調(diào)節(jié)γ-C-細(xì)胞因子活性的組合物及方法
【專利摘要】多種實(shí)施方案涉及γc-家族細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-7（IL-7）、白細(xì)胞介素-9（IL-9）、白細(xì)胞介素-15（IL-15）以及白細(xì)胞介素-21（IL-21）的肽拮抗劑。γc-細(xì)胞因子與重要的人類疾病，例如白血病、自身免疫病、膠原性疾病、糖尿病、皮膚疾病、神經(jīng)退行性疾病和移植物抗宿主病（GvHD）有關(guān)。因此，γc-細(xì)胞因子活性的抑制劑是一種有價(jià)值的治療及化妝品試劑，也是一種有價(jià)值的研究工具。傳統(tǒng)的抑制γc-細(xì)胞因子活性的方法包括產(chǎn)生針對(duì)每單種γc-細(xì)胞因子家族成員/受體亞基的中和抗體。然而，得到的成功非常有限，經(jīng)常有多種γc-細(xì)胞因子家族成員共同引起疾病狀態(tài)。組合使用針對(duì)每種因子得到的中和抗體是不切實(shí)際的，并且增加了不利的免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的實(shí)施方案通過(guò)利用基于與γc-亞基結(jié)合位點(diǎn)一致的肽拮抗劑以抑制γc-細(xì)胞因子活性而克服了這些缺點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】調(diào)節(jié)Y-C-細(xì)胞因子活性的組合物及方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求2011年I月18日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/433，890號(hào)、以及2011年8月24日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/527，049號(hào)的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)的所有內(nèi)容以引用的方式被結(jié)合在本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本實(shí)施方案涉及Y C-家族細(xì)胞因子的肽拮抗劑，Y C-家族細(xì)胞因子是一組哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子，主要由上皮、基質(zhì)和免疫細(xì)胞產(chǎn)生，控制著不同系列的淋巴細(xì)胞的正常及病理性激活。本實(shí)施方案也涉及這些肽在治療某些人類疾病上的治療用途。本實(shí)施方案還涉及這些肽的藥用化妝品應(yīng)用。本文公開(kāi)了這些肽的靶疾病、藥用化妝品應(yīng)用，以及給藥方法、生產(chǎn)以及商業(yè)化的描述。
【背景技術(shù)】
[0004]細(xì)胞因子是一組各種不同的可溶性因子，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，例如生長(zhǎng)、功能分化，以及促進(jìn)或預(yù)防程序性細(xì)胞死亡(凋亡性細(xì)胞死亡)。細(xì)胞因子不同于激素，并非是由分化的腺組織產(chǎn)生，而是可由多種細(xì)胞類型，例如上皮、基質(zhì)或免疫細(xì)胞產(chǎn)生。
[0005]迄今為止已經(jīng)鑒定出了多于100種細(xì)胞因子，被認(rèn)為是從原始基因池中通過(guò)基因復(fù)制的方式發(fā)展而來(lái)(參見(jiàn)Bazan, J.F.1990，Immunol.Today 11:350-354)。為支持這一觀點(diǎn)，一群細(xì)胞因子共有其多亞基受體系統(tǒng)中的一個(gè)組分是很常見(jiàn)的。研究最為充分的T細(xì)胞中共有的細(xì)胞因子亞基為共同的Y亞基(Y C-亞基)。Y C-亞基由6種已知的細(xì)胞因子共有(白細(xì)胞介素_2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素_7(IL_7)、白細(xì)胞介素-9(IL-9)、白細(xì)胞介素-15(IL-15)和白細(xì)胞介素-21 (IL-21),共同稱為“ Y c_細(xì)胞因子”或“Y C-家族細(xì)胞因子”)，在為這些細(xì)胞因子傳遞細(xì)胞激活信號(hào)上發(fā)揮著不可缺少的作用。另外，對(duì)于每一種Y C-細(xì)胞 因子，均有一或兩種私有的細(xì)胞因子-特異性受體亞基，當(dāng)與Y C-亞基復(fù)合時(shí),得到全功能的受體。(參見(jiàn)Rochman等人,2009, Nat Rev Immunol.9:480-90.)
[0006]Y c-家族細(xì)胞因子是一組哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子，主要由上皮、基質(zhì)和免疫細(xì)胞產(chǎn)生，控制著不同系列的淋巴細(xì)胞的正常及病理性激活。在胸腺中T細(xì)胞的早期發(fā)育中以及它們?cè)谕庵艿姆€(wěn)態(tài)中均極為需要這些細(xì)胞因子。例如，如果不含Yc-亞基，則在小鼠中不會(huì)發(fā)育出 T、B 和 NK 細(xì)胞。(參見(jiàn) Sugamura 等人，1996, Annu.Rev.1mmunol.14:179-205)。
[0007]與Y C-細(xì)胞因子相關(guān)的病理學(xué)
[0008]最新研究表明，Y C-細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)節(jié)異常及功能障礙會(huì)導(dǎo)致多種人類免疫學(xué)及造血疾病。
[0009]IL-2
[0010]雖然IL-2曾被認(rèn)為是一種原型T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，但是缺乏IL-2表達(dá)的敲除小鼠的生成顯示IL-2對(duì)體內(nèi)常規(guī)T細(xì)胞的生長(zhǎng)或發(fā)育并非是關(guān)鍵的。然而，IL-2的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的一個(gè)亞類:調(diào)節(jié)T細(xì)胞(T-regs)會(huì)優(yōu)先擴(kuò)張。(參見(jiàn)Antony等人,2006, J.1mmunol.176:5255-65.) T-regs抑制了其他細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而起到維持外周耐受的作用(在Sakaguchi等人，2008，Cell 133:775-87中綜述過(guò))。研究認(rèn)為外周耐受的破壞引起了人類中的自身免疫病。因此，T-regs的免疫抑制功能被認(rèn)為可以預(yù)防自身免疫病的發(fā)生(參見(jiàn)Sakaguchi等人，2008，Celll33:775-87)。T-regs也與癌癥有關(guān)，其中實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤與T-regs的升高的值有關(guān)(參見(jiàn)De Rezende等人,2010, Arch.1mmunol.Ther.Exp.58:179-190)。
[0011]IL-4
[0012]在T輔助細(xì)胞分化成Th2 (T輔助細(xì)胞2型)亞類中IL-4是非豐余的抑制細(xì)胞因子，可以促進(jìn)早熟的B細(xì)胞分化成產(chǎn)生IgE的漿細(xì)胞。在變應(yīng)性哮喘中IgE的水平升高。因此，IL-4與變應(yīng)性哮喘的發(fā)展有關(guān)?？刹捎冒邢蛴贗L-4的抗體治療或甚至預(yù)防變應(yīng)性哮喘的發(fā)作。(參見(jiàn) Le Buanec 等人，2007，Vaccine25:7206-16.)
[0013]IL-7
[0014]IL-7對(duì)于B細(xì)胞發(fā)育及胸腺中T細(xì)胞的早期發(fā)育是必不可少的。在小鼠中，IL-7的表達(dá)異常引起了 T細(xì)胞相關(guān)的白血病。(參見(jiàn)Fisher等人，1993，Leukemia2:S66-68.)然而在人類中，IL-7的誤調(diào)節(jié)似乎不會(huì)引起T細(xì)胞相關(guān)的白血病。在人類中，單獨(dú)或與另一種Yc-細(xì)胞因子家族成員IL-15協(xié)同上調(diào)IL-7與大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)白血病有關(guān)。
[0015]IL-9
[0016]與其他Yc-細(xì)胞因子家族成員相比，IL-9的作用人體相當(dāng)不典型。缺少IL-9基因的小鼠看上去很正常，并且在淋巴和造血隔室中的細(xì)胞中也不缺少任何亞類。然而近期研究顯示，IL-9在生成Thl7 (由白細(xì)胞介素-17誘導(dǎo)的T輔助)細(xì)胞中發(fā)揮體內(nèi)作用(參見(jiàn) Littman 等人，2010，Celll40 (6):845-58 ；以及 Nowak 等人，2009，J.Exp.Med.206:1653-60)。
[0017]IL-15
[0018]IL-15在NK細(xì)胞、NK-T細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IELs)的一些亞類、Y δ-細(xì)胞，以及記憶-表型CD8T-細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中非常關(guān)鍵(參見(jiàn)Waldmann, 2007，J.Cl in.1mmunol.27:1-18 ;和 Tagaya 等人，1996，EMBO J.15:4928-39.)。在小鼠中 IL-15 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致發(fā)育出NK T-細(xì)胞和CD8細(xì)胞型T細(xì)胞白血病(參見(jiàn)Fehniger等人，2001, J.Exp.Med.193:219-31 ;Sato等人,2011Blood in press)。這些實(shí)驗(yàn)上誘導(dǎo)的白血病看上去與人類LGL (大顆粒淋巴細(xì)胞)白血病相似，因?yàn)樵谶@兩者中白血病細(xì)胞均表達(dá)⑶8抗原。
[0019]同樣懷疑IL-15-介導(dǎo)的自分泌機(jī)制可能與⑶4T淋巴細(xì)胞的白血病轉(zhuǎn)化有關(guān)。(參見(jiàn) Azimi 等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sc1.95:2452-7 ;Azimi 等人，1999，J.1mmunol.163:4064-72 ；Azimi 等人，2000，AIDS Res.Hum.Retroviruses 16:1717-22 ;以及Azimi等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.98:14559-64)。例如，引起人類中成人T細(xì)胞白血病的⑶4-向性HTLV-1通過(guò)生成IL-15和IL_15Ra而誘導(dǎo)病毒轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞的自分泌生長(zhǎng)(Azimi 等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sc1.95:2452-7)。
