Tfeb變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及組成型定位在真核細胞核內的TFEB相關分子，如變體、突變體、截短蛋白、嵌合體等。這類分子在需要誘導細胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的所有疾病中具有治療應用性，所述疾病例如溶酶體貯積癥、神經變性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
【專利說明】TFEB變體及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及組成型定位在真核細胞核內的TFEB相關分子，如變體、突變體、截短蛋白、嵌合體等。這類分子在需要誘導細胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的所有疾病中具有治療應用性，所述疾病例如溶酶體貯積癥、神經退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
[0002]背景和現(xiàn)有技術
[0003]自體吞噬是一種分解代謝過程，依賴于自噬體和溶酶體這兩種不同類型細胞器的協(xié)同作用(I)。饑餓期間，細胞擴張這兩種細胞區(qū)室(compartment)以促進降解和再循環(huán)過程。
[0004]所述溶酶體維持細胞內穩(wěn)態(tài)并調節(jié)多種生理過程，包含細胞清除、脂質內穩(wěn)態(tài)、能量代謝、質體膜修復、骨重塑和抵御病原體。所有這些過程需要溶酶體對環(huán)境信號的適應性且動態(tài)的反應。確實，生理信號(例如衰老和饑餓)和病理病癥(包含溶酶體貯積癥(LSD)、神經退行性疾病、損傷和感染)可以產生所述溶酶體的適應性反應(34、35、36)。
[0005]對調解溶酶體功能的機制和溶酶體適應的基本機制的理解仍然處在初始階段。調解溶酶體生物發(fā)生的主要作用物是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)亮氨酸拉鏈轉錄因子一TFEB (2)。已確定的TFEB轉錄靶標有參與底物降解的溶酶體水解酶，調解溶酶體與其他細胞結構相互作用的溶酶體膜蛋白，和參與溶酶體酸化的液泡H+-ATP酶(νΑΤΡ酶)復合物的組件(37，2)。
[0006]W02010/092112涉 及能增強作用于所謂清除元件(CLEAR element)上的細胞降解通路的分子；其中列有TFEB。

【發(fā)明內容】

[0007]本 申請人:顯示了在饑餓期間，細胞活化能控制自體吞噬通路的主要步驟的轉錄程序，所述步驟包含自噬體形成、自噬體一溶酶體融合和底物降解。所述轉錄因子EB (TFEB)此前已鑒定為溶酶體生物發(fā)生的主要基因(2)，該轉錄因子通過驅動自體吞噬和溶酶體基因的表達來調整這種轉錄程序。
[0008]本 申請人:發(fā)現(xiàn)TFEB的核定位和活性由特異性絲氨酸磷酸化來調節(jié)。與饑餓相似，基于藥理或基因突變對特異性磷酸化的抑制通過活化TFEB來誘導自體吞噬。這些數據公開了通過控制兩種協(xié)同細胞器的生物發(fā)生和合作而參與調節(jié)溶酶體一自體吞噬通路的一種新的激酶依賴性機制。
[0009]因此，本發(fā)明的一個目標是組成型定位在真核細胞核內的TFEB變體蛋白。本發(fā)明所述TFEB變體蛋白包含絲氨酸殘基的取代或改變以使其對磷酸化不敏感。本領域普通技術人員會識別能進行除了酪氨酸以外的其他氨基酸取代以使所述TFEB變體對磷酸化不敏感。例如，絲氨酸殘基能取代為天然氨基酸，例如中性氨基酸如丙氨酸，或非天然氨基酸。組成型定位在真核細胞核內的TFEB變體蛋白包含TFEB的突變體、截短蛋白、嵌合體。
