專利名稱：一種利拉魯肽干預(yù)gk大鼠模型及其在制備干預(yù)治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用動物模型及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型及利拉魯肽在制備干預(yù)治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟的發(fā)展和西方生活方式的流行，2型糖尿病的發(fā)病率逐年上升。2型糖尿病及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害人類健康，給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病發(fā)病的兩大基本環(huán)節(jié)。隨著飲食，生活方式，還有遺傳因素的影 響，胰島β細(xì)胞的功能和數(shù)量缺陷是除胰島素抵抗之外導(dǎo)致2型糖尿病的另一個非常重要的原因。因此，如何保護胰島β細(xì)胞不再衰竭已經(jīng)成為治療糖尿病的一個核心問題。功能性β細(xì)胞量是近年來很受關(guān)注的一個名詞，它反映了機體內(nèi)能夠有效分泌胰島素，防止血糖的升高的總的β細(xì)胞量。利拉魯肽是一種人胰高糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物，用于2型糖尿病治療。該藥的活性成份利拉魯肽(通過基因重組技術(shù)，利用酵母生產(chǎn)的人胰高糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物)?；瘜W(xué)名稱Arg34Lys26- (N- ε - ( y -Glu (N-α -十六?；?))-GLP_l [7-37]，是胰島素促泌劑，它是在進食后由小腸L細(xì)胞分泌入血的多肽類激素。但是，目前缺乏利拉魯肽在2型糖尿病動物模型中確切的結(jié)果和結(jié)論。GK大鼠是一種自發(fā)性2型糖尿病的模型鼠，出生時就已經(jīng)存在胰島β細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的缺陷，導(dǎo)致胰島素分泌障礙和胰島β細(xì)胞量減少。且隨著年齡的增長，這些缺陷逐漸嚴(yán)重，并在大約6-8周齡的時候血糖突然升高，而被認(rèn)為是糖尿病開始發(fā)作。鑒于利拉魯肽可能存在優(yōu)于其他抗糖尿病藥物的對β細(xì)胞的保護作用，而且2型糖尿病人和動物模型中都發(fā)現(xiàn)有廣泛的β細(xì)胞增殖缺陷，凋亡增加和胰島炎癥現(xiàn)象，這就需要進一步證明利拉魯肽對于2型糖尿病β細(xì)胞的保護作用是否涉及到對抗炎癥導(dǎo)致的β細(xì)胞凋亡。現(xiàn)有關(guān)于利拉魯肽對β細(xì)胞保護作用的資料大多是以已經(jīng)發(fā)生糖尿病的動物或者正常動物體為模型，而且在這兩個模型中的結(jié)果和結(jié)論也都不一致，沒有利用利拉魯肽早期干預(yù)GK大鼠模型的實驗結(jié)果，所以無法比較早期干預(yù)和晚期干預(yù)下利拉魯肽對于糖尿病的治療作用有什么不同，所以也就沒法為臨床上更合理的使用利拉魯肽藥物提供更多的科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型，在2周齡和4周齡的GK大鼠分別給其利拉魯肽治療，比較早期干預(yù)和晚期干預(yù)下GLP-1對于2型糖尿病的治療效果，為臨床上更合理的使用GLP-1類似藥物提供更多的實驗數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明的另一個目的是提供利拉魯肽在干預(yù)治療糖尿病藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)
一種利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型，其步驟包括選擇2周齡和4周齡的GK雄性大鼠作為動物模型，分別給予2周齡的DK大鼠4周利拉魯肽治療和4周齡的GK大鼠8周利拉魯肽治療；對在治療期間及停藥后一周的GK大鼠進行檢測。所述GK大鼠進行利拉魯肽皮下注射，注射頻率為每天一次，注射劑量為O. 4μ g/
