專利名稱：一種生物活性多肽lplp及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種生物活性多肽LPLP及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的過程中，牛乳中的一部分蛋白質(zhì)被乳酸菌代謝利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變?yōu)槎嚯幕蛘哂坞x的氨基酸，被人體消化吸收或通過小腸上皮細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運直接進(jìn)入人體的血液循環(huán)。在這些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被稱為“生物活性多肽”。氧化反應(yīng)和氧化代謝對于食物和人體來說都是至關(guān)重要的，自由基和活性氧引起了一系列的氧化反應(yīng)。當(dāng)過量的自由基形成，它們會超過保護(hù)性酶如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的保護(hù)作用，從而導(dǎo)致脂質(zhì)氧化、細(xì)胞凋亡等一系列的副作用產(chǎn)生。這一類的氧化反應(yīng)，不僅影響含脂食物的保質(zhì)期，也對人體的健康造成了一定的危害，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、動脈硬化等。此外，Collins等人2005年研究發(fā)現(xiàn)癌癥的發(fā)生也與DNA的氧化損傷有關(guān)。早期一些人工合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)、2，6- 二叔丁基_4_甲基苯酚(BHT)被運用到食品中，作為脂質(zhì)的抗氧化劑，但這些人工合成的添加劑對于人體都有潛在的風(fēng)險。因此，在天然食物來源中尋找安全的抗氧化劑尤為重要。近些年來，人們發(fā)現(xiàn)一些食物來源的多肽類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。這些多肽可以通過微生物發(fā)酵、消化酶解等多種途徑得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2 20個氨基酸殘基組成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。免疫活性肽是繼阿片肽發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性多肽。1981年Jolles等 人首次發(fā)現(xiàn)，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一個氨基酸序列為Val-Glu-Pro-1Ie-Pro-Tyr的六肽，體外實驗證明該肽能夠增強小鼠腹腔巨曬細(xì)胞對綿羊血紅細(xì)胞的吞曬作用。Migliore-Samour等人發(fā)現(xiàn)來自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能夠刺激綿羊血紅細(xì)胞對小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬作用以及增強對于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)飼喂大鼠發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用和紅細(xì)胞相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)功能有顯著的增強。研究表明，免疫活性肽不僅能夠增強機體免疫力，刺激機體淋巴細(xì)胞的增殖，增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能，還能促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放、提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發(fā)病率，而且不會引起機體的免疫排斥反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Leu-Pro-Leu-Pro(LPLP, SEQ ID NO:1)。較優(yōu)的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。
本發(fā)明的生物活性多肽LPLP為乳源性，具體來源于￠-酪蛋白，并且為￠-酪蛋白(SEQ ID NO:3)第150 153位的氨基酸殘基。較優(yōu)的，所述生物活性多肽具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功能。本發(fā)明的生物活性多肽可以通過基因工程的方法和化學(xué)方法人工合成，也可以從乳制品中通過分離純化的方法直接獲得。本發(fā)明還公開了編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段。￠-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列為既有技術(shù)，編碼￠-酪蛋白第150 153位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽LPLP。進(jìn)一步的，編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段，其序列為:5’ -cttcctctgcct-3’(SEQ ID N0:2)本發(fā)明第二方面公開了前述生物活性多肽的制備方法，步驟如下:I)發(fā)酵:將瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳；2)多肽的粗提:對步驟I)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進(jìn)行低溫離心分離，取上清液；3)多肽的純化:a.對步驟2)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液；b.收集的濾液采用反向?qū)游鲋鵖OURSE 5RPC ST (4.6 X 150mm)進(jìn)行反相高效液相色譜分離，收集生物活性多肽 LPLP。本發(fā)明所述脫脂乳為經(jīng)過脫脂處理的乳制品，通常脫脂乳中脂肪含量小于0.1%。較優(yōu)的，步驟I)所述厭氧發(fā)酵的條件為:發(fā)酵溫度36 38°C，發(fā)酵培養(yǎng)15 20h ；優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)19h。較優(yōu)的，步驟2)所述低溫離心的條件為:4°C,8000 IOOOOrpm,離心15 30min。較優(yōu)的，步驟3) a所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為IOkDa和3kDa。本發(fā)明采用截留分子量分別為10kDa、3kDa的濾膜，使樣品依次通過兩張濾膜進(jìn)行超濾。更優(yōu)的，步驟3) a所述超濾過程中，壓力范圍為0.f 0.3MPa，濾液流速為0.8
1.2mL/min。較優(yōu)的，步驟3 ) b反相高效液相色譜分離法中，流動相A為含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH20 ;流動相B為100%乙腈。較優(yōu)的，步驟3) b反相高效液相色譜分離法中，收集分子量為439.29Da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽LPLP。在本發(fā)明反相高效液相色譜法分離過程中，已知LPLP的分子量，收集分子大小為439.29Da的洗脫峰，即為本發(fā)明的生物活性多肽LPLP。具體的，本發(fā)明分子大小為439.29Da的洗脫峰其保留時間為21min。本發(fā)明第三方面公開了前述生物活性多肽在制備抗氧化和/或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的生物活性多肽LPLP可以用于酸奶等乳制品、減少自由基對皮膚傷害的化妝品；并且由于本發(fā)明的生物活性多肽LPLP能夠通過胃腸道直接吸收不被降解，因此可以用于制備提高免疫力的保健品，或者用于制備具有抗氧化和/或增強機體免疫力的藥物。
本發(fā)明第四方面公開了一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。本發(fā)明第五方面公開了一種增強機體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸側(cè)鏈基團上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；?、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。本發(fā)明生物活性多肽LPLP的有益效果為:本發(fā)明的乳源性生物活性多肽LPLP具有很好的抗氧化活性和促進(jìn)機體免疫力活性；一方面能夠清除機體內(nèi)的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發(fā)明的生物活性多肽LPLP還能夠增強機體免疫力，增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發(fā)病率，而且能夠通過胃腸道直接吸收不被降解，進(jìn)入體內(nèi)不會引起機體的免疫排斥反應(yīng)。對開發(fā)具有抗氧化功能及增強免疫功能的乳制品、保健品和藥品具有十分重要的意義。


圖1:瑞士乳桿菌發(fā)酵乳與未經(jīng)發(fā)酵處理的脫脂乳超濾后粗提物的質(zhì)譜對比圖(A:3000Da未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳粗提物質(zhì)譜圖，B:3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗提物質(zhì)譜圖)圖2:3000Da未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳粗提物與3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳粗提物分子
量差異及豐度比較圖3:反相高 效液相色譜分離對照發(fā)酵乳和瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中生物活性多肽比較圖(a曲線:對照發(fā)酵乳反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜；b曲線:瑞士乳桿菌發(fā)酵乳3000Da上清液反相高效液相色譜215nm的洗脫圖譜)圖4:質(zhì)量色譜提取圖(m/z=439.29)圖5:質(zhì)荷比為439.29的片段的一級質(zhì)譜6:質(zhì)荷比為439.29的片段的二級質(zhì)譜7:質(zhì)荷比為439.29的多肽az、by斷裂情況及計算得到的序列圖8: [DPPH ]甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖9:瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中生物活性多肽對[DPPH ]自由基清除率圖10:FeS04標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果圖11:酶解處理后LPLP的總離子流12:酶解處理后LPLP的一級質(zhì)譜圖
