胰升糖素樣肽-1類似物在制備眼科疾病藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及胰升糖素樣肽-1類似物在制藥中的用途，具體涉及胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4在制備眼科疾病藥物中的用途，本發(fā)明采用外源性胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4，進行糖尿病性視網(wǎng)膜病變動物模型實驗，結(jié)果表明Exendin-4能抑制膠質(zhì)細胞活化所引起的視網(wǎng)膜炎癥反應，對抗糖尿病等所引起的視網(wǎng)膜細胞凋亡，顯著改善視功能，可作為眼科若干疾病的治療藥物，尤其使治療眼部缺血性及視神經(jīng)損傷疾病的藥物，治療包括糖尿病視網(wǎng)膜病變，高血壓視網(wǎng)膜病變，視網(wǎng)膜靜脈栓塞等眼科疾病。
【專利說明】胰升糖素樣肽-1類似物在制備眼科疾病藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及胰升糖素樣肽-1類似物在制藥中的用途，具體涉及胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4在制備眼科疾病藥物中的用途，尤其涉及胰升糖素樣肽_1類似物Exendin-4在制備治療缺血性或神經(jīng)損傷性眼科疾病(如糖尿病性視網(wǎng)膜病變等)藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了 Exendin-4是一種從蜥蜴唾液腺中提取的GLP-1 (胰升糖素樣肽-1, glucagons-like peptide-1)類似物,與哺乳動物GLP-1的氨基酸序列具有53%的同源性。其同時具有促進胰腺胰島素的分泌、增加胰島素敏感性及改善胰島細胞功能的作用，且不被二肽基肽酶IV(DPP-1V)分解，血漿半衰期較長，據(jù)報道，目前已用于糖尿病的臨床治療。 [0003]糖尿病(DM)作為我國繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大疾病，對人類健康的威脅和對社會的影響不言而喻。在糖尿病的諸多并發(fā)癥中，糖尿病性視網(wǎng)膜病變(簡稱糖網(wǎng)病，diabetic retinopathy, DR)具有特殊的重要地位,其病理改變從微血管瘤、硬性滲出、黃斑水腫、棉絮斑，到新生血管、玻璃體增殖甚至視網(wǎng)膜脫離，目前認為，糖網(wǎng)病的發(fā)病機理主要包括視網(wǎng)膜微血管病變和神經(jīng)元病變及中低度的炎癥反應。其發(fā)病非常普遍，是世界上主要的致盲眼病之一，統(tǒng)計顯示，糖網(wǎng)病的全球發(fā)病率約為4.8%，其發(fā)病率隨DM病程的發(fā)展而增高，5年內(nèi)DR發(fā)生率為44.4%，7年后為56%。預計到2030年美國將有2500萬，全世界將有3億DR患者。研究還顯示，糖網(wǎng)病(DR)是DM代謝紊亂和內(nèi)分泌系統(tǒng)與血液系統(tǒng)損害在視網(wǎng)膜上的反映，已成為糖尿病(DM)的最為常見和嚴重的微血管并發(fā)癥之一。據(jù)調(diào)查，不論I型或2型糖尿病患者，其中90%以上的患者在病程較長時都存在發(fā)生可造成失明的糖網(wǎng)病的危險性，嚴重影響了患者的正常生活。臨床實踐中對糖網(wǎng)病及其引起的失明尚缺乏有效的治療措施，目前主要采用的是玻璃體腔內(nèi)注射激素、眼底激光及玻璃體切割手術(shù)等治療方案。盡管這些治療手段能在一定程度上延緩病情的進展或改善癥狀，但由于其中多是相對晚期的干預尚不能從根本上消除糖網(wǎng)病的發(fā)病原因，故預后不甚理想。
[0004]因此，深入了解糖網(wǎng)病的發(fā)病機制并尋找有效的治療方法及藥物，乃是目前國際眼科研究領(lǐng)域研究人員的關(guān)注熱點和重要挑戰(zhàn)課題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供胰升糖素樣肽-1類似物在制藥中的新的用途，具體涉及胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4在制備眼科疾病藥物中的用途，尤其涉及胰升糖素樣肽_1類似物Exendin-4在制備治療缺血性或神經(jīng)損傷性眼科疾病(如糖尿病性視網(wǎng)膜病變等)及視功能的保護藥物中的用途。