[0020]除白血病轉(zhuǎn)化外，近期的研究暗示了 IL-15在脂瀉病(⑶)，一種自身免疫病的病理性發(fā)展中起作用。已知IL-15會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞溶解酶(B卩，粒酶和穿孔素)以及干擾素-Y的表達(dá)而刺激NK、CD8和小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)分化成淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞。脂瀉病(本文中以CD表示)是一種免疫介導(dǎo)的腸病，在表達(dá)特異性的HLA-DQ等位基因的個(gè)體中由食用含谷蛋白的食物而引起。在西方人群中該病的發(fā)病率為1%。目前對(duì)CD唯一的治療是從患者的飲食中徹底除去谷蛋白。CD的病理學(xué)主要是由對(duì)腸粘膜的大面積損壞而造成，這是由激活的CD8T細(xì)胞滲透到小腸固有層而引起的。這些CD8T細(xì)胞似乎是通過(guò)涉及IL-15的機(jī)制而被激活的。最近的一篇出版物顯示，在小鼠中由腸上皮細(xì)胞異位過(guò)表達(dá)IL-15導(dǎo)致了腸病的發(fā)生，這與⑶患者中的損害非常類似。中和IL-15的活性顯著降低了病理變化。因此，通過(guò)IL-15介入阻斷⑶8T細(xì)胞的激活看上去提供了相對(duì)于常規(guī)的無(wú)谷蛋白飲食而應(yīng)對(duì)CD的一種可選的策略。
[0021]IL-21
[0022]IL-21是Yc-家族中最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成員。不同于其他家族成員，IL-21看上去并不具有強(qiáng)力的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。相反，IL-21被認(rèn)為相比于控制細(xì)胞增殖的因子而更多地起到分化因子的作用(參見(jiàn) Tagaya, 2010，J.Leuk.Biol.87:13-15)。
[0023]當(dāng)前治療Y C-細(xì)胞因子-介導(dǎo)的紊亂的策略
[0024]由于Y C-細(xì)胞因子被認(rèn)為涉及到多種人類疾病，現(xiàn)在已經(jīng)給出了幾種通過(guò)抑制
YC-細(xì)胞因子家族活性而治療Y C-細(xì)胞因子相關(guān)疾病的方法。這些方法包括在體內(nèi)使用細(xì)胞因子-特異性的單克隆抗體中和靶向的細(xì)胞因子的活性；使用靶向于私有的細(xì)胞因子-特異性的受體亞基(除共有的Y C-亞基外的亞基)的單克隆抗體以選擇性抑制細(xì)胞因子的活性；以及使用阻斷下游的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化學(xué)抑制劑。雖然細(xì)胞因子-特異性抗體通常為在設(shè)計(jì)治療方法上的第一選擇，但共有受體組分的細(xì)胞因子顯示出重疊的功能(參見(jiàn)Paul，w.E.，1989，Cell57:521-24)，并且多于一種細(xì)胞因子可協(xié)作引起疾病(參見(jiàn)下文所述的例子)。因此，涉及中和單種細(xì)胞因子的方法在治療細(xì)胞因子相關(guān)的人類疾病中可能并不有效。
[0025]也提出過(guò)通過(guò)識(shí)別共有 的受體組分的抗體而抑制多種細(xì)胞因子的功能的設(shè)計(jì)治療方法的策略。然而，細(xì)胞因子受體系統(tǒng)多亞基的特性及單種細(xì)胞因子的功能受體能夠采用不同構(gòu)型的事實(shí)使得這一方法非常困難。例如，功能性IL-15受體既可以為IL-15Ri3/Yc，也可以為 IL-15Ra/3"c。(參見(jiàn) Dubois 等人，2002，Immunityl7:537-47.)IL_15R3受體的抗體(ΤΜβ I)是IL-15功能的一種高效的抑制劑，但只有在受體復(fù)合物中不含IL-15Ra 分子的時(shí)候才是如此。(參見(jiàn) Tanaka 等人，1991，J.1mmunol.147:2222 - 28.)因此，不管是針對(duì)共有的還是私有的亞基，單克隆抗受體抗體的效力在體內(nèi)都是取決于背景的且是不可預(yù)見(jiàn)的。
[0026]雖然將單克隆抗體用于針對(duì)與疾病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)的生物學(xué)活性因子或受體的臨床用途是一種慣例，但很少有成功的案例。此外，確定一種適于臨床的單克隆抗體治療方法是一個(gè)非常漫長(zhǎng)及困難的過(guò)程，成功生成中和抗體大部分是運(yùn)氣的成分。例如，由于
YC-亞基在通過(guò)Y C-家族細(xì)胞因子介導(dǎo)信號(hào)通路的極端重要性，已經(jīng)付出了很多努力以生成針對(duì)Y C-亞基的多克隆和單克隆抗體，目前有一些識(shí)別小鼠和人的Y C-亞基的商業(yè)化抗體。然而很奇怪地，這些抗Y C-亞基抗體中沒(méi)有一種能夠阻斷Y C-細(xì)胞因子的功能。
[0027]單克隆抗體的治療用途的另一個(gè)問(wèn)題在于單克隆抗體通常是用人類蛋白使嚙齒類免疫產(chǎn)生的，因此所生成的抗體是異種蛋白，因此高度致免疫。為了規(guī)避這一問(wèn)題，對(duì)單克隆抗體的氨基酸序列進(jìn)行了分子改良，使得抗體分子被識(shí)別為人源免疫球蛋白(一種稱為人源化的過(guò)程)，但這一過(guò)程需要時(shí)間和費(fèi)用。
[0028]靶向于JAK3，一種抑制多種Y C-細(xì)胞因子的現(xiàn)有的可選示例
[0029]y C-亞基和Y C-細(xì)胞因子間的相互作用導(dǎo)致一種稱為Janus激酶3 (Jak3)的細(xì)胞內(nèi)蛋白酪胺酸激酶的激活。Jak3反過(guò)來(lái)將多種信號(hào)分子包括STAT5和PI3激酶磷酸化。Y C-亞基與Jak3的相互作用非常特異。實(shí)際上，沒(méi)有其他的受體分子需要Jak3進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。(參見(jiàn) O，Shea, 2004, Ann.Rheum.Dis.63: (suppl.1I):1i67_7.)因此，可以通過(guò)阻斷Jak3激酶的活性而通過(guò)Y C-亞基抑制細(xì)胞因子信號(hào)。因此，市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了靶向于Jak3激酶活性的多種化學(xué)抑制劑。(參見(jiàn)Pesu等人，2008, Immunol.Rev.223:132-142.)一種這樣的例子為CP690, 550。
[0030]這些蛋白激酶抑制劑的主要缺點(diǎn)是缺乏對(duì)Jak3激酶的特異性。這些藥物阻斷了ATP (腺苷-三磷酸)分子與Jak3激酶的結(jié)合，這是一種對(duì)許多蛋白激酶共同的生化反應(yīng)，因此可能會(huì)阻斷與Jak3激酶無(wú)關(guān)、其作用對(duì)于各種組織中的正常細(xì)胞的健康極為需要的多種細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的作用。因此，需要對(duì)于通過(guò)Y C-亞基的信號(hào)傳遞更為特異性的抑制劑。
[0031]因此，對(duì)于治療Y C-細(xì)胞因子相關(guān)的疾病的另外一種可供選擇的策略具有很大需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0032]一個(gè)實(shí)施方案涉及被分離或純化的肽，基本上由19-元氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)所組成(在本文中被稱為 “BNZ-Y ”)。
[0033]另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)一種或多種Y C-細(xì)胞因子家族成員而阻斷信號(hào)傳遞的方法，包括將細(xì)胞與基本上由氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQID NO:1)組成的被分離或純化的 肽接觸。
[0034]另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)一種或多種Y C-細(xì)胞因子家族成員而阻斷信號(hào)傳遞的方法，包括將細(xì)胞與基本上由氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQID NO:1)組成的被分離或純化的肽接觸，其中所述細(xì)胞為免疫細(xì)胞。
[0035]另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)一種或多種Y C-細(xì)胞因子家族成員而阻斷信號(hào)傳遞的方法，包括將細(xì)胞與基本上由氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQID NO:1)組成的被分離或純化的肽接觸，其中所述Y C-細(xì)胞因子家族成員選自由IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 或 IL-21 組成的組。
[0036]另一個(gè)實(shí)施方案涉及由氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S(SEQ ID NO:1)組成的肽的衍生肽，其中所述衍生肽具有與由氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)組成的肽相似的理化性質(zhì)，但衍生肽具有不同的生物活性。
[0037]另一個(gè)實(shí)施方案涉及定制肽(custom peptide),其中所述定制肽的氨基酸序列通過(guò)保守置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而不同于氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)。
[0038]另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種定制肽，基本上由19-元氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)組成。[0039]另一個(gè)實(shí)施方案涉及定制肽，其中所述定制肽的氨基酸序列通過(guò)將6-位的谷氨酰胺(Q)用另一種極性氨基酸取代而不同于氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)。
[0040]另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種定制肽，其中定制肽的氨基酸序列通過(guò)用與含序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的氨基酸具有相似的生化特性的一種或多種氨基酸取代而不同于氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S( SEQID NO:1)。
[0041]另一個(gè)實(shí)施方案涉及氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S 的定制肽衍生物，其中定制肽的氨基酸序列與氨基酸序列為1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的肽具有相似的理化性質(zhì)，但具有不同的生物活性，其中定制肽的氨基酸序列與氨基酸序列 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)共有至少50%的序列同源性。
[0042]另一個(gè)實(shí)施方案涉及基本上由氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)組成的肽與現(xiàn)有的生物學(xué)蛋白/肽的N末端、C末端和/或側(cè)鏈殘基的結(jié)合用于在體內(nèi)高效遞送和改善生物學(xué)穩(wěn)定性。這種結(jié)合的例子為BSA、白蛋白、IgG的Fe域、起到支架作用的其他生物學(xué)蛋白、不同分子量的聚乙二醇或(PEG)或其他相似的部分。
[0043]另一個(gè)實(shí)施方案涉及氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQID NO:1)的定制肽衍生物與現(xiàn)有的生物學(xué)蛋白/肽的N末端、C末端和/或側(cè)鏈殘基的結(jié)合，其中定制肽的氨基酸序列與氨基酸序列為1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S(SEQ ID NO:1)的肽具有相似的理化性質(zhì)，但具有不同的生物活性，其中定制肽的氨基酸序列與氨基酸序列 1-K-`E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)共有至少 50%的序列同源性。這種結(jié)合的例子為白蛋白、IgG的Fe域、起到支架作用的其他生物學(xué)蛋白、不同分子量的或聚乙二醇或(PEG)或其他相似的部分。
