專(zhuān)利名稱(chēng)：一種防齲dna疫苗及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于口腔預(yù)防醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防齲DNA疫苗及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
齲病的發(fā)病率僅次于流感，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康和生存質(zhì)量。由于我國(guó)人口眾多、醫(yī)療資源有限，齲病的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家，研制易于普及的齲病疫苗以防治齲病、降低齲病發(fā)病率對(duì)于保障國(guó)民健康顯得尤為重要。變形鏈球菌(Streptococcus mutans下稱(chēng)變鏈菌)能夠與牙面緊密粘附并定植于牙面，產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，引起牙齒脫礦最終導(dǎo)致齲齒，是人類(lèi)主要的致齲菌。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltranferaes GTFs)和表面蛋白(surface protein antigen PAc),葡聚糖結(jié)合蛋白(glucan-bind proteins, GBPs)及變形鏈球菌壁相關(guān)蛋白A (wall-associated protein A gene, wapA)是變形鏈球菌的重要抗原物質(zhì)。這些抗原成分參與介導(dǎo)細(xì)菌的粘附，在免疫學(xué)方面有重要意義?，F(xiàn)在所研究變鏈菌的防齲疫苗多利用這幾種抗原物質(zhì)，將這幾種基因編碼的DNA疫苗載入體內(nèi)，可誘導(dǎo)血液、唾液中相應(yīng)IgG、slgA抗體的產(chǎn)生，有效控制頻病的發(fā)生和發(fā)展。有Hong Qian和My Lien Dao的研究表明wapA與細(xì)菌聚集相關(guān)(HongQian and My Lien Dao.1nactivation of the Streptococcus mutans Wall-AssociatedProtein A Gene(wapA)Results in a Decrease in Sucrose Dependent Adherence andAggregation.1nfect Immun，1993. 61 (12) : 5021-5028)。Lin Zhu 和 Jens Kreth 等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明wapA在細(xì)菌非蔗糖依賴(lài)性的聚集中扮演了重要角色，Real-time RT-PCR顯示蔗糖對(duì)wapA的基因有抑制作用，鹿糖濃度降低后，wapA開(kāi)始大量表達(dá)(Zhu Lj Kreth Jj CrossSE，et al. Functional characterization of cell-wall-associated protein WapA inStreptococcus mutans. Microbiology, 2006, 152 (8) :23952404)。Thomas K. Han 等經(jīng)過(guò)一系列的體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為WapA起了雙重粘附作用，介導(dǎo)了葡聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(尤其是I 型膠原)的粘附(Han TKj Zhang C，Dao ML.1dentification and characterization ofcollagen-binding activity in Streptococcus mutans wall-associated protein:Apossible implication in dental root caries and endocarditis. Biochem Biophys ResCommun. 2006，343(3) : 787-792)。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道將wapA用于制備DNA疫苗，并應(yīng)用于防齲的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種防齲DNA疫苗，本發(fā)明的另一目的是提供該防齲DNA疫苗的其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種防齲DNA疫苗，是由變形鏈球菌UA159的wapA蛋白全長(zhǎng)基因和真核表達(dá)載體PVAXl質(zhì)粒構(gòu)成，由于單純的DNA疫苗進(jìn)入人體后很快會(huì)被核酸酶降解，很難進(jìn)入細(xì)胞，為了進(jìn)一步提高DNA疫苗的免疫能力，本發(fā)明將該DNA疫苗以殼聚糖作為載體制備成殼聚糖納米復(fù)合物，以期刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗wapA抗體,阻斷變形鏈球菌的粘附和菌斑形成，從而應(yīng)用于抗齲齒。本發(fā)明提供了一種防齲DNA疫苗，該疫苗中的DNA是由變形鏈球菌UA159的wapA蛋白全長(zhǎng)基因和真核表達(dá)載體PVAXl質(zhì)粒構(gòu)成。所述的一種防齲DNA疫苗，該疫苗中的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明的另一方面，提供了上述的防齲DNA疫苗的制備方法，該制備方法包括如下步驟(I) wapA蛋白全長(zhǎng)表達(dá)基因的克?。?
