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用于在具有或不具有抑制物的情況下治療血友病a或b的新型促凝血分子引誘物的制作方法

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用于在具有或不具有抑制物的情況下治療血友病a或b的新型促凝血分子引誘物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療具有或不具有抑制物的血友病A或B患者的出血性事故的包含修飾的因子X(jué)a(GDXa)的藥物組合物,所述修飾的GDXa是非血栓性的,能夠結(jié)合到TFPI上但不能結(jié)合到磷脂上。
【專利說(shuō)明】用于在具有或不具有抑制物的情況下治療血友病A或B的新型促凝血分子引誘物
[0001]本發(fā)明涉及通過(guò)修飾的因子X(jué)預(yù)防或治療血友病A或B的患者的出血事故的藥物組合物。
[0002]血友病A,和血友病B—樣包括兩種類型的血友病——體質(zhì)性血友病(constitutional hemophilia)和獲得性血友病(acquired hemophilia)。
[0003]A型體質(zhì)性血友病是一種出血性疾病,其特征在于FVIII基因異常導(dǎo)致的FVIII的定量或定性缺乏。B型體質(zhì)性血友病也是一種出血性疾病,但是其特征在于FIX基因異常導(dǎo)致的FIX的定量或定性缺乏。
[0004]A型或B型的獲得性血友病定義為出現(xiàn)針對(duì)所述FVIII或FIX的自身抗體。
[0005]血友病反映為缺 乏響應(yīng)出血的凝血。未經(jīng)治療的A型或B型血友病具有在受傷時(shí)過(guò)量出血和有時(shí)甚至自發(fā)出血的癥狀。
[0006]以正常水平的百分比的形式評(píng)估因子VIII或IX的生物活性。正常個(gè)體被認(rèn)為具有100%的活性。如果該活性不可檢測(cè)(低于1%),其為嚴(yán)重的血友病,如果該活性為I至5%,該血友病被稱作中度血友病;高于該值并最高達(dá)30%,其為輕微的血友病。
[0007]患有血友病A和B的患者可以分別用含有FVIII或FIX的濃縮物治療,該濃縮物可以是來(lái)自于基因工程的血漿衍生物或產(chǎn)品。這些濃縮物可以在每次出血時(shí)使用,在這種情況下,最好在出現(xiàn)最初跡象時(shí)盡可能快地開(kāi)始治療。也可以預(yù)防性地給與治療,每周定期2至3次以防止出血。但是,這種治療會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)針對(duì)FVIII或FIX的抗體(所謂抑制物)。所述抗體的存在隨即使得施用因子VIII或IX無(wú)效。這些抗體是G類免疫球蛋白,主要是IgG4。它們?cè)谑状谓o藥后不久,通常在第十次給藥前出現(xiàn)。一些患者保持差的響應(yīng)(抗體滴度〈10U.B),另一些所謂強(qiáng)響應(yīng)患者達(dá)到了意味著他們不能再用相應(yīng)因子治療的滴度。
[0008]截至本發(fā)明,尚無(wú)治療方法可以令人滿意地預(yù)防和/或治療具有抑制物的血友病A或B患者的出血風(fēng)險(xiǎn)的存在。事實(shí)上,可用產(chǎn)品可能是無(wú)效的(Astermark J、DonfieldSM、DiMichele DM、Gringeri A、Gilbert SA、Waters J、Berntorp E,對(duì)FSG0 A randomizedcomparison of bypassing agents in hemophilia complicated by an inhibitor:theFEIBA NovoSeven Comparative (FENOC) Study.Blood.2007; 109:546-51 ),或者它們的施用可能并發(fā)血栓形成事件(Aledort LM.Comparative thrombotic event incidenceafter infusion of recombinant factor Vila versus factor VIII inhibitor bypassactivity.J Thromb Haemost.2004;2:1709.)。
[0009]因此存在對(duì)現(xiàn)有療法的替代療法的已知需要。但是,此類療法的開(kāi)發(fā)已經(jīng)證實(shí)非常困難,因?yàn)樵摨煼ū仨?
