Toll樣受體激動(dòng)劑治療癌癥的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于通過(guò)提供Toll樣受體激動(dòng)劑，例如鞭毛蛋白，治療表達(dá)Toll樣受體5的組織中的癌癥的方法和試劑。本發(fā)明還涉及使用Toll樣受體激動(dòng)劑保護(hù)肝臟免受肝毒性。
【專利說(shuō)明】TOLL樣受體激動(dòng)劑治療癌癥的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及治療表達(dá)Toll樣受體的組織中的癌癥的方法，并且涉及使用TLR激動(dòng)劑保護(hù)肝臟免受肝毒性影響的方法。[0002]發(fā)明背景
[0003]死亡受體家族及其同源配體之間的相互作用誘導(dǎo)控制組織，尤其是免疫系統(tǒng)中細(xì)胞群的內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞凋亡。雖然許多腫瘤細(xì)胞類型對(duì)死亡配體敏感，但是Fas信號(hào)的活化也誘導(dǎo)了肝臟中的大量細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致器官衰竭和死亡，妨礙其對(duì)系統(tǒng)性抗癌療法的用途。Fas配體是在活化淋巴細(xì)胞和也可通過(guò)金屬蛋白酶介導(dǎo)的裂解分泌出來(lái)并且以自分泌和旁分泌方式殺傷敏感細(xì)胞的許多腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的Fas信號(hào)的40kDa生理激動(dòng)劑。Fas是在活化淋巴細(xì)胞、多種組織和腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的跨膜受體。Fas信號(hào)通過(guò)引起自分泌自殺或旁分泌死亡(細(xì)胞凋亡)，通過(guò)消除活化淋巴細(xì)胞抑制免疫應(yīng)答在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用。結(jié)合后，F(xiàn)as信號(hào)通過(guò)參與DISC形成的外部細(xì)胞凋亡通路、半胱天冬酶-8和10和內(nèi)部(線粒體)細(xì)胞凋亡活化半胱天冬酶-8和Bid裂解和細(xì)胞色素釋放誘導(dǎo)p53非依賴性細(xì)胞死亡。兩種細(xì)胞凋亡通路導(dǎo)致半胱天冬酶-3和7活化。線粒體細(xì)胞凋亡受促凋亡和抗凋亡Bcl2家族膜調(diào)節(jié)。在腫瘤細(xì)胞中，在Fas受體不存在時(shí)，或NF_kB組成性活化，導(dǎo)致抗凋亡基因(例如c-Flip、Bcl-2、Bcl-xL)表達(dá)時(shí)，常常發(fā)現(xiàn)Fas信號(hào)調(diào)節(jié)異常。已經(jīng)證明NF-kB反應(yīng)性基因c-Flip抑制腫瘤中半胱天冬酶-8和Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(REF，Kataoka 等 2000)。
[0004]發(fā)現(xiàn)通過(guò)Fas、TRAIL和TNF α死亡受體信號(hào)的ρ53非依賴性細(xì)胞凋亡機(jī)制后，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞通常Ρ53功能受損，所以它們似乎是有希望的抗癌療法目標(biāo)。然而，死亡受體配體誘導(dǎo)嚴(yán)重的肝毒性。這阻礙了這些抗癌療法的研發(fā)。雖然Fas激動(dòng)劑引起肝損傷并且TNF-a在肝臟、肺和其它器官中引起嚴(yán)重炎癥，但是在人體中TRAIL毒性最低。因此相比臨床應(yīng)用于抗癌療法的其它激動(dòng)劑，TRAIL受到更多的關(guān)注。然而，許多腫瘤對(duì)TRAIL療法不敏感。當(dāng)前采取了解決死亡受體毒性問(wèn)題的幾種方法，其中大部分旨在通過(guò)阻滯NF-kB活性和增加受體表達(dá)增強(qiáng)腫瘤敏感性，從而減少有效治療所必需的藥物量。另一個(gè)方向是使藥物遞送局部化于腫瘤以將對(duì)遠(yuǎn)處器官的毒性作用減到最小。迄今為止，沒(méi)有預(yù)防毒性(包括肝損傷)，允許在臨床試驗(yàn)中全身應(yīng)用死亡受體激動(dòng)劑的可靠方法。因此，在本領(lǐng)域中需要在使用死亡受體治療癌癥時(shí)預(yù)防死亡受體的不期望的影響的方法。具體而言，需要保護(hù)肝臟免受這些不期望的影響。通常還需要保護(hù)肝臟免受肝毒性。
[0005]發(fā)現(xiàn)TLR在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞上表達(dá)。目前，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)鑒定了 13種TLR。受體刺激后，幾種常見(jiàn)信號(hào)通路被活化，例如NF-kB、AP-U PI3K/AKT和有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)，導(dǎo)致存活率升高，刺激細(xì)胞增殖和分泌許多具有趨化性和促炎功能的細(xì)胞因子。癌細(xì)胞中TLR的誘導(dǎo)可用于治療癌癥，然而，不同TLR的分布在各種器官和細(xì)胞類型中顯著不同。這影響細(xì)胞因子譜和細(xì)胞炎癥反應(yīng)的程度。因此，在本領(lǐng)域中需要不依賴于TLR5表達(dá)存在的癌癥免疫療法。
[0006]發(fā)明概述[0007]本文提供了一種治療哺乳動(dòng)物的癌癥的方法，所述方法可包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑。還提供了一種減少哺乳動(dòng)物的癌癥復(fù)發(fā)的方法，所述方法可包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用TLR激動(dòng)劑。所述癌癥可能存在于表達(dá)TLR的組織中。所述癌癥可為轉(zhuǎn)移或腫瘤再生。
[0008]TLR激動(dòng)劑可為鞭毛蛋白。所述癌癥可能不表達(dá)TLR，TLR可為T(mén)LR5。所述組織可為肝臟、肺、膀胱或腸道。所述癌癥可是轉(zhuǎn)移性的。所述癌癥可為黑素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌或惡性血液腫瘤，所述惡性血液腫瘤為淋巴瘤。所述癌癥可為腫瘤。
[0009]所述激動(dòng)劑可作為單一療法施用。所述哺乳動(dòng)物未接受聯(lián)合治療。所述哺乳動(dòng)物也未接受化學(xué)治療或放射治療，但是可手術(shù)治療。所述哺乳動(dòng)物可具有足夠的先天免疫力，所述先天免疫力可在相當(dāng)于適合第一輪或后續(xù)化學(xué)治療所需水平的水平上。所述哺乳動(dòng)物的白細(xì)胞計(jì)數(shù)可在正常范圍內(nèi)，或白細(xì)胞計(jì)數(shù)可表明輕微免疫抑制?？稍谇谐[瘤之前、之后或同時(shí)向哺乳動(dòng)物施用所述TLR激動(dòng)劑。可在腫瘤切除期間施用所述TLR激動(dòng)劑。
[0010]本文進(jìn)一步提供了治療哺乳動(dòng)物的癌癥的方法，所述方法可包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用FAS激動(dòng)劑和TLR激動(dòng)劑，所述TLR激動(dòng)劑為鞭毛蛋白。所述FAS激動(dòng)劑為FAS激動(dòng)劑抗體。所述癌癥是轉(zhuǎn)移性的，并且可為腫瘤。所述癌癥可能不表達(dá)TLR。所述癌癥可能已經(jīng)轉(zhuǎn)移到表達(dá)TLR的被侵入組織。所述被侵入組織可為肝臟、膀胱、肺或腸道。
[0011]本文還提供了保護(hù)哺乳動(dòng)物的肝臟組織免受肝毒性影響的方法，所述方法可包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用TLR激動(dòng)劑。毒性可為FAS配體、FAS激動(dòng)性抗體、TNFa、醋氨酚、醇、肝臟的病毒感染或化療劑。毒性也可為沙門(mén)氏菌(Salmonella)感染，沙門(mén)氏菌感染可能來(lái)自鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)。TLR激動(dòng)劑可為鞭毛蛋白。
[0012]附圖簡(jiǎn)述
[0013]圖1示出了細(xì)菌鞭 毛蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。Ca骨架跟蹤、疏水核心分布和F41結(jié)構(gòu)信息。限定結(jié)構(gòu)域Dl、D2a、D2b和D3的4個(gè)不同疏水核心。與Ca骨架一起展示了所有疏水側(cè)鏈原子。側(cè)鏈原子有色碼:Ala，黃色；Leu、lie或Val，橙色；Phe和Tyr，紫色(碳原子)和紅色(氧原子)。C，鞭毛蛋白氨基酸序列中不同結(jié)構(gòu)特征的位置和區(qū)域。從上到下，示出了:藍(lán)色的F41片段；3個(gè)褐色的b-葉狀折疊；具有黃色a-螺旋、綠色b-結(jié)構(gòu)和紫色b_旋轉(zhuǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布；每50個(gè)殘基處藍(lán)色的tic標(biāo)記；結(jié)構(gòu)域D0、D1、D2和D3 ;原型元件中青色的軸向亞基接觸區(qū)域；紅色的非常保守的氨基酸序列和紫羅蘭色的可變區(qū)；F41中生成不同超螺旋元件的點(diǎn)突變。底部的字母指突變?cè)男螒B(tài):L(D107E、R124A、R124S、G426A)，L 型直鏈;R(A449V)，R 型直鏈;C (D313Y、A414V、A427V、N433D)，卷曲 33。
[0014]圖2示出了沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)域、其片段及其與TLR5的相互作用的示意圖。黑色條形表示鞭毛蛋白基因用于構(gòu)造包含A、B、C、A’和B’的片段的區(qū)域。
[0015]圖3描繪了鞭毛蛋白衍生物。所選編碼蛋白衍生物(列于右側(cè))的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和近似邊界(氨基酸坐標(biāo))。在505個(gè)氨基酸(aa)內(nèi)編碼都柏林沙門(mén)氏菌(Salmonelladub I in)的FliC鞭毛蛋白。
[0016]圖4示出了下列鞭毛蛋白變體的核苷酸和氨基酸序列:AA’ (SEQ ID NO:7-8),AB，(SEQ ID NO:9-10), Mf (SEQ ID NO: 11-12)、BB，(SEQ ID NO: 13-14)、CA’ (SEQ IDNO: 15-16)、CB’ (SEQ ID NO: 17-18)、A (SEQ ID NO: 19-20)、B (SEQ ID NO: 21-22)、C (SEQID NO: 23-24)、GST-A’ (SEQ ID NO: 25-26)、GST-B’ (SEQ ID NO: 27-28)、AA’nl-170 (SEQID N0:29-30)、AA，nl-163(SEQ ID NO:33-34)、AA’ n54_170(SEQ ID N0:3卜32)、AA’n54-163(SEQ ID NO:335-36)、AB’nl-170(SEQ ID NO:37-38)、AB’nl-163(SEQ IDNO: 39-40)、M’nl-129 (SEQ ID NO: 41-42)、AA’n54_129 (SEQ ID NO: 43-44)、AB’nl_129 (SEQID NO:45-46)、AB’ n54-129(SEQ ID NO:47-48)、AA’ nl-100(SEQ ID N0:49_50)、AB，nl-100(SEQ ID NO: 51-52)、AA’ nl_70 (SEQ ID NO:53-54)和 AB’nl_70 (SEQ IDNO:55-56).用斜體字示出了 pRSETb前導(dǎo)序列(前導(dǎo)序列包括Met，后者也是FliC的氨基酸I)。N端恒定結(jié)構(gòu)域加有下劃線。將氨基酸連接序列加粗。C端恒定結(jié)構(gòu)域加有下劃線。若存在GST，將其突出顯示。
[0017]圖5示出了對(duì)來(lái)自21種細(xì)菌的保守氨基(圖5A)和羧基(圖5B)末端的氨基酸序列的比較。用陰影示出了 13個(gè)對(duì)于TLR5活性而言重要的保守氨基酸。用其登記號(hào)從TrEMBL(首字母=Q)或Swiss-Prot (首字母=P)中鑒定氨基酸序列。
[0018]圖6示出了人TLR5的序列。
[0019]圖7示出了響應(yīng)于CBLB502和LPS注射體內(nèi)NF_kB活化。A.在用CBLB502 (0.2mg/kg)處理2h后，通過(guò)無(wú)損成像檢測(cè)BALB/c_Tg(I κ B a -luc)Xen報(bào)告小鼠體內(nèi)的背景和NF-kB依賴性螢光素酶表達(dá)。B.皮下注射100 μ I PBS、CBLB502 (0.2mg/kg)或LPS(lmg/kg) 2h后，評(píng)估報(bào)告小鼠肝臟、小腸(回腸部分)、結(jié)腸、脾臟、腎臟、肺和心臟中的NF-kB依賴性螢光素酶表達(dá)。檢測(cè)了每一組3只小鼠體內(nèi)每yg蛋白質(zhì)提取物的標(biāo)準(zhǔn)化螢光素酶活性。條形表示平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。C.表示來(lái)自皮下注射了 CBLB502或LPS的NIH-Swiss小鼠的肝臟中激動(dòng)劑LPS和CBLB502生物活性的NF-kB核易位(p65)的動(dòng)態(tài)。向?qū)φ招∈笞⑸銹BS。在處理20、40和60min后獲得組織樣品，將其處理成石蠟塊。在用CBLB502 (IOOng/ml)或LPS(lyg/ml)體外處理指定時(shí)間后檢測(cè)從NIH-Swiss小鼠(D)分離的原代小鼠肝細(xì)胞和從(BD Biosciences)購(gòu)買(mǎi)的人肝細(xì)胞(E)中p65的核易位。對(duì)照肝細(xì)胞保持完整。P65染綠色熒光，細(xì)胞角蛋白-8染紅色熒光而細(xì)胞核染非特異性Dapi藍(lán)染色。在放大X 20倍下照相。箭頭指基于形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)確定的KupfTer和內(nèi)皮細(xì)胞。