[0010]在優(yōu)選的實施方式中，所述TFEB變體蛋白由Seq.1d N0.2所含的氨基酸序列組成，并且其中絲氨酸殘基的取代在Seq.1d N0.2的SER142和/或SER211處。優(yōu)選Seq.1dN0.2所含的氨基酸序列是氨基酸117 —氨基酸166，并且絲氨酸殘基的取代是在Seq.1dN0.2的SER142處(Seq Id N0.4)?；蛘?，所述氨基酸序列實質上由Seq.1d N0.2組成，并且絲氨酸殘基的取代是在SER142和/或SER211處。在最優(yōu)選實施方式中，Seq.1d.N0.2的SER142和/或SER211處由ALA取代。
[0011]本發(fā)明的另一個目標是供醫(yī)學應用的上述TFEB變體蛋白的。
[0012]上述TFEB變體蛋白用于治療需要誘導細胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病中具有優(yōu)勢，其優(yōu)選用于治療任意下列病變:溶酶體貯積癥、神經退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
[0013]溶酶體貯積癥的示例有:激活因子缺乏癥/GM2神經節(jié)苷脂沉積病、α _甘露糖苷貯積癥、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯(Farber)病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇(Gaucher)病(包含I型、II型和III型)、GMl神經節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/少年型、成年型/慢性)、I細胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質營養(yǎng)不良、假性赫爾利多營養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合征、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合征、A型沙費利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費利波綜合征/MPS IIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏(Niemann-Pick)病(包含A型、B型和C型)、神經元蠟樣質脂褐質沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年(early juvenile)巴-斯-沃三氏(Baten-Spielmeyer-Vogt) / 少年型 NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏(Jansky-Bielschowsky)病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成年發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經元蠟樣脂褐質沉積癥(Santavuor1-Haltia )/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積癥、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡(Tay-Sachs)/GM2神經節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
[0014]肝病的示例有:α I抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
[0015]肌肉疾病的示例有:自體吞噬液泡肌病和過度自噬X連鎖肌病。
[0016]代謝疾病的示例有:高膽固醇血癥和脂肪肝病。
[0017]神經退行性疾病的示例有:阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費爾特-雅各布病和脊髓性小腦萎縮癥。
