應(yīng)用于癌癥治療的免疫修飾碳納米管的制作方法
【專利摘要】一種構(gòu)建免疫修飾納米管的方法，以及使用該化合物將免疫佐劑輸送至腫瘤細(xì)胞和產(chǎn)生靶向、協(xié)同光物理和免疫學(xué)反應(yīng)的方法，用于癌癥的治療。為了制備免疫修飾的納米管，將碳納米管溶解于糖化殼聚糖(一種免疫刺激物)的一種溶液中，從而，將糖化殼聚糖作為一種表面活性劑使用，使納米管的水溶液穩(wěn)定。該化合物能用于癌癥的治療。本方法包括皮下注射免疫修飾納米管和對(duì)目標(biāo)腫瘤進(jìn)行激光照射的步驟。納米管作為一種載體使用，用于將免疫佐劑運(yùn)輸至腫瘤細(xì)胞中，以及作為受者中一個(gè)腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊中的一種光吸收劑作用。在激光照射目標(biāo)腫瘤細(xì)胞下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的免疫修飾納米管能產(chǎn)生空間和時(shí)間的協(xié)同光熱和免疫反應(yīng)，用于癌癥的治療。
【專利說(shuō)明】應(yīng)用于癌癥治療的免疫修飾碳納米管
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002]本申請(qǐng)宣稱具有美國(guó)專利申請(qǐng)(13 / 037，171)的所有權(quán)益。該美國(guó)專利，發(fā)明名稱為“應(yīng)用于癌癥治療的免疫修飾碳納米管”，于2011年2月28日提交，在此以其全部目的完整的作為本申請(qǐng)的參考。
[0003]發(fā)明的領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及納米技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。更為特別地，本發(fā)明涉及一種新型的免疫修飾碳納米管化合物，以及用該化合物將免疫佐劑運(yùn)送至癌細(xì)胞，產(chǎn)生靶向、協(xié)同光物理和免疫學(xué)反應(yīng)，用于癌癥的治療。
[0005]發(fā)明的背景[0006]納米技術(shù)已被用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。尤其是，單壁碳納米管(SWNTs)已經(jīng)被用于各種生物系統(tǒng)中。單壁碳納米管(SWNTs)的一個(gè)固有特性是，它們能穿過(guò)細(xì)胞膜而不會(huì)誘發(fā)細(xì)胞毒性。單壁碳納米管(SWNTs)的其它固有特性是，它們?cè)诮t外(NIR)區(qū)有很強(qiáng)的光吸收能力。曾有報(bào)告稱，在近紅外激光照射和射頻照射期間，單壁碳納米管(SWNTs)能提高細(xì)胞的熱破壞。由于在700— IIOOnm的范圍內(nèi)，生物組織比較透光，所以用于光熱療法的理想單壁碳納米管(SWNTs)在近紅外區(qū)內(nèi)應(yīng)該有一個(gè)吸收譜帶。此外，尺寸均一的納米管更為適宜，這樣一個(gè)窄吸收峰就能用于有效的光照射。在“通過(guò)在雙金屬鈷-鑰催化劑上進(jìn)行的CO催化分解來(lái)控制單壁碳納米管的生產(chǎn)”(Kitiyanan B, Alvarez We, Harwell JH,Resasco DE (2000) in Chem.Phys.Lett.317:497— 503)中討論的 CoMoCAT 方法，通過(guò)引用成為本發(fā)明中的一部分，用于生產(chǎn)具有一個(gè)980nm左右的強(qiáng)烈吸收窄譜帶的單壁碳納米管(SffNTs)。
[0007]對(duì)于生物應(yīng)用，單壁碳納米管(SWNTs)應(yīng)該在一種水懸液中制備；穩(wěn)定溶解需要表面活性劑，以避免納米管的聚集。十二烷基苯磺酸鈉(NaDDBS)、羧甲基纖維素鈉(NaCMC)和膽酸鈉(NaCholate)通常作為納米管的表面活性劑使用。
[0008]單壁碳納米管(SWNTs)的電子結(jié)構(gòu)易受周圍靜電環(huán)境中變化的影響。例如，通過(guò)表面電荷轉(zhuǎn)移或通過(guò)分子的吸收，能極大地改變它們的光反應(yīng)。因此，具有合適光學(xué)性質(zhì)的SffNT溶液對(duì)于生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。
[0009]由于腫瘤細(xì)胞對(duì)溫度升高具有敏感性，光熱療法對(duì)于局部癌癥治療有效。激光免疫療法的開發(fā)是將免疫刺激的光熱反應(yīng)結(jié)合來(lái)治療轉(zhuǎn)移瘤。使用一種近紅外激光照射和一種光吸收染料的結(jié)合方法，其選擇性的光熱作用可作為腫瘤的一線攻擊使用?？梢月?lián)合使用一種免疫刺激物來(lái)誘發(fā)免疫反應(yīng)。一種新型的化合物，糖化殼聚糖(glycated chitosan,GC)作為這樣的一種免疫刺激物已被研發(fā)。在預(yù)臨床研究中，使用糖化殼聚糖(GC)和光吸收染料的激光免疫療法已被證實(shí)對(duì)轉(zhuǎn)移瘤的治療很有效。此方法也已經(jīng)用于治療晚期乳腺癌患者，并具有令人滿意的治療結(jié)果。
發(fā)明概要
[0010]局部干預(yù)誘發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)對(duì)于轉(zhuǎn)移瘤的治療來(lái)說(shuō)是最理想的。一種新型的免疫修飾納米管系統(tǒng)通過(guò)糖化殼聚糖(GC)構(gòu)建，GC作為單壁碳納米管(SWNTs)的一種有效表面活性劑，也是一種有效的免疫佐劑。這種新型的SWNT-GC系統(tǒng)有長(zhǎng)期的穩(wěn)定性，并且保持了 SWNT的吸收特性和GC的免疫佐劑功能。SWNT-GC的局部給藥和近紅外光的照射在腫瘤細(xì)胞的治療中產(chǎn)生了同步協(xié)同光熱免疫反應(yīng)，無(wú)論在體外還是體內(nèi)。激光+SWNT-GC在動(dòng)物腫瘤模型中產(chǎn)生了非常有效的腫瘤抑制作用，并在很多病例中出現(xiàn)完全的腫瘤消退和長(zhǎng)期存活。用激光+SWNT — G成功治療的荷腫瘤動(dòng)物建立了對(duì)隨后腫瘤激發(fā)的完全抗性。將從激光+SWNT-G治愈的動(dòng)物中獲得的脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞使用的被動(dòng)繼承性免疫轉(zhuǎn)移，在初治受者中提供了 100%的免疫性。激光+SWNT-GC可被證實(shí)為一種有希望的選擇性局部療法，可誘發(fā)系統(tǒng)性抗腫瘤反應(yīng)，同時(shí)將副作用降到最低。