[0020]圖8示出了 CBLB502對(duì)Fas介導(dǎo)的肝毒性的防護(hù)。A.單獨(dú)腹腔注射4 μ g抗Fas抗體或在抗體前30min、2h和6h組合注射CBLB502 (I μ g/只小鼠)后NIH-Swiss小鼠的的存活率。括號(hào)內(nèi)是每次處理小鼠的數(shù)量。B.保護(hù)肝臟免受抗Fas抗體毒性。使用TUNEL技術(shù)檢測(cè)注射抗Fas抗體5h后肝臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡。C.經(jīng)蘇木精伊紅(H&E)染色的組織形態(tài)顯示了注射抗Fas抗體對(duì)肝臟的壞死損害和CBLB502的保護(hù)。D.使用紅細(xì)胞自身熒光(若丹明通道，紅色)、小鼠IgG對(duì)照(Cy5偶聯(lián)的抗小鼠IgG抗體，偽紫色)和DAPI細(xì)胞核(藍(lán)色)檢測(cè)肝臟出血。E.用或不用CBLB502預(yù)處理30min，注射3yg抗Fas抗體5h后在組織蛋白溶解產(chǎn)物中測(cè)定NIH-Swiss小鼠肝臟樣品中的半胱天冬酶-3/7活性。N=3。條形表示平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。F.用或不用CBLB502，抗Fas抗體注射5h后檢測(cè)NIH-Swiss小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)積聚。N=3。條形表示平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。G.用或不用CBLB502預(yù)處理30min，注射3 μ g抗Fas抗體5h后在組織蛋白溶解產(chǎn)物中測(cè)定NIH-Swiss小鼠肝臟樣品中的半胱天冬酶-8活性。N=3。條形表示平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0021]圖9示出了 CBLB502對(duì)肝臟中細(xì)胞凋亡相關(guān)因素的調(diào)節(jié)及其在CT-26腫瘤模型中對(duì)Fas介導(dǎo)的抗腫瘤活性的影響。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)單獨(dú)或與CBLB502組合注射抗Fas抗體(5 μ g) 2h后從C57BL/6小鼠分離的肝臟中CBLB502對(duì)半胱天冬酶_8 (A)和Bid (B)裂解的抑制。C.通過(guò)RT-PCR檢測(cè)用CBLB502處理30min和2h的完整小鼠的肝臟中Bcl2AlB、Bcl2AlD、IER-3、Fos、Jun和JunB基因的RNA表達(dá)。使用GAPDH作為對(duì)照以監(jiān)測(cè)對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。D.為具有皮下生長(zhǎng)的CT-26腫瘤的小鼠注射單一抗Fas抗體(4yg/只小鼠)和CLB502或其組合。對(duì)照小鼠(“完整”)接受代替CBLB502的PBS和抗體。括號(hào)內(nèi)是每一組中腫瘤的數(shù)量。結(jié)果表示平均腫瘤體積(m+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差)。(*)_完整和組合處理組之間的差異顯著(p〈0.05)。E.脾內(nèi)注射表達(dá)螢光素酶的CT-26腫瘤細(xì)胞后第5天，用單獨(dú)或與CBLB502組合的抗Fas抗體處理小鼠。在腫瘤細(xì)胞接種后第10、15、17、22、28和40天，使用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)測(cè)定肝臟內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。呈現(xiàn)了在第15天為來(lái)自每一組的3只小鼠獲取的圖像。在星號(hào)所示天數(shù)，CBLB502處理組和對(duì)照組中肝臟無(wú)腫瘤的小鼠比例之間的差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(P〈0.05)。F.用CBLB502處理5h后免疫細(xì)胞移動(dòng)并浸潤(rùn)(箭頭)至小鼠肝臟中生長(zhǎng)的腫瘤節(jié)結(jié)中。
[0022]圖10.注射CBLB502 (5 μ g，皮下)或LPS (20 μ g，皮下)后，不同器官中NF-kB活化的動(dòng)態(tài)。C02吸入2、6、24和48h后使小鼠安樂(lè)死。將來(lái)自肝臟、大腸、腎臟和肺的蛋白質(zhì)提取物中的螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為每μg蛋白質(zhì)提取物并且計(jì)算每個(gè)器官的平均值。按來(lái)自TLR激動(dòng)劑處理小鼠的器官的蛋白質(zhì)提取物中的平均螢光素酶活性和來(lái)自注射了 PBS的對(duì)照小鼠的相應(yīng)器官的提取物中獲得的平均螢光素酶活性之間的比例計(jì)算螢光素酶誘導(dǎo)倍數(shù)(3只小鼠/組)。條形表示作為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差的誘導(dǎo)倍數(shù)。
[0023]圖11.從螢光素酶報(bào)告小鼠分離并用CBLB502 (100ng/ml)、LPS(5yg/ml)或PBS對(duì)照體外處理3h的小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)物中的NF-kB依賴性螢光素酶表達(dá)。然后用PBS沖洗肝細(xì)胞并收集于細(xì)胞溶解緩沖液(Promega)中。用Promega報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定蛋白質(zhì)上清液中的螢光素酶活性并標(biāo)準(zhǔn)化為每μ g蛋白質(zhì)提取物。條形表示螢光素酶單位(平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
[0024]圖12.在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)獲得的來(lái)自用CBLB502、抗Fas抗體(3 μ g)或其組合處理的NIH-Swiss小鼠的 肝臟樣品的蘇木精伊紅染色。在注射抗Fas抗體5、12和26h后獲得肝臟樣品，于10%福爾馬林中固定，包埋于石蠟中并用蘇木精和伊紅染色用于組織形態(tài)。
[0025]圖13.B16和CT-26細(xì)胞上的TLR5表達(dá)。A.通過(guò)RT-PCR測(cè)定B16和CT-26細(xì)胞中編碼TLR5和GAPDH(作為對(duì)照)基因的mRNA的表達(dá)。使用對(duì)小鼠TLR5基因有特異性的引物來(lái)擴(kuò)增小鼠TLR5mRNA的一個(gè)區(qū)域:正向(5’ -AGTCCCCCAGCTCCAGTTTC-3’ )和反向(5’-GGAGCCCCCTAGCAGTG AGT-3’)。B.使用螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定測(cè)試B16和CT-26腫瘤細(xì)胞中響應(yīng)于CBLB502、小鼠TNFa和LPS的NF_kB活化。數(shù)據(jù)表示螢光素酶單位(平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
[0026]圖14.示出了 CT-26腫瘤細(xì)胞和A20淋巴瘤細(xì)胞中的TLR5表達(dá)。圖14A和C，使用原稿正文中描述的TRIzoI試劑從CT-26和B16腫瘤細(xì)胞(圖14A)和CT-26和A20 細(xì)胞(圖 14C)提取總 RNA。使用 LaserGene 軟件(DNASTAR, Inc.，Madison, WI)設(shè)計(jì)TLR5的引物。使用對(duì)小鼠TLR5基因有特異性的引物擴(kuò)增小鼠TLR5mRNA的一個(gè)區(qū)域(GenBank 登記號(hào) ΝΜ_016928.2):正向(5，-AGTCCCCCAGCTCCAGTTTC-3 ’)和反向(5’ -GGAGCCCCCTAGCAGTGAGT-3’)。使用GAPDH作為對(duì)照以監(jiān)測(cè)對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。使用SuperscriptTM II 逆轉(zhuǎn)錄酶和寡聚(dT) 12-18 引物(Invitrogen, Carlsbad, CA)合成cDNA。B.對(duì)B16(TLR5陽(yáng)性)和CT-26TLR5陰性)腫瘤細(xì)胞中的NF_kB活化進(jìn)行體外螢光素酶測(cè)定。
[0027]圖15示出了 CBLB502或PBS (未處理)處理(0.2mg/kg，皮下，1、2、3天)后，無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)TLR5陽(yáng)性HCT116腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)，n=6_10。
[0028]圖16示出了 CBLB502或PBS (未處理)處理(0.2mg/kg，皮下，1、2、3天)后，無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)的293-TLR5腫瘤生長(zhǎng)，n=6-10。
[0029]圖17示出了 2個(gè)過(guò)程的CBLB502對(duì)比PBS(對(duì)照)處理(1、2、3、14、15和16天)期間，無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)異種A549腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)，n=6-10。無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)作為異種移植物在皮下生長(zhǎng)的結(jié)腸HCT116腺癌的抗腫瘤活性。向8只無(wú)胸腺裸鼠的2個(gè)腹側(cè)皮下注射HCT116(0.5X106個(gè)/100ml PBS)以誘導(dǎo)腫瘤。當(dāng)腫瘤直徑變成約3_5mm時(shí)(到注射后第6天)，將小鼠隨機(jī)分成2組，5只小鼠為CBLB502處理組而3只小鼠為PBS對(duì)照組。
[0030]圖18示出了 CBLB502或PBS (未處理)處理(0.lmg/kg，皮下，1、2、3天)后同源C3H小鼠體內(nèi)SCCVII原位腫瘤生長(zhǎng)的速率達(dá)到400mm3腫瘤尺寸，n=6-10。右圖表示用和不用CBLB502處理，腫瘤達(dá)到400mm3體積所需的天數(shù)。
[0031]圖19.經(jīng)腹腔施用CBLB502(0.2mg/kg) 3天，每天一次，處理具有皮下生長(zhǎng)的同源Ward結(jié)腸腫瘤的Fischer大鼠。
[0032]圖20示出了 CBLB502與PBS(對(duì)照)處理(1、2、3天)后，無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)異種A549-shV和A549-shTLR5腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)。在第2、4、6和8天，在A549_shV腫瘤中觀察到的腫瘤體積之間的統(tǒng)計(jì)差異(P〈0.05)，n=9-14。右圖證明A549_shV和A549_shTLR5中響應(yīng)于CBLB502處理NF-kB依賴性誘導(dǎo)螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)。
[0033]圖21示出了 CBLB502與PBS (對(duì)照)處理(1、2、3天)后，無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)Hl299 (對(duì)照)和H1299-TLR5腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)，n=6。右圖證明如H1299-TLR5細(xì)胞中的TLR5功能所表明，響應(yīng)于CBLB502處理IL-8生成。
[0034]圖22顯示膀胱強(qiáng)烈響應(yīng)于CBLB502。
[0035]圖23顯示CBLB502處理延遲了肝臟，甚至不表達(dá)TLR5的腫瘤中的腫瘤出現(xiàn)和生長(zhǎng)。
[0036]圖24示出了 CBLB502對(duì)Fas介導(dǎo)的肝毒性的防護(hù)。
[0037]圖25顯示CBLB502保護(hù)肝臟免受TNF α和LPS毒性。
[0038]圖26顯示CBLB502保護(hù)肺免受TNF和LPS毒性。
[0039]圖27顯示CBLB502保護(hù)小鼠免于口服施用致死沙門(mén)氏菌。
[0040]圖28顯示伊立替康消除了鞭毛蛋白(CBLB502)的抗腫瘤作用。
[0041]發(fā)明詳述
[0042]發(fā)明人已經(jīng)得出了一個(gè)驚人的發(fā)現(xiàn)，甚至當(dāng)細(xì)胞不表達(dá)TLR5時(shí)，提供Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑，例如TLR5的激動(dòng)劑(如鞭毛蛋白)，可有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并減少癌細(xì)胞。TLR激動(dòng)劑可能在治療原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌、膀胱癌、肺癌和腸道癌，以及影響其它TLR5陽(yáng)性組織的癌癥中特別有用。TLR激動(dòng)劑也可用于治療在除肝臟、膀胱、肺、腸道和其它TLR5陽(yáng)性組織以外的組織中產(chǎn)生，但是轉(zhuǎn)移到這些組織的癌癥。即使轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞不表達(dá)TLR5，但是當(dāng)癌癥已經(jīng)轉(zhuǎn)移到表達(dá)TLR5的組織，例如肝臟時(shí)，也可用TLR激動(dòng)劑治療癌癥。雖然不受理論約束，但是本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的想法是，TLR激動(dòng)劑有效減少或殺傷影響具有強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)的組織的癌細(xì)胞，從而消除了對(duì)在癌細(xì)胞中任何預(yù)先存在的TLR5表達(dá)的需要。出乎意料地，通過(guò)提供TLR激動(dòng)劑，充分觸發(fā)先天免疫系統(tǒng)以便治療缺乏TLR5表達(dá)的癌癥。因此，為了 TLR激動(dòng)劑有效減少或殺傷癌細(xì)胞，不需要向癌細(xì)胞提供TLR5。
[0043]發(fā)明人還得出了驚人的發(fā)現(xiàn)，TLR激動(dòng)劑可保護(hù)肝臟免受肝毒性。例如，F(xiàn)AS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的死亡配體和活化劑(例如FAS配體和抗FAS激動(dòng)性抗體)可誘導(dǎo)劑量依賴性肝毒性。施用TLR激動(dòng)劑可保護(hù)肝臟免于此類毒性。TLR激動(dòng)劑這種未預(yù)料到的性質(zhì)允許其與FAS激動(dòng)劑或TNF組合用于癌癥治療，以致減少或預(yù)防了 FAS激動(dòng)劑或TNF的副作用。
[0044]1.定義