[0044]另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種抑制Y C-細(xì)胞因子活性的方法，包括將Y C-細(xì)胞因子與基本上由氨基酸序列 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)組成的肽進(jìn)行接觸。
[0045]另一個(gè)實(shí)施方案涉及針對(duì)含氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的免疫原性肽得到的多克隆和單克隆抗體。
[0046]另一個(gè)實(shí)施方案涉及針對(duì)氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S(SEQ ID NO:1)的定制肽衍生物得到的多克隆和單克隆抗體，其中定制肽的氨基酸序列與氨基酸序列為 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的肽具有相似的理化性質(zhì)，但具有不同的生物活性，其中定制肽的氨基酸序列與氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)共有至少 50% 的序列同源性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0047]圖1A示出了人類Y C-細(xì)胞因子家族成員的D螺旋域的比對(duì)。
[0048]圖1B描述了得到Y(jié)c-細(xì)胞因子的D螺旋域附近的共有序列的Yc盒及IL-2/IL-15盒基序。[0049]圖2描述了表示氨基酸的生化特性的圖示。
[0050]圖3A顯示了在PT-18增殖試驗(yàn)中BNZ- Y對(duì)IL-2、IL-15和IL-9活性的抑制。
[0051]圖3B顯示了在含IL-2或IL-15以及0、0.1、I或IOuM BNZ-y下生長(zhǎng)的CTTL2細(xì)胞的增殖試驗(yàn)。
[0052]圖3C顯示了由BNZ- Y抑制IL-15-介導(dǎo)的酪氨酸-磷酸化。
[0053]圖4A顯示了使用HAM/TSP外周血進(jìn)行的來(lái)自體內(nèi)的T-細(xì)胞增殖試驗(yàn)。T-細(xì)胞增殖通過(guò)加入BNZ-Y而被抑制。
[0054]圖4B顯示，在使用HAM/TSP外周血的來(lái)自體內(nèi)的T-細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，⑶4+⑶25+細(xì)胞的群在向培養(yǎng)物中加入BNZ-Y后而被減小。
[0055]圖4C顯示，在使用HAM/TSP外周血的來(lái)自體內(nèi)的T-細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，⑶4+Ki67細(xì)胞的群在向培養(yǎng)物中加入BNZ-Y后而被減小。
[0056]圖4D顯示，在使用HAM/TSP外周血的來(lái)自體內(nèi)的T-細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，通過(guò)Guava染色的活細(xì)胞的百分率在向培養(yǎng)物中加入BNZ-Y后并未受影響。
【具體實(shí)施方式】
[0057]綜沭
[0058]在構(gòu)成免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞，特別是T、B和NK細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，Y C-細(xì)胞因子是重要的一員。此外，Y C-細(xì)胞因子與多種人類疾病有關(guān)。因此，抑制Yc-細(xì)胞因子活性的因子可提供有用的工具用于闡明淋巴細(xì)胞亞類的發(fā)育機(jī)制以及治療免疫功能紊亂和
YC-細(xì)胞因子-介導(dǎo)的疾 病。
[0059]已知在小鼠中編碼Y C-亞基的基因的種系缺失或在人類中Y C-亞基的突變通過(guò)破壞NK、T和B細(xì)胞的正常出現(xiàn)或功能而引起了嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)。在顯示從這些小鼠及人類患者中淋巴細(xì)胞對(duì)Y C-細(xì)胞因子的應(yīng)答的研究中指出了 Y C-亞基在Y C-細(xì)胞因子，IL-2、-4、-7、-9、-15、-21的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性(在Sugamura等人，1995Adv.1mmunol.59:225-277中綜述過(guò))。這表明破壞Y c_亞基與Y c_細(xì)胞因子之間的相互作用會(huì)通過(guò)Y C-細(xì)胞因子家族成員而有效阻斷細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞事件。因此按照本文的實(shí)施方案的拮抗劑肽被認(rèn)為會(huì)有效地阻斷罹患由Y C-細(xì)胞因子家族成員的誤調(diào)控介導(dǎo)的疾病的人類中的病原性變化。
[0060]作為調(diào)節(jié)單種Y C-細(xì)胞因子活性的抗體-介導(dǎo)的方法的一種替換方法， 申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了一種在本文中稱為“同時(shí)-阻斷(Simul-Block)”的新型低分子量的化合物，可抑制多種Y C-細(xì)胞因子的活性。這些低分子量化合物包括化合物和肽兩者，比抗體具有更低的免疫原性。這些特性顯示同時(shí)-阻斷是一種在臨床介入中調(diào)節(jié)Y C-細(xì)胞因子活性的更為高效的策略。
[0061]Y C-盒的發(fā)現(xiàn)
[0062]Y C-細(xì)胞因子的C末端(D螺旋)含有所建議的用于與多單位細(xì)胞因子受體的共同的Y C-亞基發(fā)生相互作用的位點(diǎn)。(Bernard等人,2004J.Biol.Chem.279:24313-21.)通過(guò)對(duì)小鼠和人類中所識(shí)別的所有的Y C-細(xì)胞因子的氨基酸的生化特性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示在Y C-細(xì)胞因子家族成員中的D螺旋的許多位點(diǎn)處，氨基酸的化學(xué)性質(zhì)，例如疏水性、親水性、堿/酸性，如果不相同，也是保守的。相反，與Y C-細(xì)胞因子IL-4相關(guān)但不與Y C-亞基結(jié)合的IL-13的序列并不表現(xiàn)出與Y C-細(xì)胞因子的D螺旋域顯著的同源性，這表明D螺旋域中的序列同源性與和Yc-亞基結(jié)合相關(guān)。如圖1所示，人類中Yc-細(xì)胞因子家族成員的D螺旋域的氨基酸序列的比對(duì)顯示了在這些細(xì)胞因子中的中等序列同源性的基序，在本文中被稱為“ Y C-盒”。
[0063]Y C-盒包括19個(gè)氨基酸，其中在這19個(gè)位點(diǎn)中，位點(diǎn)4、5和13分別為完全保守的苯丙氨酸、亮氨酸和天冬酰胺。在Yc-盒的第6、7和11位觀察到保守性較差，其中氨基酸為共有理化性質(zhì)的兩種或三種相關(guān)氨基酸中的一種--第6位可由極性氨基酸谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺所占據(jù)；非極性氨基酸絲氨酸或精氨酸可占據(jù)第7位；第11位可由非極性脂肪族氨基酸亮氨酸或異亮氨酸所占據(jù)。第9位和第16位可由非極性氨基酸異亮氨酸或極性氨基酸賴氨酸所占據(jù)。參見(jiàn)圖1B。在Y C-細(xì)胞因子亞家族中，在第9和16位觀察到了 Y C-盒的氨基酸組成上的一些差異。各種類間的Yc-細(xì)胞因子的對(duì)比表明，在IL-2/15亞家族中異亮氨酸出現(xiàn)在第9和6位，而另一種Y C-家族成員(例如IL-4、IL-21)在這些位點(diǎn)處具有賴氨酸。并非希望受限于某一具體理論，異亮氨酸和賴氨酸是生化不同的，因此有可能使IL-2/15亞家族和其他Y C-細(xì)胞因子之間具有特異的構(gòu)象差異。
[0064]位于D螺旋域中的天冬酰胺(Asn，Q)殘基對(duì)Y c-細(xì)胞因子結(jié)合到Y(jié) c-亞基上很關(guān)鍵這一研究結(jié)果支持了 Y C-細(xì)胞因子間Y C-盒基序的保守性。(Bernard等人,2004J.Biol.Chem.279:24313-21.)
[0065]Y C-細(xì)胞因子活性的肽抑制劑
[0066]Y C-家族細(xì)胞因子的活性可通過(guò)破壞Y C-細(xì)胞因子和Y C-亞基之間的相互作用，例如通過(guò)引入能與Y C-亞基發(fā)生相互作用而不會(huì)通過(guò)多亞基細(xì)胞因子受體刺激信號(hào)傳遞的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑而被阻斷。并非是受限于某一具體理論，參與Y C-家族細(xì)胞因子結(jié)合到Y(jié) C-亞基中的保守的Y C-盒基序含有一個(gè)核心堿性氨基酸序列，可被用于設(shè)計(jì)Y C-細(xì)胞因子信號(hào)傳遞的肽抑制劑。
[0067]核心Y C-盒氨 基酸序列包括:D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-1/K-X-L/1-X-Q (SEQ IDNO: 2)(其中X表示任意氨基酸)。本文所描述的實(shí)施方案涉及能夠抑制一種或多種Yc-細(xì)胞因子的活性的核心Y C-盒氨基酸序列的定制肽衍生物。定制肽衍生物包括其部分氨基酸序列與核心Y C-盒氨基酸序列表現(xiàn)出大約50%、50-60%、60-70%、70-80%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或99.8%同一性的任何肽。定制肽衍生物進(jìn)一步包括該肽衍生物的部分氨基酸序列包括與核心Y C-盒的氨基酸具有相似理化性質(zhì)的氨基酸的任意肽。例如，具有相似理化性質(zhì)的氨基酸可以包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸，均為芳香族氨基酸。圖2給出了具有相似理化性質(zhì)的氨基酸的圖示，其可被用于替換含核心Yc-盒的氨基酸。核心 Y C-盒的肽衍生物的長(zhǎng)度可以為 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50或多于50個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，定制肽衍生物可以結(jié)合到現(xiàn)有的生物學(xué)蛋白/肽的N末端、C末端或結(jié)合到其側(cè)鏈殘基上。
[0068]基于對(duì)細(xì)胞因子中與Y C-亞基結(jié)合的保守Y C-盒基序的鑒定， 申請(qǐng)人:設(shè)計(jì)了一種新型的19-元定制衍生肽，這是一種人工合成的肽，與人源IL-2和IL-15YC-盒的氨基酸序列結(jié)合。該19-元肽，在本文 中稱為BNZ- Y，由氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-S-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)組成，其中以黑體字顯示的氨基酸在IL-2和IL-15之間是保守的，帶下劃線的氨基酸表示氨基酸的理化性質(zhì)是保守的位點(diǎn)。[0069] 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)，19-元BNZ- Y抑制IL-15和IL-19誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，但不抑制IL_2或IL-4誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。參見(jiàn)圖3A和實(shí)施例2。 申請(qǐng)人:進(jìn)一步證明，BNZ-Y抑制IL-15介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT-5的磷酸化。參見(jiàn)圖3C和實(shí)施例5。這些結(jié)果證明，保守的Y C-盒基序的定制肽衍生物能夠抑制多種Yc-細(xì)胞因子的活性。