[0011]為了利用CoMoCAT SWNTs的特殊吸收特性，并在免疫學(xué)上提高光熱作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的SWNT-GC系統(tǒng),其中GC可同時(shí)作為一種有效的表面活性劑和一種有效的免疫刺激物使用，從而為該新型系統(tǒng)提供了兩個(gè)重要的功能。SWNT-GC懸液是穩(wěn)定的，它能完全保持SWNTs的光吸收特性和GC的免疫功能。在動(dòng)物腫瘤模型中，使用局部激光+SWNT-GC療法能獲得顯著的腫瘤消退和抗腫瘤免疫反應(yīng)。
[0012]此外，納米管能進(jìn)入細(xì)胞中，這要?dú)w功于其尺寸和電特性。納米管可作為藥物載體使用。在本發(fā)明的方法中，納米管將免疫佐劑GC載入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。因此，在具有適當(dāng)波長(zhǎng)的一種激光照射下，SffNT-GC能在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)間和空間的協(xié)同光熱和免疫反應(yīng)。SWNT—GC聯(lián)合療法也有將其它治療劑載入腫瘤的潛力，這樣就能用所需藥劑的聯(lián)合療法來(lái)治療癌癥。
[0013]圖的簡(jiǎn)要描述
[0014]圖1A.免疫修飾納米管系統(tǒng)SWNT-GC的圖解。
[0015]圖1B.不同 SffNT-GC 濃度(頂部曲線，SffNT-GC 濃度:135 μ g/ml-0.73fft % ；SffNT-GC濃度連續(xù)50%降低，下曲線)的SWNT-GC懸液的吸收?qǐng)D譜。
[0016]圖1C.SffNT-GC 的 Raman 光譜。
[0017]圖2A.使用SWNT-GC和激光照射的選擇性光熱作用(熱電偶測(cè)量)。在一個(gè)980nm的激光照射期間，用熱電偶測(cè)量凝膠模型(帶或不帶納米管增強(qiáng))內(nèi)的溫度。激光功率密度為1.13W / cm2,并且照射時(shí)間為5分鐘。熱電偶置于樣品表面下4mm。
[0018]圖2B.使用SWNT-GC和激光照射的選擇性光熱作用(紅外熱感攝像機(jī)測(cè)量)。在激光照射期間，用一個(gè)紅外熱感攝像機(jī)進(jìn)行測(cè)量凝膠模型(帶或不帶納米管增強(qiáng))表面的溫度升高。激光功率密度為1.13W / cm2，并且照射時(shí)間為5分鐘。
[0019]圖3A.激光照射前，不帶納米管增強(qiáng)的凝膠模型中的溫度分布(磁共振溫度測(cè)量法測(cè)量)。
[0020]圖3B.激光照射后，不帶納米管增強(qiáng)的凝膠模型中的溫度分布(磁共振溫度測(cè)量法測(cè)量)。用一個(gè)980nm的激光從底部開始照射樣品。激光功率密度為0.212W / cm2，光束直徑為3.0cm0該圖顯示了激光照射后7分鐘的溫度分布。
[0021]圖3C.激光照射前，帶納米管增強(qiáng)的凝膠模型中的溫度分布(磁共振溫度測(cè)量法測(cè)量)。一個(gè)納米管增強(qiáng)球形凝膠包埋在表面下1mm。
[0022]圖3D.激光照射后，帶納米管增強(qiáng)的凝膠模型中的溫度分布(磁共振溫度測(cè)量法測(cè)量)。一個(gè)納米管增強(qiáng)球形凝膠包埋在表面下1_。用一個(gè)980nm的激光從底部開始照射樣品。激光功率密度為0.212W / Cm2，光束直徑為3.0cm。該圖顯示了激光照射后7分鐘的溫度分布。
[0023]圖4.SffNT載入并轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞內(nèi)的GC的亞細(xì)胞分布。SWNT_GC_FITC(SWNT-GC結(jié)合熒光染料FITC)和GC-FITC(GC結(jié)合一種熒光染料FITC)在EMT6細(xì)胞中的熒光圖像。細(xì)胞用SWNT-GC-FITC和GC-FITC培養(yǎng)2小時(shí)，用激光掃描顯微鏡檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞的FITC熒光。注意，GC只有在附著于SWNT時(shí)才能進(jìn)入細(xì)胞。Bar=IO μ m。
[0024]圖5.不同條件的治療下，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的存活能力。用GC (50 μ g/ml)、SffNT-GC(2.5 μ g-50 μ g / ml)、僅用激光(60，120 或 150J / cm2)、或激光 +SffNT-GC(60,120或150J / cm2 ；1.251 μ g-25 μ g/ml或2.5 μ g-50 μ g/ml)治療腫瘤細(xì)胞。評(píng)估細(xì)胞存活能力之前，治療的細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)。柱，平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差SD(n=4)。[0025]圖6A.SffNT-GC的體內(nèi)免疫作用。小鼠巨噬細(xì)胞分泌的TNF α用GC或SWNT-GC懸液培養(yǎng)，用ELISA檢測(cè)。用不同濃度(25，50和90 μ g/ml，灰色柱)的GC溶液或用不同濃度(2.5 μ g-25 μ g，2.5 μ g-50 μ g 和 2.5 μ g_90 μ g/ml，黑色柱)的 SffNT-GC 溶液培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24小時(shí)。培養(yǎng)后，收集上層清液用于測(cè)定TNF α。柱，平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差SD (η=4)。
[0026]圖6Β.SffNT-GC的體內(nèi)免疫作用:由治療的ΕΜΤ6細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞分泌的TNFa。用 GC (50 μ g/ml)、SffNT-GC (2.5 μ g-50 μ g / ml)、激光(60—150J / cm2)或激光+SffNT-GC (60—150J / cm2, 2.5 μ g-50 μ g / ml)治療的腫瘤細(xì)胞(I:1)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24小時(shí)。沒(méi)有治療的細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)作為對(duì)照組。培養(yǎng)后，收集上層清液用于測(cè)定TNF a。柱，平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差SD(n=4)。
[0027]圖7A.SffNT-GC的不同成分在瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤負(fù)荷的作用:(i)對(duì)照，(i i)SffNTdmg / kg), (iii)GC(25mg / kg)，或(iv) SffNT-GC (lmg-25mg / kg) ;12 只小鼠 / 組。將EMT6細(xì)胞皮下注射到Balb / c雌性小鼠的脅腹中，當(dāng)腫瘤達(dá)到一個(gè)大約300nm3的大小時(shí)，進(jìn)行治療。