[0010]-能夠停止出血,
[0011]-不會(huì)導(dǎo)致血栓形成,
[0012]-即使在抗-FVIII或FIX抗體的存在下也能夠治療或預(yù)防出血事故。
[0013]本發(fā)明回應(yīng)了這種需求;本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療血友病A或B的患者的出血事故的包含修飾的活化因子X(jué) (FXa)的藥物組合物,所述修飾的FXa (⑶Xa)是非血栓性的,并且能夠結(jié)合到組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor) (TFPI)上而不具有磷脂結(jié)合位點(diǎn)(phospholipid binding site)。
[0014]本發(fā)明的組合物還可用于預(yù)防或治療存在抗-因子VIII (FVIII)或因子IX(FIX)抗體的血友病患者的出血事故。該抗體在用因子FVIII或FIX治療后出現(xiàn),或例如在獲得性血友病中自發(fā)地出現(xiàn)。
[0015]本發(fā)明還涉及包含修飾的活化因子X(jué)a (⑶Xa)的藥物組合物用于預(yù)防或治療血友病A或B的患者的出血事故的用途,所述患者具有或不具有抗-FVIII或FIX抗體(ant1-FVIII or FIX antibodies)。
[0016]本發(fā)明還涉及通過(guò)施用修飾的因子X(jué)a (⑶Xa)預(yù)防性治療血友病A或B患者的出血性綜合癥的方法。
[0017]本發(fā)明還涉及通過(guò)施用修飾的因子X(jué)a (⑶Xa)治療血友病A或B患者的出血事故的方法。
[0018]在本發(fā)明的上下文中,提到因子FXa是指通過(guò)激活天然存在于血漿中或以其原始未修飾形式處于分離狀態(tài)的天然因子獲得的激活因子。該術(shù)語(yǔ)包括從血漿中分離的FXs,也包括已經(jīng)激活的重組產(chǎn)生或通過(guò)化學(xué)合成獲得的FXs。因子X(jué)a或天然因子X(jué)a (FXa)在本發(fā)明的上下文中是指參與凝血并以惰性形式——因子X(jué) (FX)制得的絲氨酸蛋白酶類型蛋白質(zhì)。
[0019]凝血因子X(jué)的激活是凝血和阻止出血中的關(guān)鍵步驟。其激活對(duì)于凝血的傳播和擴(kuò)增步驟而言是必須的。其激活對(duì)于通過(guò)其與TFPI的相互作用停止凝血激活而言也是必須的。
[0020]通過(guò)激活因子IX及其輔因子一激活因子VIII或通過(guò)激活因子VII及其輔因子一組織因子(TF)激活FX 。FXa構(gòu)成凝血酶原酶復(fù)合物,其結(jié)合到具有激活因子V的膜上,并且是該凝血酶原酶復(fù)合物中的活性組分,該凝血酶原酶復(fù)合物催化凝血酶原向凝血酶的轉(zhuǎn)化。在其運(yùn)行過(guò)程中,凝血酶催化血纖蛋白原向血纖蛋白的轉(zhuǎn)化,這導(dǎo)致在血液中形成凝塊,并停止出血。FXa的活性可以稱為“促凝血活性”。
[0021]Leytus 等(Biochemistry, 1986,25: 5098-5102)和 Venkateswarlu 等(Biophysical Journal, 2002,82:1190-1206)描述了因子X(jué)和存在于這種多肽中的各種域。該重鏈的催化分裂能夠?qū)X活化為FXa。FXa包含輕鏈(其一個(gè)實(shí)例由序列標(biāo)識(shí)符SEQ IDN0.1表示)和重鏈(其一個(gè)實(shí)例由序列標(biāo)識(shí)符SEQ ID N0.2表示)。
[0022]在本發(fā)明的上下文中,術(shù)語(yǔ)“修飾的FXa”是指不再能結(jié)合到磷脂上、不再具有促凝血活性或具有降低的促凝血活性的FXa。在本發(fā)明的上下文中,此類因子稱為GDXa?!按倌钚浴倍x為因子導(dǎo)致凝血或凝塊形成的能力。降低的促凝血活性標(biāo)志著該活性相對(duì)于天然FXa的活性降低至少50%、優(yōu)選至少90%或甚至更優(yōu)選超過(guò)95%。