[0045]本文使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述特殊實(shí)施方案并非旨在限制。如說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中所使用，除非上下文另有明確指示，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)指示物。
[0046]為了敘述本文的數(shù)值范圍，明確涵蓋了介于其間具有相同精確程度的介入數(shù)字。例如，對(duì)于6-9的范圍而言，除6和9外還涵蓋數(shù)值7和8，并且對(duì)于范圍6.0-7.0而言，明確涵蓋了數(shù)值 6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 和 7.0。
[0047]“施用”可指單劑量或多劑量的試劑。
[0048]在肽或多肽的情況下，“類似物”可指包含一個(gè)或多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸或來(lái)自常規(guī)氨基酸集合的其它結(jié)構(gòu)變型的肽或多肽。
[0049]“抗體”可指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE類抗體或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab’)2、Fd和單鏈抗體、雙 鏈抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物。所述抗體可能是對(duì)所需表位或源自其中的序列表現(xiàn)出足夠結(jié)合特異性的單克隆抗體、多克隆抗體、親和純化抗體或其混合物。所述抗體也可能是嵌合抗體。可通過(guò)連接本領(lǐng)域已知的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)、肽或多肽部分衍生所述抗體?？墒顾隹贵w與化學(xué)部分偶聯(lián)。
[0050]“衍生物”可指一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸和氨基酸類似物)不同的肽或多肽。衍生物的不同之處可能在于糖基化，一種翻譯后修飾形式。例如，由于在異源系統(tǒng)中表達(dá)，肽或多肽可能表現(xiàn)出糖基化模式。如果保持至少一種生物學(xué)活性，則這些肽或多肽是根據(jù)本發(fā)明的衍生物。其它衍生物可包括具有共價(jià)修飾N-或C-末端的融合肽或融合多肽、PEG化肽或多肽、與脂質(zhì)部分締合的肽或多肽、烷基化肽或多肽、經(jīng)氨基酸側(cè)鏈官能團(tuán)與其它肽、多肽或化學(xué)試劑連接的肽或多肽，并且另外的修飾如本領(lǐng)域所理解。
[0051]“片段”可指參考肽或多肽的一部分。
[0052]“同系物”可指共享一個(gè)共同的進(jìn)化原種的肽或多肽。
[0053]“前導(dǎo)序列”可為編碼與目標(biāo)肽或多肽連接并與之一起翻譯以使目標(biāo)肽或多肽正確通過(guò)真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體以便從細(xì)胞膜進(jìn)行胞外分泌的任何肽序列的核酸。前導(dǎo)肽序列可源自堿性磷酸酶。前導(dǎo)序列可具有包含atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctct ccctgggc 的 DNA 序列。
[0054]“脂質(zhì)體”可指由與細(xì)胞膜相同的材料制成的微小氣泡(囊泡)。脂質(zhì)體填充有藥物并用于為癌癥和其它疾病遞送藥物。脂質(zhì)體可填充有載體。脂質(zhì)體膜可由磷脂制成，磷脂是具有頭基和尾基的分子。脂質(zhì)體的頭部可為水所吸引，而由長(zhǎng)烴鏈構(gòu)成的尾部為水所排斥。尾部可為水所排斥，并且排列起來(lái)遠(yuǎn)離水形成表面。質(zhì)膜中的脂質(zhì)可能主要是磷脂，如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體可由具有混合脂質(zhì)鏈的自然衍生磷脂(如卵磷脂酰乙醇胺)或純表面活性劑組分(如二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE)構(gòu)成。
[0055]“肽”或“多肽”可指連接的氨基酸序列并且可為天然、合成的或修飾或天然和合成的組合。
[0056]“大體上相同”可指第一和第二氨基酸序列在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 個(gè)氨基酸的區(qū)域上至少有 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0057]“治療(treating) ”、“治療(treatment) ” 或“治療(to treat) ” 各自可指在臨時(shí)或永久基礎(chǔ)上減輕、抑制、阻遏、消除、預(yù)防或減緩病狀或病癥的癥狀、臨床體征或潛在病理的表現(xiàn)。預(yù)防病狀或病癥包括在疾病發(fā)作之前向受試者施用本發(fā)明的試劑。抑制病狀或病癥包括在誘導(dǎo)病狀或病癥之后，但是在其臨床表現(xiàn)之前向受試者施用本發(fā)明的試劑。阻遏病狀或病癥包括在疾病的臨床表現(xiàn)之后向受試者施用本發(fā)明的試劑。
[0058]“變體”可指因氨基酸的插入、缺失或保守性取代在氨基酸序列上不同，但是保持了至少一種生物學(xué)活性的肽或多肽?！吧飳W(xué)活性”的代表性實(shí)例包括與toll樣受體結(jié)合和被特異性抗體結(jié)合的能力。變體也可指氨基酸序列與具有保持了至少一種生物學(xué)活性的氨基酸序列的參考蛋白大體相同的蛋白質(zhì)。在本領(lǐng)域中認(rèn)為氨基酸的保守性取代，即用具有相似性質(zhì)(例如，親水性、帶電區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸置換氨基酸，通常涉及微小變化。如本領(lǐng)域中所理解，可通過(guò)考慮氨基酸的親水指數(shù)部分來(lái)鑒定這些微小變化。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132 (1982)。氨基酸的親水指數(shù)基于對(duì)其疏水性和電荷的考慮。本領(lǐng)域已知可取代具有相似親水指數(shù)的氨基酸并且仍保持蛋白質(zhì)功能。一方面，取代親水指數(shù)為±2的氨基。氨基酸的親水性也可用于揭示將產(chǎn)生保持生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)的取代。在肽的情況下，對(duì)氨基酸親水性的考慮允許計(jì)算所述肽的最強(qiáng)局部平均親水性，這是已經(jīng)報(bào)道與抗原性和免疫原性非常相關(guān)的有用方法。美國(guó)專利N0.4，554，101，通過(guò)引用全部并入本文。如本領(lǐng)域中所理解，取代具有相似親水性值的氨基酸可產(chǎn)生保持生物學(xué)活性，例如免疫原性的肽。可用親水性值在相互的±2以內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值受該氨基酸的特殊側(cè)鏈影響。與該觀察情況一致，認(rèn)為與生物學(xué)功能相容的氨基酸取代依賴于氨基酸，并且尤其是那些氨基酸的側(cè)鏈的相對(duì)相似性，正如疏水性、親水性、電荷、尺寸和其它性質(zhì)所揭示的那樣。
[0059]“載體”可指含有復(fù)制起點(diǎn)的核酸序列。載體可為質(zhì)粒、酵母或哺乳動(dòng)物人工染色體。載體可為RNA或DNA載體。載體可為自我復(fù)制的染色體外載體或整合至宿主基因組中的載體。
[0060] 2.Toll樣受體激動(dòng)劑
[0061 ] 本文提供了 TLR激動(dòng)劑。TLR激動(dòng)劑可為PAMP，PAMP可能是源自病原體的保守分子產(chǎn)物。病原體可能是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌或病毒。TLR激動(dòng)劑可能是損傷相關(guān)分子模式(DAMP)配體，所述配體可能是從受損或垂死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性分子。DAMP或PAMP可通過(guò)TLR信號(hào)發(fā)起免疫應(yīng)答并且補(bǔ)充細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銜接分子以便傳送信號(hào)。TLR激動(dòng)劑可為可能是來(lái)自以下表1中的配體的TLR的激動(dòng)劑:
[0062]表1TLR和配體。記號(hào)M84972編碼)。鞭毛蛋白相關(guān)多肽可為結(jié)合TLR5并誘導(dǎo)TLR5介導(dǎo)的活性，例如活化NF-kB活性的M84972片段、變體、類似物、同系物或衍生物或其組合?？筛鶕?jù)鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和TLR5識(shí)別的保守結(jié)構(gòu)，通過(guò)基于合理的設(shè)計(jì)獲得鞭毛蛋白的片段、變體、類似物、同系物或衍生物。
[0069]鞭毛蛋白可包含圖2所示13個(gè)保守氨基酸中的至少10、11、12或13個(gè)(位置89、90、91、95、98、101、115、422、423、426、431、436和452)。鞭毛蛋白可與]?84972的氨基酸1174和418505至少30-99%相同。其內(nèi)容全部并入本文的美國(guó)專利申請(qǐng)公布N0.2009/0011982的圖26列出了具有已知TLR-5刺激活性的鞭毛蛋白的氨基和羧基末端與M84972相比的同一性百分比。
[0070]鞭毛蛋白可為細(xì)菌鞭毛的主要組分。鞭毛蛋白可由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(圖1)。結(jié)構(gòu)域I (Dl)和結(jié)構(gòu)域2(D2)可能不連續(xù)并且可在通過(guò)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使氨基末端和羧基末端的殘基并列時(shí)形成。包含Dl和D2結(jié)構(gòu)域的氣基和竣基末端可能最保守，而中間聞變結(jié)構(gòu)域(D3)可能高度可變。對(duì)含有被大腸桿菌(Escherichia coli)鉸鏈(ND1-2/ECH/CD2)分隔開(kāi)的氨基Dl和D2與羧基Dl和D2的重組蛋白的研究表明，當(dāng)與ECH元件偶聯(lián)時(shí)，Dl和D2可具生物活性。這種嵌合體(而不是單獨(dú)的鉸鏈)可誘導(dǎo)兩個(gè)腸上皮細(xì)胞系中的IkBa降解、NF-kB活化及NO和IL-8生成。非保守D3結(jié)構(gòu)域可能在鞭毛絲的表面并且可含有主要的抗原表位。鞭毛蛋白的強(qiáng)促炎活性可能存在于高度保守的N和CDl和D2區(qū)(見(jiàn)圖1)。
[0071]鞭毛蛋白可通過(guò)與Toll樣受體5 (TLR5)結(jié)合誘導(dǎo)NF_kB活性。TLR可識(shí)別對(duì)于鞭毛蛋白而言特殊的保守結(jié)構(gòu)。保守結(jié)構(gòu)可由稍微允許氨基酸含量變化的一大群殘基構(gòu)成。Smith等，Nat Immunol.4:1247-53 (2003)(其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)已經(jīng)鑒定了鞭毛蛋白中為T(mén)LR5識(shí)別的保守結(jié)構(gòu)的一部分的13個(gè)保守氨基酸。圖2中示出了鞭毛蛋白的對(duì)于TLR5活性而言可能很重要的13個(gè)保守氨基酸。
[0072]已經(jīng)產(chǎn)生了保持至少一些TLR5刺激活性的鞭毛蛋白的大量缺失突變體。鞭毛蛋白可能是這種缺失突變體，并且可能是本文實(shí)施例中公開(kāi)的缺失突變體。鞭毛蛋白可包含從缺少氨基酸185-306或444-492的GenBank登記號(hào)D13689或從缺少氨基酸179-415的GenBank登記號(hào)M84973翻譯的 序列或其變體。
[0073]鞭毛蛋白可包含轉(zhuǎn)座子插入和對(duì)可變D3結(jié)構(gòu)域的改變?？捎迷试SDl和D2結(jié)構(gòu)域正確折疊的鉸鏈或連接子多肽部分或全部取代D3結(jié)構(gòu)域，以致變體刺激TLR5活性。在大腸桿菌(E.coli)MukB蛋白中可找到變體鉸鏈元件并且可具有2010年10月6日提交，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文的國(guó)際申請(qǐng)N0.PCT/USlO/51646中提出的序列。
[0074]如上所述的鞭毛蛋白可進(jìn)一步包含前導(dǎo)序列。進(jìn)一步包含前導(dǎo)序列的鞭毛蛋白可為 CBLB502S。
[0075]3.試劑
[0076]本發(fā)明還涉及包含治療有效量的TLR激動(dòng)劑的試劑。所述試劑可為多肽。所述試劑也可為載體。所述載體可包含編碼TLR激動(dòng)劑的核酸。所述載體可能能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。可通過(guò)病毒或脂質(zhì)體相關(guān)載體系統(tǒng)將載體遞送至哺乳動(dòng)物體內(nèi)。病毒載體系統(tǒng)可為腺病毒或巨細(xì)胞病毒。
[0077]所述試劑可為攜帶載體的脂質(zhì)體。所述脂質(zhì)體可能能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并遞送載體進(jìn)行表達(dá)。[0078]所述試劑可為活化TLR的藥物制劑，從而模仿大量滲透通過(guò)腸壁的情形使腫瘤或感染細(xì)胞暴露于宿主免疫系統(tǒng)?？捎谌芤褐腥磉f送所述試劑，以便(例如)肌肉內(nèi)施用。所述試劑可為表達(dá)呈納米顆粒形式的TLR激動(dòng)劑的藥物制劑，所述納米顆粒形式可將功能激動(dòng)劑帶到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面。
[0079]所述試劑可為包含上述藥物制劑的藥物試劑，可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法生產(chǎn)所述藥物試劑。所述試劑也可包含助劑。
[0080]所述載體可包含編碼鞭毛蛋白的核酸。所述載體可能能夠使用強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)鞭毛蛋白。表達(dá)載體可進(jìn)一步包含在編碼TLR激動(dòng)劑的基因上游克隆的前導(dǎo)序列。藥物制劑可為表達(dá)以下的腺病毒:
[0081]于溶液中全身遞送，以便(例如)肌肉內(nèi)施用的TLR激動(dòng)劑；或
[0082]表達(dá)呈攜帶功能TLR激動(dòng)劑的納米顆粒形式的TLR激動(dòng)劑，例如可源自CBLB502表面的鞭毛蛋白。納米顆粒可基于噬菌體T7，或全部形成為保持其生物學(xué)活性。納米制劑可提供劑量依賴性、NF- κ B反應(yīng)性報(bào)告基因活化，并且可通過(guò)胞吞作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化以便有效免疫(Mobian AP-A)。