以UA159基因組為模板擴(kuò)增獲得wapA蛋白全長(zhǎng)基因后，根據(jù)wapA蛋白全長(zhǎng)表達(dá)序列(GENBANK號(hào)NC_004350. 2)及pVAXl/lac z質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)并合成如下引物
pVAXl-wapA-F CAACTTAAGCATGAAAATGAAACGTAAACT(如SEQ ID NO:2 所示)；pVAXl-wapA-R CATGGGCCCTTAACGACGTGTTCTATAGA(如SEQ ID NO:3 所示)；(2) pVAXl-wapA重組質(zhì)粒的構(gòu)建；將(I)中獲得的rapA基因片段插入到pVAXl (pVAXl/lac z)質(zhì)粒中，構(gòu)建pVAXl-wapA重組質(zhì)粒，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH_5 α，重組質(zhì)粒酶切鑒定正確后送測(cè)序，序列如SEQ ID NO:1所示(3) DNA疫苗殼聚糖納米復(fù)合物的制備；殼聚糖(CS)溶解在NaAc緩沖液(ΡΗ=6. O)，與含有Na2SO4的pVAXl-wapA質(zhì)粒溶液分別預(yù)先加熱到50 55 , IOmin,等體積迅速混合，潤(rùn)旋Imin,室溫放置30min,即得DNA疫苗殼聚糖納米復(fù)合物。所述的殼聚糖納米復(fù)合物DNA疫苗的配方具體如下質(zhì)粒pVAXl-wapA 364 μ I (含有質(zhì)粒 100 μ g)殼聚糖O. 5mg/ml, 364 μ INa2SO415mmol/L。本發(fā)明的第三方面，提供了上述的防齲DNA疫苗在制備免疫防齲藥物中的應(yīng)用。所述的防齲是指防止非蔗糖依賴(lài)型齲齒的形成。本發(fā)明將防齲靶標(biāo)wapA應(yīng)用于防齲DNA疫苗的制備之中，利用wapA蛋白在非蔗糖依賴(lài)型齲齒形成中的重要作用，擴(kuò)大了 DNA疫苗在防齲免疫中的應(yīng)用范圍。同時(shí)，本發(fā)明將利用殼聚糖納米粒無(wú)毒、安全、有效的穿細(xì)胞能力，制備DNA疫苗殼聚糖納米復(fù)合物，從而提高DNA疫苗的免疫效率。本發(fā)明安全性高，能表達(dá)天然抗原，免疫應(yīng)答持久，有效防齲。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，易于推廣。


圖1是以變形鏈球菌UA159菌株基因組為模板克隆wapA全長(zhǎng)基因電泳鑒定圖；I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1400bp有wapA條帶2 marker2000o圖2是pVAXl-wapA和pVAXl限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳鑒定I pVAXl-wapA經(jīng)kpn I酶單酶切得到4. 3Kb片段2 PVAXI經(jīng)kpn I和EcoR I雙酶切得到3.1Kb片段3 pVAXl-wapA經(jīng)kpn I和EcoR I雙酶切得到3. OKb和1. 4Kb兩個(gè)片段4 IOK marker ο圖3是重組質(zhì)粒pVAXl-wapA結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)電泳鑒定圖；其中I為pVAXl-wapA，2為marker，3，4為DNA疫苗殼聚糖納米復(fù)合物。圖5是殼聚糖納米復(fù)合物在人胚腎293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力實(shí)驗(yàn)電泳鑒定圖； 1-7:使用弓I物 pVAXl-wapA-F 如 SEQ ID NO: 2 所示；pVAXl-wapA-R 如 SEQ ID NO: 3 所示；9-10 :使用引物 wapRTf 如 SEQ ID NO:4 所示wapRTr 如 SEQ ID NO:5 所不1:去離子水2 :轉(zhuǎn)染 Blank3:轉(zhuǎn)染 pVAXl/lipo4 :轉(zhuǎn)染 pVAXl-wapa5 :轉(zhuǎn)染 pVAXl-wapa/cs6 :轉(zhuǎn)染 pcdna-wapa/lipo7 pVAXl-wapa8 marker20009 :去離子水10 pVAXl-wapa11 marker2000o圖6是小鼠血清IgG抗體濃度(血清樣品1:600，000稀釋)檢測(cè)結(jié)果示意圖；A 