[0023]本發(fā)明的修飾的因子X(jué)a,⑶Xa,缺少其用于結(jié)合到磷脂上的Y-羧基谷氨酸(Gla)域。該輕鏈的前43個(gè)氨基酸(SEQ ID N0.1的殘基1_43)代表該Gla域,當(dāng)其含有11個(gè)翻譯后修飾的殘基(Y-羧基谷氨酸)時(shí)。用胰凝乳蛋白酶消化使得能夠抑制殘基1-43,使得能夠生成缺少其用于結(jié)合到磷脂上的域的FXa或⑶Xa (對(duì)于Gla Domainless FXa而言)。除了缺少其Gla域之外,所述⑶Xa還可以包含其它修飾。所述修飾的FXa保留了結(jié)合到因子Va上的性質(zhì),但是不具有促凝血活性。GDXa的一個(gè)實(shí)例由以下序列標(biāo)識(shí)符表示:對(duì)其輕鏈由SEQ ID N0.7或由SEQ ID N0.3表示,對(duì)其重鏈由SEQ ID N0.2表示。不存在促凝血活性可以通過(guò)在不存在組織因子的情況下將其添加到血漿中時(shí)不能活化凝血來(lái)確定,這將其與天然因子X(jué)a區(qū)別開(kāi)來(lái)。
[0024]⑶Xa可以通過(guò)由胰凝乳蛋白酶控制的蛋白酶解法分裂因子X(jué)并根據(jù)例如Skogen等人所述(1984)的一般方法通過(guò)特異性蛋白酶激活來(lái)獲得。在其激活前的GDX的一個(gè)實(shí)例可以由以下序列標(biāo)識(shí)符表示:對(duì)其核苷酸序列由SEQ ID N0.20表示,對(duì)其氨基酸序列由SEQ ID N0.28 表示。
[0025]GDXa可以通過(guò)化學(xué)合成以單一序列形式或以隨后連接在一起的幾個(gè)序列的形式制得。這種合成可以在固相中或在溶液中進(jìn)行。這些技術(shù)更特別由Atherton和Shepard描述在“Solid phase peptide synthesis”(IRL Press Oxford, 1989)中和由 Houbenweyl描述(在“Methoden der organischen Chemie,,中[Methods in Organic Chemistry]由E.Wunsch出版,卷15-1和11, Stuttgart, 1974),以及描述在下列論文中:Ρ.E.Dawson等(Sciencel994; 266 (5186),第 776-779 頁(yè));G G Kochendoerfer 等(1999; 3 (6),第 665-671頁(yè));P E Dawson 等(2000,69, Annu.Rev.Biochem.,第 923-960 頁(yè))。
[0026]⑶Xa是非血栓性的;其不具有促凝血活性可以通過(guò)測(cè)量凝血酶生成的試驗(yàn)來(lái)確定(Hemker 等,Thrombosis and Haemostasis.1993; 70:617-624,參比例 4)。
[0027]使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何試驗(yàn)確定GDXa結(jié)合到TFPI上的能力。此類試驗(yàn)描述在實(shí)施例1中,采用能夠測(cè)定通過(guò)TFPI抑制FXa和⑶Xa的百分率的顯色基底。
[0028]在本發(fā)明的另一方面中,⑶Xa不僅缺少其Gla域,還缺少域EGFl (表皮生長(zhǎng)因子
1)。本發(fā)明的此類用途可以表示為包含其輕鏈由SEQID N0.4表示且其重鏈由SEQ ID N0.2表示的⑶Xa的組合物。
[0029]在本發(fā)明的另一方面中,⑶Xa不僅缺少其Gla域,還缺少域EGF2 (表皮生長(zhǎng)因子
2);此類⑶Xa的一個(gè)實(shí)例由以下序列標(biāo)識(shí)符表示:對(duì)其輕鏈由SEQID N0.5表示,對(duì)其重鏈由 SEQ ID N0.2 表示。
[0030]在本發(fā)明的另一方面中,⑶Xa不僅缺少其Gla域,還缺少域EGFl和EGF2 ;此類⑶Xa的一個(gè)實(shí)例由以下序列標(biāo)識(shí)符表示:對(duì)其輕鏈由SEQ IDN0.6表示,對(duì)其重鏈由SEQ IDN0.2表示。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的另一方面,⑶Xa僅由FXa的重鏈組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案,此類FXa由序列標(biāo)識(shí)符SEQ ID N0.2表示。