[0083]a.施用
[0084]可使用本文所述方法經(jīng)全身、口服、腸胃外、舌下、經(jīng)皮、直腸、經(jīng)黏膜、局部、經(jīng)吸入、經(jīng)頰或其組合施用所述試劑。腸胃外施用包括但不限于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)。也可皮下、靜脈內(nèi)、經(jīng)氣管內(nèi)或瘤內(nèi)施用。對(duì)于獸用，可根據(jù)正常獸醫(yī)實(shí)踐作為可適當(dāng)接受的制劑施用所述試劑。獸醫(yī)可容易地確定給藥方案和最適于特定動(dòng)物的施用途徑?？上蛉祟惢颊摺⒇?、犬、大型動(dòng)物或禽類施用所述試劑。
[0085]所述試劑可作為 單一療法施用或與可為手術(shù)或切除腫瘤的其它治療一起同時(shí)或有節(jié)奏地(metronomically)施用。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“同時(shí)(simultaneous) ”或“同時(shí)(simultaneously) ”指所述試劑和其它治療可相互在48h,優(yōu)選24h,更優(yōu)選12h,還更優(yōu)選6h和最優(yōu)選3h或更少時(shí)間內(nèi)施用。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“有節(jié)奏地”指在不同于其它治療的時(shí)間并且按相對(duì)于重復(fù)施用的一定頻率施用所述試劑。
[0086]可在另一治療之前的任何點(diǎn)施用所述試劑，包括約120h、118h、116h、114h、112h、110h、108h、106h、104h、102h、100h、98h、96h、94h、92h、90h、88h、86h、84h、82h、80h、78h、76h、74h、72h、70h、68h、66h、64h、62h、60h、58h、56h、54h、52h、50h、48h、46h、44h、42h、40h、38h、36h、34h、32h、30h、28h、26h、24h、22h、20h、18h、16h、14h、12h、10h、8h、6h、4h、3h、2h、lh、55min、50min、45min、40min、35min、30min、25min、20min、15min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min和lmin?？稍诘诙卧噭┲委熤暗娜魏吸c(diǎn)施用所述試劑，包括約 120h、118h、116h、114h、112h、110h、108h、106h、104h、102h、100h、98h、96h、94h、92h、90h、88h、86h、84h、82h、80h、78h、76h、74h、72h、70h、68h、66h、64h、62h、60h、58h、56h、54h、52h、50h、48h、46h、44h、42h、40h、38h、36h、34h、32h、30h、28h、26h、24h、22h、20h、18h、16h、14h、12h、10h、8h、6h、4h、3h、2h、lh、55min、50min、45min、40min、35min、30min、25min、20min、15min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min 和 lmin。
[0087]可在另一治療之后的任何點(diǎn)施用所述試劑，包括約lmin、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、IOmin、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、lh、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h、50h、52h、54h、56h、58h、60h、62h、64h、66h、68h、70h、72h、74h、76h、78h、80h、82h、84h、86h、88h、90h、92h、94h、96h、98h、100h、102h、104h、106h、108h、110h、112h、114h、116h、118h和120h?？稍诘诙卧噭┲委熤蟮娜魏吸c(diǎn)施用所述試劑，包括約 120h、118h、116h、114h、112h、110h、108h、106h、104h、102h、100h、98h、96h、94h、92h、90h、88h、86h、84h、82h、80h、78h、76h、74h、72h、70h、68h、66h、64h、62h、60h、58h、56h、54h、52h、50h、48h、46h、44h、42h、40h、38h、36h、34h、32h、30h、28h、26h、24h、22h、20h、18h、16h、14h、12h、10h、8h、6h、4h、3h、2h、lh、55min、50min、45min、40min、35min、30min、25min、20min、15min、10min、9min、8min、7min、6min、5min、4min、3min、2min 和 lmin。
[0088]b.制劑
[0089]所述方法可包括施用所述試劑。本文提供的試劑可呈以常規(guī)方式配制的片劑或錠齊?形式。例如，供口服的片劑和膠囊可含有可能為粘合劑、填料、潤(rùn)滑劑、崩解劑和濕潤(rùn)劑的常規(guī)賦形劑。粘合劑包括但不限于糖漿、阿拉伯樹(shù)膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠、淀粉膠漿和聚乙烯吡咯烷酮。填料可為乳糖、食用糖(sugar)、微晶纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣和山梨糖醇。潤(rùn)滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙二醇和二氧化硅。崩解劑可為馬鈴薯淀粉和羥基乙酸淀粉鈉。濕潤(rùn)劑可為硫酸月桂酯鈉。可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法對(duì)片劑進(jìn)行包衣。
[0090]本文提供的試劑也可為液體制劑，例如水或油混懸液、溶液、乳液、糖漿和酏劑。也可將所述試劑配制成干品，以在使用之前用水或其它適合媒介物溶解。此類液體制劑可含有添加劑，例如助懸劑、乳化劑、非水媒介物和防腐劑。助懸劑可為山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/食用糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂肪。乳化劑可為卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯和阿拉伯樹(shù)膠。非水媒介物可為食用油、扁桃仁油、分餾椰子油、油酯、丙二醇和乙醇。防腐劑可為對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸。
[0091]也可將本文提供的試劑配制成栓劑，其可含有栓劑基體，例如可可油或甘油酯。也可配制本文提供的試劑用于吸入，可呈例如可作為干粉施用的溶液、混懸液或乳液形式或呈使用推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷施用的氣霧劑形式。也可將本文提供的試劑配制成包含含水或非水媒介物的透皮制劑，例如乳膏、軟膏、洗劑、糊劑、膏藥、貼片或膜。
[0092]也可配制本文提供的試劑用于腸胃外施用，例如通過(guò)注射、瘤內(nèi)注射或持續(xù)輸注。供注射的制劑可于含水媒介物中呈混懸液、溶液或乳液形式，并且可含有配制試劑，包括但不限于助懸劑、穩(wěn)定劑和分散劑。也可提供呈粉末形式的試劑，以用適合媒介物溶解，包括但不限于無(wú)菌、無(wú)熱原水。
[0093]也可將本文提供的試劑配制成可通過(guò)植入或肌肉注射施用的貯庫(kù)制劑?？捎眠m合的聚合或疏水性材料(例如，于可接受的油中呈乳液)、離子交換樹(shù)脂或微溶衍生物(例如，呈微溶鹽)配制試劑。
[0094]c.劑量
[0095]所述方法可包括向有需要的患者施用治療有效量的試劑。治療使用所需的治療有效量隨治療病狀的性質(zhì)、活化TLR活性所需的時(shí)間長(zhǎng)度和患者的年齡/狀況而變化。然而，一般而言，用于成人治療的劑量通常在每天0.00lmg/kg至約200mg/kg的范圍內(nèi)。劑量可為每天約lmg/kg至約100mg/kg。所需劑量可方便地呈單劑量施用，或以適當(dāng)間隔作為多劑量施用，例如每天2、3、4個(gè)或更多個(gè)子劑量?？赡芟Ｍ蛐枰鄤┝?。[0096]所述劑量可為任何劑量,例如約0.lmg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、lmg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、IOOmg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg、275mg/kg、300mg/kg、325mg/kg、350mg/kg、375mg/kg、400mg/kg、425mg/kg、450mg/kg、475mg/kg、500mg/kg、525mg/kg、550mg/kg、575mg/kg、600mg/kg、625mg/kg、650mg/kg、675mg/kg、700mg/kg、725mg/kg、750mg/kg、775mg/kg、800mg/kg、825mg/kg、850mg/kg、875mg/kg、900mg/kg、925mg/kg、950mg/kg、975mg/kg 或 lmg/kg。
[0097d.單一療法
[0098]所述試劑可作為單一療法施用，在單一療法下，不與任何其它類型的癌癥治療，例如化學(xué)治療、放射治療、另一種生物治療或其它聯(lián)合治療一起施用所述試劑；條件是“單一療法”可包括與手術(shù)治療一起施用所述試劑?？膳c手術(shù)組合施用所述試劑，手術(shù)可為腫瘤切除?？稍谑中g(shù)之前、同時(shí)或之后施用所述試劑?？稍谑中g(shù)期間施用所述試劑。
[0099]4.治療癌癥的方法
[0100]本文提供了通過(guò)向有需要的哺乳動(dòng)物施用所述試劑，治療可能存在于表達(dá)TLR(例如TLR5)的組織中的癌癥的方法。所述癌癥可能是腫瘤或轉(zhuǎn)移性癌癥。所述癌癥也可能存在于肝臟、膀胱、肺或腸道組織中，并且也可能起源于另一類型的組織，例如結(jié)腸、乳腺或前列腺。所述癌癥也可能是黑素瘤或惡性血液腫瘤，例如淋巴瘤。所述癌癥也可能是已經(jīng)轉(zhuǎn)移到表達(dá)TLR的組織，例如肝臟、肺、膀胱、腸道或其它表達(dá)TLR的組織的任何癌癥。所述癌癥可能是TLR陰性癌，因此缺乏Toll樣受體的表達(dá)。所述癌癥可能缺乏Toll樣受體的內(nèi)源和外源表達(dá)兩者。所述方法可包括不向癌癥提供Toll樣受體的步驟，其可包括不在外源或內(nèi)源提供Toll樣受體。所述癌癥可能缺乏任何及所有Toll樣受體表達(dá)。
[0101]a.Toll 樣受體
[0102]Toll樣受體(TLR)可識(shí)別源自病原體的保守分子產(chǎn)物，但是可區(qū)別于宿主分子的分子，統(tǒng)稱為病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，所述病原體包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌和病毒。TLR也可識(shí)別從受損或垂死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性分子，統(tǒng)稱為損傷相關(guān)分子模式(DAMP)。如以下進(jìn)一步描述，PAMP或DAMP可為T(mén)LR激動(dòng)劑。TLR可為補(bǔ)充細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銜接分子以便傳送信號(hào)的片段、變體、類似物、同系物或衍生物。TLR可來(lái)自人類或其它哺乳動(dòng)物物種，例如獼猴、小鼠或大鼠。TLR可與補(bǔ)充細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銜接分子的TLR至少30-99%相同，以便傳送信號(hào)。
[0103]TLR可能是估計(jì)存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中的10-15個(gè)類型的TLR之一。TLR可能是在人類和小鼠中已經(jīng)鑒定的13種TLR(簡(jiǎn)稱TLR1-TLR13)之一，或可為在其它哺乳動(dòng)物物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的等效形式。TLR可能是在人類中已經(jīng)鑒定的11個(gè)成員(TLR1-TLR11)之一 O
[0104]TLR—般可由不同類型的免疫細(xì)胞表達(dá)，并且可位于細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。TLR —般可在癌細(xì)胞上表達(dá)。TLR —般可由消化系統(tǒng)中的正常上皮細(xì)胞、皮膚中的正常角化細(xì)胞、肺泡和支氣管上皮細(xì)胞及雌性生殖道的上皮細(xì)胞表達(dá)。器官內(nèi)襯的這些細(xì)胞可能是防御微生物侵入的第一道防線，并且一般在上皮細(xì)胞中表達(dá)的TLR在對(duì)增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中可能有至關(guān)重要的作用。
[0105]TLR可能不由癌細(xì)胞表達(dá)。TLR陰性癌細(xì)胞可能不表達(dá)任何TLR mRNA，可能不表達(dá)任何TLR蛋白，或可能不表達(dá)任何功能TLR蛋白。由于結(jié)合TLR配體的能力減弱或傳送通過(guò)配體結(jié)合觸發(fā)的下游信號(hào)的能力減弱，TLR蛋白可能不起作用。TLR陰性癌細(xì)胞的TLRmRNA、蛋白質(zhì)或TLR功能水平也可能降低。與來(lái)自產(chǎn)生癌癥的組織的正常細(xì)胞相比，或與其它已知的表達(dá)TLR的細(xì)胞類型相比，可能降低100%，或大于99.9%、99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%。表達(dá)TLR的細(xì)胞可為正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞系或腫瘤異種移植物。
[0106]一般在癌細(xì)胞上表達(dá)的TLR可上調(diào)NF-κ B級(jí)聯(lián)并生成有助于致癌和癌細(xì)胞增殖的抗凋亡蛋白。
