專利名稱：一種基于硅納米線的藥物載體制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)學技術領域，涉及一種納米材料藥物載體的制備方法，具體涉及一種基于硅納米線的藥物載體的制備方法。
背景技術：
隨著納米生物技術的快速發(fā)展，近年來納米材料作為藥物載體進行癌癥治療得到了廣泛的關注。傳統(tǒng)的抗癌藥物，如鹽酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，會分布于正常組織中并且能夠快速的被腎臟清除，只有極少量的抗腫瘤藥物能夠累積在癌癥 部位發(fā)揮作用(Clin. Cancer. Res. 1999, 5, 1703-1707;Pharm. Res. 2003, 20, 1337-1350;Clin. Cancer.Res. 2005，11，8782-8788;Nat. Rev. Cancer. 2006，6，583-592.)，因而在癌癥治療方面受到極大的限制。為提高抗腫瘤藥物在作用部位的藥物濃度，其有效的策略之一是設計高載藥效率的藥物載體。近年來，許多納米材料由于其較大的比表面積、多孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)良的性能被用于設計成高載藥量的納米藥物載體，如基于介孔硅的藥物載體裝載DOX的量為1200mg/g (ACS nano2010, 4，529-539;ACS Nano2011,5,7462-7470;Angew. Chem.1nt.Ed. 2011，50，8853-8857.);氧化石墨烯負載 DOX 的量達至Ij 2350mg/g (J. Phys. Chem.C.2008，112，17554-17558;J. Am. Chem. Soc. 2008，130，10876-10877;Small2011, 7，460-464.);而單壁碳納米管具有極高的DOX負載效率達到4000mg/g (ACS Nano2007, I, 50-56.)。然而盡管在癌癥治療領域取得如此巨大的進步，發(fā)展具有更高載藥效率的新型納米藥物載體依然勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于娃納米線的具有更聞負載效率的藥物載體的制備方法。與傳統(tǒng)娃技術相比，娃納米結(jié)構(gòu)(如納米點、納米線、納米球等)具有良好的生物相容性、優(yōu)良的光電性質(zhì)、在體內(nèi)易降解和極易進行表面修飾的優(yōu)點(Nature2000,408，440-444;Science2003, 299，1874-1877;J.Am.Chem.Soc. 2007, 129, 7228-7229 ; Angew. Chem.1nt. Ed. 2009, 121, 134-138; J. Am. Chem.Soc. 2009, 131，4434-4438 ; J. Am. Chem. Soc. 201 1, 133, 14192-14195 ; Nat.Mater. 2009, 8, 331-336;Nano Lett. 2012，12，5532-5538.)。因而，硅納米材料被廣泛用于生物領域，尤其是娃納米線(silicon nanowires, SiNWs)被廣泛用于生物應用領域，如基于SiNWs腫瘤成像和癌癥熱治療的納米探針(Angew. Chem.1nt.Ed.2011，123，3136-3139;ACS Nano2012, 6，2582-2590;Nano. Lett. 2012，12，1845-1850.)。近期相關工作表明硅納米線由于大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)在催化領域得到了很好的應用(J. Am. Chem. Soc. 2009，131，17738-17739 ; Nano. Lett. 2009，9，4539-4543 ; Nano.Lett. 2009, 9，3550-3554.)，而大的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)也是增大載藥率的兩個重要因素。
基于上述的理論基礎，發(fā)明人首次發(fā)展了利用硅納米線作為新型納米載體裝載抗腫瘤藥物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案本發(fā)明的基于硅納米線的藥物載體的制備方法，具體包括下述步驟用緩沖溶液將硅納米線配成2(T200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液，在2(T37攝氏度下振蕩3 30小時，離心并用相同緩沖溶液清洗3 10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復合物。優(yōu)選的，所述的硅納米線直徑為50 150納米、長度為250 750納米。優(yōu)選的，所述的緩沖溶液pH為4 10。 優(yōu)選的，所述的緩沖溶液為PB緩沖液、PBS緩沖液或碳酸鹽緩沖液，其中PB緩沖液表示磷酸鹽緩沖液，PBS緩沖液表示加了氯化鈉的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明以硅納米線復合鹽酸阿霉素(DOX)為例，做負載效率測定及硅納米線-鹽酸阿霉素(SiNW-DOX)復合物對體外和體內(nèi)癌癥細胞的殺傷研究，但不限于D0X，紫杉醇(PTX)及其他的抗腫瘤藥物亦同樣適用。