[0032]在又一不同的方面,⑶Xa由具有突變的分子變異體組成。因此,在編碼⑶Xa的基因中引入各種突變,以便能夠保持凝血酶生成活性和降低突變體的小肽底物上的酶活性。這些突變可以使用QuickChange試劑盒(Stratagene)并遵循制造商的建議和根據(jù)出版物ffang&Malcolm(1999) - BioTechniques, 26:680-682 引入。這些突變可以涉及⑶Xa 的重鏈的精氨酸142 (根據(jù)SEQ ID N0.2編號(hào)),其可以突變以獲得任何其它氨基酸,優(yōu)選苯丙氨酸(例如SEQ ID N0.10)、甘氨酸(例如SEQ ID N0.11)、異亮氨酸(例如SEQ ID N0.12)或酪氨酸(例如SEQ ID N0.13)。此類突變可以涉及用由牛FXa:Arg-Leu-Ser-Ser-Thr-Leu獲得的等效序列(例如SEQ ID N0.26)替代人FXa Arg-Gln-Ser-Thr-Arg-Leu的肽序列(重鏈的139-143)。類似地,重鏈的賴氨酸82 (根據(jù)SEQ ID N0.2編號(hào))也可以用氨基酸如酪氨酸替代(例如SEQ ID N0.9)。[0033]編碼⑶Xa的核苷酸序列可以化學(xué)合成(Young L和Dong Q., 2004, NucleicAcids Res.,Apr 15 ; 32 (7),Hoover, D.Μ.和 Lubkowski, J.2002.Nucleic AcidsRes., 30, Villalobos A 等,2006.BMC Bioinformatics, Jun6; 7:285)0 編碼⑶Xa 的核苷酸序列還可以使用合適引物通過(guò)PCR擴(kuò)增。
[0034]⑶Xa還可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因工程技術(shù)制造。編碼人因子X(jué)的核苷酸序列因此可以克隆到表達(dá)載體中;刪除編碼信號(hào)肽、前肽和域Gla的一部分核苷酸序列,融合信號(hào)肽,如--ΜΡ-1的信號(hào)肽(Crombez等,2005)。由此制得的修飾的因子X(jué)可以通過(guò)TF-FVIIa復(fù)合物或通過(guò)分裂精氨酸234與異亮氨酸235(根據(jù)Swiss-Prot:P00742.2編號(hào))之間鍵合的任何其它酶激活。或者,GDXa可以通過(guò)在異亮氨酸235上游直接插入被前蛋白轉(zhuǎn)換酶(furins)或任何其它細(xì)胞內(nèi)酶識(shí)別的分裂序列而直接制得;編碼這些氨基酸如精氨酸-賴氨酸-精氨酸的序列能夠被前蛋白轉(zhuǎn)換酶(furins)分裂(Nakayama等,1997)。為了改善分裂,可以引入精氨酸-賴氨酸-精氨酸-精氨酸-賴氨酸-精氨酸序列。編碼所述修飾的FX的DNA在表達(dá)質(zhì)粒中插入,并在用于其生產(chǎn)的ad hoc細(xì)胞系中(例如HEK-393E系)插入,由此制得的蛋白質(zhì)隨后通過(guò)色譜法提純。
[0035]這些技術(shù)詳細(xì)描述在參考手冊(cè)中:Molecular cloning:a laboratory manual,第三版-Sambrook 與 Russel 編輯(2001)和 Current Protocols in Molecular Biology -Ausubel 等編輯(2007)。
[0036]由此,該⑶Xa’ s還可以通過(guò)它們的編碼上述⑶Xa’ s的核苷酸序列編碼來(lái)表示,此類序列由下列序列標(biāo)識(shí)符表示:對(duì)于輕鏈由SEQ ID N0.8,SEQID N0.16至SEQ ID N0.19表示,對(duì)于重鏈由 SEQ ID N0.15 或 SEQ ID N0.21 至 25 和 SEQ ID N0.27 表示。
[0037]這種類型的修飾的因子是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(Morita和Jackson, 1986 ;Skogen等,1984,Padmanabhan 等,1993.J.Mol.Biol.,232:947-966 或 US2009/2298119)。
[0038]本發(fā)明的藥物組合物.可以以其給藥所需的任何劑型配制。特別地,在全身給藥的情況下,本發(fā)明的組合物可以以用于注射的消毒凍干粉末形式配制。本發(fā)明的藥物組合物還可以經(jīng)鼻或腸胃外給藥。因此,除有效成分外,它們還可以包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且以所需形式制備該藥物組合物必須的任何藥物可接受的配制添加劑,尤其是在為其隨后的注射而使用水溶液復(fù)原后能夠穩(wěn)定該凍干蛋白質(zhì)GDXa的任何賦形劑。