[0107]已知在信號(hào)中涉及TLR的4種銜接分子。將這些蛋白質(zhì)稱為髓樣分化因子88 (MyD88)、Tirap(也稱為Mai)、Trif和Tram。銜接因子活化細(xì)胞中的其它分子，包括放大信號(hào)的某些蛋白激酶(IRAK1、IRAK4、TBKl和IKKi)，并最終導(dǎo)致對(duì)配合炎癥反應(yīng)的基因的誘導(dǎo)和抑制。病原體識(shí)別期間的TLR信號(hào)通路可通過(guò)MyD88、活化B細(xì)胞(NF-kB)的核因子κ輕鏈增強(qiáng)子和有絲分裂原相關(guān)蛋白激酶(MAPK)介導(dǎo)的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)通路誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。總之，TLR信號(hào)活化了成千上萬(wàn)個(gè)基因，并且總的來(lái)說(shuō)，TLR構(gòu)成了基因調(diào)控最具多效性，然而嚴(yán)格調(diào)節(jié)的通路之一。
[0108]TLR與白細(xì)胞介素-1受體一起形成受體超家族，稱為“白細(xì)胞介素-1受體/Toll樣受體超家族”。這個(gè)家族所有成員的共同之處是具有稱為T(mén)IR(T011-1L-1受體)的結(jié)構(gòu)域?？赡艽嬖赥IR結(jié)構(gòu)域的3個(gè)亞類。具有亞類I TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞生成的白細(xì)胞介素的受體并且全部具有細(xì)胞外免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域。具有亞類II TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是傳統(tǒng)TLR，并且直接或間接與微生物來(lái)源的分子結(jié)合。含有TIR結(jié)構(gòu)域(III)的第3亞類蛋白由全部為細(xì)胞溶質(zhì)并介導(dǎo)來(lái)自亞類I和2蛋白質(zhì)的信號(hào)的銜接蛋白組成。TLR可能是保持亞類I TIR結(jié)構(gòu)域、亞類II TIR結(jié)構(gòu)域或亞類III TIR結(jié)構(gòu)域的片段、變體、類似物、同系物或衍生物。
[0109]TLR可起二聚體的作用。例如，雖然多數(shù)TLR似乎起同型二聚體的作用，但是TLR2與TLRl或TLR6形成異二聚體，每個(gè)二聚體具有不同配體特異性。TLR也可依賴于其它輔助受體以便對(duì)全部配體敏感，例如在TLR4識(shí)別LPS的情況下，需要MD-2。已知⑶14和LPS結(jié)合蛋白(LBP)促進(jìn)LPS向MD-2的呈遞。
[0110](I)TLRl
[0111]TLR可為T(mén)LR1，其以對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的特異性識(shí)別PAMP。TLRl也稱為⑶281。
[0112](2) TLR5
[0113]TLR可為T(mén)oll樣受體5。TLR5編碼的蛋白質(zhì)可能在病原體識(shí)別和先天免疫活化中起重要作用。TLR5可識(shí)別在傳染劑上表達(dá)的PAMP并介導(dǎo)生成有效免疫發(fā)展所必需的細(xì)胞因子。TLR5可識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白，后者是細(xì)菌鞭毛的主要成分和毒力因子。TLR5的活化可使核因子NF- κ B移動(dòng)并刺激腫瘤壞死因子-α生成。
[0114](3)癌癥類型
[0115]癌癥可為原發(fā)性癌或轉(zhuǎn)移性癌。原發(fā)性癌可為變得在臨床上可檢測(cè)的起源部位的一個(gè)區(qū)域的癌細(xì)胞，并且可為原發(fā)性腫瘤。相反，轉(zhuǎn)移性癌可為疾病從一個(gè)器官或部分傳播到另一非相鄰器官或部分。轉(zhuǎn)移性癌可由獲得穿透并浸潤(rùn)局部區(qū)域中的周圍正常組織的能力，形成可局部轉(zhuǎn)移的新腫瘤的癌細(xì)胞引起。[0116]轉(zhuǎn)移性癌也可由獲得穿透淋巴管壁和/或血管壁的能力的癌細(xì)胞引起，之后癌細(xì)胞能夠通過(guò)血液循環(huán)(從而稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞)至體內(nèi)其它部位和組織。轉(zhuǎn)移性癌可能是由于例如淋巴或血液傳播的過(guò)程。轉(zhuǎn)移性癌也可由?？吭诹硪徊课簧?，再次穿透血管或壁，持續(xù)繁殖，并最終形成另一臨床上可檢測(cè)的腫瘤的腫瘤細(xì)胞引起。轉(zhuǎn)移性癌可為這種可為轉(zhuǎn)移性(或繼發(fā)性)腫瘤的新型腫瘤。
[0117]轉(zhuǎn)移性癌可由已經(jīng)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞引起，可為繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤。轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞可能和原腫瘤中的細(xì)胞相同。例如，如果乳腺癌或結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移到肝臟，當(dāng)存在于肝臟中時(shí)，繼發(fā)性腫瘤由異常乳腺或結(jié)腸細(xì)胞，而非異常肝臟細(xì)胞構(gòu)成。因此，肝臟中的腫瘤可為轉(zhuǎn)移性乳腺癌或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，而非肝癌。
[0118]轉(zhuǎn)移性癌可能起源于任何組織。轉(zhuǎn)移性癌可能源自黑素瘤、結(jié)腸、乳腺或前列腺，并且因此可由最初分別為皮膚、結(jié)腸、乳腺或前列腺的細(xì)胞構(gòu)成。轉(zhuǎn)移性癌也可以是惡性血液腫瘤(可能是淋巴瘤)。轉(zhuǎn)移性癌可侵害組織，例如肝臟、肺、膀胱或腸道。被侵入組織可表達(dá)TLR，而轉(zhuǎn)移性癌可能表達(dá)或不表達(dá)TLR。
[0119]b.組合
[0120]所述方法也可包括聯(lián)合施用TLR激動(dòng)劑和抗癌療法?？拱┋煼蔀镕AS配體、FAS激動(dòng)性抗體、TNF a、TNF α激動(dòng)性抗體、TRAIL或TRAIL激動(dòng)性抗體。TLR5激動(dòng)劑可用于使得所述癌癥對(duì)抗癌療法敏感。所述方法也可與治療癌癥的其它方法組合，包括使用免疫刺激劑、細(xì)胞因子或化學(xué)治療劑。免疫刺激劑可為生長(zhǎng)激素、催乳激素或維生素D。
[0121]5.減少癌癥復(fù)發(fā)的方法
[0122]本文提供了一種減少癌癥復(fù)發(fā)的方法，包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用TLR激動(dòng)劑。所述癌癥可能或可能已經(jīng)存在于表達(dá)或不表達(dá)TLR，例如TLR5的組織中。所述癌癥、組織、TLR、哺乳動(dòng)物和試劑可如 上所述。所述方法也可防止癌癥復(fù)發(fā)。所述癌癥可為腫瘤疾病。
[0123]所述癌癥可為休眠腫瘤，其可由癌癥的轉(zhuǎn)移引起。休眠腫瘤也可能是手術(shù)切除腫瘤所遺留下的。癌癥復(fù)發(fā)可能是腫瘤再生、肺轉(zhuǎn)移或肝臟轉(zhuǎn)移。
[0124]6.哺乳動(dòng)物
[0125]哺乳動(dòng)物可能具有功能完整的免疫系統(tǒng)，并且不可能免疫受損。哺乳動(dòng)物的免疫水平也可能與足以使得哺乳動(dòng)物適合第一輪或第二輪化學(xué)治療的水平相當(dāng)。哺乳動(dòng)物可能不具有可能由化學(xué)治療引起的低白細(xì)胞計(jì)數(shù)。低白細(xì)胞計(jì)數(shù)可能是由化學(xué)治療期間健康細(xì)胞損失引起。所述損失是化學(xué)治療藥物的預(yù)期副作用。低白細(xì)胞計(jì)數(shù)可能是化學(xué)治療引起的嚴(yán)重免疫抑制。低白細(xì)胞計(jì)數(shù)可損害所述試劑的抗腫瘤作用。低白細(xì)胞計(jì)數(shù)可在化學(xué)治療7-14天后恢復(fù)。
[0126]哺乳動(dòng)物的白細(xì)胞計(jì)數(shù)可能在正常范圍內(nèi)。哺乳動(dòng)物的白細(xì)胞計(jì)數(shù)也可能表明輕微免疫抑制。哺乳動(dòng)物可能尚未接受7-14天，或至少14天的化學(xué)治療。哺乳動(dòng)物的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)也可為至少3000或3500個(gè)細(xì)胞/ml全血；粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為至少1800或2100個(gè)細(xì)胞/ml全血；或白蛋白水平為至少3.0或3.5g/100ml全血。白細(xì)胞計(jì)數(shù)、粒細(xì)胞計(jì)數(shù)或白蛋白水平也可能在這些水平的+/_5%、10%、20%、30%、40%或50%內(nèi)。
[0127]7.保護(hù)肝臟的方法
[0128]如以上所討論，通過(guò)FAS、TRAIL和TNFa死亡受體信號(hào)(例如死亡配體)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的抗癌療法可引起嚴(yán)重的肝毒性。因此，已經(jīng)限制使用分子，例如FAS、TRAIL和TNFa作為抗癌療法，即使這些分子在靶向癌細(xì)胞中有效。因此，本文還提供了一種保護(hù)哺乳動(dòng)物的肝臟組織免受肝毒性影響的方法。通過(guò)向哺乳動(dòng)物施用所述試劑保護(hù)肝臟。死亡受體信號(hào)激動(dòng)劑可為FAS、TRAIL或TNFa。死亡配體可為肝毒性。FAS、TRAIL或TNF a可用作抗癌劑。
[0129]肝毒性也可為沙門(mén)氏菌感染，沙門(mén)氏菌感染可能來(lái)自鼠傷寒沙門(mén)氏菌。所述試劑也可用于防御可能是FAS介導(dǎo)的肝毒性。毒性也可為FAS配體、FAS激動(dòng)性抗體、TNF a、醋氨酚、醇、肝臟的病毒感染或化療劑?？上虿溉閯?dòng)物施用所述試劑。
[0130]實(shí)施例1
[0131 ] TLR5激動(dòng)劑保護(hù)肝臟免受肝毒性
[0132]由于至少部分抑制放射敏感組織中的細(xì)胞凋亡，藥學(xué)上優(yōu)化的TLR5激動(dòng)劑CBLB502是一種有效的放射防護(hù)劑。試驗(yàn)CBLB502保護(hù)肝臟免受Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。下列實(shí)施例證明，用CBLB502刺激后，小鼠和人類肝細(xì)胞中TLR5通路活化，導(dǎo)致NF_kB依賴性誘導(dǎo)編碼抗凋亡蛋白的基因。用CBLB502預(yù)處理小鼠保護(hù)其免于致死劑量的Fas激動(dòng)性抗體，減少Fas誘導(dǎo)的血液中肝酶、肝臟提取物中的半胱天冬酶活性升高并保護(hù)肝臟組織完整性。在同源黑素瘤和結(jié)腸癌小鼠模型中CBLB502并不保護(hù)腫瘤。這些觀察情況支持在TLR5激動(dòng)劑，例如CBLB502的保護(hù)下，使用Fas激動(dòng)劑進(jìn)行癌癥治療。
[0133]施用TLR5激動(dòng)劑CBLB502和TLR4激動(dòng)劑LPS (另一已知的NF_kB活化劑)后，t匕較不同器官中的NF-kB反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)CBLB502誘導(dǎo)肝細(xì)胞中NF_kB的迅速直接活化，而通過(guò)不同類型的細(xì)胞介導(dǎo)肝細(xì)胞中NF-kB的LPS活化。因此下列數(shù)據(jù)還證明，用CBLB502預(yù)處理可降低抗癌療法期間小鼠體內(nèi)Fas介導(dǎo)的肝毒性。以下描述的方法基于通過(guò)源自鼠傷寒沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白的toll樣受體-5 (TLR5)激動(dòng)劑CBLB502活化NF_kB增強(qiáng)正常組織對(duì)破壞性副作用的抗性。
[0134]1.響應(yīng)于TLR4和TLR5激動(dòng)劑體內(nèi)NF_k活化的確定
[0135]與通過(guò)TLR4作用的細(xì)菌LPS比較，研究在小鼠不同器官中對(duì)TLR5激動(dòng)劑CBLB502的NF-kB反應(yīng)。NF-kB依賴性螢光素酶報(bào)告基因Xenogen小鼠模型，其中螢光素酶轉(zhuǎn)基因在IkBa基因的NFkB依賴性天然啟動(dòng)子的控制下表達(dá)(Zhang N等，2005)。施用NFkB活化劑后，在對(duì)指定試劑起反應(yīng)的細(xì)胞和組織中螢光素酶活性增強(qiáng)。使用非侵入性Xenogen成像系統(tǒng)和離體螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定，在CBLB502皮下注射2h后檢測(cè)小鼠肝臟中NF_kB強(qiáng)烈活化(圖7A)。對(duì)不同器官中NF-kB活化的定量分析揭示，與LPS相比，CBLB502誘導(dǎo)肝臟中更強(qiáng)烈的NF-kB活化，腸道中同樣高的NF-kB活化水平，而在脾臟、骨髓、腎臟和肺中發(fā)現(xiàn)NF-kB活性較低(圖7B)。對(duì)于兩種TLR激動(dòng)劑而言，NF-kB誘導(dǎo)的螢光素酶報(bào)告基因活性的動(dòng)態(tài)相似，注射約2h后活化譜達(dá)到峰值，在6h時(shí)間點(diǎn)降低并且在注射24h后不可有效檢測(cè)(圖10)。
[0136]對(duì)小鼠肝臟樣品向核的p65易位的免疫組織化學(xué)染色揭示，早在注射20min后CBLB502直接活化肝細(xì)胞中的NF-kB，尚無(wú)Kupffer和內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)(圖7C)。CBLB502注射Ih時(shí)，所有肝細(xì)胞，包括Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，證明了 p65的核積聚，這表明原發(fā)和繼發(fā)性作用與旁分泌機(jī)制對(duì)NF-kB的后續(xù)活化重疊。相反，肝細(xì)胞中LPS活化的NF-kB核易位發(fā)生明顯更遲。LPS施用約Ih后首先在庫(kù)普弗(Kupffer)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，接著在肝細(xì)胞中觀察到NF-kB活化。
[0137]用CBLB502，而不用LPS處理原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物(鼠和人)證明NF_kB易位至核(圖7D、E)。用鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)物，通過(guò)NF-kB依賴性螢光素酶表達(dá)確認(rèn)CBLB502介導(dǎo)NF_kB活化，而LPS不誘導(dǎo)該細(xì)胞中的NF-kB活化(圖11)。在LPS處理的肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NF_kB活化水平低更有可能是由于其它肝基質(zhì)細(xì)胞污染了原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0138]這些結(jié)果顯示，肝細(xì)胞表達(dá)TLR5，但是不表達(dá)TLR4，使得CBLB502直接活化肝細(xì)胞中的NF-kB，而LPS最初活化其它細(xì)胞類型(免疫和/或基質(zhì))并且稍后僅作為繼發(fā)事件，間接活化肝細(xì)胞。
