專利名稱：乙型肝炎病毒核心抗原-dna復(fù)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗，還涉及該復(fù)合疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白疫苗和DNA疫苗是目前最常用的兩種疫苗形式，二者均有各自的優(yōu)勢和劣勢。蛋白疫苗可反復(fù)免疫，可有效激發(fā)機(jī)體體液免疫應(yīng)答，但不易誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。DNA疫苗則具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，而誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答能力較弱；若單獨(dú)使用，易被機(jī)體降解，且其轉(zhuǎn)染具有非特異性，對體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致T細(xì)胞對該抗原的耐受，長期免疫效果差。因此，如何實(shí)現(xiàn)二者的優(yōu)勢互補(bǔ)，一直是疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗，即能有效激發(fā)機(jī)體的體液免疫，還能激發(fā)機(jī)體的體細(xì)胞免疫；本發(fā)明的目的之二在于提供乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗的制備方法。1.乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗，由乙型肝炎病毒核心抗原和質(zhì)粒DNA組成，所述質(zhì)粒DNA為含小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重組載體。優(yōu)選的，所述乙型肝炎病毒核心抗原與質(zhì)粒DNA的摩爾比為1:1。優(yōu)選的，所述重組載體為PGM載體，制備方法如下克隆小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因，用BglII和EcoRI酶切后連接經(jīng)同樣酶切的pTCAE載體而得。。2.所述乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗的制備方法，包括以下步驟
將乙型肝炎病毒核心抗原加入變性劑，變性，然后加入質(zhì)粒DNA，混合，經(jīng)透析后，去變性，最后通過梯度離心得到乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗。優(yōu)選的，將HBcAg蛋白在變性條件下處理30分鐘，使HBcAg蛋白裂暴露出C-末端核酸結(jié)合序列，然后加入質(zhì)粒pGM，然后在含有500 mM NaCl，pH 7.0,50 mM Tris-HCl.O. 5mM EDTA的透析液中、4°C透析過夜；經(jīng)10-50%氯化銫密度梯度離心，收集14-19處離心液；將離心液過10 kDa孔徑的柱，然后10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，去除含氯化銫液體，用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于磷酸鹽緩沖液中，得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗；
所述變性劑中各物質(zhì)的濃度為2 M尿素，200 mM NaCl, pH值為9. 5的50mM碳酸鈉，10 mM ^ -巰基乙醇和200mM咪唑。本發(fā)明有益效果在于本發(fā)明公開了乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗，巧妙利用乙型肝炎病毒核心抗原C端有效結(jié)合核酸及其自聚成病毒樣顆粒的特性，克服了蛋白疫苗免疫原性較弱，不易誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答；DNA疫苗的轉(zhuǎn)染具有非特異性，對體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致T細(xì)胞對該抗原的耐受，長期免疫效果差的缺陷，實(shí)現(xiàn)了蛋白疫苗和DNA疫苗的優(yōu)勢互補(bǔ)，即能有效激發(fā)機(jī)體的體液免疫，還能激發(fā)機(jī)體的體細(xì)胞免疫；本發(fā)明還公開了復(fù)合疫苗的制備方法，制備方法簡單，便于大批量生產(chǎn)。


圖1為HBcAg蛋白純化前后的SDS-PAGE電泳圖。圖2 為 DNA 阻滯實(shí)驗(yàn)(A)和DNase I 保護(hù)實(shí)驗(yàn)(B)(圖 A 中，I DNA marker DL2000,2. HBcAg-pGM 復(fù)合疫苗，3.質(zhì)粒 pGM ;圖 B 中，I DNA marker DL2000, 2. HBcAg-pGM 復(fù)合疫苗，3為經(jīng)蛋白酶處理后的HBcAg-pGM復(fù)合疫苗)。圖3為HBcAg-DNA復(fù)合疫苗透視電鏡照片。