kg ο將經(jīng)利拉魯肽治療的GK大鼠進行隨機血糖、糖耐量、胰島素分泌量、胰島的體外分泌能力、單個胰島β細(xì)胞的電生理測試。利拉魯肽在制備干預(yù)治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用。選用GK大鼠作為2型糖尿病(T2DM)模型，因為GK大鼠是 一種自發(fā)性2型糖尿病的模型鼠，出生時就已經(jīng)存在胰島β細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的缺陷，導(dǎo)致胰島素分泌障礙和胰島β細(xì)胞量減少。隨著年齡的增長，這些缺陷逐漸嚴(yán)重，并在大約6-8周齡的時候血糖突然升高，而被認(rèn)為是糖尿病開始發(fā)作，而且，GK大鼠和人類2型糖尿病有相似的胰島β細(xì)胞損傷變化。例如，GK大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量減少，α細(xì)胞增加，胰島內(nèi)巨噬細(xì)胞廣泛浸潤等。所以本發(fā)明以2周齡GK大鼠和4周齡GK大鼠作為參比進行利拉魯肽治療，觀察利拉魯肽對GK大鼠2型糖尿病的保護作用以及對胰島β細(xì)胞保護機制，為GLP-1類似物的臨床應(yīng)用提供一些依據(jù)。在實驗中，GK大鼠被隨機分為利拉魯肽組和對照組，利拉魯肽組給予利拉魯肽皮下注射，每天一次，對照組給予空白對照。本發(fā)明的有益效果為1、以2周和4周的GK大鼠為模型進行利拉魯肽治療從而建立利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型，彌補了利拉魯肽早期干預(yù)GK大鼠模型的空白試驗結(jié)果，比較早期干預(yù)和晚期干預(yù)下對于糖尿病的治療作用。2、為臨床上更合理的使用GLP-1類似藥物提供更多的科學(xué)依據(jù)。3、利拉魯肽在早期干預(yù)2型糖尿病的治療中效果顯著。


圖1是利拉魯肽治療8周后的治療組與不治療對照組的糖耐量對比圖。圖2是利拉魯肽治療8周后的治療組與不治療對照組的隨機血糖對比圖。圖3是利拉魯肽治療8周后并停藥一周后的治療組與不治療對照組的隨機血糖對比圖。圖4是利拉魯肽治療8周后的治療組與不治療對照組的血胰島素對比圖。圖5是利拉魯肽治療8周后的治療組與不治療對照組的分泌指數(shù)對比圖。圖6是利拉魯肽治療8周后的治療組與不治療對照組的β細(xì)胞量對比圖。圖7是利拉魯肽治療4周后的治療組與不治療對照組的糖耐量對比圖。圖8是利拉魯肽治療4周后并停藥后I周后的治療組與不治療對照組的糖耐量對比圖。圖9是利拉魯肽治療4周后的治療組與不治療對照組的隨機血糖對比圖。圖10是利拉魯肽治療4周后的治療組與不治療對照組的血胰島素對比圖。圖11是利拉魯肽治療4周后的治療組與不治療對照組的分泌指數(shù)對比圖。圖12是利拉魯肽治療4周后的治療組與不治療對照組的β細(xì)胞量對比圖。圖13是利拉魯肽治療4周后的治療組與不治療對照組的胰島素體外分泌能力對比圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明實驗所用到的大鼠模型為SPF級GK(Goto-Kakizaki)大鼠，雄性，2周齡和4周齡各12只，均購自上海中科院斯萊克實驗動物中心。1、4周齡GK大鼠干預(yù)模型將4周齡GK大鼠隨機分為2組，每組六只，對其中一組進行利拉魯肽皮下注射，注射量為O. 4μ g/kg，每天一次；另一組作為對照組，給予空白對照。干預(yù)8周后及停藥后對大鼠進行各項檢測，具體檢測如下(I)糖耐量 將利拉魯肽干預(yù)8周的GK大鼠隔夜禁食16-18小時后，給予腹腔注射葡萄糖(2g/kg體重)；在注射葡萄糖之前以及注射后的15分鐘、30分鐘、60分鐘以及120分鐘分別從尾靜脈采血，用血糖儀(羅氏)測血糖水平。結(jié)果如圖1所示，說明使用利拉魯肽后，DK大鼠的糖耐量異常得到了很好的控制。(2)隨即血糖將利拉魯肽干預(yù)的DK大鼠每周測一次血糖，具體結(jié)果如圖2所示，說明利拉魯肽對于DK大鼠的隨機血糖起到了很好的控制效果。停藥后一周后，每周測一次隨機血糖，連續(xù)測4周，數(shù)據(jù)如圖3所示，原本血糖被控制在正常水平的治療組DK大鼠的隨機血糖迅速升高至跟未治療組相似的水平。(3)胰島素分泌測試將要做實驗的大鼠隔夜禁食16-18小時后，給予腹腔注射葡萄糖(2g/kg體重);在注射葡萄糖之前(以O(shè)’表示)以及注射后的15分鐘，30分鐘分別從尾靜脈斷尾采血，每個時間點大約80-100ul血液。將新鮮血液立即在4°C以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，留取血清，-80°C凍存。凍存的血液在室溫下融化后進行ELISA (mercodia)實驗檢測胰島素水平。實驗發(fā)現(xiàn)給藥組和不給藥組并沒有明顯的差別具體如圖4所示，計算胰島素分泌指數(shù)ΔΙ15/Δ615 (即[(115-10)/(G15-G0)])也沒有得出明顯的差別，見圖5所示；實驗比較了一下兩者的β細(xì)胞量，發(fā)現(xiàn)兩組的β細(xì)胞量也沒有明顯的差別，具體見圖6所示。