[0070]多個(gè)實(shí)施方案涉及19-元 BNZ- Y 氨基酸序列 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的定制衍生肽，其能夠抑制一種或多種Yc-細(xì)胞因子的活性。19-元BNZ-Y氨基酸序列的定制肽衍生物包括其部分氨基酸序列與氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)表現(xiàn)出大約 50%、50-60%、60-70%、70_80%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或99.8%同一性的任意肽。定制肽衍生物進(jìn)一步包括該肽衍生物的部分氨基酸序列包括與序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ IDNO:1)的氨基酸具有相似理化性質(zhì)的氨基酸的任意肽。在多個(gè)實(shí)施方案中，定制衍生肽的氨基酸殘基具有與BNZ-Y的氨基酸殘基相似的理化性質(zhì)，但表現(xiàn)出與原始19-元肽不同的對(duì)6 Y C-細(xì)胞因子家族成員的生物學(xué)抑制特異性。BNZ-Y的肽衍生物的長(zhǎng)度可以為19、20、
21、22、24、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50或多于50個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，定制肽衍生物可以結(jié)合到現(xiàn)有的生物學(xué)蛋白/肽的N末端、C末端或結(jié)合到其側(cè)鏈殘基上。
[0071]多個(gè)實(shí)施方案涉及IL-5、IL-2、IL-21、IL_4、IL-9或IL-7的\ c_盒基序的定制肽衍生物，這在圖1A中進(jìn)行了描述。其他實(shí)施方案涉及的定制衍生肽為將人源IL-5、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9和IL_7 y c-盒基序中的兩種或更多種的氨基酸序列結(jié)合起來(lái)的人工復(fù)合肽。多個(gè)實(shí)施方案涉及的IL-5、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9或IL-7的Yc-盒基序的定制肽衍生物的部分氨基酸序列表現(xiàn)出與IL-5、IL-2、IL-21、IL_4、IL-9或IL-7的、c-盒基序的氨基酸序列具有大約 50%、50-60%、60-70%、70-80%、80%、90%、95%、97%、98%、99% 或 99.8%的同一性。IL-5、IL-2、IL-21、IL-4、IL-9或IL-7的Y c_盒基序的定制肽衍生物進(jìn)一步包括該肽衍生物的部分氨基酸序列包括與IL-5、IL-2、IL-21、IL_4、IL-9或IL-7的Y c_盒基序的序列的氨基酸具有相`似理化性質(zhì)的氨基酸的任意肽。
[0072]多個(gè)實(shí)施方案涉及的定制肽衍生物可以抑制Y C-細(xì)胞因子中的一個(gè)、所有或選擇的成員的功能。在一些實(shí)施方案中，定制肽衍生物選擇性地靶向于單個(gè)Y C-細(xì)胞因子家族成員。例如，定制肽衍生物能夠選擇性地抑制IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15或IL-21的功能。在其他實(shí)施方案中，定制肽衍生物能夠抑制2種或更多種Y C-細(xì)胞因子家族成員。例如，本文的實(shí)施方案的定制肽衍生物能夠選擇性地抑制IL-2連同IL-4、IL-7、IL_9、IL-15和IL-21中的一種或多種的功能；IL-4連同IL-7、IL-9、IL-15和IL-21中的一種或多種的功能；IL-7連同IL-9、IL-15和IL-21中的一種或多種的功能；IL_9連同IL-2、IL-4、IL-7、IL-15和IL-21中的一種或多種的功能；IL-15連同IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21中的一種或多種的功能；或IL-21連同IL-2、IL-4、IL_7、IL-9和IL-15中的一種或多種的功能。在其他實(shí)施方案中，定制肽衍生物能夠全面地靶向于所有的Yc-細(xì)胞因子家族成員。并非希望受限于某一具體理論，定制肽衍生物能夠通過(guò)減少Y C-細(xì)胞因子與Y C-亞基的結(jié)合而抑制Yc-細(xì)胞因子的所有成員或選擇的成員的功能，例如，可以為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。這種定制肽衍生物可被用于多種應(yīng)用，包括作為臨床用藥。
[0073]當(dāng)指代與本發(fā)明的實(shí)施方案所提供的定制肽衍生物時(shí)，術(shù)語(yǔ)“寡肽”、“多肽”、“肽”和“蛋白”能夠互換使用并且能夠用于指定任意長(zhǎng)度的一系列氨基酸殘基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的肽也可包括非自然的氨基酸。連接子元件能夠通過(guò)肽鍵或通過(guò)化學(xué)鍵與本發(fā)明的實(shí)施方案的肽連接。本發(fā)明的實(shí)施方案的肽可以是線性或環(huán)狀的，并且可以包括(D)及(L)氨基酸。本發(fā)明的實(shí)施方案的肽也可包含一種或多種稀有氨基酸(例如4羥脯氨酸或羥賴氨酸)，常見(jiàn)氨基酸的有機(jī)酸或酰胺和/或衍生物，例如C末端羧酸酯化(例如苯甲酯、甲酯或乙酯)或酰胺化和/或?qū)末端氨基具有修飾(例如乙酰化或烷氧羰基氨基化)的氨基酸，含或不含任意多種側(cè)鏈修飾和/或取代(例如，甲基化、芐化、叔丁基化、甲苯磺?；⑼檠豸驶被鹊??？赡芎械某Ｒ?jiàn)氨基酸外的殘基包括但不局限于青霉胺、四亞甲基半胱氨酸、環(huán)戊烷半胱氨酸、巰基丙酸、環(huán)戊烷-巰基丙酸、2-巰基苯、2-巰基苯胺、2-巰基脯氨酸、鳥(niǎo)氨酸、二氨基丁酸、氨基已二酸、間-氨甲基苯甲酸和二氨基丙酸。
[0074]可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法制造和獲得本發(fā)明的實(shí)施方案的肽。例如，肽可以通過(guò)基因工程，基于編碼本發(fā)明的實(shí)施方案的肽的核苷酸序列而制造出，或者是通過(guò)化學(xué)合成，依靠肽固相合成等等而制造出，或者通過(guò)它們的組合而制造并得到。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于本發(fā)明的保守的Y C-盒基序以及在圖2中描述的氨基酸的生化特性的知識(shí)合成定制肽衍生物。一些實(shí)施方案還涉及含編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列的多核苷酸。“核苷酸序列”、“多核苷酸”或“核酸”能夠互換使用，并且被理解為指的是雙鏈DNA、單鏈DNA或所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如RNA分子)。多核苷酸可被施用到細(xì)胞或受試者中并由細(xì)胞或受試者表達(dá)，而非施用肽本身。多個(gè)實(shí)施方案還涉及包括編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸序列的基因構(gòu)件?；驑?gòu)件也可包括其他調(diào)控元件例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及任選地，選擇性標(biāo)記物。
[0075]治療Y C-細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病的方法
[0076]多個(gè)實(shí)施方案涉及Y C-拮抗劑肽在治療Y C-細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病中的用途。使用按照本發(fā)明的實(shí)施方案定制`肽衍生物使得可以靈活設(shè)計(jì)治療制劑(肽的定制設(shè)計(jì))，能夠得到更綜合的結(jié)果，這是由使用抗細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子受體抗體的常規(guī)策略所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。
[0077]本文所描述的是一種阻斷Y C-家族細(xì)胞因子的作用的新型方法。這樣的操作可以得到一種很有效的臨床介入治療與Y C-細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)異常或功能障礙有關(guān)的疾病的方法。可通過(guò)破壞Y C-細(xì)胞因子與Y C-亞基之間的相互作用而治療的疾病的例子包括自身免疫病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、韋格納肉芽腫痛、脂瀉病、橋本或自免疫甲狀腺炎；膠原性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、糖尿病、自身免疫皮膚病例如牛皮癬；退行性神經(jīng)疾病例如多發(fā)性硬化、眼睛的葡萄膜炎或炎癥以及交感性眼炎、移植物抗宿主病(GvHD)和重癥肌無(wú)力。
[0078]在一些實(shí)施方案中，本文所描述的Y C-拮抗劑肽可被用于治療1-人源T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞的I型和II型(HTLV-1和HTLV-1I)-相關(guān)的疾病，包括成人T細(xì)胞性白血病(ATL)、HTLV-相關(guān)的脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱(HAM/TSP)，以及與HTLV相關(guān)的其他非腫瘤的炎性疾病例如葡萄膜炎(HU)、關(guān)節(jié)病、肺病、皮炎、外分泌腺體病和肌炎。在一些實(shí)施方案中，本文所描述的Y C-拮抗劑肽可被用于治療其他病毒性疾病例如流感、艾滋病、HBV和皰疹或寄生蟲(chóng)病。
[0079]在多個(gè)實(shí)施方案中，Y C-拮抗劑肽可以作為免疫抑制劑而在移植多種器官之前、期間或之后施用。[0080]在一些實(shí)施方案中，本文所描述的Y C-拮抗劑肽可被用于治療免疫介導(dǎo)的疾病例如哮喘和其他炎性的呼吸道疾病，例如但不局限于鼻竇炎、花粉熱、支氣管炎、慢性阻塞性肺病(C0PD)、變應(yīng)性鼻炎、急性和慢性耳炎、肺纖維化。在一些實(shí)施方案中，可以施用
YC-拮抗劑肽以治療或預(yù)防由于接觸過(guò)敏原、化學(xué)試劑或急性呼吸道疾病的其他常見(jiàn)病因的變態(tài)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，Yc-拮抗劑肽可被施用以治療或預(yù)防由病毒、細(xì)菌、化學(xué)試劑和生化試劑引起的炎癥反應(yīng)。
[0081]在多個(gè)實(shí)施方案中，Y C-拮抗劑肽可被施用以治療有些類型的惡性腫瘤例如LGL白血病、上皮內(nèi)淋巴瘤和頑固性脂瀉病中的白血病、NK白血病/淋巴瘤和NK-T白血病/淋巴瘤。
[0082]在一些實(shí)施方案中，按照本文所描述的實(shí)施方案的定制肽衍生物由于其抗炎特性而可被用于化妝品的用途，例如治療痤瘡、脫發(fā)、曬黑和指甲保養(yǎng)，包括用作抗老化組分的軟膏。
[0083]多個(gè)實(shí)施方案涉及的治療用拮抗劑肽可以抑制Y C-細(xì)胞因子的所有或選擇的成員的功能。在一些實(shí)施方案中，治療用拮抗劑肽選擇性地抑制了單個(gè)Yc-細(xì)胞因子家族成員(定制肽)。在其他實(shí)施方案中，治療用拮抗劑肽能夠全面抑制所有的Y C-細(xì)胞因子家族成員(同時(shí)-阻斷)。在一些實(shí)施方案中，治療用拮抗劑肽選擇性地抑制了 Y C-細(xì)胞因子的亞類。并非希望受限于某一具體理論，肽拮抗劑能夠通過(guò)減少Y C-細(xì)胞因子與Y C-亞基的結(jié)合而抑制Y C-細(xì)胞因子的所有成員或選擇的成員的功能，例如，可以為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