圖4為HBcAg-DNA復(fù)合疫苗轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)ELISA檢測293T細(xì)胞上清GM-CSF的濃度(pg/mL)。圖5為51Cr殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。一、實(shí)驗(yàn)材料
乙肝病毒核心抗原(JfficAg)表達(dá)質(zhì)粒為pTrcHBcshHIS質(zhì)粒，由Drvon Brunn惠贈(zèng)(參考文獻(xiàn)見H. ffizemann,A. von Brunn. Purification of E. col1-expressed HIS-taggedhepatitis B core antigen by Ni2+ -chelate affinity chromatography. J VirolMethods. 1999 ；77(2) :189-97.)。His蛋白純化鎳柱(N1-NTA Agarose,購自Qiagen公司，貨號30210);表達(dá)小鼠巨噬細(xì)胞-粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的質(zhì)粒為pGM ;對照質(zhì)粒pTCAE 由M. Reff (IDECCorp. , San Diego, Calif.)惠贈(zèng)；293T 細(xì)胞，購自 ATCC 公司。二、步驟1. HBcAg蛋白的表達(dá)、純化，參照已建立的方法(H. ffizemann, A. von Brunn.Purification of E. col1-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni2+-chelate affinity chromatography. J Virol Methods. 1999 ；77 (2) :189-97.)
(1)pTrcHBcshHIS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，用含100 u g/mL的TY培養(yǎng)液230轉(zhuǎn)37 °C過夜培養(yǎng)；
(2)取5mL新鮮菌液至2000 mL TY培養(yǎng)液，230轉(zhuǎn)37°C培養(yǎng)至OD6tltlS 0.7;再加入IPTG至終濃度為0.1 mM,繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。(3)細(xì)菌沉淀加入裂解液(100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8. 0)，5 mM EDTA,10 mM P -疏基乙醇，0.2% Trition-X-100,1 mg/mL 溶菌酶，10 mg/mL DNase I 和 10 mg/mL RNAse A)，配合超聲，破碎細(xì)菌；然后10000 g、4°C離心20分鐘，收集上清。(4)HBcAg蛋白收集將步驟(3)所得上清在25000 rpm條件下，用20%蔗糖進(jìn)行密度梯度離心；然后溶解于解離溶液(2 M尿素，200 mM NaCl, 50 mM碳酸鈉(pH 9. 5),10 mM^ -巰基乙醇，5 mM咪唑，0. 5%十二烷基肌氨酸鈉)，冰浴過夜后，再加入不含十二烷基肌酸鈉的解離溶液，繼續(xù)冰浴放置2小時(shí)。(5) HBcAg蛋白純化、濃縮用鎳柱純化HBcAg蛋白，去除細(xì)菌蛋白(具體操作步驟見Qiagen鎳柱說明書)；測定蛋白濃度，如濃度過低可用10 kDa孔徑Macrosep:Microsep柱(Pall Filtron, Karlstein, Germany)濃縮至合適濃度。將純化前和純化后的HBcAg蛋白用SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，處理HBcAg蛋白后，得到分子量約為17 kD的單體和分子量為34 kD的二聚體形式存在的；純化后能得到純度較高的HBcAg蛋白。2. GM-CSF質(zhì)粒大量制備
表達(dá)小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的質(zhì)粒pGM由劉宏利博士惠贈(zèng)(上海賀普生物科技有限公司)，該質(zhì)粒構(gòu)建方法如下用RT-RCR擴(kuò)增編碼小鼠GM-CSF基因，利用 Bglll/EcoRI克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pTCAE (由Dr. M. Reff惠贈(zèng))，測序驗(yàn)證后用堿裂解法大量制備質(zhì)粒PGM。紫外分光度測定及瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒質(zhì)量及濃度。紫外分光光度測定顯示A260/A280=1.95，質(zhì)粒濃度為11.5 mg/mL，能夠滿足實(shí)驗(yàn)所需純度及濃度。3. HBcAg-DNA復(fù)合疫苗的制備與鑒定