[0028]圖7B.激光照射(第O天以0.75W / cm2照射10分鐘)后，不同成分的瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤負(fù)荷的作用:(i)對(duì)照，(?)激光，(iii)激光+GC(25mg / kg), (iv)激光+SWNT(lmg /kg)，或(v)激光+SffNT-GC(lmg-25mg / kg) ；12只小鼠/組。將EMT6細(xì)胞皮下注射到Balb / c雌性小鼠的脅腹中，當(dāng)腫瘤達(dá)到一個(gè)大約300_3的大小時(shí)，進(jìn)行治療。與其它組相比，激光+SWNT-GC和激光+SWNT對(duì)腫瘤的消退更為有效。
[0029]圖8A。不帶激光照射的SWNT和GC的體內(nèi)作用:動(dòng)物存活。通過(guò)不同成分的皮下注射治療(第O天)的荷腫瘤小鼠存活率:(i) SWNT-GC (lmg-25mg / kg) ； (ii) GC (25mg/kg)，(iii) SffNTdmg / kg)，或(iv)對(duì)照:12只小鼠/組。將EMT6細(xì)胞皮下注射到Balb /c雌性小鼠的脅腹中，當(dāng)腫瘤達(dá)到一個(gè)大約300_3的大小時(shí)，進(jìn)行治療。
[0030]圖8B.帶激光照射的SWNT和GC的體內(nèi)作用:動(dòng)物存活。激光照射(第O天以0.75W / cm2照射10分鐘)后，通過(guò)不同成分的皮下注射治療的荷腫瘤小鼠存活率:(i)激光+SWNT-GC (lmg-25mg / kg) ； (ii)激光+SWNT(lmg / kg), (iii)激光+GC (25mg/kg), (iv)激光或(V)對(duì)照；12只小鼠/組。將EMT6細(xì)胞皮下注射到Balb / c雌性小鼠的脅腹中，當(dāng)腫瘤達(dá)到一個(gè)大約300mm3的大小時(shí)，進(jìn)行治療。與其它組相比，激光+SWNT-GC和激光+SWNT對(duì)腫瘤的消退更為有效。
[0031]圖9.成功治療的小鼠的腫瘤再激發(fā)。在初次接種后的100天，用2X106的存活腫瘤細(xì)胞激發(fā)由激光+SWNT-GC或激光+SWNT治療治愈的荷腫瘤小鼠。相同年齡的健康小鼠也接種2 X IO6的腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照。用激光+SWNT-GC治愈的所有小鼠都顯示出對(duì)再激發(fā)的完全抗性；然而，由激光+SWNT治愈的小鼠，雖然其平均存活時(shí)間得到了延長(zhǎng)，但是不能完全對(duì)抗腫瘤的再激發(fā)。
[0032]圖10.使用脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞的繼承性免疫。從激光+SWNT-GC或激光+SWNT成功治愈的小鼠中獲得的脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞收集。從未治療的荷腫瘤小鼠中獲得的脾細(xì)胞也被收集作為對(duì)照免疫細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞與來(lái)自不同小鼠的脾細(xì)胞混合，隨后注射到小鼠體內(nèi)。脾細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的比例為50，000, 000:100, 000 /小鼠。從激光+SWNT-GC治療的小鼠中獲得的脾細(xì)胞能完全抑制腫瘤的生長(zhǎng)；該組中的所有小鼠都存活并且沒(méi)有腫瘤惡化。從激光+SWNT治愈的小鼠和對(duì)照小鼠中獲得的脾細(xì)胞只能分別對(duì)受者提供30%和10%的保護(hù)作用。
[0033]優(yōu)選方案的詳細(xì)描述
[0034]材料和方法
[0035]CoMoCAT 單壁碳納米管(SWNTs)[0036]使用CoMoCAT SWNT是由于其均一尺寸和近紅外光吸收的獨(dú)特性質(zhì)。CoMoCAT法用一個(gè)硅負(fù)載的雙金屬鈷-鑰酸鹽催化劑來(lái)生產(chǎn)單壁碳納米管。該產(chǎn)品由一個(gè)窄分布的納米管類型組成，其平均直徑為0.Slnm0由于在近紅外區(qū)域的吸收特性，尤其是在大約980nm處有強(qiáng)烈吸收，這種類型的納米管一直備受關(guān)注。此類型的納米管在“在非侵入式射頻領(lǐng)域中癌細(xì)胞的碳納米管增強(qiáng)熱破壞”(Gannon CJ, Cherukuri P, Yakobson BL, Cognet L, KanziusJS, Kittrell C, Wesiman RB, Pasquali M, Schmidt HK, Smalley RE, Curley SA(2007) inCancerllO:2654-2665)，“生命科學(xué)中的多光子顯微鏡” (Konig K(2000) in J.Microsc.(Oxford) 200:83-104)，“通過(guò)在雙金屬鈷-鑰催化劑上進(jìn)行的CO催化分解來(lái)控制單壁碳納米管的生產(chǎn)”(Kitiyanan B, Alvarez We, Harwell JH, Resasco DE (2000) in Chem.Phys.Lett.317 =497—503)和“使用一種固體負(fù)載催化劑的單壁碳納米生長(zhǎng)的窄(n，m)分布”(Bachilo SM, Balzano L, Herrera JE, Pompeo F, Resasco DE, Weisman RB (2003) inJ.Am.Chem.Soc.125:11186—11187)中有詳細(xì)討論，每篇文章都被引用為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。
[0037]糖化殼聚糖(GC)
[0038]在本發(fā)明中，GC作為一種特殊的免疫佐劑以及SWNT的一種有效表面活性劑使用。GC作為激光免疫治療的一種免疫刺激物開發(fā)，用于治療轉(zhuǎn)移瘤。在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物研究中，GC是無(wú)毒性的，如之前的試驗(yàn)所證實(shí)的。GC可通過(guò)使用三倍過(guò)量的半乳糖培養(yǎng)殼聚糖的一種水懸液來(lái)合成，隨后用Schiff堿和Amadori產(chǎn)品的混合物的硼氫化物還原來(lái)穩(wěn)定；如“激光免疫療法:一種新型的轉(zhuǎn)移瘤療法”(Chen WR7Carubelli R,Liu H7Nordquist RE (2003)in Mol.Biotechnol.25:37-43)中討論的，此文被引用為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。殼聚糖衍生的生物材料的實(shí)例可在美國(guó)專利N0.5，747, 475中找到，其內(nèi)容被引用為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。除了免疫佐劑的性質(zhì)外，GC的分子結(jié)構(gòu)也能使其成為SWNTs的一種極好的表面活性劑。