[0039]在出血事故的情況下,本發(fā)明的藥物組合物可以以低于重組體
FVIIa (Novoseven?) 10至20倍的濃度給藥,所述重組體根據(jù)劑量學(xué)在每劑量90至270
微克/千克范圍內(nèi)給藥。由此,根據(jù)另一方面,本發(fā)明還涉及包含可以結(jié)合到TFPI上但不能結(jié)合到磷脂上的非血栓性GDXa的藥物組合物,所述藥物組合物用于在具有或不具有抑制物的情況下向血友病A或B的患者施用每劑量4.5至27微克/千克。所述給藥可以通過(guò)全身、經(jīng)鼻或腸胃外途徑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1:⑶Xa或FXa對(duì)凝血酶生成的影響
[0041](A)在正常血漿池(實(shí)線)中和在嚴(yán)重血友病A的血漿池(虛線)中在磷脂和在TF的存在下制造凝血酶的試驗(yàn)。(B)在磷脂與TF的存在下(實(shí)線)和在沒(méi)有TF的情況下(虛線)添加⑶Xa (50nM)的血友病患者血漿。(C)在磷脂與TF的存在下(實(shí)線)和在沒(méi)有TF的情況下(虛線)添加FXa (50nM)的血友病患者血漿。(D)通過(guò)⑶Xa分裂底物ZGGR-AMC。在不存在(曲線B)或存在各種濃度的GDXa (曲線C至E)的情況下在具有和不具有6pg/毫升重組水蛭素的情況下在磷脂和在TF的存在下測(cè)試的CTI預(yù)處理的正常血漿。(E)在添加IOnM (實(shí)線)或20nM (虛線)⑶Xa和(F) 40nM (粗線)或200nM (虛線)的rFVIIa的血友病患者血漿中在磷脂和在TF的存在下凝血酶的生成。
[0042]該數(shù)據(jù)代表使用來(lái)自不同的嚴(yán)重A型血友病患者的至少三種不同血漿進(jìn)行的試驗(yàn)。
[0043]圖2:在血友病患者血漿中抗AT和抗TFPI抗體對(duì)凝血酶生成的影響
[0044]將不同濃度的抗-人抗凝血酶(A)或抗-人TFPI (B)抗體添加到嚴(yán)重血友病患者血漿A中并隨后令凝血酶生成??贵w濃度對(duì)于抗-抗凝血酶抗體以克/升表示,對(duì)抗-TFPI抗體以毫克/升表示。⑶Xa的濃度為nM。HP是指血友病患者血漿;NP是指正常血漿。
[0045](A)曲線A顯 示血友病患者血漿,曲線B至D顯示添加到血友病患者血漿中的不同濃度的抗凝血酶抗體;曲線E顯示添加加入到血友病患者血漿中的50nM的⑶Xa,曲線F顯示正常血衆(zhòng)。(B)曲線A顯示血友病患者血楽;,曲線B至D顯示添加到血友病患者血楽;中的不同濃度的抗-TFPI抗體;曲線E顯示添加加入到血友病患者血漿中的50nM的GDXa,曲線F顯示正常血衆(zhòng)。
[0046]圖3:通過(guò)TFPI或抗凝血酶的⑶Xa和FXa的酶抑制
[0047](A-B)對(duì)于抗凝血酶的抑制,1.25nM的FXa (A)或⑶Xa (B)在漸增濃度的抗凝血酶(ΑΤ:0(曲線A)至500nM(曲線F))的存在下在37°C下培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)處(O至90分鐘)取等分試樣并添加到顯色底物PNAPEP1025中。
[0048](C-D)通過(guò)TFPI抑制FXa (C)或⑶Xa (D)的活性通過(guò)在漸增濃度的TFPI的存在下(對(duì)⑶Xa為O至30nM,對(duì)FXa為O至IOnM)在緩沖液A中在25°C下培養(yǎng)0.25nM的酶3小時(shí)來(lái)分析。
[0049]該數(shù)據(jù)代表兩種不同的試驗(yàn)。
[0050]圖4:測(cè)定血漿中⑶Xa和FXa的藥代動(dòng)力學(xué)特征
[0051]將50nM FXa (A)或⑶Xa (B)添加到正常血漿中,整體在37°C下培養(yǎng)。在不同時(shí)間間隔處取等分試樣,并立即在緩沖液A中稀釋25倍以測(cè)定殘余活性。半衰期對(duì)FXa為1.4±0.1分鐘,對(duì)⑶Xa為1.8±0.1分鐘。
[0052]該數(shù)據(jù)是兩次不同試驗(yàn)的平均值。