(1)復(fù)合疫苗制備將步驟I中純化所得的HBcAg蛋白在變性條件(2M尿素，200 mMNaCl, 50 mM碳酸鈉(pH 9. 5),10 mMP-巰基乙醇，200 mM咪唑)下處理30分鐘，使HBcAg蛋白裂暴露出C-末端核酸結(jié)合序列；然后加入質(zhì)粒pGM使HBcAg蛋白與質(zhì)粒pGM的按摩爾比為 1:1 ;然后將結(jié)合產(chǎn)物，以含有 500 mM NaCl, 50 mM Tris - HCl (pH 7. 0)、0. 5 mM EDTA 的液體為透析液，4°C透析過夜去除變性條件，使HBcAg蛋白重新聚合病毒樣顆粒并包裹質(zhì)粒pGM ;經(jīng)10-50%氯化銫密度梯度離心(4°C，Sff41轉(zhuǎn)子36000轉(zhuǎn)/分鐘，18小時(shí))，收集14-19處離心液；將收集液置于 10 kDa 孔徑 Macrosep:Microsep 柱(Pall Filtron, Karlstein,Germany), 10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,去除含氯化銫液體,用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，重懸于合適體積的PBS中，得到HBcAg-DNA復(fù)合疫苗。HBcAg-DNA復(fù)合疫苗主要通過HBcAg蛋白C端帶正電荷，質(zhì)粒DNA帶負(fù)電荷將HBcAg蛋白與質(zhì)粒DNA連接，經(jīng)HBcAg蛋白的自組裝從而形成HBcAg-DNA復(fù)合疫苗。重組乙肝核心抗原氨基酸序列 MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASAL
YRDALESPEHCTNHTALRQAILCWGELMTLASWVGNNLE
DPAARDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVL
EYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRS
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(2)復(fù)合疫苗鑒定
①通過凝膠延遲實(shí)驗(yàn)證實(shí)HBcAg與質(zhì)粒pGM結(jié)合取10uL HBcAg-DNA復(fù)合物疫苗，使用0. 8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；
②通過DNaseI保護(hù)試驗(yàn)證實(shí)質(zhì)粒被包裹于HBcAg蛋白內(nèi)部而不是存在于表面一組用45 UL復(fù)合疫苗中加入5 ii L含10 mM MgCljP 10 mM CaCl2的溶液，再加入5 u L 0. 5U g/mL的DNase I，37°C水浴30分鐘；加入4 y L 0. 5 M的EDTA并65°C加熱10分鐘終止反應(yīng)，如果質(zhì)粒DNA位于顆粒的表面，則被降解；如果質(zhì)粒被包裹于內(nèi)部，則受到保護(hù)，需要將蛋白裂解后釋放出來。另一組加入IuL 10% SDS, 5 UL 10 mg/mL的蛋白酶K，55°C水浴30分鐘，消化HBcAg顆粒；然后進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳，檢測有無DNA存在；如檢測到DNA的存在，則證實(shí)質(zhì)粒DNA被包裹在HBcAg病毒樣顆粒內(nèi)部，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，經(jīng)蛋白酶K處理后的HBcAg-DNA復(fù)合疫苗能夠檢測到DNA存在，表明制得的HBcAg-DNA復(fù)合疫苗，HBcAg蛋白與pGM質(zhì)粒結(jié)合，并將其包裹在蛋白內(nèi)部。另外通過透射電鏡檢測，分析HBcAg-DNA復(fù)合疫苗的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，HBcAg-DNA復(fù)合疫苗包裹pGM質(zhì)粒,形成直徑約30 nm的顆粒。4. HBcAg-DNA復(fù)合疫苗體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
將制備的HBcAg-DNA復(fù)合疫苗轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以用HBcAg蛋白包裹pTCAE空白質(zhì)粒及質(zhì)粒pGM作為對照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集上清，ELISA試劑盒檢測GM-CSF，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，HBcAg-pGM復(fù)合疫苗，能較好的介導(dǎo)pGM轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。HBcAg與pGM的混合物只能介導(dǎo)低水平的GM-CSF表達(dá)，而HBcAg包裹空質(zhì)粒pTCAE (由M. Reff博士惠贈(zèng)，(IDEC Corp.，San Diego, California,美國))則不能介導(dǎo) GM-CSF 的表達(dá)。5. HBcAg-DNA復(fù)合疫苗免疫原性分析