[0018]本發(fā)明的另一個目標是包含上述TFEB突變蛋白的編碼序列的核酸。優(yōu)選所述核酸包含Seq.1d N0.3的序列。
[0019]本發(fā)明的另一個目標是于適當調節(jié)序列下包含上述核酸的表達載體。
[0020]本發(fā)明所述表達載體對用于基因治療是有利的。
[0021]本發(fā)明的另一個目標是提高離體培養(yǎng)細胞中內源或重組溶酶體酶的產量的方法，所述方法包含以下步驟:_將所述核酸或上述表達載體導入所述細胞，和-使所編碼的TFEB變體蛋白得以表達。[0022]本發(fā)明的另一個目標是通過給予對象以治療有效量的上述TFEB變體蛋白來治療疾病的方法，優(yōu)選當所述疾病通過誘導細胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)得以緩解時。
[0023]更優(yōu)選所述疾病選自:溶酶體貯積癥、神經退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。上文提供了這些疾病的示例。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:TFEB誘導自體吞噬。(A)穩(wěn)定過量表達TFEB的HeLa細胞用GFP-LC3質粒轉染，并且如圖示來處理。各實驗分析大約100個細胞，均一式三份。圖顯示了 GFP陽性囊泡的定量。(B-F)在TFEB-3xflag穩(wěn)定過量表達(+)和對照細胞(-)中LC3的Western印跡分析(B)。圖表示使用imagej軟件對三個獨立印跡分析LC3II表達(相對于肌動蛋白)的定量；(C)血清和氨基酸饑餓(Starv) 了指定時間(h=小時)的TFEB穩(wěn)定過量表達細胞，(D-F)從(D)正常培養(yǎng)基、(E)饑餓培養(yǎng)基或者(F)補充有巴伐洛霉素的饑餓培養(yǎng)基(4h;400nM)中培養(yǎng)的TFEB-RNAi和用亂序RNAi (對照(ctr))處理的對照細胞中分離的細胞裂解液。圖表示三個獨立印跡中LC3II表達(相對于肌動蛋白)的定量，并且條帶強度使用imagej軟件分析定量。(G) TFEB mRNA水平通過qPCR分析，所用cDNA從轉染了靶定TFEB的3種不同siRNA寡核苷酸(寡核苷酸#1、#2、#3)或者亂序siRNA寡核苷酸(ctr)的細胞中制備。(H)用空(對照)或TFEB載體轉染的、穩(wěn)定表達GFP-mRFP-LC3的HeLa細胞固定的代表性共聚焦照片。最少計數2000個細胞，并且所述值表示獲自三個獨立實驗的囊泡的平均數值(相對于對照，%)。AL(自噬溶酶體)=mRFP陽性/GFP陰性囊泡；總體:mRFP陽性囊泡。(所有誤差線代表標準偏差。T檢驗(未配對)p值(*) <0.05, (**)〈0.01)
[0025]圖2:饑餓調節(jié)TFEB的核移位和活性。(A)散點圖顯示不同條件下培養(yǎng)的HeLa細胞中51個自體吞噬相關基因的相對表達水平中倍數變化差異的對數值。X軸=對照組。Y軸=處理組。圓圈表示有增加(紅色)或降低(綠色)倍數變化的基因。如指示進行比較。(B)染色質免疫沉淀(ChIP)分析。柱狀圖顯示由qPCR試驗測得的免疫沉淀的DNA的量。數值相對進樣來標準化，并且以對`模擬對照的相對富集作圖。實驗進行一式三份。(C)正常、饑餓和TFEB-siRNA饑餓細胞中TFEB靶標基因表達的qPCR分析。GAPDH和HPRT表示持家基因，而ATG10、ATG9A和ATG4D表示對照基因(非TFEB靶標基因)。(D-F)穩(wěn)定過量表達TFEB的HeLa細胞保持不處理或者營養(yǎng)饑餓4小時。(D)就TFEB核定位分析各包含50-100個細胞的5個區(qū)域。P值(*)=〈0.01。(E)細胞進行核/胞質分級分離，并用Flag抗體印跡。H3和微管蛋白分別用作核和胞質的標記。