[0053]圖5:通過(guò)rVIIa和⑶Xa修正凝血酶生成
[0054]以不同濃度在血友病患者血漿(HP,曲線B)中添加⑶Xa (曲線C和D)或rVIIa(曲線E和F)。NP:正常血漿(曲線A)。
[0055]通過(guò)下列實(shí)施例描述本發(fā)明。
【具體實(shí)施方式】
[0056]實(shí)施例1:材料與方法
[0057]材料:
[0058]來(lái)自正常患者的冷凍血漿池和來(lái)自血友病A或血友病B患者的個(gè)體血漿、磷脂TGT、Prionex、玉米胰蛋白酶抑制物(CTI)、顯色底物PNAPEP1025、人因子X(jué)a、人⑶Xa和羊抗-人凝血酶抗體獲自CryQpep(Montpellier,F(xiàn)rance)。人重組體TFPI獲自Sino BiolocalInc.(Bei jing, China)。再脂質(zhì)化(relipidized)重組體人組織因子(TF, Innovin)來(lái)自 Siemens Healthcare Diagnostics (Puteaux, France)。 來(lái)自 Diagnostica Stago(Asnieres, France)的凝血酶校正劑、FluCaKit和圓底96孔微量滴定板(Immulon2HB,具有U型底部的板)用于該凝血酶生成試驗(yàn)。對(duì)于酶試驗(yàn),平底96孔微量滴定板來(lái)自Greiner(Frickenhausen, Germany);羊抗-TFPI 抗體來(lái)自 Affinity Biologicals (SandhillDrive, Canada)。來(lái)自 American Diagnostica (Stamford, USA)的 TFPI 活性的 Actichrom試樣用于測(cè)定TFPI活性??鼓富钚栽嚇?STA-Stachrom抗凝血酶III)來(lái)自DiagnosticaSTAGO。酶計(jì)算用PRISM5.0進(jìn)行。
[0059]方法
[0060]I)凝血酶生成試驗(yàn)(TGA)
[0061]凝血酶生成的測(cè)量通過(guò)使用IpM的用于激活凝血的組織因子(TF)的Hemker’ s法并在30微克/毫升用于抑制培養(yǎng)期過(guò)程中凝血的接觸階段的激活的CTI存在下進(jìn)行(van Veen JJ, Gatt A, Cooper PC, Kitchen S, Bowyer AE, Makris M.突光凝血酶生成測(cè)量中的玉米胰蛋白酶抑制物僅在低組織因子濃度下是必須的,并影響因子VIII凝血?jiǎng)┗钚院湍干蓤D參數(shù)之間的關(guān)系。Blood Coagul Fibrinolysis.2008Apr; 19 (3): 183-9)。簡(jiǎn)而言之,將20微升TF、4 μ M磷脂和80微升血漿的混合物一式三份移液至微量滴定板中。二十微升的凝血酶校正劑與80微升血漿也通過(guò)移液管一式三份放置在該板中。隨后將該板插入到激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定在390納米并具有460納米的發(fā)射波長(zhǎng)和10納米的通帶的Varioskan (Thermofisher, Illkirch, France)中。向所有孔中注入二十微升的 FluCaKit(2.5mM 熒光底物(Z-Gly-Gly-Arg-AMC, ZGGR-AMC),含有 0.1M 的 CaCl2),由此啟動(dòng)反應(yīng)。
每20秒讀取突光信號(hào)60分鐘。突光強(qiáng)度的原始數(shù)據(jù)輸出到Sigmaplot? 9.0用于米用
上述三波法的數(shù)學(xué)計(jì)算(De Smedt E.Advanced thrombinoscopy:PhD thesis, UniversityMaastricht;2007)。
[0062]在下文中:
[0063]ETP是指內(nèi)源性凝血酶潛能并對(duì)應(yīng)于曲線下方的面積;
[0064]PH是指峰的高度并對(duì)應(yīng)于峰值凝血酶水平;
[0065]LT是延遲時(shí)間并對(duì)應(yīng)于達(dá)到2nM凝血酶的時(shí)間;
[0066]PT是峰值時(shí)間并對(duì)應(yīng)于獲得該P(yáng)H的時(shí)間。