以上測試，說明在已經(jīng)發(fā)生了糖尿病的GK大鼠體內(nèi)使用利拉魯肽并不能延緩糖尿病病情。這些實驗結(jié)果可能提示在糖尿病發(fā)生以后再用利拉魯肽干預(yù)是不能很好地保護和保存胰島β細(xì)胞的，更早的干預(yù)可能會更好的保護β細(xì)胞。2、2周齡GK大鼠干預(yù)模型 將2周齡GK大鼠隨機分為2組，每組六只，對其中一組進行利拉魯肽皮下注射，注射量為0.4yg/kg，每天一次；另一組作為對照組，給予空白對照。干預(yù)4周后及停藥后對大鼠進行各項檢測，具體檢測如下( I)糖耐量將利拉魯肽干預(yù)4周的GK大鼠隔夜禁食16-18小時后，給予腹腔注射葡萄糖(2g/kg體重)；在注射葡萄糖之前以及注射后的15分鐘、30分鐘、60分鐘以及120分鐘分別從尾靜脈采血，用血糖儀(羅氏)測血糖水平。具體如圖7所示，利拉魯肽能很明顯的改善糖尿病前期GK大鼠的糖耐量異常。而且在停藥4周后，再次測試糖耐量時，發(fā)現(xiàn)給藥組大鼠的糖耐量好于對照的未給藥組，見圖8。(2)隨即血糖給2周齡GK大鼠予利拉魯肽治療4周期間及停藥后4周內(nèi)，每周測一次血糖，由于兩組大鼠都還處于糖尿病前期階段，隨機血糖沒有開始升高，所以隨機血糖測試結(jié)果也無明顯的差異，具體如圖9所示。(3)胰島素分泌測試胰島素分泌測試的方法與上述4周齡DK大鼠的測試方法相同，如圖10所示，沒有發(fā)現(xiàn)給藥組和不給藥組之間的測胰島素分泌水平有明顯的差別，但是計算了胰島素分泌指數(shù)Λ I15/AG15(即[(115-10) / (G15-G0)])發(fā)現(xiàn)給藥組的分泌指數(shù)較未給藥組高一倍左右，如圖11所示；進一步提取了整個胰腺的萃取液，測兩組大鼠胰腺的胰島素含量發(fā)現(xiàn)給藥組的胰島素含量較對照組升高大約50%，見圖12 ;分離胰島體外行葡萄糖刺激的胰島素分泌 實驗(GSIS)，發(fā)現(xiàn)給藥組大鼠的胰島在高糖刺激下的胰島素分泌能力較對照組增長了近I倍，見圖13。綜合上述兩批GK大鼠的實驗數(shù)據(jù)，說明利拉魯肽早期干預(yù)能更好的改善GK大鼠糖代謝和保護胰島β細(xì)胞。對于2型糖尿病人來說，在β細(xì)胞還未明顯破壞或者說還未明顯衰竭的時候給利拉魯肽治療能更好的保存β細(xì)胞和改善糖耐量。
權(quán)利要求
1.一種利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型，其步驟包括選擇2周齡和4周齡的GK雄性大鼠作為2型糖尿病鼠類模型，分別給予2周齡的DK大鼠4周利拉魯肽治療和4周齡的GK大鼠8周利拉魯肽治療；對在治療期間及停藥后一周的GK大鼠進行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型的實驗方法，其特征在于所述GK大鼠進行利拉魯肽皮下注射，注射頻率為每天一次，注射劑量為0. g/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型的實驗方法，其特征在于將經(jīng)利拉魯肽治療的GK大鼠進行隨機血糖、糖耐量、胰島素分泌、胰島的體外分泌能力測試。
4.利拉魯肽在制備干預(yù)治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)用動物模型及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型及利拉魯肽在干預(yù)治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用，選擇2周齡和4周齡的GK雄性大鼠作為2型糖尿病鼠類模型，分別給予2周齡的DK大鼠4周利拉魯肽治療和4周齡的GK大鼠8周利拉魯肽治療；對在治療期間及停藥后一周的GK大鼠進行檢測。將經(jīng)利拉魯肽治療的GK大鼠進行隨機血糖、糖耐量、胰島素分泌等測試。本發(fā)明以2周和4周的GK大鼠為模型進行利拉魯肽治療從而建立利拉魯肽干預(yù)GK大鼠模型，彌補了利拉魯肽早期干預(yù)GK大鼠模型的空白試驗結(jié)果，比較早期干預(yù)和晚期干預(yù)下對于糖尿病的治療作用。為臨床上更合理的使用GLP-1類似藥物提供更多的科學(xué)依據(jù)。
文檔編號A61K49/00GK103007296SQ201210568408
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者寧光, 駱休, 汪啟迪, 顧燕云 申請人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所