優(yōu)選的，所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素或紫杉醇。將上層未結(jié)合的DOX溶液用紫外-可見-近紅外光譜儀測定DOX在特定吸收峰處的吸光值，從而計算出硅納米線載藥效率，其負載效率不低于10000毫克每克，甚至可以達到20000毫克每克以上。利用3- (4，5-二甲基噻唑_2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽標準比色(MTT)法進行硅納米線-抗腫瘤藥物復合物對體外癌癥細胞的殺傷研究，本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復合物在細胞層面起到良好的殺傷癌細胞的作用；在4飛周齡雌性Balb/c裸鼠右側(cè)背部皮下注射0. ro. 2毫升密度為5 X IO6IX IO7的癌細胞懸液進行硅納米線-抗腫瘤藥物復合物對體內(nèi)癌癥細胞的殺傷研究，本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復合物在較長時間內(nèi)抑制腫瘤生長增加了小鼠存活率。本發(fā)明的方法極大地提高了傳統(tǒng)抗腫瘤藥物在載體中的負載效率，操作安全，快速簡便。所得的硅納米線-抗腫瘤藥物復合物能夠在細胞及活體層面不僅能夠起到良好的殺傷癌細胞的作用，還能夠起到藥物緩釋從而在較長時間內(nèi)抑制腫瘤生長的作用。由于硅納米線具有極大的載藥效率可以作為納米藥物廣泛用于癌癥治療領域。


為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的有關本發(fā)明的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復合物在細胞層面殺傷癌細胞的對比曲線圖；圖2是本發(fā)明制備得到的SiNW-DOX復合物在活體層面通過藥物緩釋殺傷癌細胞，抑制腫瘤生長的對比曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明的基于硅納米線的藥物載體的制備方法，具體包括下述步驟用緩沖溶液將硅納米線配成2(T200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液，在2(T37攝氏度下振蕩3 30小時，離心并用相同緩沖溶液清洗3 10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復合物。優(yōu)選的，所述的硅納米線直徑為5(Tl50納米、長度為25(T750納米。優(yōu)選的，所述的緩沖溶液pH為4 10。優(yōu)選的，所述的緩沖溶液為PB緩沖液、PBS緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
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優(yōu)選的，所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素或紫杉醇。下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行詳細的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。以下具體實施方式
中用到的儀器、藥品試劑包括恒溫振蕩器、離心機、酶標儀、紫外-可見-近紅外光譜儀、PB緩沖液、PBS緩沖液、碳酸鹽緩沖液、鹽酸阿霉素、改良型1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT )、十二烷基磺酸鈉(SDS )、濃鹽酸、生理鹽水。實施例1( I) SiNW-DOX 復合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=9的PB緩沖液中，然后和I毫升640微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器中25攝氏度下反應12個小時后，離心機中離心，PB緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計算得到裝載效率約為20800微克每克。(3) SiNW-DOX復合物細胞毒性研究將含20微克每毫升SiNW-DOX復合物的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入含有HeLa細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中孵育24小時，經(jīng)MTT法用酶標儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計算HeLa細胞存活率下降到約40%。實施例2(I) SiNW-DOX 復合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=9的PBS緩沖液中，然后和I毫升700微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器25攝氏度下反應24個小時后，離心機中離心，PBS緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計算得到裝載效率為19000微克每克。