[0067]各種因子GDXa、Xa 或 NovosevenK 稀釋在包含 1% 的 Prionex、18mM 的 HEPES、135mM 的氯化鈉且pH為7.35的緩沖液A中并添加到用各種濃度的CTI預(yù)處理的血友病患者血漿中。
[0068]2)通過(guò)特異性抗體中和抗凝血酶和TFPI
[0069]為了中和抗凝血酶,向嚴(yán)重血友病A的血漿中添加不同濃度的羊IgG抗-人抗凝血酶抗體(1.8、3、5和7.5克/升)并在TGA中受試前在25°C下培養(yǎng)一小時(shí)。平行地,用抗凝血酶III STA-Stachrom試劑在STAR血凝度計(jì)(Diagnostica Stago)上測(cè)量抗凝血酶活性。
[0070]為了中和TFPI,在TGA中受試前令相同的血友病A血漿與不同濃度的羊抗-人TFPI免疫球蛋白(2.5、5、10和50毫克/升)接觸。平行地,根據(jù)制造商指示用ActichromTFPI活性試樣測(cè)定TFPI的活性。簡(jiǎn)而言之,20微升稀釋20倍的血漿在20微升TF/FVIIa的存在下在37°C下培養(yǎng)30分鐘。隨后加入因子X(jué) (FX),在添加EDTA和Spectrozyme FXa之前整體在37°C下培養(yǎng)15分鐘。通過(guò)添加冰醋酸在5分鐘后終止反應(yīng),并在405nm處讀取吸光度。
[0071]3)色原的測(cè)定
[0072]3.1)測(cè)定⑶Xa和Xa的動(dòng)力學(xué)常數(shù)
[0073]為了測(cè)定 GDXa 或 FXa 活性,在包含 1% 的 Prionex、18mM 的 HEPES、135mM的氯化鈉且pH為8.4的緩沖液中在37 V下將0.3nM的酶培養(yǎng)5分鐘。隨后以0.33,0.50,I, 1.5,and2.0mM的濃度添加顯色底物PNAPEP1025,并在405nm下記錄吸光度的變化。
[0074]3.2)抗凝血酶(AT)的酶抑制
[0075]Xa或⑶Xa (1.25nM)在漸增濃度的抗凝血酶(O至500nM)存在下在緩沖液A中在37°C下培養(yǎng)。在不同時(shí)間間隔處取200微升該混合物的等分試樣,直到90分鐘。隨后加入50微升顯色底物PNAPEP1025 (6mM)并記錄吸光度的改變。
[0076]3.3) TFPI 的酶抑制
[0077]TFPI對(duì)⑶Xa或FXa活性的抑制通過(guò)在200微升的最終體積中在漸增濃度的TFPI的存在下(對(duì)⑶Xa為O至30nM,對(duì)FXa為O至IOnM)在緩沖液A中在25°C下培養(yǎng)0.25nM的酶3小時(shí)來(lái)分析。隨后添加50微升的顯色底物PNAPEP1025(2.5mM),并記錄吸光度的改變。如上所述測(cè)定 Ki*(Bunce MW, Toso R, Camire RM.Zymogen-like factor Xa variantsrestore thrombin generation and effectively bypass the intrinsic pathwayin vitr0.Blood.2011Jan6;117(I):290-8 ;Baugh RJ,Broze GJ,Jr.,KrishnaswamyS.Regulation of extrinsic pathway factor Xa formation by tissue factor pathwayinhibitor.J Biol Chem.1998;273(8):4378-86)。
[0078]3.4)測(cè)定⑶Xa和Xa的血漿半衰期
[0079]通過(guò)向正常血漿中添加50nM的⑶Xa或Xa來(lái)測(cè)定⑶Xa或Xa的血漿半衰期。該混合物隨后在37°C下培養(yǎng)。由O至60分鐘取等分試樣并立即在緩沖液A中稀釋25倍,隨后添加顯色底物PNAPEP1025 (1.5mM)并如上所述測(cè)定剩余酰胺分解活性。
[0080]實(shí)施例2:制備修飾的因子X(jué)a