(F)核部分用Flag和H3(加樣對照)抗體印跡。(G)核提取物中Flag、微管蛋白和H3的Western印跡分析，所述核提取物從正常、饑餓和饑餓/正常培養(yǎng)基刺激I小時(正常)或者培養(yǎng)基刺激前用AP-2 (AKT抑制劑)、雷帕霉素(mTOR抑制劑)和UO126 (MEK抑制劑)預處理I小時的細胞中制備?？偺崛∥镉糜诖_證抑制劑的效率。(H)用組成型活性MEK(caMEK)質?；蛴每蛰d體轉染的TFEBsiRNA或TFEB亂序對照細胞中溶酶體和自體吞噬基因的qPCR分析。如圖所示進行饑餓。(所有誤差線代表標準偏差。T檢驗(未配對)P值(*)〈0.05，(**)〈0.01)
[0026]圖3:絲氨酸磷酸化調節(jié)TFEB活性。(A)在表達突變形式TFEB_3xFlag的HeLa細胞中的TFEB亞細胞定位，用Flag抗體免疫染色。分析來自三個獨立實驗的各自包含50-100個細胞的5個區(qū)域。(B)對空、正常和突變TFEB質粒轉染后24小時TFEB靶標基因表達的qPCR分析。(C，D)蛋白提取物中LC3II(C)和Lampl (D)的Western印跡分析，蛋白提取物來自以等量空(pcDNA)、TFEB-3xFlag或TFEBS142A-3xFlag載體轉染的HeLa細胞。如圖所示加入巴伐洛霉素。實驗進行一式三份，并且對肌動蛋白水平來標準化蛋白水平的定量。(E)穩(wěn)定表達GFP-mRFP-LC3并用pcDNA、Tfeb或Ser-Tfeb轉染24小時的HeLa細胞中的自噬溶酶體分析(AL=RFP陽性/GFP陰性)。如圖1H所述定量。(F)用抗Erk抗體對HeLa細胞的Western印跡分析，所述HeLa細胞用HA_Erk2和/或TFEB_3xFlag轉染、在全血清中維持或營養(yǎng)饑餓中保持4小時，以及用抗Flag抗體免疫沉淀。裂解液用抗FLAG免疫沉淀，并且用抗Erk抗體印跡。(G)體外激酶試驗。在ATP-Y32P以及TFEB蛋白的氨基酸120 - 170的肽(TFEB-S-142)或絲氨酸142被丙氨酸取代的相似肽(TFEB-A-142)存在下孵育重組激酶。以所述肽整合放射性的量來測量磷酸化效率(“磷酸化靈敏度”)。(H)過量表達TFEB的HeLa穩(wěn)定克隆用ERK1/2特異性siRNA寡核苷酸或者對照siRNA轉染。48h后，細胞在不處理、血清饑餓或者血清和氨基酸(a.a.)饑餓下保持4小時，收集并進行核分離和Flag免疫印跡?？偭呀庖河肊RK抗體探測。所有誤差線代表標準偏差。P值(*)=〈0.05。
[0027]圖4:TFEB介導的自體吞噬誘導的體內分析。(A)在進食、16小時禁食和24小時禁食的小鼠中GFP陽性囊泡的免疫熒光分析。圖中顯示囊泡的定量。(B)來自進食和禁食動物的肝樣品中TFEB靶標基因表達的qPCR分析(n=3;誤差線代表標準偏差。P值(*)〈0.05)。Gapdh和Hprt用作參比基因。(C，D)在用AAV2/9Tcfeb_HA感染并且處死前禁食16小時的2月齡野生型小鼠中TFEB亞細胞定位的分析。(C) HA免疫熒光分析。圖顯示了核HA信號的定量。對各個肝計數100個轉導的細胞。n=3只小鼠/組。*=〈0.001。(D)在進行核分級分離的肝樣品中的HA、微管蛋白和H3的Western印跡分析?？偟母瘟呀庖河肏A抗體探測以確證進食和禁食動物中相似的轉基因表達。(E)注射有AAV2/9Tcfeb-HA的小鼠的肝提取物中LC3、肌動蛋白、P-ERK1/2和ERK1/2的Western印跡分析。(F)來自2月齡GFP-LC3轉基因小鼠的凍存肝切片中GFP Western印跡分析和DAPI染色，所述轉基因小鼠注射有AAV-Tcfeb-HA或鹽水溶液(對照組)，并且在處死前自由進食或禁食24小時。圖中顯示了 GFP陽性囊泡的定量。(G)分離自條件型Tc feb-3xFLAG轉基因小鼠(Tcfeb-3Xflag; AlbCRE)的肝樣品中自體吞噬和溶酶體TFEB靶標基因表達的qPCR分析，其中轉基因表達由肝特異性CRE重組酶(即白蛋白-CRE)驅動。(H)來自 Alb-CRE、Tcfeb-3xFlag 和 Tcfeb_3xFlag; Alb-CRE 小鼠的肝蛋白提取物中LC3和肌動蛋白的Western印跡分析。