[0039]SffNT-GC 和 SWNT-PEG 溶液的制備
[0040]在本發(fā)明中，CoMoCAT SWNT作為碳納米管的一個(gè)實(shí)例使用。其它納米結(jié)構(gòu)，例如納米顆粒、納米簇和納米棒，能與GC —起使用來(lái)構(gòu)造免疫修飾的納米結(jié)構(gòu)。為了制備SWNT-GC溶液，將2.5-2.7mg的原CoMoCAT SffNTs與7ml不同濃度的GC水溶液混合。我們估計(jì)，I一5mg范圍內(nèi)的任何子集范圍內(nèi)的量都是有效的。為了分散SWNTs，用一個(gè)超聲波細(xì)胞破碎儀將混合物超聲處理30分鐘。然后將該SWNTs懸液在30，150g下離心30分鐘。GC溶液中SffNT的最終濃度，可通過(guò)將它的吸光度與已知濃度的校準(zhǔn)SWNT溶液的吸光度對(duì)比獲得。
[0041]光譜測(cè)量
[0042]SffNT-GC的吸光度由一個(gè)紫外可見光吸收光譜儀測(cè)量。為了利用SWNTs的固有光學(xué)特性，測(cè)量期間在沒(méi)有旋轉(zhuǎn)或攪拌的情況下，用Raman光譜法，使用毛細(xì)管確認(rèn)SWNT-GC的結(jié)合。將一個(gè)氬離子激光器(514.5nm)用于一個(gè)40X物鏡的顯微鏡、一個(gè)光譜儀和一個(gè)CCD檢測(cè)器結(jié)合中的激發(fā)。在聚焦于毛細(xì)管中心后，記錄樣品的Raman光譜圖，其分離度為2CHT1 (IOmff功率，20秒收集時(shí)間)。[0043]使用凝膠模型(phantom)的激光+SWNT-GC的選擇性光熱作用
[0044]將具有978nm吸收峰的SWNT，用于SWNT-GC的懸液。將凝膠模型與SWNT-GC懸液混合，來(lái)模擬吸收增強(qiáng)目標(biāo)。一臺(tái)980nm激光器用于SWNT-GC凝膠樣品和一般凝膠樣品的照射。用熱電偶測(cè)量凝膠表面以下4_深度的溫度升高。在激光照射期間，用一臺(tái)紅外熱感攝像機(jī)測(cè)量帶或不帶SWNT-GC增強(qiáng)的凝膠模型的表面溫度。
[0045]在激光照射期間，用一臺(tái)磁共振成像儀測(cè)量凝膠模型內(nèi)部的溫度分布。將明膠凝膠置于一個(gè)圓筒容器中。在激光照射之前和照射期間，也對(duì)一般凝膠塊內(nèi)的溫度分布進(jìn)行測(cè)量。為了提高凝膠的吸收，將含有SWNT-GC懸液的一個(gè)0.5cm半徑的凝膠球體包埋在凝膠中表面下方Imm處，來(lái)模擬深部目標(biāo)腫瘤。在激光照射之前和照射期間，測(cè)量SWNT-GC增強(qiáng)凝膠塊內(nèi)的溫度分布。
[0046]細(xì)胞培養(yǎng)
[0047]此實(shí)驗(yàn)中使用了小鼠乳腺腫瘤系EMT6細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞。在一個(gè)加濕培養(yǎng)箱中，于37°C，5% CO2和95%空氣條件下，在添加了 15%胎牛血清(FCS)、盤尼西林(100units/ml)和鏈霉素(100 μ g/ml)的RPMI (GIBCO)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0048]GC-FITC 和 SWNT-GC-FITC 功能化
[0049]將FITC (13mM，50 μ I)溶解于DMSO中，隨后將其與Iml的GC或SWNT-GC溶液混合。在室溫下，將該混合物培養(yǎng)過(guò)夜，避光，之后用IOOKDa過(guò)濾器(微孔)過(guò)濾GC-FITC或SffNT-GC-FITC以去除多余的FITC。隨后用ΕΜΤ6腫瘤細(xì)胞將GC-FITC和SWNT-GC-FITC培養(yǎng)2小時(shí)，并用激光掃描顯微鏡檢測(cè)來(lái)自細(xì)胞的FITC熒光。
[0050]細(xì)胞存活能力分析
[0051]在一塊24孔的組織培養(yǎng)板中，用不同的SWNT和GC結(jié)合方法培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(I X IO4/孔)2小時(shí)，用PBS洗，并將其暴露于60-150J/cm2 (于0.5-1.25ff/cm2照射2分鐘)照射通量的激光中。光源為一臺(tái)980nm的半導(dǎo)體激光器。
[0052]用基于比色四唑鹽的分析法，用CCK-8試劑盒進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞毒性的測(cè)定。為了檢測(cè)光熱細(xì)胞毒性，用帶或不帶SWNT-GC培養(yǎng)的一臺(tái)980nm激光器照射腫瘤細(xì)胞。0D450，即在450nm處的吸收值，用一塊96孔平板讀數(shù)器讀取，以測(cè)定細(xì)胞的存活能力。
[0053]TNF α 的檢測(cè)
[0054]為了檢測(cè)治療后,腫瘤細(xì)胞刺激時(shí)由巨噬細(xì)胞分泌的TNF α ,用治療的腫瘤細(xì)胞在24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)巨噬細(xì)胞。在24小時(shí)的培養(yǎng)后，收集上層清液用于ELISA檢測(cè)。[0055]動(dòng)物腫瘤模型。
[0056]將0.1ml的EMT6細(xì)胞溶液(I X IO6)注射到6_8周大的Balb/c雌性小鼠的脅腹部位。在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)后的7-10天，當(dāng)腫瘤達(dá)到大約300mm3的大小時(shí)，將動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)中。
[0057]用激光+SWNT-GC治療動(dòng)物腫瘤
[0058]將荷腫瘤小鼠分為不同的治療組(12-16只小鼠/組)。在用一臺(tái)980-nm的激光器進(jìn)行照射前的 2 小時(shí)，將 0.1-ml 含有 5mg/ml (25mg/kg)GC 或 0.2mg/ml (lmg/kg) SffNT 或0.2-5mg/ml (lmg-25mg/kg) SffNT-GC的溶液直接注射到每個(gè)腫瘤的中心。用一個(gè)光導(dǎo)纖維傳輸系統(tǒng)傳輸激光。對(duì)于10分鐘的治療時(shí)間，治療部位(包含腫瘤和0.5到Icm的周圍皮膚)的功率密度為0.75ff/cm2。在激光照射期間，通過(guò)戊巴比妥鈉的腹膜內(nèi)注射將小鼠麻醉，并將其約束在一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的固定器中。治療后，在100天的期限內(nèi)，每天觀察小鼠，并每隔一天進(jìn)行一次腫瘤的測(cè)量。