組 pVAXl-wapA/CS 納米復(fù)合物B組pVAXl對(duì)照組C組CS溶液對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明用以構(gòu)建真核表達(dá)載體的基本骨架為pVAXl/lac z(購(gòu)自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見(jiàn)該公司的產(chǎn)品目錄)；構(gòu)建過(guò)程以及制備過(guò)程中，質(zhì)粒擴(kuò)增所用的宿主菌為DH5a (購(gòu)自GIBCO公司)；插入的外源基因?yàn)閁A159變形鏈球菌的WapA基因。實(shí)施例1 :防齲DNA疫苗——pVAXl-wapA的構(gòu)建一、變形鏈球菌的培養(yǎng)將凍存的變形鏈球菌UA159菌株(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院贈(zèng)送，參見(jiàn)文獻(xiàn)黃正蔚、劉正、馬瑞、唐子圣、朱彩蓮，變形鏈球菌電擊轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化研究，《中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志2007年第5期2頁(yè)404-405頁(yè))劃線(xiàn)培養(yǎng)與BHI平板培養(yǎng)基(商品化平板培養(yǎng)基，購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)上，培養(yǎng)條件為37°C厭氧培養(yǎng)(80%N2 10%C0210%H2)o挑取平板上長(zhǎng)出的單克隆接種至TY培養(yǎng)基(1% tryptone O. 8% yeast extractpH5. O)中，密閉條件下于37°C振蕩培養(yǎng)。收集菌液用于后續(xù)試驗(yàn)。二、變形鏈球菌UA159菌株基因組的獲得使用細(xì)菌基因組提取試劑盒(BacterialDNA Extraction Kit (Solution type),bioteke corporation)提取UA159基因組。步驟簡(jiǎn)述如下1、取2ml菌液，IOOOO rpm,離心30秒。棄上清,收集菌體,盡可能的吸凈上清。2、加入200 μ I緩沖液RB重懸洗滌細(xì)胞，IOOOOrpm,離心30秒，棄上清后再次將菌體重懸于200 μ I緩沖液RB中。3、加入 50 100μ1 IysozymeC 10mg/ml inlOmM Tris-HCl, ρΗ8· 0),顛倒混勻，37°C溫育30-60min。IOOOOrpm離心2min,棄上清后將菌體再次重懸于200 μ I緩沖液RB中。4、加入200 μ I結(jié)合液CB，立刻劇烈顛倒充分混勻，再加入20 μ I蛋白酶K (20mg/ml)，溶液，充分混勻，70°C放置lOmin。5、冷卻后加入100 μ I異丙醇，劇烈顛倒充分混勻。6、將上一步溶液及可能出現(xiàn)的絮狀沉淀移至吸附柱AC中，(吸附柱套入收集管中)IOOOOrpm離心30s,棄廢液。7、加入500 μ I抑制物去除液IR, 12000rpm離心30min,棄廢液。8、加入700 μ I漂洗液WB，12000rpm離心30s，棄廢液。9、加入500 μ I漂洗液WB, 12000rpm離心30s,棄廢液。10、吸附柱AC放回收集管中，13000rpm離心2min。11、取出吸附柱AC，放入一干凈離心管中，在吸附膜中部加100 μ I洗脫緩沖液EB(洗脫液65-70°C預(yù)熱)，室溫放置3-5min，12000離心lmin。三、wapA蛋白全長(zhǎng)基因的克隆及載體構(gòu)建為了獲得wapA蛋白全長(zhǎng)表達(dá)基因，以上述基因組為模板，設(shè)計(jì)合成引物如下pVAXl-wapA-F CAACTTAAGCATGAAAATGAAACGTAAACT(如SEQ ID NO:2 所示)；pVAXl-wapA-R CATGGGCCCTTAACGACGTGTTCTATAGA(如SEQ ID NO:3 所示)；并按下述PCR體系及擴(kuò)增條件克隆wapA基因。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如表I和表2所示表1:PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種防齲DNA疫苗，其特征在于，該疫苗中的DNA是由變形鏈球菌UA159的wapA蛋白全長(zhǎng)基因和真核表達(dá)載體PVAXl質(zhì)粒構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種防齲DNA疫苗，其特征在于，其中的DNA序列如SEQIDNO:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種防齲DNA疫苗，其特征在于，將該DNA疫苗以殼聚糖作為載體制備成殼聚糖納米復(fù)合物。