[0006]本發(fā)明采用外源性胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4，進行糖尿病性視網(wǎng)膜病變動物模型試驗，通過眼內(nèi)注射Exendin-4對大鼠血糖、體重的影響實驗，結(jié)果顯示，眼內(nèi)注射E4對大鼠的血糖和體重無影響；通過Exendin-4保護GK大鼠閃光視網(wǎng)膜電圖(FERG)實驗，結(jié)果顯示,Exendin-4眼內(nèi)給藥能顯著減少ERG b波成分振幅下調(diào),實驗結(jié)果還顯示，Exendin-4能抑制GK大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡，增加Bcl-xl/Bax及Bcl-2/Bax基因的表達，減少視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞酸性蛋白的表達以及減少GK大鼠視網(wǎng)膜Claudin-5、0ccludin、ICAM-l、PIGF的表達，實驗結(jié)果表明，所述的胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4具有:
[0007]1、減輕視網(wǎng)膜形態(tài)學損傷變化，維持神經(jīng)節(jié)細胞及內(nèi)叢狀層及整個視網(wǎng)膜厚度的作用；
[0008]2、具有減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞丟失的作用；
[0009]3、具有保護視功能的作用，對視覺電生理包括視網(wǎng)膜電圖具有保護作用；
[0010]4、具有抑制膠質(zhì)細胞活化所導致的視網(wǎng)膜損傷的作用；
[0011]5、具有抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡的作用；
[0012]6、具有保護血-視網(wǎng)膜屏障功能的作用。
[0013]實驗結(jié)果證明，本發(fā)明所述的胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4可作為眼科疾病的治療藥物，對視網(wǎng)膜形態(tài)學以及視功能具有保護作用，尤其涉及糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物治療，并可顯著改善視功能，抑制膠質(zhì)細胞活化所引起的視網(wǎng)膜炎癥反應，對抗糖尿病所引起的視網(wǎng)膜細胞凋亡，治療包括糖尿病視網(wǎng)膜病變，高血壓視網(wǎng)膜病變等疾病，并可改善視功能。
[0014]本發(fā)明所述的外源性胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4可通過市購的渠道獲得?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0015]圖1是眼內(nèi)注射Exendin-4對大鼠血糖、體重的影響實驗結(jié)果，其中，
[0016]A為空腹血糖，B為餐后血糖，C為體重，GK和GK+Exendin-4治療后的兩組大鼠的空腹血糖和餐后血糖分別為Wistar組大鼠的1.7-2.8倍和1.3-1.8倍；而兩組的體重分別比Wistar大鼠輕4.3% -9% ；GK組和GK+Exendin-4組兩者的空腹血糖、餐后血糖、體重之間均無統(tǒng)計學差異(*P < 0.05，林P < 0.01, #P < 0.001，η = 12)；
[0017]圖中，control:Wistar 大鼠；
[0018]G+NS:GK大鼠+生理眼水眼內(nèi)注射；
[0019]G+E4:GK 大鼠 +Exendin-4 眼內(nèi)注射。
[0020]圖2為Exendin-4保護GK大鼠閃光視網(wǎng)膜電圖(FERG)實驗結(jié)果，其中，
[0021]A為三組大鼠FERG中b波振幅改變的比較；C為Ops波振幅比較；B和D是三組大鼠典型ERG的改變；糖尿病組b波成分振幅較正常組顯著下降(P<0.01) ;Exendin-4眼內(nèi)給藥顯著減少ERG b波成分振幅下調(diào)(*P < 0.05，#P < 0.01，#P < 0.001，η = 12);
[0022]圖中control:Wistar 大鼠；
[0023]G+NS:GK大鼠+生理眼水眼內(nèi)注射；
[0024]G+E4:GK 大鼠 +Exendin-4 眼內(nèi)注射。
[0025]圖3是Exendin-4抑制GK大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡，增加Bcl-xl/Bax及Bcl-2/Bax基因的表達，其中， [0026]A為各組視網(wǎng)膜細胞計數(shù)；B為各組GLP-1R蛋白表達情況；C為免疫組化法顯示GLP-1R在視網(wǎng)膜中的表達情況；D為Bcl-xl、Bax、Bcl-2基因在各組的表達；其中，GCL:節(jié)細胞層；INL:內(nèi)核層；ONL:外核層；