[0084]在實(shí)驗(yàn)小鼠模型中，￥(3-細(xì)胞因子家族的多個(gè)成員，11^-2、11^-7和11^-15而非11^-4與移植物抗宿主病(GvHD)相關(guān)聯(lián)。(Miyagawa 等人,2008J.1mmunol.181:1109-19.) 一個(gè)實(shí)施方案涉及使用選擇性抑制IL-2、IL-7和IL-15活性的治療用拮抗劑肽以治療人類中的GvHD，使得移植的組織或骨髓細(xì)胞存活下來(lái)。其他實(shí)施方案涉及使用選擇性抑制IL-2和IL-7、IL-2和IL-15，或IL-7 和IL-15的組合的治療用拮抗劑肽以治療GvHD。其他實(shí)施方案涉及使用選擇性抑制IL-2、IL-7或IL-15的治療用拮抗劑肽的組合。
[0085]一些實(shí)施方案涉及使用選擇性抑制IL-2功能的治療用拮抗劑肽以治療T-regs發(fā)揮作用的自身免疫病。在一些實(shí)施方案中，肽介導(dǎo)的T-regs的抑制能夠增強(qiáng)人類中天然的抗癌免疫力，這提供了一種新型的抗癌治療方法。
[0086]多個(gè)實(shí)施方案涉及使用選擇性抑制IL-4的治療用拮抗劑肽以治療哮喘。
[0087]一些實(shí)施方案涉及使用單獨(dú)選擇性抑制IL-7的治療用拮抗劑肽或與選擇性抑制
YC-細(xì)胞因子家族成員IL-15的治療用拮抗劑肽結(jié)合用作LGL白血病的治療試劑。在一些實(shí)施方案中，選擇性抑制IL-7和IL-15兩者活性的治療用拮抗劑肽可被用于治療LGL白血病。多個(gè)實(shí)施方案涉及將BNZ-Y用于治療LGL白血病。在一些實(shí)施方案中，僅選擇IL-15的特異性Y C-拮抗劑肽或者選擇IL-15和IL-7的特異性Y C-拮抗劑肽被用作⑶4/⑶8T淋巴細(xì)胞相關(guān)的白血病包括由HTLV-1所引起的白血病的治療劑。
[0088]多個(gè)實(shí)施方案涉及將單獨(dú)選擇性抑制IL-9活性的Y C-拮抗劑肽或與另一種
YC-細(xì)胞因子家族成員結(jié)合用作涉及Thl7細(xì)胞發(fā)育異常的人類疾病的治療劑。
[0089]多個(gè)實(shí)施方案涉及將選擇性抑制IL-15活性的治療用拮抗劑肽用作治療CD的治療劑。一篇最近的出版文章表明除IL-15外，IL-21可能在⑶的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮作用。(參見(jiàn)Bodd等人,2010，Mucosal Immunol.3:594-601.)這表明，通過(guò)常規(guī)的抗-細(xì)胞因子或細(xì)胞因子-受體抗體對(duì)⑶的最佳的治療會(huì)受益于屬于IL-15和IL-21系統(tǒng)的至少兩種抗體識(shí)別組分的組合。在一些實(shí)施方案中，將選擇性抑制IL-15和IL-21 二者活性的定制衍生物拮抗劑肽用作治療CD的治療劑。
[0090]除具有治療應(yīng)用外，Y C-拮抗劑肽還可用于消費(fèi)產(chǎn)品中。多個(gè)實(shí)施方案涉及
YC-拮抗劑肽用于護(hù)膚品中，例如抗老化、抗炎、抗痤瘡和其他相關(guān)的應(yīng)用。一些實(shí)施方案涉及Y C-拮抗劑肽在護(hù)發(fā)產(chǎn)品中作為抗脫發(fā)成分以治療由自身免疫紊亂造成的脫發(fā)的應(yīng)用。
[0091]另一個(gè)實(shí)施方案涉及開(kāi)發(fā)立體結(jié)構(gòu)與19-元氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的類似并且能夠裝進(jìn)Y c_亞基的口袋中以從結(jié)構(gòu)上阻礙Yc-細(xì)胞因子與Yc-亞基結(jié)合的化合物(非肽，非蛋白)。一些實(shí)施方案涉及將結(jié)構(gòu)上類似的化合物用作Y C-細(xì)胞因子活性的抑制劑。這種進(jìn)一步改進(jìn)在結(jié)構(gòu)上與現(xiàn)有的生物學(xué)肽/蛋白相似的合成的化合物的開(kāi)發(fā)的分子模擬策略在Orzaez等人，2009Chem.Med.Chem.4:146-160中描述過(guò)。另一個(gè)實(shí)施方案涉及施用與19-元氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)具有相似的3D結(jié)構(gòu)的化合物(非肽，非蛋白)以治療Y C-細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病。
[0092]多個(gè)實(shí)施方案涉及施用氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S(SEQ ID NO:1)的肽以治療Y C-細(xì)胞因子-介導(dǎo)的疾病。另一個(gè)實(shí)施方案涉及施用氨基酸序列 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S(SEQ ID NO:1)的衍生肽，其中衍生肽的氨基酸序列具有與氨基酸序列 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的肽相似的理化性質(zhì)，但具有不同的生物活性，以治療Y C-細(xì)胞因子-介導(dǎo)的疾病。另一個(gè)實(shí)施方案涉及向患者施用與現(xiàn)有的生物學(xué)蛋白/肽的N和C末端或與其側(cè)鏈殘基相連的氨基酸序列為 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S(SEQ ID NO:1)的肽以治療 Y c_ 細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病。
[0093]多個(gè)實(shí)施方案涉及向患者中施用針對(duì)含氨基酸序列為1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的肽的多克隆和單克隆抗體作為免疫原以治療Y c_細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病。另一個(gè)實(shí)施方案涉及向患者中施用針對(duì)氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的衍生肽得到的多克隆和單克隆抗體作為免疫原，其中衍生肽的氨基酸序列具有與氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S(SEQID NO:1)的肽相似的理化性質(zhì)，但具有不同的生物活性，以治療Yc-細(xì)胞因子-介導(dǎo)的疾病。
[0094]Y C-拮抗劑肽的施用
[0095]本發(fā)明的實(shí)施方案還包括將Y C-拮抗劑肽用于制造用于治療疾病的藥劑。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括一種藥物組合物，所述藥物組合物包括Y C-拮抗劑肽連同藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體及非毒性的治療有效量的Y C-拮抗劑肽，或本發(fā)明的實(shí)施方案的其他組合物。
[0096]本發(fā)明的實(shí)施方案提供了使用包括在合適的稀釋劑或載體中的有效量的Y C-細(xì)胞因子拮抗劑的藥物組合物的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案的Y C-拮抗劑可以按照用于制備藥學(xué)上有用的組合物的已知的方法進(jìn)行配制。Y C-拮抗劑既可以作為單獨(dú)的活性物質(zhì)也可以與其他已知的活性物質(zhì)一起，與藥學(xué)上合適的稀釋劑(例如，磷酸酯、醋酸酯、Tris-HCl)、防腐劑(例如硫汞撒、芐醇、對(duì)羥基苯甲酸脂)、乳化化合物、增溶劑、佐劑、和/或載體例如牛血清清蛋白混合在混合物中。合適的載體及它們的制劑在Remington’s PharmaceuticalSciences (雷明頓氏藥物學(xué)),第16版，1980Mack Publishing C0.中描述過(guò)。另外，這些組合物可以含有與聚乙二醇(PEG)、金屬離子絡(luò)合，或結(jié)合進(jìn)聚合物例如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝膠等等，或結(jié)合進(jìn)脂質(zhì)體、微乳劑、膠束、單層或多層氣泡、紅細(xì)胞血影或球芽的Y C-拮抗劑。這些組合物會(huì)影響物理狀態(tài)、可溶性、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率，以及體內(nèi)清除速率或
YC-拮抗劑。Y C-拮抗劑能夠連接至針對(duì)細(xì)胞特異性抗原、受體、配基的抗體上，或連接至組織特異性受體的配基上。
[0097]施用本發(fā)明的實(shí)施方案的Y C-拮抗劑的方法可以酌情選擇，這取決于各種因素，例如疾病類型、受試者的狀況，和/或靶向的位點(diǎn)。Y C-拮抗劑可通過(guò)局部、口服、腸胃外、直腸，或通過(guò)吸入施用。術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦池內(nèi)注射，或浸入技術(shù)。這些組合物通常會(huì)單獨(dú)包括有效量的Y C-拮抗劑或與有效量的任意其他活性物質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明的實(shí)施方案的藥物組合物中含有的肽的量、藥物組合物的劑型、給藥頻率等等可以酌情選擇，這取決于各種因素，例如疾病類型、受試者狀況和/或靶向的位點(diǎn)。在所述組合物中含有的這些劑量和所希望的藥物濃度可受多種參數(shù)的影響，包括計(jì)劃的用途、患者的體重和年齡，以及給藥途徑。首先會(huì)使用動(dòng)物研究進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，向人給藥的量可按照本領(lǐng)域的習(xí)慣做法進(jìn)行。
[0098]在一個(gè)實(shí)施方案中，向受試者中施用已經(jīng)用編碼至少一種Yc-拮抗劑肽的多核苷酸進(jìn)行基因修飾的宿主細(xì)胞，以治療增殖紊亂和/或降低惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。多核苷酸由宿主細(xì)胞表達(dá)，從而在受試者體內(nèi)生成所述肽。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞對(duì)受試者是異源的或自體的。
[0099]在進(jìn)一步方面，Y C-拮抗劑肽可與其他療法結(jié)合使用，例如抑制癌癥細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的療法。短語(yǔ)“聯(lián)合治療”施用Y C-拮抗劑肽及其他的治療試劑作為在與這些治療試劑的共同作用下帶來(lái)有益效果的具體治療方案的一部分。與這些治療試劑聯(lián)合施用通常在一個(gè)確定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行(通常為 分鐘、小時(shí)、天或星期，這取決于所選擇的組合)。
[0100]聯(lián)合治療包括以順序方式施用這些治療試劑，即，其中每一種治療試劑在不同的時(shí)間下施用，還包括以基本上同時(shí)的方式施用這些治療試劑，或至少兩種治療試劑?；旧贤瑫r(shí)施用可通過(guò)例如向受試者中施用每種治療試劑有固定比例的單種膠囊或施用多種含單種治療試劑的單種膠囊。順序或基本上同時(shí)施用每種治療制劑會(huì)受到合適的路徑的影響，包括但不限于口服路徑、靜脈內(nèi)路徑、肌肉路徑，以及通過(guò)粘膜組織直接吸收。因此治療試劑可通過(guò)相同的路徑或不同的路徑施用。治療試劑施用的順序并不是非常關(guān)鍵的。