[0028]圖5 =TFEB瞬時過量表達誘導自體吞噬。(A)HeLa細胞瞬時轉染有編碼帶flag標簽的TFEB蛋白的質粒。轉染后48小時，細胞收集、裂解，并且對IOmg蛋白樣品分析LC3、Flag和肌動蛋白免疫反應性。實驗進行一式三份，并且使用imagej軟件分析定量條帶強度。(誤差線代表標準偏差。P值(*)〈0.05) (B)C0S-7細胞瞬時轉染有空載體或TFEB-3xFlag載體。24小時后，細胞用溶酶體抑制劑(抑胃酶肽/E64，lOyg/ml，西格瑪公司(SIGMA))處理4小時。10 μ g細胞裂解液用于LC3和肌動蛋白免疫印跡。
[0029]圖6:在TcFEB過量表達型MEF中誘導自體吞噬。(A，B)用表達TcFEB的慢病毒感染的MEF和對照細胞的電子顯微圖。(a)TcFEB表達后觀察到的自體吞噬結構，其包含自噬體(AV)和自噬溶酶體(AL)。(B)早期自噬體的形成。電子密集細胞質材料周圍的膜分離(箭頭)。(C)自體吞噬結構(AV和AL)數目和⑶早期自噬體數目的定量。至少分析30個細胞/組。誤差線表示SEM; P值(*)<0.05;(林*)〈0.0001。[0030]圖1:TFEB促進自噬體形成。(A)對照和穩(wěn)定過量表達TFEB的細胞用巴伐洛霉素(baf;12小時400nM)處理，收集并且用于LC3I1、Flag和肌動蛋白免疫印跡。(B)對照和穩(wěn)定過量表達TFEB的細胞保持不處理或用10 μ g/ml溶酶體抑制劑抑胃酶肽/E64處理4小時，裂解并且用于LC3、Flag和肌動蛋白免疫印跡。實驗進行一式三份，并且使用imagej軟件分析定量帶強度。(誤差線代表標準偏差。P值(*)〈0.05)
[0031]圖8 =TFEB增強溶酶體蛋白水解。在正?；蝠囸I條件下，TFEB過量表達、TFEB枯竭和對照細胞中長壽命蛋白降解的速率。如圖所示加入3-甲基腺嘌呤(3MA)。(誤差線代表標準偏差。P值(*)〈0.05)
[0032]圖9:自體吞噬基因亞組的啟動子區(qū)域中TFEB推定的結合元件的分布。數字指示結合元件距離轉錄起始位點(TSS)的距離。
[0033]圖10:饑餓增強TFEB活性。螢光素酶報導試驗使用載有四個TFEB結合位點串聯(lián)拷貝的構建物。正常和TFEB過量表達的HeLa細胞轉染有含TFEB結合位點的人工啟動子。在饑餓條件下培養(yǎng)時，兩種細胞類型都顯示增強的反式激活潛能。(誤差線代表標準偏差ρ(*)〈0.05)
[0034]圖11:饑餓通過MAPK誘導TFEB的核移位。(A)饑餓誘導胞質TFEB遷移率改變和核移位。正常培養(yǎng)基；饑餓培養(yǎng)基(4小時)；饑餓+正常，表示細胞在饑餓培養(yǎng)基中培養(yǎng)(4小時)，再補充正常培養(yǎng)基培養(yǎng)I小時然后收集。胞質和核部分用于Flag免疫印跡。(B)如圖2G所示處理的HeLa細胞中通過免疫熒光分析TFEB細胞定位。圖顯示呈現(xiàn)TFEB核定位的細胞的百分比。誤差線代表標準偏差。P值(*)=〈0.05。
[0035]圖12 =TFEB 核移位依賴于 S142 磷酸化。(A)表達 TFEB_3xFlag、S142A_3xFlag、S332-3xFlag或S423_3xFlag蛋白的HeLa細胞用于核蛋白分離。等量的核蛋白用麗春紅染色確證。(B)在正常和饑餓條件下，表達TFEB-3xFlag、S142A_3xFlag和S142D_3xFlag蛋白的HeLa細胞用于核蛋白分離。(C)從表達TFEB_3xFlag和TFEB_S142A_3xFlag的HeLa細胞分離的胞質蛋白的Flag免疫印跡顯示在正常培養(yǎng)基中S142A以相比野生型(WT)TFEB較低分子量的條帶遷移，而在饑餓條件下這種變化不再明顯。(D)從表達TFEB-3xFlag、S142A-3xFlag和S142D_3xFlag的受饑餓HeLa細胞分離的胞質蛋白的Flag免疫印跡顯示TFEB-S142D的變化減弱。