[0139]2.CBLB502防護(hù)Fas介導(dǎo)的肝毒性
[0140]與已經(jīng)證明的一樣，抗Fas抗體可誘導(dǎo)劑量依賴性肝毒性并通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、肝組織壞死和出血迅速殺傷小鼠(Ogasawara J等，Naturel993, Nishimura等1997)。因此，TLR5激動(dòng)劑CBLB502誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中的NF_kB活化可保護(hù)肝臟免于Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在NIH-Swiss小鼠中，腹腔注射的4yg抗Fas抗體(克隆Jo2)誘導(dǎo)肝臟中大量細(xì)胞凋亡、壞死和出血(圖8B、C和D)，在抗體注射后的前1-2天內(nèi)殺死小鼠(圖8A)。與完整對(duì)照小鼠相比，在動(dòng)力學(xué)上對(duì)用CBLB502處理的小鼠的病理形態(tài)學(xué)檢查顯示，其肝臟有輕微的肝細(xì)胞空泡形成(圖12)。在動(dòng)力學(xué)上對(duì)注射了亞致死劑量的抗Fas抗體(3μ g/只小鼠)的檢查揭示，與末端(中間)靜脈相鄰的細(xì)胞受更好保護(hù)的肝門(mén)通道周圍的肝細(xì)胞明顯凋亡，在5h時(shí)最明顯并且隨時(shí)間推移(注射12和24h后)減弱。在用CBLB502和抗Fas抗體處理的小鼠的肝臟中，變化最小并且肝細(xì)胞看上去接近正常-僅可見(jiàn)到輕微空泡形成和單個(gè)凋亡細(xì)胞。
[0141]當(dāng)在抗Fas抗體前30min注射時(shí)，CBLB502注射小鼠對(duì)注射后更好總體存活率有偏差的肝臟損傷比NIH-Swiss小鼠低約80%(圖8A)。當(dāng)在抗體前2h注射CBLB502時(shí)，所有小鼠均存活。然后到預(yù)處理的6h時(shí)間點(diǎn)，保護(hù)水平降低。
[0142]2和3μ g的抗Fas抗體僅誘導(dǎo)NIH-Swiss小鼠體內(nèi)的瞬時(shí)肝毒性、肝臟中的半胱天冬酶3/7活化和血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)分泌(圖SE、F)。兩次試驗(yàn)表明，如果用CBLB502預(yù)處理小鼠，則抗Fas抗體誘導(dǎo)的肝損傷顯著降低。有趣的是，Balb/c和C57B1/6小鼠似乎對(duì)抗Fas抗體比NIH-Swiss小鼠敏感度低。4 μ g的抗Fas抗體(NIH-Swiss小鼠的致死劑量)僅在BALB/c和C57B1/6小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)瞬時(shí)半胱天冬酶3/7活化，這通過(guò)在抗體前30min注射CBLB502成功預(yù)防(圖13)。
[0143]這些數(shù)據(jù)支持肝細(xì)胞中TLR5介導(dǎo)的NF-kB活化可為對(duì)Fas介導(dǎo)的毒性的抗性增強(qiáng)的指示和測(cè)量的假設(shè)。
[0144]3.肝臟中CBLB502抑制促凋亡并誘導(dǎo)抗凋亡因子
[0145]半胱天冬酶3和7是內(nèi)部(線粒體)和外部(半胱天冬酶)Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)的下游靶標(biāo)。受體活化后，首先半胱天冬酶-8變得磷酸化并且裂解，導(dǎo)致通過(guò)裂解促凋亡Bid蛋白和細(xì)胞色素釋放作用的線粒體凋亡機(jī)制活化(Lou等1998)。因此，我們檢查CBLB502是否抑制這種機(jī)制。
[0146]對(duì)于半胱天冬酶-8和Bid的肝臟蛋白提取物的蛋白質(zhì)印跡分析證明，與單一注射抗Fas抗體相比，在注射CBLB502和抗Fas抗體組合的小鼠體內(nèi)，這些蛋白質(zhì)裂解少得多(圖9A、B)。一致地，正如使用熒光底物測(cè)定所表明，半胱天冬酶8活化降低至背景水平(圖8F)。
[0147]CBLB502使小鼠免受Fas介導(dǎo)的肝毒性的保護(hù)隨時(shí)間推移而增強(qiáng)，在30min_2h達(dá)到最大峰值的事實(shí)表明，在肝細(xì)胞中存在預(yù)處理事件。在許多細(xì)胞因子和抗凋亡因子中，通過(guò)RT-PCR確認(rèn)，在CBLB502施用30min和2h后，通過(guò)RNA陣列雜交在肝臟中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)抗凋亡 bcl2 家族成員 bcl2AlB 和 bcl2AlD 上調(diào)(Chao 和 Korsmeyer, 1998, Arikawa 等 2006)(圖9C)。CBLB502也迅速誘導(dǎo)另一種抗凋亡蛋白，立即早期反應(yīng)蛋白IER-3的RNA表達(dá)(圖9C，IEX-1是替代名稱)，經(jīng)證實(shí)所述蛋白抑制生成活性氧族和線粒體凋亡通路(Shen等2009)。對(duì)肝臟樣品的RT-PCR分析揭示，施用30min后CBLB502已經(jīng)誘導(dǎo)IER-3RNA表達(dá)，到2h時(shí)顯著增強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)MAPK通路的幾種蛋白質(zhì)在用CBLB502處理的小鼠的肝臟中上調(diào)。證明腫瘤中MAPK通路的活化介導(dǎo)了這些細(xì)胞對(duì)Fas受體凋亡(REF)的抗性。抗Fas抗體注射，接著用CBLB502預(yù)處理后，JuruJun-B和Fos基因表達(dá)的上調(diào)與小鼠存活率直接相關(guān)，這表明了它們?cè)贑BLB502介導(dǎo)的對(duì)Fas肝毒性的防御中的可能作用。
[0148]4.CBLB502對(duì)Fas介導(dǎo)的抗腫瘤活性的影響
[0149]LPS不是臨床應(yīng)用很好的候選，因?yàn)樗谠S多器官中誘導(dǎo)嚴(yán)重炎癥并且可通過(guò)FADD/半胱天冬酶-8凋亡通路(REF)直接毒害細(xì)胞。進(jìn)而已經(jīng)在小鼠、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類健康志愿者中測(cè)試了 CBLB502并且發(fā)現(xiàn)其是短效炎癥更溫和的誘導(dǎo)劑。評(píng)估組織保護(hù)化合物時(shí)，也總有可能通過(guò)降低毒副作用，也可使腫瘤細(xì)胞抗性更強(qiáng)并且危及抗腫瘤治療的功效。測(cè)試了皮下生長(zhǎng)腫瘤和實(shí)驗(yàn)性肝轉(zhuǎn)移的CT-26結(jié)腸癌小鼠模型中用CBLB502和抗Fas抗體聯(lián)合治療的體內(nèi)抗腫瘤作用。在最近公開(kāi)的研究中使用了這種腫瘤模型，該研究應(yīng)用表達(dá)FasL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌，總減毒細(xì)菌，將FasL遞送至熱帶腫瘤并誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)的抗腫瘤作用(Loeffler等2008)。通過(guò)RT-PCR和NF_kB依賴性螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定確定，CT-26腫瘤細(xì)胞和A20淋巴瘤細(xì)胞不表達(dá)TLR5 (圖14)。此時(shí)，單獨(dú)用抗Fas抗體或在單獨(dú)注射抗Fas抗體24h和Ih前給予2次重組CBLB502的組合處理荷瘤小鼠(4 μ g/只小鼠，圖9D)。將處理小鼠體內(nèi)的皮下生長(zhǎng)腫瘤的體積與完整小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤的體積作比較。發(fā)現(xiàn)CT-26腫瘤相當(dāng)耐毒，但是 不耐致死劑量的抗Fas抗體(圖9D)。用CBLB502預(yù)處理稍微使腫瘤對(duì)抗Fas抗體敏感，在生長(zhǎng)抑制腫瘤反應(yīng)中反映出來(lái)。在通過(guò)脾內(nèi)注射表達(dá)螢光素酶的CT-26腫瘤細(xì)胞，接著進(jìn)行脾切除術(shù)誘導(dǎo)的肝轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袦y(cè)試了 Fas介導(dǎo)的抗腫瘤作用。處理后每4-6天，使用Xenogen螢光素酶成像來(lái)評(píng)估肝腫瘤生長(zhǎng)。在每個(gè)成像過(guò)程計(jì)數(shù)仍然沒(méi)有肝腫瘤生長(zhǎng)的小鼠(圖9E)。結(jié)果證明通過(guò)兩種處理，單獨(dú)的抗Fas抗體或在用CBLB502預(yù)處理后給藥，肝臟中的腫瘤出現(xiàn)(圖9G)和生長(zhǎng)顯著延遲。TLR5陰性CT-26腫瘤對(duì)用抗Fas和CBLB502聯(lián)合處理的敏感性增強(qiáng)表明了對(duì)CT-26腫瘤的抗腫瘤免疫應(yīng)答的活化。實(shí)際上，對(duì)抗Fas/CBLB502處理24h后取得的具有CT-26腫瘤的肝臟樣品的免疫組織化學(xué)分析揭示了嗜中性粒細(xì)胞在腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)部和周圍積聚(圖9F)。因此，CBLB502并未保護(hù)腫瘤免受抗Fas抗體毒性并且甚至可稍微增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的對(duì)CT-26腫瘤的抗腫瘤作用。同時(shí)保護(hù)正常肝組織免受Fas介導(dǎo)的毒性可使Fas激動(dòng)劑的量增加，達(dá)到對(duì)肝轉(zhuǎn)移的完全預(yù)防和對(duì)皮下生長(zhǎng)腫瘤的治療作用。
[0150]材料和方法
[0151]小鼠
[0152]從NCI (Frederick, MD)購(gòu)買(mǎi) NIH-Swiss 雌性小鼠，從 Jackson Laboratory (BarHarbor, ME)購(gòu)買(mǎi)BALB/c和C57B1/6雌性小鼠。在實(shí)驗(yàn)中使用的所有小鼠均為10-14周齡。最初從Xenogen(Alameda, CA)購(gòu)買(mǎi)具有NF_kB誘導(dǎo)型螢光素酶報(bào)告基因的Balb/C-Tg(I K Ba-luc)Xen小鼠并在我們家養(yǎng)的群體中繁殖。
[0153]試劑
[0154]從Cleveland BioLabs, Inc.獲得細(xì)菌鞭毛蛋白衍生物CBLB502。從Sigma購(gòu)買(mǎi)來(lái)自大腸桿菌055:B5的細(xì)菌脂多糖(LPS)。從BD Biosciences購(gòu)買(mǎi)純化激動(dòng)性倉(cāng)鼠抗小鼠Fas抗體，克隆Jo2。
[0155]使用NF-kB報(bào)告小鼠模型分析NF- κ B活化
[0156]為BALB/c-Tg(I κ Ba -luc) Xen 報(bào)告小鼠皮下注射 CBLB502 (0.2mg/kg)。處理 2h后，通過(guò)非侵入性體內(nèi)成像檢測(cè)CBLB502對(duì)NF-kB的誘導(dǎo)(圖1A)。對(duì)小鼠注射D-螢光素(3mg/100 μ I,腹腔內(nèi)，Promega),立即用異氟燒麻醉并且用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)100系列照相。為量化結(jié)果，注射2、6和24h后獲得來(lái)自皮下注射了 IOOy I PBS、CBLB502(0.2mg/kg)或LPS(lmg/kg)的NF-kB報(bào)告小鼠的肝臟、肺、腎臟、脾臟、心臟和腸道樣品(圖7B、10)。使含有蛋白酶抑制劑混合物的溶解緩沖液(根據(jù)生產(chǎn)商的建議，Calbiochem)覆蓋組織樣品以獲得IOOmg組織/Iml溶解緩沖液。隨后，在4C、14，OOOrpm下勻化并離心lOmin。添加30 μ I 螢光素試劑(Bright-Glo Luciferase Assay System, Promega)后立即測(cè)量 20 μ I 樣品中的螢光素酶活性。將螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為每μ g的蛋白質(zhì)提取物。按TLR配體處理小鼠的肝臟和從注射PBS的對(duì)照小鼠獲得的肝臟中平均螢光素酶單位之間的比例計(jì)算螢光素酶誘導(dǎo)倍數(shù)。
[0157]p65易位的免疫組織化學(xué)染色。
[0158]檢測(cè)從皮下注射了CBLB502 (0.04mg/kg)或 LPS(lmg/kg)的 NIH-Swiss 小鼠分離的肝臟中的P65位置。向?qū)φ招?鼠注射PBS。在處理20、40和60min后獲得組織樣品，將其處理成石蠟塊。用兔多克隆抗體為所用肝臟組織染色NF-kB p65和兔單克隆抗體染色細(xì)胞角蛋白8，接著用適當(dāng)?shù)亩螣晒馊玖吓悸?lián)抗體染色(p65-綠色，細(xì)胞角蛋白-8-紅色)。在板上用從NIH-Swiss小鼠輸注了 EGTA(0.5mM于PBS中)的肝臟組織分離的原代小鼠肝細(xì)胞和從(BD Biosciences)購(gòu)買(mǎi)的人肝細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行相同染色，接著對(duì)原代小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行膠原酶消化。在體外經(jīng)指定時(shí)間用CBLB502(100ng/ml)或LPS(lyg/ml)處理兩種類型的肝細(xì)胞。對(duì)照肝細(xì)胞保持完整。在X20放大倍數(shù)下照相(圖7C、D、E)。
[0159]存活率測(cè)定
[0160]NIH-Swiss小鼠腹腔內(nèi)注射2、3、4和5 μ g于200 μ I PBS中的抗Fas抗體以測(cè)定100%致死劑量，發(fā)現(xiàn)這個(gè)小鼠品系的100%致死劑量為4 μ g/只小鼠。然后在4 μ g抗Fas抗體(腹腔)前30min、2h和6h皮下注射CBLB502 (0.04mg/kg,皮下)(圖8A)。通常因抗Fas肝毒性的死亡在抗體注射后前1-2天內(nèi)發(fā)生。觀察并記錄30天內(nèi)的小鼠存活率。
[0161]肝臟中凋亡細(xì)胞的TUNEL染色
[0162]在石蠟包埋樣本中檢測(cè)在抗Fas抗體30min之前注射CBLB502 (皮下，0.04mg/kg)或PBS5h后NIH-Swiss小鼠肝臟中的細(xì)胞凋亡。用TUNEL POD試劑盒(Roche AppliedScience),通過(guò)間接末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法將凋亡細(xì)胞染色(圖8B)。