[0101]聯(lián)合治療也可包括進(jìn)一步與其他生物學(xué)有效成分(例如但不局限于第二及不同的治療試劑)和非藥物療法(例如但不局限于手術(shù)或放射療法)組合施用如上所述的治療試劑。如果聯(lián)合治療進(jìn)一步包括放射療法，則放射療法可在任何合適的時(shí)間進(jìn)行，只要能夠取得治療試劑與放射療法組合的共同作用的有益效果即可。例如，在合適的情況下，當(dāng)從施用治療試劑中暫時(shí)去除放射療法，或者幾天乃至幾星期后仍能取得有益效果。
[0102]在一些實(shí)施方案中，Y C-拮抗劑肽能夠與至少一種抗增生試劑組合施用,所述抗增生試劑選自由如下組成的組:化學(xué)治療劑、抗代謝物，以及抗致癌劑，以及抗有絲分裂劑，以及抗病毒劑，以及抗腫瘤劑，免疫治療劑和放射治療劑。[0103]在一些實(shí)施方案中，Y C-拮抗劑肽能夠與至少一種抗炎劑組合施用，所述抗炎劑選自由類固醇、皮質(zhì)類固醇和非類固醇抗炎藥組成的組中。
[0104]本發(fā)明還提供了進(jìn)行任何上述方法的試劑盒。試劑盒可以包括按照本發(fā)明的實(shí)施方案的Yc-拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包括說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)可以為書(shū)面或統(tǒng)計(jì)圖表的形式，或可以在記錄介質(zhì)上，包括錄音磁帶、音頻⑶、錄像磁帶、DVD、⑶-ROM等。試劑盒可以包括包裝。
[0105]
[0106]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“患者”指的是治療性處理的接受者，包括動(dòng)物界內(nèi)的所有有機(jī)體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物為哺乳科內(nèi)的，例如人、牛、羊、豬、貓、水牛、犬、山羊、馬、驢、鹿和靈長(zhǎng)類。最優(yōu)選的動(dòng)物為人。
[0107]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療”或其任何變型(例如，療法、處理等)指的是對(duì)被診斷為患有如下生物學(xué)狀況的患者的任何治療，例如⑶4、⑶8和LGL白血病、自身免疫病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、韋格納肉芽腫痛、脂瀉病、橋本甲狀腺炎；膠原性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、糖尿病、牛皮癬、神經(jīng)退行性疾病、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎、目艮睛的炎癥、移植物抗宿主病(GvHD)、重癥肌無(wú)力、1-人源T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞的I型和II型(HTLV-1和HTLV-1I)-相關(guān)的疾病、成人T細(xì)胞性白血病(ATL)、HTLV-相關(guān)的脊髓病/熱帶痙攣性輕截癱(HAM/TSP)、葡萄膜炎(HU)、關(guān)節(jié)病、肺病、皮炎、外分泌腺體病、肌炎、流感、艾滋病、HBV、皰疹、哮喘、鼻竇炎、花粉熱、支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、變應(yīng)性鼻炎、急性和慢性耳炎、肺纖維化、NK白血病/淋巴瘤和NK-T白血病/淋巴瘤。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)治療包括:(i)預(yù)防或延遲在尚未表現(xiàn)出與所關(guān)心的生物學(xué)癥狀有關(guān)的病癥的具有患病風(fēng)險(xiǎn)的患者中表現(xiàn)出與所關(guān)心的生物學(xué)癥狀有關(guān)的病癥；(ii)改善在被診斷患有所關(guān)心的生物學(xué)癥狀的患者中與所關(guān)心的生物學(xué)癥狀相關(guān)的病癥；(iii)預(yù)防、延遲或改善具有患病風(fēng)險(xiǎn)的患者或被診斷為患有所關(guān)心的生物學(xué)癥狀的患者中表現(xiàn)出與所關(guān)心的生物學(xué)癥狀相關(guān)的并發(fā)癥、癥狀或疾病相關(guān)的病癥；(iv)減緩、延遲或停止生物學(xué)癥狀的進(jìn)展；和/或(V)預(yù)防、延遲、減緩、停止或改善炎癥的細(xì)胞事件。
[0108]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“癥狀”指的是患者遭受具體的癥狀或疾病的常見(jiàn)的病征或跡象。
[0109]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”指的是取得所希望的生物學(xué)效應(yīng)所需要的量。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，Y C-拮抗劑的有效量為在用于治療生物學(xué)癥狀中取得至少一個(gè)生物學(xué)因素的可觀察到的作用所需要的量。
[0110]“重組DNA技術(shù)”或“重組體”指的是從已經(jīng)被克隆或合成的DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染能夠生物合成異種肽的微生物(例如細(xì)菌、酵母)、無(wú)脊椎動(dòng)物(昆蟲(chóng))、哺乳細(xì)胞或生物(例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物)生成具體的多肽的所使用的技術(shù)和方法。只有哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)原生糖基化模式。原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏向合成的蛋白添加糖基化的能力。酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞提供了獨(dú)特的糖基化模式，可能與原生模式不同。
[0111]“核苷酸序列”指的是源自DNA或RNA的以分開(kāi)的片段或作為更大的DNA構(gòu)件的一個(gè)組分的形式的多核苷酸，至少分離了一次，處于基本上純的形式，不含污染性內(nèi)源物質(zhì)，其量或濃度可以進(jìn)行鑒定、操作，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(例如在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols in Molecular Biology)中所列的)還原其組分核苷酸序列。[0112]“重組表達(dá)載體”指的是包括含如下組件的轉(zhuǎn)錄單元的質(zhì)粒:(1)在基因表達(dá)中具有調(diào)控作用的一個(gè)遺傳元件或多個(gè)遺傳元件包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，(2)編碼按照本發(fā)明的實(shí)施方案的多肽的構(gòu)件或編碼序列，以及(3)合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯起始序列，以及如果需要的，終止序列。計(jì)劃用于酵母及哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)元件優(yōu)選包括能夠由酵母或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞在細(xì)胞外分泌翻譯的多肽的信號(hào)序列。
[0113]“重組微生物表達(dá)系統(tǒng)”指的是具有在染色體DNA中穩(wěn)定整合的重組轉(zhuǎn)錄單元或攜帶重組轉(zhuǎn)錄單元作為殘余質(zhì)粒的一個(gè)組分的合適的宿主微生物，例如細(xì)菌如大腸桿菌或酵母如啤酒酵母的基本上同源的單種培養(yǎng)物。通常，構(gòu)成重組微生物表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞為單種祖轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代。重組微生物表達(dá)系統(tǒng)在引入與待表達(dá)的結(jié)構(gòu)核苷酸序列連接的調(diào)控元件后可表達(dá)異種多肽。
[0114]為了進(jìn)行說(shuō)明，給出了如下的實(shí)施例，這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為是一種限制。
[0115]實(shí)施例
[0116]實(shí)施例1
[0117]測(cè)定Y C-拮抗劑肽的抑制活性的方法
[0118]采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)量它們對(duì)Y C-細(xì)胞因子家族成員的增生性應(yīng)答，測(cè)定按照本發(fā)明的實(shí)施方案制備的任意定制衍生肽抑制Y C-細(xì)胞因子家族成員的能力。
[0119]對(duì)于六種Yc-細(xì)胞因子中的每一種,指不細(xì)胞系:CTLL_2,—種從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所獲得的鼠源CD8T細(xì)胞系，以及PT-18，一種鼠源肥大細(xì)胞系及其亞克隆ΡΤ-18β用人源IL-2R0基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使得細(xì)胞對(duì)IL-2和IL-15發(fā)生應(yīng)答(Tagaya等人，1996，EMBOJ.15:4928-39)，并被用于定量測(cè)定Y c_細(xì)胞因子的生長(zhǎng)促進(jìn)活性(參見(jiàn)Wiley和Sons的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current pr`otocols in Immunology)以參考方法學(xué))。當(dāng)用比色WST-1試驗(yàn)在一定范圍的濃度下測(cè)量時(shí)(對(duì)于試劑和方法的詳細(xì)描述，參見(jiàn)Clontech PT3946-1及相關(guān)的用戶手冊(cè)，以引用的方式被結(jié)合到本文中)指示細(xì)胞顯示出半線性的劑量依賴性響應(yīng)。一旦從指示細(xì)胞系中測(cè)定到適當(dāng)劑量的細(xì)胞因子產(chǎn)生了 50%及95%最大響應(yīng)，則向含細(xì)胞因子及指示細(xì)胞的每個(gè)孔中加入各種濃度(從IpM到10 μ M)的純化的或合成的定制衍生肽。將在450nm下的光吸光度的降低用作抑制細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞增殖的指示。通常，細(xì)胞受到細(xì)胞因子的刺激，使得含指示細(xì)胞系和細(xì)胞因子的孔的吸光度為2.0-3.0，當(dāng)加入抑制肽后可降至0.1-0.5。
[0120]實(shí)施例2
[0121]BNZ-Y狀特異件地抑制IL-9和IL-15的牛長(zhǎng)促講活件
[0122]使用如上所述的ΡΤ-18 β細(xì)胞，測(cè)定BNZ- Y肽特異性抑制選擇的Y c_細(xì)胞因子的生長(zhǎng)促進(jìn)活性的能力(圖3A)。將IL-3，一種支持ΡΤ-18β細(xì)胞的生長(zhǎng)的非Yc-細(xì)胞因子用作陰性對(duì)照。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，將ΡΤ-18β細(xì)胞用兩種不同稀釋度的由ΗΕΚ293Τ細(xì)胞生成的BNZ- Y肽(用BNZ- Y表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞的原始上清液的1:20或1:50稀釋度)或不含BNZ-Y肽在IL-3、IL-9、IL-15或IL-4中孵育(培養(yǎng)物中每種細(xì)胞因子InM)。采用WST-1試驗(yàn)，在引入BNZ-Y肽和細(xì)胞因子兩天后測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)-響應(yīng)。IL-3(非Yc-細(xì)胞因子)的生長(zhǎng)促進(jìn)活性并沒(méi)有受到BNZ- Y的抑制。相反，IL-15和IL-9的活性則被BNZ- Y肽顯著(T檢驗(yàn)p〈0.01)降低。由IL-4，另一種Y C-細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞增殖并沒(méi)有受到加入BNZ-Y肽的影響。IL-3、IL-9、IL-15和IL-4的結(jié)果在圖3A中示出。[0123]在相似的試驗(yàn)中，采用鼠源細(xì)胞系CTTL2。在該試驗(yàn)中，將細(xì)胞用含0.5nM的重組體IL-2的RPMI10%胎牛血清培養(yǎng)。為準(zhǔn)備增殖試驗(yàn)，將細(xì)胞洗滌3遍以除去細(xì)胞因子。將細(xì)胞向96-孔板的每孔中接種I X 10 (5)個(gè)細(xì)胞，終濃度為50pM的IL-2或IL-15。向每孔中加入各種濃度的BNZ-Y肽(0.1、1和10ug/ml)。將細(xì)胞培養(yǎng)20小時(shí)，在最后的14小時(shí)中，向培養(yǎng)板中加入3H-胸苷。使用讀板儀收集細(xì)胞。數(shù)據(jù)在圖3B中示出。