(3) SiNW-DOX復合物細胞毒性研究將含5微克每毫升SiNW-DOX復合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有KB細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中孵育48小時，經(jīng)MTT法用酶標儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計算KB細胞存活率下降到約20%。實施例3(I) SiNW-DOX 復合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=8的碳酸鹽緩沖液中，然后和I毫升800微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器20攝氏度下反應30個小時后，離心機離心，碳酸鹽緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計算得到裝載效率為14000微克每克。 (3) SiNW-DOX復合物細胞毒性研究將含10微克每毫升SiNW-DOX復合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有A549細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中孵育48小時，經(jīng)MTT法用酶標儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計算A549細胞存活率下降到約30%。實施例4 (I) SiNW-DOX 復合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=8的PB緩沖液中，然后和I毫升900微克每毫升的DOX溶液共同放入到一個1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器37攝氏度下反應3個小時后，離心機離心，PB緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計算得到裝載效率為16000微克每克。(3) SiNW-DOX復合物細胞毒性研究將含15微克每毫升SiNW-DOX復合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有MCF-7細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中孵育24小時，經(jīng)MTT法用酶標儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計算MCF-7細胞存活率下降到約30%。實施例5(I) SiNW-DOX 復合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=8的PBS緩沖液中，然后和I毫升1000微克每毫升DOX溶液共同放入到一個1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器30攝氏度下反應6個小時后，離心機離心，PBS緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計算得到裝載效率為14000微克每克。(3) SiNW-DOX復合物細胞毒性研究將含40微克每毫升SiNW-DOX復合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有MCF-7/Adr細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中孵育48小時，經(jīng)MTT法用酶標儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計算MCF-7/Adr細胞存活率下降到約45%。實施例6
(I) SiNW-DOX 復合物制備將20微克SiNWs固體加入100微升pH=7的PB緩沖液中，然后和I毫升1000微克每毫升DOX溶液共同放入到一個1. 5毫升離心管中，于恒溫振蕩器20攝氏度下反應30個小時后，離心機離心，PB緩沖液清洗可得到SiNW-DOX復合物溶液備用。(2) DOX裝載效率收集離心后的含有自由DOX的上清溶液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過比色法測定490納米處吸光值，計算得到裝載效率為10000微克每克。(3) SiNW-DOX復合物細胞毒性研究將含20微克每毫升SiNW-DOX復合物的低糖DMEM培養(yǎng)基，加入含有U87MG細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中孵育48小時，經(jīng)MTT法用酶標儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計算U87MG 細胞存活率下降到約15%。