[0059]繼承性免疫轉(zhuǎn)移
[0060]用2 X IO6細(xì)胞/小鼠的增加量的腫瘤激發(fā)激光+SWNT-GC和激光+SWNT成功治療的小鼠。同時(shí)，相同年齡的對(duì)照小鼠用相同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤培養(yǎng)的28天后，用頸椎脫臼法將小鼠處死，切割它們的脾臟，去除脂肪。用機(jī)械破碎制備脾細(xì)胞懸液，并將其倒入具有10% FCS的培養(yǎng)基中?；旌现?，在一臺(tái)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上對(duì)脾細(xì)胞和存活的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)?；旌衔镏衅⒓?xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的比例為500: I。用0.2-ml含有5X107脾細(xì)胞和IO5腫瘤細(xì)胞的混合物培養(yǎng)小鼠。
[0061]在用不同的激光、SWNT和GC結(jié)合治療的7天后，在EMT6腫瘤細(xì)胞的存在下，將來(lái)自治療小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)5天，之后用CCK8評(píng)估細(xì)胞毒性。
[0062]結(jié)果
[0063]SffNT-GC 的特征
[0064]在溶液的最終離心后，獲得穩(wěn)定的SWNT-GC懸液。SffNT-GC的圖解在圖1A中給出。SWNT-GC的近紅外吸收光譜在980nm周圍呈現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)譜帶(圖1B)，這是CoMoCAT樣品的典型表現(xiàn)。SWNT-GC的Roman光譜在圖1C中給出。GC溶液在此光譜窗的吸光度非常低。
[0065]測(cè)得的SWNT懸液在GC中的諧振率為0.140，能與NaCholate (具有相似的比率為
0.147，文獻(xiàn)中所報(bào)告的一種最好的表面活性劑)相比。在4°C條件下，SffNT-GC儲(chǔ)藏超過(guò)6個(gè)月后仍可保持穩(wěn)定。
[0066]將SWNT-GC用于光吸收增強(qiáng)，用熱電偶測(cè)量凝膠模型表面以下4_深度的溫度升高。如圖2A中所示，在SWNT-GC增強(qiáng)凝膠和一般凝膠之間可獲得一個(gè)12°C的差異。冷凍樣品的表面溫度升高如圖2B中所示。在相同的條件下，這些增長(zhǎng)證明了 SWNT-GC在980nm處的選擇性。目標(biāo)樣品的溫度升高能通過(guò)調(diào)節(jié)SWNT-GC的濃度和激光的設(shè)置來(lái)控制。
[0067]在激光照射之前和激光照射期間，一般凝膠塊內(nèi)的溫度分度可通過(guò)磁共振溫度測(cè)量法獲得，如圖3A和3B所示。在激光照射之前和激光照射期間，SWNT-GC增強(qiáng)凝膠塊內(nèi)的溫度分布如圖3C和3D中所示。結(jié)果顯示出SWNT-GC增強(qiáng)目標(biāo)中較高的溫度升高。
[0068]為了確認(rèn)SWNT能否將GC載入腫瘤細(xì)胞，用FITC，一種熒光標(biāo)記，將SWNT-GC功能化，并觀察來(lái)自SWNT-GC-FITC或GC-FITC培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的熒光發(fā)射。EMT6細(xì)胞的共軛焦點(diǎn)影像顯示出SWNT-GC-FITC主要積聚于細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞內(nèi)部不存在GC-FITC(圖4)。
[0069]這些結(jié)果顯示，作為一種獨(dú)特的準(zhǔn)一維材料，SffNT能將GC載入腫瘤細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)激光照射下，目標(biāo)腫瘤細(xì)胞中短暫和空間同步的光熱和免疫反應(yīng)。
[0070]為了測(cè)定激光照射下SWNT-GC的細(xì)胞毒性，用SWNT-GC溶液將EMT6腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)，隨后用一臺(tái)980nm的激光器進(jìn)行照射。腫瘤的細(xì)胞毒性取決于SWNT-GC的濃度和激光劑量(圖5)。
[0071]SWNT-GC的體外免疫刺激
[0072]免疫學(xué)的觀察顯示，當(dāng)用小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在規(guī)定的濃度下GC和SWNT-GC能刺激相似水平的TNF α分泌，并且TNF α分泌的水平會(huì)隨著GC濃度增長(zhǎng)(圖6Α)。這些結(jié)果顯示穩(wěn)定的SWNT-GC懸液保持了 GC的免疫能力。
[0073]為了測(cè)定治療的腫瘤細(xì)胞誘發(fā)的免疫反應(yīng)，進(jìn)行ELISA來(lái)測(cè)量巨噬細(xì)胞(在不同的治療后，用腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí))分泌的TNF α。如圖6Β中所示，用GC或SWNT-GC培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞能刺激某一水平的TNFa分泌，然而，單獨(dú)的低劑量激光照射^OJ/cm2)不能提高巨噬細(xì)胞的活性。用高劑量激光照射(120或150J/cm2)治療的腫瘤細(xì)胞也能刺激巨噬細(xì)胞分泌TNFa，因?yàn)榧す鈱?dǎo)致了細(xì)胞的死亡。然而，在這些高激光劑量下，用激光+SWNT-GC治療的腫瘤細(xì)胞，其引起的TNFa分泌水平更高(圖6B)。
[0074]SWNT-GC 體內(nèi)作用
[0075]將EMT6細(xì)胞皮下注射到Balb/c雌性小鼠的脅腹內(nèi)。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約300nm3的大小時(shí)，將動(dòng)物分成8個(gè)不同的治療組。治療后，每天觀察小鼠，并用一把卡尺每隔一天測(cè)量一次腫瘤體積。通過(guò)注射 SWNT (lmg/kg，PEG)、GC(25mg/kg)或 SWNT-GC(lmg-25mg/kg)治療的小鼠，其平均腫瘤負(fù)荷與未治療的對(duì)照小鼠的腫瘤負(fù)荷類似(圖7A);在這三組中，沒(méi)有小鼠呈現(xiàn)出腫瘤的消退。與之相反，用激光照射(以0.75ff/cm2照射10分鐘)治療的小鼠，其平均腫瘤負(fù)荷明顯小于對(duì)照小鼠的腫瘤負(fù)荷(圖7B)。激光+SWNT和激光+SWNT-GC療法引起了明顯的腫瘤消退(圖7B)。
