BNP) N末端基因片段的釣取
[0041]設計合適的引物，從步驟Al獲得的全長人腦鈉肽基因(pre-BNP)中釣取人腦鈉肽基因(BNP)N末端基因片段。設計含有酶切位點的上游和下游引物，分別為:
[0042]上游引物序列3:5’-GM TTC GTT CGT GGT CCG CGT AGC CCG MGATG GTG CM-3’，
[0043]下游引物序列4:5’-AGC GTT CGGACG CGG GTC ACG CAG GCT CGGGCA GCC CAG GCCACT GGA-3，，
[0044]在上游引物中引入了 EcoR I酶切位點，同時引入凝血酶蛋白切割位點，以便將目的蛋白(即BDNP)與融合蛋白酶切開。在下游引物中已經引入蛇鈉肽基因的部分序列(5，-AGC GTT CGG ACG C GG GTC ACG CAG GCT CGG-3’)用作后續(xù) PCR 擴增拼接合成新型鈉肽(BDNP)。
[0045]A3:蛇鈉肽基因C末端基因片段的合成
[0046]在美國國立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)等數(shù)據(jù)庫中，找到蛇鈉肽(DNP)基因序列，并進行相應的生物信息學分析。合成蛇鈉肽(DNP)基因C末端序列，設計同時含有部分腦鈉肽(BNP)基因的基因序列和酶切位點，設計的引物序列為
[0047]引物序列5:5，-GT GGA TCC TCA AGC GCT AGT GCT CGG AGC GTTCGG ACG CGG GTCACG-3，，
[0048]在引物中引入了 BamH I酶切位點和部分腦鈉肽(BNP)基因序列(5’_AGCGTT CGGACG CGG GTC ACG CAG GCT CGG-3’ )用作后續(xù)PCR擴增拼接合成新型鈉肽(BDNP)。
[0049]上述步驟B具體包括以下步驟——新型鈉肽(BDNP)基因的PCR拼接擴增。以人全長腦鈉肽基因(pre-BNP)為模板，分別以引物序列3和引物序列4為上游和下游引物擴增，獲得約108bp大小的基因片段，其中含有BNPN末端78bp片段和DNP C末端30bp片段。隨后，以上述IOSbp片段為模板，分別以引物序列3和引物序列5為上游和下游引物擴增，獲得約123bp大小的基因片段，其中含有BNPN末端78bp片段和DNP C末端45bp片段，即為新型鈉肽(BDNP)基因片段(參見序列表中序列6)。將擴增得到的BDNP基因片段裝入T載體，經基因測序分析證實各基因片段為所需要的目的基因。
[0050]上述步驟C具體包括以下流程——構建表達質粒:將新型鈉肽BDNP基因片段的PCR產物經EcoR I和BamH I酶切后連接插入同樣酶切的原核表達載體pGEX_4T_l或pCW中，構建成含有BDNP基因的重組質粒pGEX-BDNP或pCW_BDNP ;考慮到后續(xù)的純化，優(yōu)選使用重組質粒pGEX-BDNP。[0051]由于基因工程藥物的表達水平與表達菌株密切相關，因此，本發(fā)明中表達菌株的選取也很重要，考慮表達產物的產量、可溶性以及宿主菌株的生長狀態(tài)，本發(fā)明選擇了多種表達菌株DH5 a、BL21、Rosetta或Rosetta-gami作為宿主菌，并優(yōu)選使用BL21和Rosetta來建立表達菌株。
[0052]以下的實施例中將詳細說明如何采用原核表達載體PGEX-4T-1和pCW構建原核表達質粒pGEX-BDNP和pCW-BDNP并在表達菌株BL21和Rosetta中實現(xiàn)新型鈉肽(BDNP)的高效表達。
[0053]實施例1:
[0054]將經PCR拼接擴增、并經測序的新型鈉肽(BDNP)基因克隆至原核表達載體PGEX-4T-1中，構建成含有新型鈉肽(BDNP)的原核表達質粒pGEX-BDNP。采用BL21和Rosetta作為表達菌株。提取高質量高濃度的原核表達質粒pGEX-BDNP，利用冷CaCl2法轉化宿主細菌，將上述質粒分別轉化到BL21和Rosetta菌株中，37°C過夜培養(yǎng)；然后挑取表達菌株，接種LB培養(yǎng)基(加入氨芐青霉素，終濃度為ΙΟΟμ g/ml)，37°C過夜培養(yǎng)后收集菌液，超聲波破碎后提取蛋白，進行Western Blot檢測。
[0055]實施例2:
[0056]將經PCR拼接擴增、并經測序的新型鈉肽(BDNP)基因克隆至原核表達載體pCW中，構建成含有新型鈉肽(BDNP)的原核表達質粒pCW-BDNP。采用BL21和Rosetta作為表達菌株。提取高質量高濃度的原核表達質粒pCW-BDNP，利用冷CaCl2法轉化宿主細菌，將上述質粒分別轉化到BL21和Rosetta菌株中，37°C過夜培養(yǎng)；然后挑取表達菌株，接種LB培養(yǎng)基(加入氨芐青霉素，終濃度為ΙΟΟμ g/ml)，37°C過夜培養(yǎng)后收集菌液，超聲波破碎后提取蛋白，進行Western Blot檢測。
[0057]上述步驟E中，對`實施例1-2的新型鈉肽進行純化包括通過離心收集表達菌株，然后通過親和層析分離出新型鈉肽的融合蛋白，利用凝血酶酶切去除標簽蛋白，最后分離純化獲得新型鈉肽(BDNP)。
[0058]綜上所述，本發(fā)明的新型鈉肽同時具有腦鈉肽及蛇鈉肽的特性，特異性作用顯著增強，藥物半衰期顯著延長；本發(fā)明的制備方法工藝簡單、切實可行；具有新型鈉肽的基因工程藥物可有效作用心臟、血管及腎臟等效應器官，并有效保護心臟及腎臟的功能，預防和治療心臟及腎臟衰竭等疾病。
【權利要求】
1.一種基因工程新型鈉肽，其特征在于，所述新型鈉肽由腦鈉肽和蛇鈉肽連接組成；所述腦鈉肽位于所述新型鈉肽的N端，且所述蛇鈉肽位于所述新型鈉肽的C端；所述腦鈉肽包括由兩個半胱氨酸殘基形成的二硫鍵環(huán)狀結構。
2.根據(jù)權利要求1所述的基因工程新型鈉肽，其特征在于，所述新型鈉肽由41個氨基酸組成，其中位于N端的腦鈉肽具有26個氨基酸，位于C端的蛇鈉肽具有15個氨基酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的基因工程新型鈉肽，其特征在于，所述腦鈉肽為人腦鈉肽且包括一個完整的人腦鈉肽的環(huán)狀功能區(qū)，所述蛇鈉肽具有完整的蛇鈉肽C端的15個氨基酸。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一權利要求所述的基因工程新型鈉肽，其特征在于，所述新型納妝具有序列表中的SEQ ID No:7所不的氣基酸序列。
5.一種權利要求1-4中任一權利要求的基因工程新型鈉肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: A:分別獲取腦鈉肽基因和蛇鈉肽基因； B:通過PCR方法將步驟A中的所述腦鈉肽基因和蛇鈉肽基因拼接合成新型鈉肽基因；所述新型鈉肽基因由位于其N端的所述腦鈉肽基因和位于其C端的所述蛇鈉肽基因連接組成； C:采用原核表達載體構建包括所述新型鈉肽基因的表達質粒；以及 D:將步驟C中形成的表達質 粒轉化至表達菌株中進行誘導培養(yǎng)，表達所述新型鈉肽。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，獲取的所述腦鈉肽基因為人腦鈉肽基因。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A包括以下子步驟: 獲取全長人腦鈉肽基因； 從所述全長人腦鈉肽基因獲取所述人腦鈉肽基因的N末端基因片段:構建引物序列3:5’ -GAA TTC GTT CGT GGT CCG CGT AGC CCG AAG ATGGTG CAA-3’ 和引物序列 4:5’ -AGCGTT CGG ACG CGG GTC ACG CAG GCTCGG GCA GCC CAG GCC ACT GGA-3’:以及 獲取所述蛇鈉肽基因的C末端基因片段:構建引物序列5:5’-GT GGA TCCTCA AGC GCTAGT GCT CGG AGC GTT CGG ACG CGG GTC ACG-3’。
8.根據(jù)權利要求5-7中任一權利要求所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟D之后，所述方法還包括步驟E:離心收集所述表達菌株的菌體，進行純化后得到所述新型鈉肽。
9.根據(jù)權利要求5-7中任一權利要求所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟C中，所述原核表達載體為PGEX-4T-1或pCW ;在所述步驟D中，所述表達菌株為DH5 a、BL21、Rosetta 或 Rosetta-gami。
10.權利要求1-3中任一權利要求的基因工程新型鈉肽在制備用于保護、預防及治療心血管疾病和腎臟疾病的基因工程藥物中的應用。
【文檔編號】A61P13/12GK103601808SQ201210529925
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權日:2012年12月11日
【發(fā)明者】李凌云, 周兆平, 王曉紅, 章剛, 林楓 申請人:深圳大學