[0163]肝臟形態(tài)的組織學(xué)評(píng)估[0164]在抗體前30min,用或不用CBLB502 (0.04mg/kg)預(yù)處理,注射抗Fas抗體5h (圖2C)或5、12和26h后動(dòng)態(tài)地(圖S3)從NIH-Swiss小鼠收集肝臟樣本。使用未經(jīng)處理(“完整”)的小鼠作為對(duì)照。將組織樣本于10%緩沖福爾馬林中固定，包埋于石蠟中，切片并且經(jīng)蘇木精伊紅染色處理。
[0165]肝臟出血的組織學(xué)染色
[0166]用Cy5偶聯(lián)的小鼠IgG的抗體為石臘切片染色[Jackson Immunoresearch,偽紫色]并且用具有DAPI的ProLong Gold防褪色劑封固[Invitrogen,藍(lán)核染色]。通過(guò)紅色自體熒光使紅細(xì)胞在紅色通道中顯現(xiàn)(圖2D)。使用Axio Vision軟件(rel.4.6.3)，在裝備有AxioCam HRcl300萬(wàn)像素?cái)?shù)碼相機(jī)的Axiolmager Zl突光顯微鏡(Zeiss)下拍攝圖像。
[0167]半胱天冬酶活化
[0168]將肝臟切為小片并用組織研磨器(Bullet Blender, NextAdvance)勻化于補(bǔ)充了2mM DTT的緩沖液(IOmM Hepes,0.4mM EDTA、0.2%CHAPS、2%甘油)中。所有步驟均在冰上進(jìn)行。在13，000戰(zhàn)下離心肝臟勻漿20!^11，并且將上清液儲(chǔ)存在-201:下。通過(guò)用50 μ M于200μ I 含 IOmM HEPES、0.4mM EDTA、0.2%CHAPS、2% 甘油和 2mM DTT 的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)緩沖液中的熒光底物乙?；?Asp (OMe) -Glu (OMe) -Val-Asp (OMe)-氨基甲基香豆素(Ac-DEVD-amc)(ENZO, LifeSciences)培養(yǎng)肝臟勻漿(含50 μ g總蛋白)來(lái)測(cè)定半胱天冬酶活性。在37°C下培育O和2h后，用熒光計(jì)(Ex:355,Em:485) (Victor3, PerkinElmer)測(cè)量熒光amc的釋放。數(shù)據(jù)表示為twp和Oh之間的差異(圖8E)。
[0169]檢查注射或未注射CBLB502，經(jīng)抗Fas抗體處理的小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)
[0170]在抗Fas抗體前30min對(duì)ΝΙΗ-Swiss小鼠(3只/組)皮下注射I μ gCBLB502。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明(Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA),使用商用酶測(cè)定法確定小鼠血清中存在谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。以60s間隔(Λ A/min)測(cè)量340nm下的吸光度(圖8F)。
[0171]蛋白質(zhì)印跡分析
[0172]使用補(bǔ)充了蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich St.Louis, MO)的RIPA緩沖液(Sigma-Aldrich St.Louis, MO),從經(jīng)處理和未經(jīng)處理的小鼠肝臟中分離出總蛋白。通過(guò)在變性4-20%聚丙烯酰胺Novex凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)中電泳來(lái)分離蛋白提取物并將其轉(zhuǎn)移到尼龍聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P, Millipore BillericaMA)上。使用下列抗體:半胱天冬酶_8抗體(Calbiochem, Darmstadt, Germany)、抗BID (AbCam, Cambridge MA)。從 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Santa Cruz, CA)購(gòu)買(mǎi)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二次抗兔和抗小鼠抗體(圖9A和9B)。
[0173]RNA 分析
[0174] 使用TRIzol試劑，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明(Invitrogen, Carlsbad, CA)從經(jīng)處理和未經(jīng)處理的小鼠肝臟萃取總RNA。為消除基因組DNA的任何最終污染，用DNA酶I (Invitrogen, Carlsbad, CA)處理分離的 RNA。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，使用 SuperScriptTM II逆轉(zhuǎn)錄酶和寡聚(dT) 12-18 引物(Invitrogen, Carlsbad, CA)來(lái)合成 cDNA。通過(guò) RT-PCR檢測(cè)用CBLB502和LPS處理30min和2h的完整小鼠的肝臟中Bcl2AlB、Bcl2AlD、IER-3、Fos、Jun和JunB基因的RNA表達(dá)。使用GAPDH作為對(duì)照以監(jiān)測(cè)對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。使用LaserGene 軟件(DNASTAR, Inc., Madison, WI)設(shè)計(jì)引物，然后使用 UCSC Genome BrowserIn-Silico PCR網(wǎng)站檢查定位引物。使用對(duì)IER3基因(GenBank登記號(hào)NM_133662.2)(有義鏈 5’ -ACTCGCGCAACCATCTCCACAC-3’ 和反義鏈 5’ -CTCGCACCAGGTACCCATCCAT-3’ )、Bcl2AlB 基因(GenBank 登記號(hào) ΝΜ_007534.3)(有義鏈 5’ -TAGGTGGGCAGCAGCAGTCA-3’ 和反義鏈 5’ -CTCCATTCCGCCGTATCCAT-3，)、Bcl2AlD 基因(GenBank 登記號(hào) NM_007536.2)(有義鏈 5’ -TCTAGGTGGGCAGCAGCAGTC-3’ 和反義鏈 5’ -ATTCCGCCGTATCCATTCTCC-3’ )、Jun(GenBank 登記號(hào) ΝΜ_010591.2)(有義鏈 5’ -TGAAGCCAAGGGTACACAAGAT-3’ 和反義鏈 5’ -GGACACCCAAACAAACAAACAT-3’)、Fos(GenBank 登記號(hào) ΝΜ_010234.2)(有義鏈 5’-GAGCGCAGAGCATCGGCAGAAG-3，和反義鏈 5’ -TTGAGAAGGGGCAGGGTGAAGG-3’)、JunB(GenBank 登記號(hào) ΝΜ_008416.2)(有義鏈 5’ -AGCCCTGGCAGCCTGTCTCTAC-3’ 和反義鏈5’ -GTGATCACGCCGTTGCTGTTGG-3’ )和 GAPDH 基因(有義鏈 5’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和反義鏈5’ -TCCACCACCATGTTGCTGTA-3’ )有特異性的引物。使用每個(gè)基因的特異性引物對(duì)，進(jìn)行cDNA擴(kuò)增20-30個(gè)循環(huán)(圖3C)。
[0175]具有CT-26腫瘤的小鼠的實(shí)驗(yàn)治療
[0176]用2個(gè)同源結(jié)腸腺癌CT-26腫瘤模型:I) CT-26皮下生長(zhǎng)腫瘤和2) CT-26腫瘤的實(shí)驗(yàn)性肝轉(zhuǎn)移模型，分析CBLB502對(duì)腫瘤對(duì)抗Fas抗體的敏感性的影響。用攜帶螢光素酶基因的慢病毒載體，在螢光素酶組成型表達(dá)的CMV啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)導(dǎo)CT-26細(xì)胞。通過(guò)在BALB/c小鼠的兩腹側(cè)皮下注射CT-26腫瘤細(xì)胞(2.5 X 105個(gè)/100 μ I)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到約4-5mm時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為3個(gè)組并開(kāi)始處理。一組小鼠腹腔內(nèi)注射抗Fas抗體(4 μ g/只小鼠)，另一組在抗Fas抗體注射(4 μ g/只小鼠)前24h和Ih,用CBLB502 (I μ g/只小鼠)處理。對(duì)照小鼠(“完整”)接受皮下和腹腔PBS注射代替CBLB502和抗體。每2天，使用卡尺測(cè)量并通過(guò)下式計(jì)算腫瘤體積:V=n/6*a2*b，其中a〈b。由于對(duì)照組有大腫瘤而終止實(shí)驗(yàn)時(shí)，跟蹤存活率2周(圖9D)。使用ANOVA單向方差分析評(píng)估腫瘤體積之間的統(tǒng)計(jì)差異(p〈0.05)。為了肝臟腫瘤生長(zhǎng)的發(fā)展，直接將CT-26腫瘤細(xì)胞(2 X 105個(gè)/50 μ I)注射至脾臟，接著在5min后進(jìn)行脾切除術(shù)。用抗Fas抗體和CBLB502與抗體的組合，以對(duì)腫瘤細(xì)胞接種后第5天開(kāi)始的皮下腫瘤描述的相同方式處理小鼠。在腫瘤細(xì)胞注射后第14、17,22和28天，使用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)100系列對(duì)用異氟烷麻醉并注射了 D-螢光素(3mg/100yl，腹腔內(nèi))的小鼠進(jìn)行非侵入性生物發(fā)光成像。當(dāng)確定肝臟中的腫瘤生長(zhǎng)時(shí)處死小鼠。使用對(duì)數(shù)秩(Mante l-Cox)檢驗(yàn)進(jìn)行無(wú)肝臟腫瘤曲線的統(tǒng)計(jì)比較(p〈0.05)(圖9G)。
[0177]實(shí)施例2
[0178]無(wú)胸腺小鼠異種模型中CBLB502對(duì)結(jié)腸HCT116腺癌皮下生長(zhǎng)的抗腫瘤活性。向8只無(wú)胸腺裸鼠的2個(gè)腹側(cè)皮下注射HCT116 (0.5X106個(gè)/100 μ I PBS)以誘導(dǎo)腫瘤。當(dāng)腫瘤直徑變成約3-5mm時(shí)(到注射后第6天)，將小鼠隨機(jī)分成2組，5只小鼠為CBLB502處理組而3只小鼠為PBS對(duì)照組。測(cè)定用CBLB502處理的小鼠體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。圖15中示出了數(shù)據(jù)。
[0179]實(shí)施例3
[0180]無(wú)胸腺小鼠異種模型中CBLB502對(duì)293-TLR5皮下腫瘤生長(zhǎng)的抗腫瘤活性。向10只無(wú)胸腺裸鼠的2個(gè)腹側(cè)皮下注射腫瘤細(xì)胞(2X IO6個(gè)/100 μ I PBS)以誘導(dǎo)腫瘤。當(dāng)腫瘤直徑變成約3-5mm時(shí)(到注射后第7天)，將小鼠隨機(jī)分成2組，5只小鼠為CBLB502處理組而5只小鼠為PBS對(duì)照組。在用CBLB502處理的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。圖16中示出了數(shù)據(jù)。
[0181]實(shí)施例4
[0182]無(wú)胸腺小鼠異種模型中CBLB502對(duì)A549腺癌皮下生長(zhǎng)的抗腫瘤活性。向8只無(wú)胸腺裸鼠(0.5X IO6個(gè)/100 μ I PBS)的2個(gè)腹側(cè)皮下注射原始A549細(xì)胞(ATCC，CLL-185)以誘導(dǎo)腫瘤。當(dāng)腫瘤直徑變成約3-5mm時(shí)(到注射后第6天)，將小鼠隨機(jī)分成2組，5只小鼠為CBLB502處理組而3只小鼠為PBS對(duì)照組。對(duì)具有A549腫瘤的小鼠注射CBLB502 (I μ g/只小鼠)或PBS三次，時(shí)間間隔24h。在注射PBS的對(duì)照組小鼠中，腫瘤體積逐漸有規(guī)律地增長(zhǎng)。另一方面，注射CBLB502的小鼠在注射后前幾天表現(xiàn)出抑制腫瘤生長(zhǎng)，然后腫瘤生長(zhǎng)恢復(fù)。第一次處理2周后，在腫瘤生長(zhǎng)重新開(kāi)始之前，第二輪CBLB502注射(第14、15和16天)誘導(dǎo)類似腫瘤生長(zhǎng)抑制約1-2周。因此，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，2組小鼠體內(nèi)A549腫瘤的尺寸顯著不同，用CBLB502處理的小鼠比用PBS處理的小鼠小很多。圖17中示出了數(shù)據(jù)。
[0183]實(shí)施例5
[0184]CBLB502對(duì)同源原位(皮下)生長(zhǎng)的鱗狀細(xì)胞癌SCCVII腫瘤的抗腫瘤作用。CBLB502或PBS (未處理)處理(0.lmg/kg，皮下，第1、2、3天)后，同源C3H小鼠中SCCVII原位腫瘤生長(zhǎng)的速率達(dá)到腫瘤尺寸400mm3，n=6-10。圖18中的x軸表示用和不用CBLB502處理時(shí)腫瘤達(dá)到400mm3體積所需的天數(shù)。圖18中示出了數(shù)據(jù)。
[0185]實(shí)施例6
[0186]CBLB502在具有晚期Ward結(jié)直腸癌的Fischer大鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性。經(jīng)5天腹腔內(nèi)施用CBLB-502每天一次(0.2mg/kgX5次劑量)，在腫瘤移植至4只大鼠體內(nèi)5天后開(kāi)始。4只對(duì)照大鼠接受作為媒介物對(duì)照的PBS注射。每天測(cè)量一次腫瘤重量。在用CBLB502處理的3只大鼠體內(nèi)觀察到完 全反應(yīng)(腫瘤完全消失)(圖19)。該組中第4只大鼠的腫瘤生長(zhǎng)與對(duì)照組的大鼠相似。
[0187]實(shí)施例7