[0076]對(duì)于存活能力研究，每個(gè)治療組使用16只小鼠，并在腫瘤培養(yǎng)后，對(duì)小鼠進(jìn)行100天的監(jiān)控。在單獨(dú)注射SWNT、GC或SWNT-GC溶液治療的小鼠之間，沒(méi)有長(zhǎng)期的存活者，盡管在GC和SWNT-GC組的小鼠，其平均存活時(shí)間稍微較長(zhǎng)(圖8A)。在功率密度為0.75ff/cm2的激光照射下，激光+SWNT-GC組中存活率為100%，激光+SWNT組中為56%，激光+GC組中為38%，僅用激光的組中為25% (圖8B)。在激光+SWNT組中的16只小鼠中有9只存活，但是只在3只小鼠中觀察到腫瘤的消退?？偠灾?，圖8中的結(jié)果證實(shí)，激光+SWNT-GC的聯(lián)合療法是最有效的治療，其存活率和腫瘤消退比激光、SWNT和GC的其它聯(lián)合療法要高很多。
[0077]已治愈小鼠的再激發(fā)
[0078]在初次腫瘤培養(yǎng)(10只小鼠/組)后，用2X IO6的存活腫瘤細(xì)胞激發(fā)用激光+SffNT-GC和激光+SWNT成功治療的小鼠。用2X IO6的存活腫瘤細(xì)胞/小鼠接種相同年齡的10只初治小鼠作為對(duì)照。如圖9所示，激光+SWNT-GC治愈的所有小鼠對(duì)激發(fā)有完全的抗性。然而,激光+SWNT治愈的所有小鼠，其原發(fā)性腫瘤會(huì)惡化，并在腫瘤再激發(fā)的80天內(nèi)死亡。對(duì)照組的所有小鼠,其原發(fā)性腫瘤會(huì)惡化,并在腫瘤接種的40天內(nèi)死亡。激光+SWNT-GC治愈的小鼠，用增加量的腫瘤進(jìn)行第二次激發(fā)(3X106/小鼠)。它們?cè)僖淮瓮耆挚沽四[瘤的再激發(fā)。
[0079]繼承性免疫轉(zhuǎn)移[0080]將從激光+SWNT-GC或激光+SWNT成功治療的小鼠中獲得的脾細(xì)胞作為免疫細(xì)胞收獲。未治療的荷腫瘤小鼠的脾細(xì)胞也作為對(duì)照被收集。脾細(xì)胞與存活的腫瘤細(xì)胞以500: I的比例混合。用IO5的存活腫瘤細(xì)胞和5 X IO7的從各治療組獲得的脾細(xì)胞培養(yǎng)小鼠。圖10顯示了用脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞混合物培養(yǎng)的小鼠的存活率。從激光+SWNT-GC治愈的小鼠中獲得的脾細(xì)胞為受者提供了 100%的保護(hù)，而從激光+SWNT治愈的小鼠中獲得的脾細(xì)胞僅為受者提供了 30%的保護(hù)。從荷腫瘤對(duì)照小鼠中獲得的脾細(xì)胞僅為受者提供了10%的保護(hù)(圖10)。在繼承性免疫轉(zhuǎn)移后的60天，所有由來(lái)自激光+SWNT-GC治愈的小鼠的脾細(xì)胞保護(hù)的小鼠都再次用2X106的腫瘤細(xì)胞激發(fā)；所有小鼠都抵抗了第二次激發(fā)。
[0081]討論
[0082]癌癥，尤其是轉(zhuǎn)移癌的理想療法，應(yīng)該通過(guò)微創(chuàng)局部干預(yù)達(dá)到系統(tǒng)的腫瘤特異性免疫反應(yīng)。這種方法能抑制局部腫瘤，同時(shí)根除遠(yuǎn)部位的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，為受者提供抗腫瘤免疫和最低的副作用。使用激光的光熱反應(yīng)是一種理想的局部干預(yù)，這是因?yàn)樗芫_地將能量傳輸至目標(biāo)組織，并有效的利用腫瘤細(xì)胞對(duì)溫度升高的敏感性。
[0083]近紅外區(qū)的激光，結(jié)合適當(dāng)?shù)墓馕談?，?duì)選擇性光熱干預(yù)尤為有效，這是由于生物組織在近紅外區(qū)的低吸光度。
[0084]SffNTs已作為治療靶標(biāo)使用，來(lái)降低對(duì)癌細(xì)胞的熱損傷。它顯示出能通過(guò)暴露于持續(xù)近紅外光或射頻照射中誘發(fā)內(nèi)化的SWNTs殺死癌細(xì)胞。
[0085]通過(guò)將免疫刺激物引入腫瘤，能顯著提高抗腫瘤免疫反應(yīng)，尤其是與其它干預(yù)聯(lián)合使用時(shí)。在適當(dāng)使用時(shí)，這樣的免疫刺激物能通過(guò)刺激受者免疫系統(tǒng)顯著提高癌癥治療的功效，比如，當(dāng)短棒狀桿菌、卡介苗或其它免疫佐劑皮下注射時(shí)，結(jié)合光療法。
[0086]CoMoCAT方法制成的SWNTs，其尺寸均一，并在980nm左右有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，從而成為選擇性光熱作用在局部干預(yù)中所需的一種理想光吸收劑。使用一臺(tái)980nm激光器和CoMoCAT SffNT的選擇性光熱激光-組織作用已通過(guò)體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
[0087]之前，在動(dòng)物研究中，GC也作為一種免疫佐劑用于癌癥治療中?，F(xiàn)在提出的新型SffNT-GC系統(tǒng)的目的是進(jìn)一步改進(jìn)激光免疫療法。CoMoCAT和GC的分子結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生穩(wěn)定、均一的SWNT懸液，將GC作為一種有效的表面活性劑使用(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚地顯示SffNT-GC保持了 SWNT的光學(xué)特性(圖2和3)和GC的免疫特性。
[0088]SffNT-GC的結(jié)合是因?yàn)镾WNT和GC的電子結(jié)構(gòu)也為該新型系統(tǒng)提供了一種獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):將GC載入腫瘤細(xì)胞中。通常，免疫刺激物，比如糖化殼聚糖(GC)，一種長(zhǎng)鏈聚合物，不能直接進(jìn)入細(xì)胞中，如實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)的(圖4，頂面板)。SWNT顯示出一種進(jìn)入細(xì)胞，并停留在不同的亞細(xì)胞成分中的能力，取決于SWNT攜載的分子。當(dāng)GC與SWNT結(jié)合時(shí)，它能被載入到腫瘤細(xì)胞中(圖4，底面板)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的GC能作為一種外源性免疫刺激物作用，從而進(jìn)一步提高通過(guò)激光+SWNT-GC的光熱和免疫反應(yīng)結(jié)合誘發(fā)的免疫反應(yīng)。