具體實施例方式在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實施方式
之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Samtoook等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DSIN ENZYMOLOGY, Vol.304, Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.), AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。實施例1活性肽的制備一、發(fā)酵乳的制備I)瑞士乳桿菌發(fā)酵乳采用脫脂 奶粉(新西蘭NZMP牌脫脂奶粉)與水配置12wt%的脫脂乳(12g脫脂奶粉加入到88g水中，下同)。在無菌條件下，挑取瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus,CICC6024)菌落三環(huán)，將其加入已滅菌的12wt%的脫脂乳中，在無菌條件下攪拌均勻。接種完成后，用鋁箔封口，以防止污染。置于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)19h。培養(yǎng)結(jié)束后，在無菌條件下將凝乳攪拌均勻，即完成瑞士乳桿菌的活化，制得用于制備瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵劑。取IOmL已制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵劑接種到500mL已滅菌的12wt%脫脂乳中(接種率為2v/v%)，37°C發(fā)酵19h后，在無菌條件下攪開凝乳，在4°C條件下保存，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳。2)對照發(fā)酵乳采用同樣方法，使用保加利亞乳桿菌(Lactobacillus Bulgaricus,LB340)和嗜熱鏈球茵(Streptococcus Thermophilus, TA40)作為發(fā)酵菌種制作對照發(fā)酵乳。具體方法為:在無菌條件下，分別挑取保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球茵菌落三環(huán)，將其分別加入已滅菌的12wt%的脫脂乳中，在無菌條件下攪拌均勻。接種完成后，用鋁箔封口，以防止污染。置于培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)19h。培養(yǎng)結(jié)束后，在無菌條件下將凝乳攪拌均勻，即完成保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球茵的活化，制得用于制備對照發(fā)酵乳的兩種發(fā)酵劑。取5mL已制備的保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑和5mL嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑，共同接種到500mL已滅菌的12被％脫脂乳中(接種率為2v/v%)，37°C發(fā)酵19h后，在無菌條件下攪開凝乳，在4°C條件下保存，得到對照發(fā)酵乳。二、生物活性多肽的確認(rèn)1.實驗方法I)樣品處理分別將前一步驟制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和對照發(fā)酵乳，以及12wt%的脫脂乳裝入離心管中進(jìn)行低溫離心，離心條件為9000rpm/min，4°C，20min。離心后棄沉淀，取上清液。
將上清液分別倒入超濾杯中，為了防止生物活性多肽被氧化，打開氮氣罐壓力閥充氮，同時打開磁力攪拌裝置，以防止溶液出現(xiàn)濃差極化現(xiàn)象。使樣品分別通過截留分子量為10kDa、3kDa的濾膜，待有濾液流出時進(jìn)行收集。超濾過程中，應(yīng)保持流速穩(wěn)定，濾液清澈。流速控制在lmL/min左右，壓力為0.r0.3MPa，分別收集瑞士乳桿菌發(fā)酵乳、對照發(fā)酵乳，以及未發(fā)酵的12wt%脫脂乳的濾液作為實驗樣、對照樣以及空白對照，于-4V冷凍保存。2)質(zhì)譜分析將前一步驟收集的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳超濾后的濾液(實驗樣)和脫脂乳超濾后的濾液(空白對照)進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件如下:離子方式:ES+質(zhì)量范圍(m/z):100-1500毛細(xì)管電壓(Capillary)(kV):3.0采樣錐(V):35.0離子源溫度(°C)):100去溶劑溫度(°C ):350去溶劑氣流(L/hr):600.0碰撞能量(eV):6. 0掃描時間(sec):0.3內(nèi)掃描時間(sec):0.022.實驗結(jié)果瑞士乳桿菌發(fā)酵乳超濾后的濾液(實驗樣)和脫脂乳超濾后的濾液(空白對照)的質(zhì)譜對比結(jié)果見圖1 2。圖1中的A曲線為3000Da未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳(空白對照)粗提物樣品，圖1中的B曲線為3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗提物樣品(實驗樣)。經(jīng)過比較可以看出，經(jīng)過瑞士乳桿菌發(fā)酵后，3000Da未經(jīng)發(fā)酵乳粗提物和3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳粗提物的組分上發(fā)生很大變化，且這些組分由于疏水性不同保留時間亦有所差異。