[0027]圖中control =Wistar大鼠；G+NS:GK大鼠+生理眼水眼內(nèi)注射；G+E4 ；GK大鼠+Exendin-4 眼內(nèi)注射；(*P < 0.05，林P < 0.01, #P < 0.001，η = 12)。
[0028]圖4是Exendin-4減少視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞酸性蛋白的表達,其中，
[0029]A為各組視網(wǎng)膜GFAP的蛋白表達情況；B為各組視網(wǎng)膜Vimentin的蛋白表達情況；C為免疫組化法顯示各組視網(wǎng)膜GFAP的的表達情況；
[0030]圖中control =Wistar大鼠；G+NS:GK大鼠+生理眼水眼內(nèi)注射；G+E4:GK大鼠+Exendin-4 眼內(nèi)注射；(*P < 0.05，林P < 0.01, #P < 0.001，η = 12)。
[0031]圖 5 是 Exendin-4 減少 GK 大鼠視網(wǎng)膜 Claudin-5、occludin、ICAM-1> PIGF 的表達，其中，
[0032]A為各組視網(wǎng)膜Claudin-5、occludin的蛋白表達情況；B為免疫組化法顯示各組視網(wǎng)膜Claudin-5、0ccludin的表達情況；C為各組視網(wǎng)膜ICAM-1的蛋白表達情況；D為各組視網(wǎng)膜PIGF和VEGF的蛋白表達情況；
[0033]圖中control =Wistar大鼠；G+NS:GK大鼠+生理眼水眼內(nèi)注射；G+E4:GK大鼠+Exendin-4 眼內(nèi)注射；(*P < 0.05，林P < 0.01, #P < 0.001，η = 12)。
【具體實施方式】
[0034]建立實驗動物糖尿病模型及玻璃體腔內(nèi)注射Exendin-4:
[0035]實驗采用8周齡、體重約為150克的Wistar和GK大鼠，將大鼠分為3組:正常對照組(Wistar)、糖尿病組(GK大鼠)和糖尿病E4(GK+E4)治療組；
[0036](E4溶于生理鹽水，PH = 5)，每組12只；
[0037]給藥方法:玻璃體腔內(nèi)注射E4在12周時進行，按常規(guī)方法在實驗動物模型顳側(cè)角鞏膜緣后進行玻璃體腔內(nèi)Exendin-4干預，用藥的體積量為2 μ L/眼，Ε4的劑量為0.1MG/目艮，對糖尿病組及正常對照組大鼠則給予等體積的生理鹽水；注射前將動物全身麻醉(2%戊巴比妥鈉，50mg/Kg BW)，并配合眼局部麻醉(利多卡因或丁卡因)。
[0038]實施例1玻璃體腔內(nèi)注射Exendin-4具有保護大鼠視網(wǎng)膜功能的作用，使ERG b波和Ops總振幅接近正常水平
[0039]采用全視野閃光ERG的方法檢測大鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變的程度及檢測視網(wǎng)膜的功能狀態(tài)，結(jié)果顯示，16周時，GK生理鹽水注射組的大鼠的b波和Ops波振幅明顯下降，較Wistar大鼠分別下降了 43.9±4.7% (如圖2Α、Β所示)和37.4±6.8% (如圖2C、D所示)，而GK大鼠Ε4治療組的振幅則明顯提高，b波振幅為206.7±21.5mV(GK大鼠為121.2±12.9mV,P < 0.05)，Ops 振幅為 91.7±9.0mV(GK 大鼠為 49.6±9.ImV, P < 0.05)，GK大鼠E4治療組的b波和Ops振幅與Wistar大鼠之間無顯著的統(tǒng)計學差異，提示E4對大鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變具有保護作用。
[0040]實施例2玻璃體腔內(nèi)注射Exendin-4可防止糖尿病視網(wǎng)膜厚度變薄及各核層的細胞丟失，使糖尿病大鼠視網(wǎng)膜厚度、外核層細胞計數(shù)等形態(tài)學指標接近正常水平。
[0041]HE染色形態(tài)學檢查結(jié)果顯示，在16周大小的GK大鼠的視網(wǎng)膜中，GCL，INL, ONL層較Wistar有顯著減少，最初的細胞丟失出現(xiàn)在節(jié)細胞層(是Wistar大鼠的61.3%±4.8%, η = 12 ；p < 0.05，如圖 3A、B 所示)和外核層(是 Wistar 大鼠的 72.5±1.8%,η = 12 ；p < 0.05，如圖3A所示)，在視網(wǎng)膜內(nèi)核層，也存在明顯的細胞丟失(為Wistar大鼠的78.7±5.3%，η = 12 ；p < 0.05，如圖3A所示)，Exendin-4可顯著減少節(jié)細胞層、外核層的細胞減少量，Exendin-4治療組的節(jié)細胞計數(shù)和外核層細胞計數(shù)分別為GK生理鹽水注射組的147.8 ± 14.3 %和131.6 ±4.2 % (如圖3A所示)，而內(nèi)核層為GK生理鹽水注射組的 119.6±8.7% (η = 12 ；ρ < 0.05，如圖 3Α 所示；Exendin_4 治療組與 Wistar 大鼠視網(wǎng)膜的節(jié)細胞層、外核層、內(nèi)核層計數(shù)無顯著性差異。