[0089]SffNT-GC系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于它在腫瘤治療期間同步發(fā)生的協(xié)同光熱和免疫反應(yīng)。尤其是，SffNT選擇性吸收980-nm的激光，引起腫瘤細(xì)胞的破壞，從而為受者提供一種外源性的細(xì)胞壓力和腫瘤免疫。另外，GC在相同的光熱治療部位提高了免疫反應(yīng)，這是由于它與SffNT的結(jié)合所致。因此，由于SWNT和GC的獨(dú)特結(jié)合，它們能在相同的時(shí)間以相同的腫瘤細(xì)胞為目標(biāo)，從而引起協(xié)同的光熱和免疫反應(yīng)。
[0090]體外和體內(nèi)結(jié)果證實(shí)了激光+SWNT-GC在治療動(dòng)物腫瘤中的有效性。[0091]然而，GC或SWNT-GC單獨(dú)使用時(shí)，不能引起體外的腫瘤細(xì)胞死亡，與激光照射結(jié)合時(shí)，尤其是在較高的劑量(120和150J/cm2)時(shí)，它們能顯著提高細(xì)胞毒性(圖5)。類似的，激光+SWNT-GC治療的腫瘤細(xì)胞能從巨噬細(xì)胞中誘發(fā)更高水平的TNF α分泌，如圖6中的數(shù)據(jù)所示。這些結(jié)果證實(shí)，激光照射、SffNT光吸收和GC免疫刺激的協(xié)同作用。
[0092]體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了激光、SWNT和GC之間的協(xié)同作用，如圖7所示。SWNT，GC或SWNT-GC的皮下注射不會(huì)引起腫瘤的消退(圖7Α)，盡管使用GC(GC或SWNT-GC)單成分的治療延長(zhǎng)了小鼠的中位存活時(shí)間(圖8A)。這些結(jié)果可歸于由GC誘發(fā)的受者非特異性免疫反應(yīng)，提高了腫瘤的抗性，盡管這樣的反應(yīng)不能選擇性的破壞腫瘤細(xì)胞，如體外(圖5)和體內(nèi)(圖7A)的結(jié)果所證實(shí)的。當(dāng)使用激光照射時(shí)，SWNT-GC的作用能被顯著提高，無(wú)論在體內(nèi)(圖5)還是體外(圖7B)。激光+SWNT-GC的治療引起了腫瘤的完全抑制，同時(shí)，激光+SWNT的治療也引起的明顯的腫瘤抑制(圖7B)。特別地，在使用0.75ff/cm2的激光功率密度和10分鐘的照射時(shí)間時(shí)，激光+SWNT-GC能達(dá)到100%的治愈率，比用激光+SWNT治療的56%治愈率高很多(圖8B)。[0093]激光+SWNT-GC成功治療的小鼠能抵抗隨后大量腫瘤的激發(fā)；此組中所有的治愈小鼠都顯示能完全抵抗腫瘤的再激發(fā)(圖9)。然而，用激光+SWNT成功治療的小鼠，其原發(fā)性腫瘤會(huì)惡化，并在腫瘤再激發(fā)后的大約80天死亡(圖9)。這些結(jié)果證實(shí)了 GC在誘發(fā)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的抗腫瘤免疫中的重大作用。
[0094]當(dāng)動(dòng)物注射了一種脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的混合物時(shí)，從激光+SWNT-GC治愈的小鼠中獲得的脾細(xì)胞為正常的受者小鼠提供了 100%的保護(hù)，如圖10中所示。相比而言，從激光+SWNT治愈的小鼠中獲得的脾細(xì)胞只能向受者小鼠提供部分保護(hù)(圖10)。這些結(jié)果表明，激光+SWNT-GC在免疫細(xì)胞中誘發(fā)了長(zhǎng)期記憶，這仍是由于GC的作用。
[0095]假設(shè)激光+SWNT-GC在治療腫瘤中的機(jī)制在于選擇性光熱反應(yīng)和免疫刺激之間的協(xié)同反應(yīng)。光熱反應(yīng)減少了腫瘤負(fù)荷，同時(shí)暴露了腫瘤抗原；免疫佐劑首先原位刺激受者的免疫系統(tǒng)，隨后指引免疫系統(tǒng)對(duì)抗特定的腫瘤細(xì)胞。實(shí)際上，在每個(gè)單獨(dú)的受者中，激光免疫療法產(chǎn)生了一種原位自動(dòng)疫苗。該串聯(lián)效應(yīng)不僅可以完全根治腫瘤，也可以引起長(zhǎng)期的腫瘤特異性免疫。因此，該方法通過(guò)局部干預(yù)，為單個(gè)受者提供了系統(tǒng)性免疫療法，而不需要通常要求的免疫交叉反應(yīng)。
[0096]在本發(fā)明中，一種免疫佐劑作為一種表面活性劑使用，有效地溶解了納米管，從而在激光照射下提供了協(xié)同的光熱和免疫作用。本發(fā)明中的該系統(tǒng)，由于其獨(dú)特的光學(xué)特性和免疫功能，能用于腫瘤的治療中，尤其是轉(zhuǎn)移瘤的治療中。本發(fā)明的系統(tǒng)，由于SWNT和GC的有力結(jié)合，使得GC能被載入到腫瘤細(xì)胞中，從而進(jìn)一步提高激光+SWNT-GC的光熱和免疫作用。
[0097]總之，由激光+SWNT_GC(能同時(shí)空間和短暫地將腫瘤細(xì)胞定為目標(biāo))提供的選擇性光熱作用和腫瘤特異性免疫刺激，能作為一種有效的癌癥療法使用。
[0098]因此，本發(fā)明適合進(jìn)行上述的目的，并達(dá)到上述的結(jié)果和優(yōu)勢(shì)。雖然出于本披露的目的是描述了優(yōu)選表現(xiàn)，仍明顯可見工藝的普通技術(shù)需要大量變更和改進(jìn)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于引起腫瘤細(xì)胞的破壞和抗腫瘤免疫反應(yīng)的光免疫療法，其包括: 內(nèi)化納米結(jié)構(gòu)，將其作為一種光吸收劑，用于宿主腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊中。 將上述細(xì)胞團(tuán)塊暴露于連續(xù)的近紅外光或射頻照射中，以提供外源性的細(xì)胞熱損壞或壓力，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡,并將上述腫瘤細(xì)胞暴露于腫瘤抗原中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)用一種免疫刺激物修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中: 上述的免疫刺激物為糖化殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括: 皮下給藥至上述腫瘤細(xì)胞，與上述納米結(jié)構(gòu)結(jié)合的免疫刺激物，上述從一個(gè)包含短棒狀桿菌、卡介苗或其它免疫佐劑的組中選擇的免疫刺激物； 其中，上述的納米結(jié)構(gòu)為單壁碳納米管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括: 皮下給藥至上述的腫瘤細(xì)胞，免疫刺激物與上述從一個(gè)包含納米顆粒、納米簇和納米棒的組中選擇的納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，上述免疫刺激物從一個(gè)包含短棒狀桿菌、卡介苗或其它免疫佐劑的組中選擇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中: 上述的納米顆粒、納米簇和納米棒由黃金組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)在700-1500nm的范圍內(nèi)有一個(gè)強(qiáng)吸收峰。