此質(zhì)譜質(zhì)量范圍為100Da-1500Da，因此可知脫脂乳在1500Da以下、210nm處有吸收的小分子物質(zhì)相對較少；而經(jīng)過瑞士乳桿菌發(fā)酵后，在這一分子量范圍內(nèi)的物質(zhì)明顯增多，說明了這些多肽并不存在于未經(jīng)發(fā)酵處理的脫脂乳中，而是經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵后才產(chǎn)生的。而且我們發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，多肽的豐度明顯增多，進(jìn)一步證實了通過瑞士乳桿菌的發(fā)酵，脫脂乳中原有的大分子蛋白被分解，從單一的大分子蛋白變?yōu)榱慷嗲覐?fù)雜的小分子多肽。圖2是3000Da未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳(空白對照)粗提物與3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳(實驗樣)粗提物不同分子量物質(zhì)豐度差異的比較結(jié)果?？v向軸表明在脫脂乳粗提物中所含物質(zhì)對應(yīng)的分子量，橫向軸表明發(fā)酵乳粗提物中所含物質(zhì)對應(yīng)的分子量。通過比較，可以得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和未經(jīng)發(fā)酵脫脂乳中，因為發(fā)酵所帶來的差異較大的物質(zhì)的分子量，從而選擇這些質(zhì)荷比的母離子通過二級質(zhì)譜進(jìn)行進(jìn)一步的分析。如圖1所示，分子量397.07Da，保留時間6.72分鐘的物質(zhì)在脫脂乳粗提物中含量較高(圖1-A圖譜中的峰)，而發(fā)酵乳中幾乎沒有。而分子量為232.lOTa，保留時間為
3.61min的物質(zhì)在發(fā)酵乳和脫脂乳中的含量均比較高。因此，我們選擇了在發(fā)酵乳中含量較高而在未經(jīng)發(fā)酵的脫脂乳中含量較低的組分進(jìn)行了差異比較，比較結(jié)果見表I。
表1:3000Da瑞士乳桿菌發(fā)酵乳粗提物與3000Da脫脂乳粗提物差異比較
權(quán)利要求
1.一種生物活性多肽，其氨基酸序列為LeU-Pro-LeU-Pix)。
2.權(quán)利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽為乳源性。
3.編碼權(quán)利要求1所述生物活性多肽的核苷酸片段。
4.權(quán)利要求3所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQID NO:2所示。
5.權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述生物活性多肽的制備方法，步驟如下: 1)發(fā)酵:將瑞士乳桿菌添加到脫脂乳中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳； 2)多肽的粗提:對步驟I)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進(jìn)行低溫離心分離，取上清液； 3)多肽的純化: a.對步驟2)的上清液進(jìn)行超濾處理，收集濾液； b.收集的濾液采用反向?qū)游鲋鵖OURSE5RPC ST進(jìn)行反相高效液相色譜分離，收集生物活性多肽LPLP。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述厭氧發(fā)酵的條件為:發(fā)酵溫度36 38°C，發(fā)酵時間15 20h。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟3)a所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為IOkDa和3kDa ;所述超濾過程中，壓力范圍為0.1 0.3MPa，濾液流速為.0.8 L 2mL/min。
8.權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述生物活性多肽在制備抗氧化和/或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應(yīng)用。
9.一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。
10.一種增強機體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種具有體外抗氧化活性和提高機體免疫力的乳源性生物活性多肽LPLP，其氨基酸序列為Leu-Pro-Leu-Pro。經(jīng)過體外抗氧化實驗、體外免疫功能促進(jìn)實驗，驗證了多肽LPLP具有較好的抗氧化生物學(xué)活性和促進(jìn)細(xì)胞免疫的活性一方面能夠清除機體內(nèi)的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發(fā)明的生物活性多肽LPLP還能夠增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發(fā)病率，而且不會引起機體的免疫排斥反應(yīng)。對開發(fā)具有抗氧化功能及增強免疫功能的乳制品、保健品以及藥物具有十分重要的意義。
文檔編號A61K38/07GK103232526SQ20121053660
公開日2013年8月7日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者張少輝, 盧姍姍, 孫冠華, 馬鎏镠, 周婕慧, 李錫安, 占東升 申請人:上海交通大學(xué), 浙江熊貓乳品有限公司