[0124]實(shí)施例3
[0125]通過(guò)分析作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物的3H-胸苷的結(jié)合而測(cè)暈抑制Y C-細(xì)胞因子活性的方法
[0126]通過(guò)3H胸苷結(jié)合試驗(yàn)而測(cè)量拮抗劑定制衍生肽對(duì)指示細(xì)胞群的Y C-細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的增殖的抑制作用。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，向含細(xì)胞因子的正在增殖的20-50，OOO個(gè)細(xì)胞中加入放射性標(biāo)記的胸苷(I微居)。通過(guò)采用常規(guī)的收集器(例如Perkin-Elmer公司的Filtermate Universal Harvester)將細(xì)胞結(jié)合的放射性截留在玻璃_纖維過(guò)濾器中而測(cè)量細(xì)胞結(jié)合的放射性，此后，使用b計(jì)數(shù)器(例如1450，Trilux微板閃爍計(jì)數(shù)器)測(cè)量器放射性。
[0127]實(shí)施例4
[0128]通過(guò)分析作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物的細(xì)胞追蹤染料的結(jié)合而測(cè)暈Y C-細(xì)胞因子活性的方法
[0129]將指示細(xì)胞在選擇的Y C-細(xì)胞因子下，或在選擇的Y C-細(xì)胞因子及選擇的定制衍生肽下孵育。然后使用細(xì)胞追蹤染料，例如Invitrogen公司的CMFDA、C2925，在體外標(biāo)記細(xì)胞群，使用流式細(xì)胞儀(例如Beckton-Dickinson FACScalibur)監(jiān)測(cè)每次細(xì)胞分裂的細(xì)胞綠色熒光的衰減。一般地，在綠色熒光通道中會(huì)出現(xiàn)響應(yīng)Y C-細(xì)胞因子刺激的對(duì)應(yīng)于細(xì)胞所經(jīng)歷的分裂次數(shù)的7-10個(gè)不同的峰。將細(xì)胞與選擇的Y C-細(xì)胞因子及拮抗劑定制衍生肽孵育將峰的數(shù)量降至僅有1 -3，這取決于抑制的程度。
[0130]實(shí)施例5
[0131]通過(guò)BNZ-Y及其衍生物拮抗劑而抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞
[0132]除刺激細(xì)胞增殖外，Y C-細(xì)胞因子結(jié)合到其受體上會(huì)引起不同系列的細(xì)胞內(nèi)事件。(Rochman 等人，2009Nat.Rev.1mmunol.9:480-90, Pesu 等人，2005, Immunol.Rev.203:127-142.)在細(xì)胞因子與其受體結(jié)合即刻后，一種稱作Jak3 (Janus激酶3)的酪氨酸激酶就被招募到細(xì)胞質(zhì)膜處的受體上。這種激酶將多種蛋白的酪氨酸殘基磷酸化，包括(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5)及PI3 (磷脂酰肌醇3)激酶的亞基。其中，在許多研究中涉及STAT5的磷酸化與由Y C-細(xì)胞因子引起的細(xì)胞增殖有關(guān)。(在Hennighausen 和 Robinson, 2008Genes Dev.22:711-21.中綜述過(guò))根據(jù)這些公開(kāi)的數(shù)據(jù)，檢測(cè)BNZ- Y肽是否會(huì)抑制由IL-15刺激的ΡΤ-18 β細(xì)胞中STAT5分子的酪氨酸磷酸化(結(jié)果在圖3C中示出)。
[0133]在含或不含BNZ- Y肽下由IL-15對(duì)ΡΤ-18 β細(xì)胞進(jìn)行刺激。按照如在Tagaya等人，1996，EMB0 J.15:4928-39中描述的常規(guī)方法從細(xì)胞中提取胞漿蛋白。將提取的胞漿蛋白采用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)解析，使用免疫印跡法，通過(guò)抗磷酸-STAT5抗體(Cell Signaling Technology公司，編號(hào)#9354，馬薩諸塞州，丹弗斯)證實(shí)其磷酸化狀態(tài)(參見(jiàn)圖3C，頂部條帶)。為了證實(shí)每條通道表示相似的總蛋白上樣量，然后將膜洗脫，用抗-STAT5抗體(Cell Signaling Technology公司，編號(hào)#9358)再次進(jìn)行標(biāo)記(參見(jiàn)圖3C,底部條帶)。
[0134]這些結(jié)果顯示，在ΡΤ_18β細(xì)胞中，STAT5 (—種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)記物)的酪氨酸磷酸化受到IL-15的誘導(dǎo)，STAT5的酪氨酸磷酸化被BNZ-Y肽顯著降低。
[0135]實(shí)施例6
[0136]BNZ-Y衍生物拮抗肽的合理設(shè)計(jì)
[0137]基于核心序列D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-1/K-X-L/1-X-Q (SEQ ID Ν0:2)(其中 X 表示任意氨基酸)，通過(guò)將核心序列的確定的氨基酸替換成如圖2所示的具有相同理化性質(zhì)的氨基酸而制備衍生肽。
[0138]實(shí)施例7
[0139]鑒別拮抗定制衍生肽的抑制特異性的方法
[0140]通過(guò)分析定制衍生肽抑制細(xì)胞因子-應(yīng)答的細(xì)胞系對(duì)6種Y C-細(xì)胞因子中的每一種的增生響應(yīng)情況的能力而測(cè)定拮抗定制衍生肽的Y C-細(xì)胞因子的抑制特異性。例如，使用一種小鼠細(xì)胞系CTLL-2測(cè)定待測(cè)的肽是否抑制IL-2和IL-15的功能。使用ΡΤ_18( β )細(xì)胞測(cè)定待測(cè)肽是否抑制IL-4和IL-9的功能。使用ΡΤ-17 (7α )細(xì)胞測(cè)定待測(cè)肽是否抑制IL-7的功能，以及使用ΡΤ-18 (21 α )細(xì)胞測(cè)定待測(cè)肽是否抑制IL-21的功能。ΡΤ-18(β )表示通過(guò)基因轉(zhuǎn)染而外源性表達(dá)人源IL-2R β的ΡΤ-18細(xì)胞的亞克隆(參見(jiàn)Tagaya等人，1996)，ΡΤ-18 (7 α )表示通過(guò)基因轉(zhuǎn)染而表達(dá)人源IL-7Ra的亞克隆，PT-18 (21Ra )細(xì)胞表達(dá)人源IL-21Ra。
[0141]另一種替換方法是使`用對(duì)一系列細(xì)胞因子響應(yīng)的其他細(xì)胞系。這種細(xì)胞系的一個(gè)例子為可從ATCC (編號(hào)#CRL-2407)商業(yè)購(gòu)買到的一種人源NK細(xì)胞系NK92。這種細(xì)胞系為IL-2依賴的細(xì)胞系，對(duì)其他細(xì)胞因子包括IL-9、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21發(fā)生響應(yīng)(Gong 等人，1994, Leukemia8:652-658, Kingemann 等人，1996，Biol Blood MarrowTransplant〗:68; 75, Hodge DL 等人，2002, J.Tmmunol.168:9090-8)。
[0142]實(shí)施例8
[0143]Y c-拮抗劑肽的制備
[0144]通過(guò)人工及自動(dòng)化的方法化學(xué)合成定制衍生的Y C-拮抗劑肽。
[0145]人工合成:采用經(jīng)典的液相合成，包括將一個(gè)氨基酸的羧基或C末端與另一個(gè)氨基酸的氨基或N末端連接。可選地，使用固相肽合成(SPPS )。
[0146]自動(dòng)化合成:許多商業(yè)公司提供了付費(fèi)的自動(dòng)化肽合成。這些公司使用各種商業(yè)化的肽合成器，包括由Applied Biosystems (ABI)提供的合成器。通過(guò)自動(dòng)化的肽合成器合成定制衍生的Y C-拮抗劑肽。
[0147]實(shí)施例9
[0148]采用重組技術(shù)生物生成定制衍生的Y C-拮抗劑肽
[0149]將定制衍生的Y C-拮抗劑肽生物合成為前肽，所述前肽由合適的標(biāo)記肽、信號(hào)肽或源自已知的可提高或穩(wěn)定BNZ-Y肽的結(jié)構(gòu)并改善其生物活性的人源蛋白的肽組成。如果需要的話，可以設(shè)計(jì)出針對(duì)肽的N末端進(jìn)行的合適的酶裂解序列以從最終蛋白中除去肽的標(biāo)記物或任何部分。
[0150]向一種商業(yè)化載體中插入在3’末端具有終止密碼子的編碼衍生肽的核苷酸序列，所述商業(yè)化載體含有源自大腸桿菌的硫氧還蛋白的標(biāo)記物部分，以及介入到標(biāo)記物部分及編碼定制衍生肽的核苷酸序列之間的由適當(dāng)?shù)牡鞍姿饷?例如腸激酶)所識(shí)別和消化的特異性肽序列，以及終止密碼子。一種合適的載體的例子為從加利福尼亞州Invitrogen公司獲得的pThioHis質(zhì)粒。也可使用其他的表達(dá)載體。
[0151]實(shí)施例10
[0152]將BNZ-Y及衍生物結(jié)合到載體蛋白上用于免疫目的以及生成抗BNZ-Y抗體
[0153]使用BNZ-Y及其他定制衍生肽將動(dòng)物免疫，得到多克隆和單克隆抗體。采用戊二醛或間馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯，通過(guò)常規(guī)方法將肽連接至合適的載體蛋白(例如牛血清清蛋白，鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)等等)的N或C末端。然后將連接的肽及合適的佐劑用于免疫動(dòng)物例如兔、嚙齒類或驢。使用常規(guī)方法檢測(cè)合成的抗體的特異性。如果得到的抗體與免疫原性肽反應(yīng)，然后按照在實(shí)施例1-3中描述的細(xì)胞增殖試驗(yàn)對(duì)其測(cè)定抑制單種Y C-細(xì)胞因子活性的能力。由于衍生肽的合成的特性，由于這些肽的合成的特性，因此能夠生成同時(shí)識(shí)別兩種不同的細(xì)胞因子的單一抗體。
[0154]實(shí)施例U
[0155]大規(guī)模生成定制衍生的Y C-拮抗劑肽的方法
[0156]通過(guò)使用在其他地方描述的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)而大規(guī)模地生成重組蛋白。(參見(jiàn)Takai 等人，2010Curr.Pharm.Biotechnol.11 (3): 272-8.)簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，將編碼 Y c~ 拮抗劑肽的cDNA及標(biāo)記物亞克隆進(jìn)合適的載體中(參見(jiàn)Takai等人，20IOCurr.Pharm.Biotechnol.11 (3): 272-8)，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，隨后立即進(jìn)行體外翻譯，生成被標(biāo)記的肽。然后將前多肽采用識(shí)別被標(biāo)記的表位的固定抗體進(jìn)行純化，用蛋白水解酶處理，采用常規(guī)的18%N-三(羥甲基)甲基甘氨酸-SDS-PAGE (Invitrogen)及常規(guī)的考馬斯染色對(duì)洗出液(主要含有所關(guān)心的定制衍生肽)進(jìn)行純度測(cè)定。如果肽沒(méi)有達(dá)到所希望的純度(>98%)，則將混合物用常規(guī)的HPLC (高效液 相色譜)進(jìn)行進(jìn)一步提純。