[0036]圖13:S142A TFEB突變顯示活性增強。穩(wěn)定過量表達GFP-LC3的HeLa細胞轉染以等量的空、TFEB-3xFlag或S142A-TFEB_3xFlag質粒，并且定量自噬體數。各點分析至少10個區(qū)域(包含4-10細胞)。實驗進行一式三份。誤差線代表標準偏差。P值(*)〈0.05。
[0037]圖14:與TFEB旁系同源物(paralogue)、MITF和相關TFEB有關家族成員的TFEB-人(human ) S142磷酸化位點的多序列比對。通過對ExPASy蛋白組學服務器上的UniProtKB數據庫的BLAST檢索(2.2.17)鑒定出TFEB_human同源物。 申請人:去除帶有關鍵詞“推定”、“未鑒定”和“cDNA”的記錄以及沒有基因名稱的記錄。下一步，發(fā)明人用ClustalW(1.82)比對剩余的同源物。由Seaview生成多個序列的比對。圖僅顯示TFEB_HUMAN序列中長20個氨基酸的片段與來自TFEB、MITF、TCFEB、TFE3和TCFE3家族的其他蛋白的比對?！皊p”表不SwissProt條目，而“tr”表不Tremble條目。P19484是UniProrKB登錄代碼。TFEB_HUMAN分別表示基因名稱和物種名稱。
[0038]圖15:體內TcFEB過量表達的策略。㈧用抗HA抗體免疫染色的凍存肝切片的代表性圖片(以確證病毒轉導效率)。(B)來自Tcfeb-HA注射小鼠和對照小鼠的肝蛋白提取物用HA和肌動蛋白抗體免疫印跡。(C)生成TcFEB條件型過量表達的轉基因小鼠系。頂部顯示CRE重組酶之前和之后的轉基因載體圖。左側顯示同窩幼畜的代表性基因型，而右側顯示小鼠n4中相應的肝特異性TFEB過量表達。
[0039]圖16 =TFEB過量表達增加MEF、NSC、HeLa和C0S-7細胞的培養(yǎng)基中溶酶體酶的釋放。在培養(yǎng)基和轉染有空載體或TFEB表達載體的細胞中測定溶酶體酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和β_己糖胺酶的活性。根據生產商方案，使用PolyFect轉染試劑(凱杰公司(Qiagen))或 Lipofectamine2OOO 試劑(英杰公司(Invitrogen))轉染 HeLa、Cos7 細胞和來自小鼠模型MLIV (S7)、MPSIIIA (S7)和MSD的小鼠胚胎成纖維細胞。TFEB_3xFLAG HeLa穩(wěn)定細胞系(CF7)已有描述(2)。圖顯示釋放的酶活性相較總活性的百分比。
[0040]圖17:TFEB正向控制溶酶體的胞吐。MPSIIIA MEF細胞維持在補充有10%FBS和青霉素/鏈霉素(正常培養(yǎng)基)的DMEM中。根據生產商方法，亞融合細胞使用Lipofectamine?2000(英杰公司)轉染。使用編碼帶標簽硫酸胺酶(SGSH3XFlag)的質粒和空質?；蚓幋aTFEB的質粒共轉染MPS-1IIA MEF0轉染后一天，培養(yǎng)基置換為DMEM0.5%FBS。轉染后兩天，收集條件培養(yǎng)基和球團用于硫酸胺酶活性測量，并且計算酶釋放到培養(yǎng)基中的百分比。
[0041]圖18:溶酶體應激誘導TFEB核移位。免疫印跡:經氯喹(CQ)或水楊酰胺A(Salicylihalamide A, SalA)處理的表達TFEB - 3 x Flag的HeLa細胞中提取的蛋白用于核/胞質分級分離并用FLAG抗體印跡以檢測TFEB。組蛋白3 (H3)和微管蛋白分別用作核和胞質的標記。印跡是三個平行實驗的代表。