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，其波長(zhǎng)范圍為800-1200nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中: 上述的近紅外光由一臺(tái)980-nm的激光器產(chǎn)生。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中: 上述的近紅外光由一個(gè)激光功率密度在0.1到5W / Cm2的激光器產(chǎn)生，以5-60分鐘的照射時(shí)間進(jìn)行照射。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中: 上述的近紅外光由一臺(tái)功率密度在0.75到2W / cm2的激光器產(chǎn)生。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中: 上述的近紅外光以10-30分鐘的照射時(shí)間進(jìn)行照射。
13.一種化合物，包含: 溶解于一種糖化殼聚糖水溶液的納米結(jié)構(gòu)； 由此,上述的糖化殼聚糖是使上述水溶液穩(wěn)定的一種表面活性劑； 其中上述的糖化殼聚糖是一種免疫刺激物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的化合物，其中: 其中，上述的納米結(jié)構(gòu)為單壁碳納米管。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的化合物，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)由一種免疫刺激物修飾。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的化合物，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)在800-1200nm的范圍內(nèi)有一個(gè)強(qiáng)吸收峰。
17.一種免疫活性化合物，包含: 一種由糖化殼聚糖分子包覆的納米結(jié)構(gòu)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的免疫活性化合物，其中: 其中，上述的納米結(jié)構(gòu)為單壁碳納米管。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的免疫活性化合物，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)由一種免疫刺激物修飾。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的免疫活性化合物，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)在800-1200nm的范圍內(nèi)有一個(gè)強(qiáng)吸收峰。
21.一種將免疫刺激物轉(zhuǎn)移至一個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊，以及產(chǎn)生靶向、協(xié)同光物理和免疫學(xué)反應(yīng)的方法，包含: 用糖化殼聚糖包覆一個(gè)納米結(jié)構(gòu)； 用上述納米結(jié)構(gòu)穿透 一個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊的細(xì)胞膜。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的免疫活性化合物，其中: 其中，上述的納米結(jié)構(gòu)為單壁碳納米管。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，包含以下步驟: 在上述穿透步驟后照射上述的納米結(jié)構(gòu)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中: 上述的照射步驟，包括將上述細(xì)胞團(tuán)塊暴露于近紅外光中，以促發(fā)協(xié)同的、同步發(fā)生的光熱和免疫反應(yīng)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中: 上述的近紅外光由一臺(tái)980-nm的激光器產(chǎn)生。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中: 上述的激光器有0.75到2W / cm的激光功率密度； 上述的照射步驟包含用一個(gè)10到30分鐘的照射時(shí)間進(jìn)行照射。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中: 上述的照射步驟，包括將上述細(xì)胞團(tuán)塊暴露于射頻照射中，以促發(fā)協(xié)同的、同步發(fā)生的光熱和免疫反應(yīng)。
28.權(quán)利要求書缺28.
29.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包含以下步驟: 用一種免疫刺激物修飾上述納米結(jié)構(gòu)。
30.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中: 上述的納米結(jié)構(gòu)在800-1200nm的范圍內(nèi)有一個(gè)強(qiáng)吸收峰。
31.一種制作單壁碳納米管/糖化殼聚糖化合物的方法，包含: 制備一種糖化殼聚糖的水溶液 將單壁碳納米管混合到上述的水溶液中，形成一種混合物； 超聲處理上述的混合物來(lái)分散上述的單壁碳納米管； 離心上述混合物； 將上述混合物的吸光度與一個(gè)已知濃度的校準(zhǔn)化合物的吸光度進(jìn)行比較，來(lái)測(cè)定上述的單壁碳納米管在上述混合物中的濃度。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中: 上述的單壁碳納米管是通過(guò)在雙金屬鈷-鑰催化劑上進(jìn)行Co的催化分解來(lái)生產(chǎn)。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中: 上述的混合步驟將大約2.5到2.7mg的上述單壁碳納米管與大約7ml的上述糖化殼聚糖水溶液混合。
【文檔編號(hào)】A61N5/06GK103841978SQ201280010837
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月28日
【發(fā)明者】陳偉 申請(qǐng)人:俄克拉荷馬州立中央大學(xué)