免疫正常Balb/c小鼠6 8周齡的Balb/c小鼠20只(雌雄各半)，分為5組，每組4只。一組用HBcAg-pGM復(fù)合疫苗免疫接種；其余4組分別用HBcAg蛋白、pGM表達(dá)質(zhì)粒、HBcAg蛋白包裹PTCAE質(zhì)粒、HBcAg蛋白與pGM質(zhì)?；旌厦庖撸鳛閷φ?。免疫部位均為尾根部皮下。然后去其脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞、以P815-C為靶細(xì)胞進(jìn)行51Cr殺傷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，HbcAg-pGM復(fù)合疫苗在體內(nèi)能較好地激發(fā)CTL反應(yīng)，具有較好的免疫原性。因此，根據(jù)HBcAg蛋白自聚成病毒樣顆粒及其C末端能結(jié)合核酸的特性，HBcAg成功包裹質(zhì)粒DNA，形成復(fù)合疫苗。這種新的疫苗形式能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白疫苗和DNA疫苗的優(yōu)勢互補(bǔ)，在體內(nèi)激發(fā)有效的細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答。根據(jù)此思路用，不僅可制備用于HBV感染的疫苗，也可制備感染其他疾病及腫瘤等多種疾病。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗，其特征在于由乙型肝炎病毒核心抗原和質(zhì)粒DNA組成，所述質(zhì)粒DNA為含小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重組載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗，其特征在于所述乙型肝炎病毒核心抗原與質(zhì)粒DNA的摩爾比為1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗，其特征在于，所述重組載體為PGM載體，制備方法如下克隆小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因，用BglII和EcoRI酶切后連接經(jīng)同樣酶切的pTCAE載體而得。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 將乙型肝炎病毒核心抗原加入變性劑，變性,然后加入質(zhì)粒DNA，混合，經(jīng)透析后，去變性，最后通過梯度離心得到乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗的制備方法，其特征在于具體步驟如下 將HBcAg蛋白在變性條件下處理30分鐘，使HBcAg蛋白裂暴露出C-末端核酸結(jié)合序列，然后加入質(zhì)粒pGM，然后在含有500 mM NaCl,pH 7. 0,50 mM Tris-HCl.O. 5 mM EDTA的透析液中、4°C透析過夜；經(jīng)10-50%氯化銫密度梯度離心，收集14-19處離心液；將離心液過10 kDa孔徑的柱，然后10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，去除含氯化銫液體，用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液洗滌3次后，重懸于磷酸鹽緩沖液中，得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗； 所述變性劑中各物質(zhì)的濃度為2 M尿素，200 mM NaCl, pH值為9. 5的50mM碳酸鈉，·10 mM ￠-巰基乙醇和200mM咪唑。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒核心抗原-DNA復(fù)合疫苗及其制備方法，該復(fù)合疫苗由乙型肝炎病毒核心抗原和質(zhì)粒DNA組成，所述質(zhì)粒DNA為含小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重組載體，利用了乙型肝炎病毒核心抗原C端有效結(jié)合核酸及其自聚成病毒樣顆粒的特性，克服了蛋白疫苗免疫原性較弱，不易誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答；DNA疫苗的轉(zhuǎn)染具有非特異性，對體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致T細(xì)胞對該抗原的耐受，長期免疫效果差的缺陷，制備的復(fù)合疫苗可于治療乙型肝炎病毒感染的疫苗，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P1/16GK102988976SQ201210550838
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者韓俊峰, 張俊磊, 劉宏利, 李軍, 韓超, 吳玉章 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)