[0042]實施例3玻璃體腔內(nèi)注射Exendin-4可增加GLP-1R的表達、增加抗凋亡基因Bcl-xL Bcl-2的表達從而具有抑制糖尿病性視網(wǎng)膜細胞凋亡的作用
[0043]GLP-1R的表達在16周大小的GK大鼠較Wistar大鼠明顯下調(diào)(為Wistar大鼠的75.1±2.8 %，如圖3B所示)，但Exendin-4治療組則有明顯上調(diào)(為GK大鼠的131.3±6.2%如圖3B所示)，視網(wǎng)膜GLP-1R的免疫染色和Western blot檢測GLP-1R的表達情況相一致(如圖3C所示)，免疫組化顯示GLP-1R主要表達在視網(wǎng)膜內(nèi)層(包括節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層)及光感受器的內(nèi)節(jié)(如圖3C所示)；
[0044]Western blot檢測線粒體依賴的凋亡相關(guān)基因(Bcl_2, Bcl-xL and Bax)表達顯示，與Wistar大鼠比較，GK大鼠的Bcl_xL/Bax和Bcl-2/Bax的表達比例均有下降(為Wistar大鼠的72.3±2.7%和54.7±6.1 %，如圖3D所示)，但Exendin-4治療組則有顯著提高(為GK大鼠的131±3.1%和150±9.5%，如圖3D所示)。
[0045]實施例4玻璃體腔內(nèi)注射Exendin-4具有抑制視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞活化的作用
[0046]膠質(zhì)細胞酸性蛋白(GFAP)是視網(wǎng)膜組織中Muller細胞和星形膠質(zhì)細胞的重要標志物，其作用為RGC提供代謝和營養(yǎng)支持，并維持細胞外離子和神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，在視網(wǎng)膜損傷時還可發(fā)揮吞噬細胞的作用，誘發(fā)炎癥和免疫應答，在視網(wǎng)膜環(huán)境中充當免疫監(jiān)視及調(diào)控的關(guān)鍵因素，膠質(zhì)細胞過度激活則會導致視網(wǎng)膜的損傷；如圖4所示，損傷后，GFAP的表達大幅上調(diào)，在Exendin-4治療組,所述的藥物Exendin-4在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均有顯著的抑制膠質(zhì)細胞激活的作用。
【權(quán)利要求】
1.胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4在制備眼科疾病藥物中的用途。
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的眼科疾病是糖尿病性視網(wǎng)膜病變。
3.按權(quán)利要求2所述的用途，其特征是，所述的糖尿病性視網(wǎng)膜病變是缺血性病變或神經(jīng)損傷性病變。
4.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的所述的藥物是改善視功能藥物。
5.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4減輕視網(wǎng)膜形態(tài)學損傷變化，維持神經(jīng)節(jié)細胞及內(nèi)叢狀層及整個視網(wǎng)膜厚度。
6.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞丟失。
7.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-4抑制膠質(zhì)細胞活化所導致的視網(wǎng)膜損傷。
8.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的胰升糖素樣肽-1類似物Exendin-41抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡。
【文檔編號】A61K38/17GK103908657SQ201210595101
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月31日
【發(fā)明者】葉紋, 張瑜, 范毅超, 肖以欽, 張曉燕 申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院