[0081]通過(guò)用HindII1- BamHI酶消化打開(kāi)質(zhì)粒pTT5,并插入編碼具有HindIII和NheI限制位點(diǎn)的--ΜΡ1和具有NheI和BamHI限制位點(diǎn)的缺少Gla域的FX的信號(hào)肽的基因,生成質(zhì)粒ΡΤΤ5---ΜΧ (pTT5spTIMPlgla less FX)。編碼本發(fā)明的具有NheI和BamHI限制位點(diǎn)的缺少Gla域的FX的序列通過(guò)化學(xué)合成獲得(GenScript Corporation)。隨后在允許直接在用于純化的培養(yǎng)基中分泌⑶Xa的重鏈的N-末端異亮氨酸上游引入用于前蛋白轉(zhuǎn)換酶(furins)的識(shí)別位點(diǎn)。制得的⑶Xa用以下序列標(biāo)識(shí)符表示:對(duì)其輕鏈用SEQ ID N0.3表示,對(duì)其重鏈用SEQ ID N0.2表示。
[0082]實(shí)施例3:測(cè)定⑶Xa和FXa的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0083]在分析⑶Xa對(duì)凝血酶生成的作用之前,采用顯色底物PNAPEP1025的分裂表征該⑶Xa和Fxa。⑶Xa顯示出類似于FXa(Km=0.64±0.03mM)的親和性(Km=0.75±0.05mM)和類似的催化性質(zhì):⑶Xa的kcat=290 ±58' FXa的kcat=375 ± 8s_1 (表I)。這些結(jié)果與早先用顯色底物 S2222 獲得的觀察結(jié)果(Skogen WF, Esmon CT, Cox AC.Comparison of coagulationfactor Xa and des—(1—44)factor Xa in the assembly of prothrombinase.J BiolChem.1984; 259 (4):2306-10)是一致的。
[0084]
【權(quán)利要求】
1.包含修飾的因子X(jué)a(⑶Xa)的藥物組合物,所述⑶Xa是缺少Gla域的FXa,用于預(yù)防或治療具有或不具有抑制物的患有血友病A或B的患者的出血事故。
2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的組合物,其特征在于所述⑶Xa包括EGFl域的缺失、EGF2域的缺失或EGFl與EGF2域的缺失。
3.如權(quán)利要求1或2所要求保護(hù)的組合物,其特征在于所述⑶Xa具有完整的重鏈。
4.如權(quán)利要求1至3之一所要求保護(hù)的組合物,其特征在于所述GDXa對(duì)其輕鏈表示為 SEQ ID N0.7 或 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.6,并對(duì)其重鏈表示為 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12、SEQ IDN0.13 或 SEQ ID N0.26。
5.如權(quán)利要求1至3之一所要求保護(hù)的組合物,其特征在于所述⑶Xa對(duì)其輕鏈通過(guò)核酸序列 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17、SEQ IDN0.18 或 SEQ ID N0.19 編碼,對(duì)其重鏈通過(guò) SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.21、SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25 或 SEQ ID N0.27 編碼。
6.如權(quán)利要求1至5之一所要求保護(hù)的組合物,包含4.5至27微克/千克的⑶Xa,用于通過(guò)全身、經(jīng)鼻或腸胃外途徑給藥于具有或不具有抑制物的患有血友病A或B的患者。
7.通過(guò)施用修飾因子X(jué)a(⑶Xa)或如權(quán)利要求1至5之一所要求保護(hù)的藥物組合物預(yù)防性治療血友病A或B患者的出血性綜合癥的方法。
8.通過(guò)施用修飾因子X(jué)a(⑶Xa)或如權(quán)利要求1至5之一所要求保護(hù)的藥物組合物治療血友病A或B患者的出血性綜合癥的`方法。
【文檔編號(hào)】A61P7/04GK103429255SQ201280011292
【公開(kāi)日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月1日
【發(fā)明者】伯諾瓦·波蘭克, 艾琳·托馬斯 申請(qǐng)人:約瑟夫·傅里葉 格勒諾布爾第一大學(xué), 國(guó)家科學(xué)研究中心
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