4.一種如權(quán)利要求3所述的防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (A)wapA蛋白全長(zhǎng)基因克?。? (B)pVAXl-wapA重組質(zhì)粒的構(gòu)建； (C)載pVAXl-wapA的殼聚糖納米復(fù)合物DNA疫苗的構(gòu)建。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于，其中的步驟(A)具體為 (a)變形鏈球菌的培養(yǎng)將變形鏈球菌UA159菌株的劃線(xiàn)培養(yǎng)于BHI平板培養(yǎng)基上，以期獲得單克隆菌株，培養(yǎng)條件為80%氮?dú)狻?0% 二氧化碳、10%氫氣、370C厭氧培養(yǎng)；挑取單克隆接種至TY培養(yǎng)基中，TY培養(yǎng)基為1%蛋白胨、0. 8%酵母浸粉、pH5. 0，37°C密閉振蕩培養(yǎng)； (b)提取基因組以菌基因組提取試劑盒，提取UA159基因組； (c)wapA蛋白全長(zhǎng)基因克隆 設(shè)計(jì)并合成如下引物，以變形鏈球菌UA159基因組為模板擴(kuò)增獲得wapA蛋白全長(zhǎng)基因pVAXl-wapA-F 如 SEQ ID NO:2 所示；pVAXl-wapA-R 如 SEQ ID NO: 3 所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于，其中的步驟(B)具體為 將步驟(A)獲得的wapA基因片段插入到pVAXl質(zhì)粒中，構(gòu)建pVAXl-wapA重組質(zhì)粒,將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH-5 a，提取純化的重組質(zhì)粒pVAXl-wapA作為DNA疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于，其中的步驟(C)具體為 殼聚糖溶解在NaAc緩沖液，PH=6. 0，與含有Na2S04的pVAXl-wapA溶液分別預(yù)先加熱到50 55°C, IOmin,等體積迅速混合,潤(rùn)旋Imin,室溫放置30min,即得DNA疫苗殼聚糖納米復(fù)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于，所述的DNA疫苗殼聚糖納米復(fù)合物，組成和配比如下 質(zhì)粒pVAXl-wapA 364 iil，其中含有質(zhì)粒100 y g， 殼聚糖0. 5mg/ml, 364 ii I Na2SO415mmol/L。
9.一種如權(quán)利要求1、2或3所述的防齲DNA疫苗在制備免疫防齲藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的防齲DNA疫苗在制備免疫防齲藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的防齲是指防止非蔗糖依賴(lài)型齲齒的形成。
全文摘要
本發(fā)明屬于口腔預(yù)防醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種防齲DNA疫苗，從變形鏈球菌UA159基因組中提取壁連相關(guān)蛋白A(wapA)蛋白全長(zhǎng)基因并克隆至真核表達(dá)載體pVAX1中。為了提高其免疫能力，本發(fā)明還將該疫苗以殼聚糖為載體制備成殼聚糖納米復(fù)合物。本發(fā)明還提供了該防齲DNA疫苗的制備方法以及應(yīng)用。本發(fā)明的防齲DNA疫苗安全性高，能表達(dá)天然抗原，免疫應(yīng)答持久，有效防齲。
文檔編號(hào)A61P1/02GK103007262SQ20121059260
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者李洪嬌, 陸一鳴, 向婧潔, 王少海, 魯瑩, 汪大林 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)