[0157]實(shí)施例12
[0158]定制衍生的Y C-拮抗劑肽阻斷HAM/TSP中細(xì)胞因子功能的用途
[0159]HTLV-1-相關(guān)的脊髓病(HAM)/熱帶痙攣性輕截癱(TSP)是一種慢性進(jìn)展性的脊髓病，可在一些感染了人源T-嗜淋巴細(xì)胞病毒I型(HTLV-1)的人中看到。脊髓中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與對(duì)HTLV-1的免疫反應(yīng)有關(guān)，這導(dǎo)致了釋放一些細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子中的一些也可能會(huì)損傷神經(jīng)。
[0160]患有HAM/TSP的患者表現(xiàn)出免疫系統(tǒng)的狀態(tài)升高，這與在自身免疫病中觀察到的(Oh等人，2008Neurol Clin.26:781-785)類似。這種升高的狀態(tài)可以通過(guò)HAM/TSP患者的T細(xì)胞在不含外源性添加細(xì)胞因子的體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約一周時(shí)進(jìn)行自發(fā)性增殖的能力表現(xiàn)出來(lái)。HAM/TSP患者中T細(xì)胞的自發(fā)性增殖至少部分歸因于IL-2、IL-9和IL-15的自分泌/旁泌性循環(huán)。已經(jīng)顯示，增加IL-2或IL-15受體的阻斷抗體能夠抑制HAM/TSP體外培養(yǎng)系統(tǒng)中自發(fā)性的T細(xì)胞增殖。這些觀察，以及源自體外研究的其他數(shù)據(jù)，已經(jīng)提供了將兩種單克隆抗體(抗IL-2受體α或抗-Tac及抗IL-15受體β鏈)引入到臨床以治療HAM/TSP 的理論基礎(chǔ)(Azimi 等人，2001Proc.Natl.Acad.Sc1.98:14559-64.，Azimi 等人，1999J.1mmunol 163:4064-72)。按照本文所描述的實(shí)施方案的抗-細(xì)胞因子受體拮抗劑，不但可作為用于HAM/TSP的療法的治療用免疫調(diào)節(jié)劑，而且通過(guò)按照本發(fā)明的實(shí)施方案的抗-細(xì)胞因子受體拮抗劑調(diào)節(jié)HAM/TSP中的免疫反應(yīng)起到了將按照本發(fā)明的實(shí)施方案的抗-細(xì)胞因子受體拮抗劑用在其他自身免疫病的療法中的概念驗(yàn)證作用。
[0161]為了顯示按照本文所描述的實(shí)施方案的定制衍生的Y C-拮抗劑肽的效力，我們采用HAM/TSP體外培養(yǎng)系統(tǒng)，在自發(fā)性T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中測(cè)試了 BNZ- Gamma肽阻斷對(duì)HTLV-1的免疫反應(yīng)的能力。在加入或不加入BNZ-Gamma的HAM/TSP患者血樣中進(jìn)行增殖試驗(yàn)。這些試驗(yàn)評(píng)價(jià)了在體外HAM/TSP患者血液培養(yǎng)物中BNZ-Gamma阻斷細(xì)胞因子，例如IL-2和IL-15的功能以及在這些樣品中預(yù)防自發(fā)性T細(xì)胞增殖的能力。
[0162]在體外自發(fā)性T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，將來(lái)自HAM/TSP患者的PBMC培養(yǎng)在96孔板的RPM1-10%FCS中，每孔1X10(6)個(gè)細(xì)胞。向每孔中加入增加濃度的BNZ-Y肽。作為對(duì)照，以相似的方式使用一種不相干的肽。將細(xì)胞在37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、4及6天。向細(xì)胞中加入IuCi的量的3H-胸苷。在培養(yǎng)了另外6個(gè)小時(shí)后，收集細(xì)胞，測(cè)定它們的增殖速度。代表性的HAM/TSP患者的數(shù)據(jù)在圖4A-D中示出。如在圖4中所示出的，BNZ-Gamma肽在大約lug/ml的濃度下抑制了 HAM/TSP培養(yǎng)物中T細(xì)胞的自發(fā)性增殖。
[0163]在該試驗(yàn)中還測(cè)定了其他的免疫標(biāo)記物。在體外培養(yǎng)期間，使用病毒蛋白四聚物測(cè)量了病毒特異性的CD8細(xì)胞的百分率。在流式細(xì)胞試驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)了 CD4+CD25+細(xì)胞的數(shù)量(一種T細(xì)胞激活的標(biāo)志)，以及Ki67染色(T細(xì)胞增殖的標(biāo)志)。
[0164]可以在相似的將來(lái)的試驗(yàn)中使用其他形式的連接的BNZ-Y肽衍生物。這些包括在化學(xué)合成后能夠與肽連接的白蛋白、BSA、PEG。BNZ-y肽連接物的其他生物學(xué)形式可以包括融合至BNZ-Y肽衍生物的已知的蛋白實(shí)體的域(包括但不局限于人源IgG的Fe域)。
[0165]實(shí)施例13
[0166]通過(guò)施用定制衍生的Y C-拮抗劑肽而治療人類患者中成人T細(xì)胞性白血病(ATL)的方法
[0167]鑒別出患有成人T細(xì)胞性白血病的人類患者。由醫(yī)生決定的有效劑量的定制衍生的Yc-拮抗劑肽，例如ΒΝΖ-Gamma，在由醫(yī)生決定被施用到患者中一段時(shí)間。如果患者出現(xiàn)緩解則認(rèn)定治療有效。
[0168]實(shí)施例14_9] 通過(guò)施用定制衍生的Y C-拮抗劑肽而治療人類患者中的HAM/TSP的方法
[0170]鑒別出患有HAM/TSP的人類患者。由醫(yī)生決定的有效劑量的定制衍生的Y c_拮抗劑肽，例如BNZ-Gamma，在由醫(yī)生決定被施用到患者中一段時(shí)間。如果患者的病癥得到改善，或者如果疾病的進(jìn)展已經(jīng)被停止或減慢,則認(rèn)定治療有效。
[0171]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.一種被分離或純化的肽，包括氨基酸序列D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-1/K-X-L/1-X-Q(SEQ ID N0:2)，其中X表示任意氨基酸，其中所述肽能夠抑制選自由IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15或IL-21組成的組的一種或多種Y c_細(xì)胞因子的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的被分離或純化的肽，其特征在于，所述肽包括氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1) (BNZ-y )0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的被分離或純化的肽，其特征在于，所述肽基本上由氨基酸序列 1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1) (ΒΝΖ- )組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的被分離或純化的肽，其特征在于，所述肽抑制IL-15和IL-19的活性。
5.一種被分離或純化的肽，包括氨基酸序列為1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的肽衍生物，其中衍生肽的氨基酸序列具有與氨基酸序列1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的肽相似的理化性質(zhì)，但具有不同的生物活性，其中所述生物活性為對(duì)IL-15和IL-9的活性的抑制。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽，其特征在于，衍生物的氨基酸序列中與氨基酸序列為1-K-E-F-L-Q-R-F-1-H-1-V-Q-S-1-1-N-T-S (SEQ ID NO:1)的肽共有至少大約 50% 的同一性。
7.—種通過(guò)一種或多種Y C-細(xì)胞因子家族成員阻斷信號(hào)傳遞的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的被分離或純化的肽接觸。
8.一種抑制Y C-細(xì)胞因子與Y C-亞基結(jié)合的方法，包括將Y C-亞基與權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的被分離或純化的肽接觸。
9.一種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的被分離或純化的肽，或其衍生物，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或其組合。
10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的被分離或純化的肽、或其衍生物、或權(quán)利要求9的藥物組合物用于制備用于改善或治療Y C-細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述YC-細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病選自由如下組成的組:⑶4-白血病、⑶8-白血病、LGL-白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、韋格納肉芽腫痛、脂瀉病、橋本甲狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、糖尿病、牛皮癬、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎、眼睛的炎癥以及移植物抗宿主病(GvHD)。
12.權(quán)利要求1- 6中任一項(xiàng)所述的被分離或純化的肽、或其衍生物、或權(quán)利要求9的藥物組合物用于制備用于改善或治療HTLV-1-相關(guān)的脊髓病(HAM)/熱帶痙攣輕截癱(TSP)相關(guān)疾病的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述HAM/TSP相關(guān)的疾病選自由如下組成的組:成人T細(xì)胞性白血病(ATL)、HTLV-相關(guān)的脊髓病/熱帶痙攣輕截癱(HAM/TSP)，以及與HTLV相關(guān)的其他非腫瘤的炎性疾病例如葡萄膜炎(HU)、關(guān)節(jié)病、肺病、皮炎、外分泌腺體病和肌炎。
14.權(quán)利要求1-6中`任一項(xiàng)所述的被分離或純化的肽、或其衍生物、或權(quán)利要求9的藥物組合物用于制備用于改善或治療炎性呼吸道疾病的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述炎性呼吸道疾病選自由如下組成的組:哮喘、鼻竇炎、花粉熱、支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、變應(yīng)性鼻炎、急性和慢性耳炎，以及肺纖維化。
16.—種將權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的肽、或其衍生物、或權(quán)利要求9的藥物組合物用于化妝品目的方法，其特征在于，所述化妝品目的選自由如下組成的組:治療痤瘡、治療脫發(fā)、治療曬黑、指甲保養(yǎng) ，以及減少外貌老化。
【文檔編號(hào)】A61K38/20GK103501805SQ201280010348
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月18日
【發(fā)明者】Y·塔加亞, N·阿齊米 申請(qǐng)人:比奧尼斯有限責(zé)任公司