實施例7SiNW_D0X復合物對體外癌癥細胞的殺傷研究將含20微克每毫升SiNW-DOX復合物的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入含有HeLa細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中孵育24小時，經(jīng)MTT法用酶標儀檢測570納米處吸光值。經(jīng)計算HeLa細胞存活率下降到約40%。將HeLa細胞和KB細胞以每孔0. 8^3萬個的相同密度培養(yǎng)在96孔細胞培養(yǎng)板中，在37攝氏度5vol% 二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜。將不同濃度(1. 25微克每毫升、2. 5微克每暈升、5微克每暈升、10微克每暈升和20微克每暈升)鹽酸阿霉素(D0X)、娃納米線(SiNW)和硅納米線-鹽酸阿霉素(SiNW-DOX)復合物加入細胞培養(yǎng)板中孵育24小時和48小時。然后，向每孔中加入20微升5毫克每毫升貯存在-20攝氏度中的MTT溶液，在37攝氏度條件下孵育4小時，向每孔中加入100微升經(jīng)過鹽酸酸化的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液將細胞裂解，用酶標儀檢測570納米處吸光值。結(jié)果如圖1所示，圖1a與圖1b為HeLa細胞與不同濃度硅納米線、鹽酸阿霉素和硅納米線-鹽酸阿霉素復合物分別孵育24小時和48小時，在細胞層面殺傷HeLa細胞的結(jié)果；圖1c與圖1d為KB細胞與不同濃度硅納米線、鹽酸阿霉素和硅納米線-鹽酸阿霉素復合物分別孵育24小時和48小時，在細胞層面殺傷KB細胞的結(jié)果。由圖1明顯的看出，硅納米線對癌細胞并無殺傷作用，鹽酸阿霉素和硅納米線-鹽酸阿霉素復合物保持基本一致的癌細胞殺滅趨勢，只是在低濃度時略有差異，低濃度時鹽酸阿霉素略好，漸漸的隨著濃度的增加硅納米線-鹽酸阿霉素復合物殺滅效果和鹽酸阿霉素基本相同。實施例8SiNW_D0X復合物對體內(nèi)癌癥細胞的殺傷研究在4飛周齡雌性Balb/c裸鼠右側(cè)背部皮下注射0. f 0. 2毫升密度為5X IO6^XlO7的癌細胞懸液。當腫瘤大小達到5(T250立方毫米時，為減少體重和腫瘤大小引起的誤差將裸鼠隨機分為四組，分別在瘤內(nèi)注射相同體積的生理鹽水、鹽酸阿霉素(D0X)、硅納米線(SiNW)和硅納米線-鹽酸阿霉素(SiNW-DOX)復合物。用游標卡尺每兩天對每組裸鼠腫瘤長和寬進行測量，用以下公式計算腫瘤體積ab2/2，a代表腫瘤長度，b代表腫瘤寬度；用以下公式計算腫瘤相對體積'、/'，V代表測量時腫瘤體積，Vci代表原始腫瘤體積。結(jié)果如圖2所示，可以清晰的看出，硅納米線-鹽酸阿霉素復合物在較長時間內(nèi)(30日)均能穩(wěn)定的抑制腫瘤的生長，而鹽酸阿霉素只在最初的一段時間(10天左右)能穩(wěn)定的抑制腫瘤的生長，之后的抑制效果越來越差，可見活體組織中能夠快速的清除DOX，只有少量的DOX能夠累積的發(fā)揮作用，而SiNW-DOX復合物卻能夠不斷緩釋DOX到活體組織中，使得活體組織中的DOX量維持穩(wěn)定，極大的延長了 DOX的藥效。對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所涉及的權利要求。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。·
權利要求
1.一種基于硅納米線的藥物載體的制備方法，其特征在于，包括下述步驟用緩沖溶液將硅納米線配成2(Γ200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液， 在2(Γ37攝氏度下振蕩3 30小時，離心并用相同緩沖溶液清洗3 10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的硅納米線直徑為5(Γ150納米、長度為250 750納米。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液pH為Γ10。
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的緩沖溶液為PB緩沖液、PBS緩沖液或碳酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素或紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于硅納米線的藥物載體的制備方法，用緩沖溶液將硅納米線配成20~200微克每毫升的體系，加入抗腫瘤藥物混合成溶液，在20~37攝氏度下振蕩3~30小時，離心并用相同緩沖溶液清洗3~10次，除去上層未結(jié)合的抗腫瘤藥物，得到下層沉淀即為硅納米線-抗腫瘤藥物復合物。本發(fā)明的方法極大地提高了傳統(tǒng)抗腫瘤藥物在載體中的負載效率，操作安全，快速簡便，所得的硅納米線-抗腫瘤藥物復合物能夠在細胞及活體層面不僅能夠起到良好的殺傷癌細胞的作用，還能夠起到藥物緩釋從而在較長時間內(nèi)抑制腫瘤生長的作用，由于硅納米線具有極大的載藥效率可以作為納米藥物廣泛用于癌癥治療領域。
文檔編號A61K31/704GK102989006SQ20121057941
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權日2012年12月27日
發(fā)明者何耀, 彭飛, 蘇媛媛, 李述湯 申請人:蘇州大學