[0188]CBLB502注射對(duì)TLR5表達(dá)不同的A549腫瘤(A549_shTLR5對(duì)比A549_shV)的作用。為了抑制TLR5表達(dá)，用表達(dá)對(duì)人TLR5基因有特異性的shRNA的慢病毒pLKOl-puro載體[CCG-GCC-TTG-CCT-ACA-ACA-AGA-TAA-ACT-CGA-GTT-TAT-CTT-GTT-GTA-GGC-AAG-GTT-TTT-G]或?qū)φ湛蛰d體(shV, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)轉(zhuǎn)導(dǎo)在 NF-kB 啟動(dòng)子(Cellecta, Mountain View, CA)控制下表達(dá)螢火蟲(chóng)螢光素酶基因的A549細(xì)胞。嘌呤霉素選擇后，根據(jù)生產(chǎn)商方法(Promega，Cat#E4530，Madison，WI)，使用螢光素酶報(bào)告測(cè)定來(lái)測(cè)試A549-shV和A549-shTLR5細(xì)胞響應(yīng)于用CBLB502處理的NF_kB活化。然后，將A549_shV和A549-shTLR5細(xì)胞(1X106個(gè)/100μ I PBS)皮下注射至20只無(wú)胸腺裸鼠的2個(gè)腹側(cè)以誘導(dǎo)腫瘤。用CBLB502或作為對(duì)照的PBS處理具有皮下生長(zhǎng)的A549_shV和A549_shTLR5腫瘤異種移植物的小鼠(5只小鼠/組)。結(jié)果證明，重復(fù)施用單獨(dú)的CBLB502導(dǎo)致A549_shV (表達(dá)TLR5)腫瘤異種移植物中的腫瘤生長(zhǎng)速率降低，這證明了藥物的直接腫瘤抑制作用。對(duì)A549衍生腫瘤顯示，這種作用依賴于TLR5，因?yàn)橛陕《巨D(zhuǎn)導(dǎo)shRNA對(duì)人TLR5引起的TLR5敲除致使A549腫瘤不再對(duì)CBLB502的直接抗腫瘤作用敏感。圖20中示出了數(shù)據(jù)。
[0189]實(shí)施例8
[0190]CBLB502注射對(duì)TLR5表達(dá)不同的H1299腫瘤(H1299-對(duì)照對(duì)比H1299-TLR5)的作用。為了誘導(dǎo)TLR5表達(dá)，用表達(dá)人TLR5基因的慢病毒構(gòu)造來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)H1299細(xì)胞(原為T(mén)LR5陰性)。響應(yīng)于CBLB502處理，通過(guò)IL-8生成來(lái)檢查T(mén)LR5的功能活性。然后將兩種腫瘤細(xì)胞類型(IXlO6個(gè)/ΙΟΟμΙ PBS)皮下注射至無(wú)胸腺裸鼠的2個(gè)腹側(cè)以誘導(dǎo)腫瘤。與上述A549模型相似，用CBLB502或作為對(duì)照的PBS處理荷瘤小鼠。結(jié)果證明，重復(fù)施用單獨(dú)的CBLB502僅僅導(dǎo)致H1299-TLR5 (表達(dá)TLR5)腫瘤異種移植物中的腫瘤生長(zhǎng)速率降低，這證明了藥物的直接腫瘤抑制作用。對(duì)H1299(TLR5陰性)顯示，腫瘤生長(zhǎng)不受CBLB502處理影響。圖21中示出了數(shù)據(jù)。
[0191]實(shí)施例9
[0192]該實(shí)施例證明，膀胱組織是CBLB502的強(qiáng)響應(yīng)器。如以上對(duì)肝臟組織所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在皮下注射100 μ I PBS、CBLB502 (0.2mg/kg)或LPS (lmg/kg) 2h后評(píng)估報(bào)告小鼠的肝臟、小腸(回腸部分)、結(jié)腸、脾臟、腎臟、肺和心臟中的NF-kB依賴性螢光素酶表達(dá)。檢測(cè)了每一組3只小鼠體內(nèi)每μ g蛋白質(zhì)提取物的標(biāo)準(zhǔn)化螢光素酶活性。圖22中示出了數(shù)據(jù)。
[0193]實(shí)施例10
[0194]表2示出了小鼠靶器官中CBLB502轉(zhuǎn)錄活化基因的圖譜(示出了膀胱結(jié)果)。注射I和3h后，根據(jù)其功能聚集在用CBLB502處理的小鼠的膀胱中強(qiáng)烈上調(diào)的基因。最大一類由趨化因子、細(xì)胞因子及其受體組成，這表明了先天免疫調(diào)動(dòng)機(jī)制的活化。
[0195]實(shí)施例11
[0196]將不表達(dá)TLR5的CT-26腫瘤細(xì)胞皮下注射至同源BALB/c小鼠中以誘導(dǎo)腫瘤。用CBLB502 (0.04mg/kg,皮下)處理荷瘤小鼠，間隔24h給藥2次。將處理小鼠體內(nèi)的皮下生長(zhǎng)腫瘤的體積與完整小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤的體積作比較。用CBLB502預(yù)處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)任何影響。然后在通過(guò)脾內(nèi)注射表達(dá)螢光素酶的CT-26腫瘤細(xì)胞(圖23B和C)和A20淋巴瘤細(xì)胞(圖23D)，接著進(jìn)行脾切除術(shù)誘導(dǎo)的肝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袦y(cè)試了 CT26腫瘤生長(zhǎng)。處理后每4-6天，使用Xenogen螢光素酶成像來(lái)評(píng)估肝腫瘤生長(zhǎng)。在每個(gè)成像過(guò)程計(jì)數(shù)仍然沒(méi)有肝腫瘤生長(zhǎng)的小鼠。結(jié)果證明，在兩個(gè)腫瘤模型中通過(guò)CBLB502處理防止了腫瘤生長(zhǎng)并顯著延遲了腫瘤出現(xiàn)。肝腫瘤模型(B、C、D)中CBLB502處理組和對(duì)照組之間的差異顯著(對(duì)數(shù)秩Ρ〈0.05)。圖23中示出了數(shù)據(jù)。
[0197]實(shí)施例12
[0198]CBLB502對(duì)Fas介導(dǎo)的肝毒性的防護(hù)。Α.單獨(dú)腹腔注射4 μ g抗Fas抗體或在抗體前30min、2h和6h組合注射CBLB502 (I μ g/只小鼠)后NIH-Swiss小鼠的的存活率。括號(hào)內(nèi)是每次處理小鼠的數(shù)量。B.保護(hù)肝臟免受抗Fas抗體毒性。使用TUNEL技術(shù)檢測(cè)注射抗Fas抗體5h后肝臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡。經(jīng)蘇木精伊紅染色的組織形態(tài)顯示了注射抗Fas抗體對(duì)肝臟的壞死損害和CBLB502的保護(hù)。通過(guò)組織中的紅細(xì)胞浸潤(rùn)、小鼠IgG對(duì)照(紫色)和DAPI細(xì)胞核(藍(lán)色)來(lái)檢測(cè)肝臟出血。圖24中示出了數(shù)據(jù)。
[0199]實(shí)施例13
[0200]保護(hù)肝臟免受TNF- α和LPS毒性。Α.注射TNF_a或LPS5h后檢測(cè)半胱天冬酶3/7并且在注射24h后，在TPS/TNF-a前30min用和未用CBLB502處理的小鼠體內(nèi)檢測(cè)脂質(zhì)氧化(表明炎癥性損傷)。通過(guò)CBLB502注射防止肺中由TNF(lmg/只小鼠)誘導(dǎo)的半胱天冬酶活化和脂質(zhì)氧化。通過(guò)在LPS前30min注射CBLB502完全消除了 LPS(10mg/只小鼠)誘導(dǎo)的損傷效應(yīng)。按處理24h后的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，n=3。如果在h-TNF前30min注射CBLB502，小鼠肝臟中無(wú)半胱天冬酶活化(TNF注射5h后)并且脂質(zhì)氧化少得多(TNF注射24h后，如炎癥性損傷所表明)。B.免疫組織化學(xué)分析(蘇木精伊紅染色)確認(rèn)通過(guò)在TNF-a之前注射CBLB502保護(hù)了肝臟完整性。與完整對(duì)照相比，TNF處理小鼠的肝臟顯示肝細(xì)胞的空泡形成在門(mén)靜脈周稍微更明顯并且依賴于劑量(在TNF0.4mg/只小鼠時(shí)更嚴(yán)重)。在用0.2mg或0.4mg/只小鼠的CBLB502和TNF處理的小鼠肝臟中，變化最小并且盡管仍可見(jiàn)輕微空泡形成，但是肝細(xì)胞接近正常。圖25中示出了數(shù)據(jù)。
[0201]實(shí)施例14[0202]保護(hù)肺免受TNF-a和LPS毒性。與完整對(duì)照相比，TNF處理小鼠的肺顯示肺泡細(xì)胞反應(yīng)性增生、充血、間質(zhì)性水腫和肺泡滲出物，導(dǎo)致氣腔減小，并且改變依賴于劑量(在TNF400時(shí)更嚴(yán)重)。在用200ng或400ng的CBLB502和TNF處理的小鼠的肺中，變化最小。盡管仍可見(jiàn)輕微的肺泡空泡增厚，但是形態(tài)接近正常(圖26B)。如果在LPS(10mg/kg)或h-TNF (0.05mg/kg)前30min注射CBLB502，肺中的脂質(zhì)氧化(表明炎癥性損傷)的水平幾乎正常(圖26A)。圖26中示出了數(shù)據(jù)。
[0203]實(shí)施例15
[0204]通過(guò)注射CBLB502保護(hù)小鼠免于口服致死鼠傷寒沙門(mén)氏菌。圖27中示出了實(shí)驗(yàn)條件。
[0205]實(shí)施例16
[0206]該實(shí)施例證明伊立替康消除了鞭毛蛋白的抗腫瘤作用。圖28中示出了數(shù)據(jù)。用CBLB502 (0.2mg/kg)處理具有皮下生長(zhǎng)的同源Ward結(jié)腸腫瘤的Fischer大鼠,經(jīng)3天腹腔內(nèi)施用CBLB502，每天一次。每次CBLB502注射30min后，靜脈注射伊立替康(200mg/kg)。使用PBS作為媒介物對(duì)照(圖28A)。CBLB502使大鼠免遭伊立替康毒性，伊立替康抗腫瘤活性不受干擾(圖28B)。然而，在伊立替康處理大鼠中未觀察到CBLB502的抗腫瘤作用(圖28C)。這證明，CBLB502的抗腫瘤作用需要足夠的先天免疫水平。
[0207]表2
【權(quán)利要求】
1.一種治療哺乳動(dòng)物的癌癥的方法，其包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑，其中所述癌癥存在于表達(dá)TLR的組織中。
2.一種減少哺乳動(dòng)物的癌癥復(fù)發(fā)的方法，其包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用TLR激動(dòng)劑，其中所述癌癥存在于表達(dá)TLR的組織中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述癌癥復(fù)發(fā)選自轉(zhuǎn)移和腫瘤再生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TLR激動(dòng)劑為鞭毛蛋白。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥不表達(dá)TLR。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TLR為T(mén)LR5。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織選自肝臟、肺、膀胱和腸道。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述癌癥選自黑素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性血液腫瘤。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥為腫瘤。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述惡性血液腫瘤為淋巴瘤。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述激動(dòng)劑作為單一療法施用。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一 項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物未接受聯(lián)合癌癥治療。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物未接受化學(xué)治療或放射治療。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有足夠的先天免疫力。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述足夠的免疫力水平相當(dāng)于適合第一輪或后續(xù)化學(xué)治療所需的水平。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物的白細(xì)胞計(jì)數(shù)在臨床正常范圍內(nèi)。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在切除腫瘤之前、之后或同時(shí)向哺乳動(dòng)物施用所述TLR激動(dòng)劑。
19.一種治療哺乳動(dòng)物的癌癥的方法，其包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用FAS激動(dòng)劑和TLR激動(dòng)劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述TLR激動(dòng)劑為鞭毛蛋白。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述FAS激動(dòng)劑為FAS激動(dòng)劑抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述癌癥為腫瘤。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)移性癌癥不表達(dá)TLR，并且其中所述癌癥已經(jīng)轉(zhuǎn)移到表達(dá)TLR的被侵入組織。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述被侵入組織選自肝臟、膀胱、肺和腸道。
26.一種保護(hù)哺乳動(dòng)物的肝臟組織免受肝毒性影響的方法，其包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用Toll樣受體激動(dòng)劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述毒性選自FAS配體、FAS激動(dòng)性抗體、TNFa、醋氨酚、醇、肝臟的病毒感染和化療劑。
28.一種治療哺乳動(dòng)物的沙門(mén)氏菌感染的方法，包括向有需要的哺乳動(dòng)物施用TLR激動(dòng)劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述TLR激動(dòng)劑為鞭毛蛋白。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述沙門(mén)氏菌為鼠傷寒沙門(mén)氏菌。
31.根據(jù)權(quán)利要求2 8所述的方法，其中所述感染存在于肝臟組織中。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK103476458SQ201280009451
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月10日
【發(fā)明者】A·格雷伯曼, L·伯戴爾亞, A·古德科 申請(qǐng)人:克利夫蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司