[0042]圖19:mT0RCl調節(jié)TFEB。⑷溶酶體應激抑制mTOR信號轉導。如圖示，處理過夜的HeLa細胞中分離的蛋白提取物的免疫印跡。膜用p-T202/Y204_ERKl/2、ERK1/2、P-T389-S6K和S6K的抗體探測以測量ERK和mTORCl活性。(B) Torinl誘導TFEB去磷酸化和核移位。從經無氨基酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且如圖示后續(xù)刺激至少3小時的TFEB-3 X FLAGHeLa細胞分離的胞質和核部分的FLAG免疫印跡。用H3和微管蛋白抗體確證正確的亞細胞分級分離。(C，D) ERK和mTOR抑制劑對TFEB核移位的影響和劑量反應曲線。TFEB - GFPHeLa細胞接種入384孔板，培養(yǎng)12小時，并用2.54ηΜ_50 μ M范圍內10種不同濃度的ERK抑制劑U0126或mTOR抑制劑雷帕霉素、Torinl和Torin2處理。37°C下在包含各個化合物的RPMI培養(yǎng)基中保持3小時后，細胞洗滌、固定，再用DAPI染色，并用共聚焦自動顯微鏡(Opera高內涵系統(tǒng),帕金埃爾默公司(Perkin Elmer))照相。(C)各化合物測試濃度的代表性圖片。比例尺代表30 μ m。(D)圖顯示各化合物的10個不同濃度(以濃度的對數顯示)下核移位的百分比。使用Prism軟件計算各化合物的EC50(詳見材料和方法)。(E)氨基酸誘導TFEB分子量變化。從HEK-293T細胞分離的蛋白提取物的免疫印跡，所述HEK-293T細胞轉染有TFEB-3XFLAG或空載體，經營養(yǎng)饑餓和用氨基酸(a.a.)刺激50分鐘。所用抗體是p-T389-S6K、S6K和FLAG。(F) Rag敲減誘導TFEB核移位。穩(wěn)定表達Flag - 3 x TFEB的HeLa細胞用編碼短發(fā)夾(Sh_) RNA的慢病毒感染，所編碼的Sh-RNA靶定螢光素酶(對照)或者RagC和RagD mRNA。轉染96h后，細胞保持不處理(N=正常培養(yǎng)基)、饑餓(S=饑餓培養(yǎng)基)或者用Torinl (T=Torinl)處理4小時,然后用于核/胞質分級分離。用FLAG抗體檢測TFEB定位，而微管蛋白和H3分別用作胞質和核部分的對照；S6K磷酸化水平用于檢測RagC和RagD敲減效率。(G)mT0RC2不影響TFEB磷酸化。從Sinl-/-或對照胚胎(E14.5)分離的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)用編碼TFEB - 3 x FLAG的逆轉錄病毒感染；感染后48小時，細胞如圖示用Torinl(T)處理4小時，用于核/胞質分級分離并且用FLAG、微管蛋白和H3免疫印跡。
[0043]圖20:mT0RCl在絲氨酸142 (S142)處磷酸化TFEB。(A) Torinl誘導S142去磷酸化。如圖示處理HeLa細胞，并將總提取物和核提取物用TFEB p_S142磷酸化抗體和抗FLAG抗體探測。(B) TFEB蛋白結構示意圖顯示預測的mTORCl磷酸化位點和它們在脊椎動物中的保守性。根據人同種型I編號。(C)所述磷酸化位點的序列保守性評分，以及mTOR共有基序和TFEB磷酸化位點附近序列之間的定量一致性。⑶S142和S211調節(jié)TFEB定位。表達絲氨酸-向-丙氨酸突變形式TFEB - 3 X Flag的HeLa細胞中TFEB亞細胞定位的Flag免疫染色。核用DAPI進行染色。數值是包含至少50個轉染細胞的五個區(qū)域的平均。學生t檢驗(未配對)*#Ρ〈(λ 001。比例尺代表30 μ m。
[0044]圖21:溶酶體通過TFEB調芐基因表達。(A)氯奎處理抑制原代肝細胞中mTORCl的活性。從 2 月齡 Tcfebflox/flox (對照)和 Tcfebflox/flox; Alb-Cre (Tcfeb-/-)小鼠分離的原代肝細胞保持不處理或用Torinl、U0126或氯奎處理過夜。隨后，細胞裂解，并且蛋白提取物用圖示抗體免疫印跡。(B，C)TFEB調節(jié)對氯奎和Torinl的轉錄反應。來自對照(flox/flox)和Tcfeb-/-(flox/f1x;alb-Cre)小鼠的原代肝細胞中TFEB祀標基因的定量PCR(qPCR)。細胞用氯奎(左)和Torinl(右)處理。表達水平顯示為所述經處理對比相應未處理樣品的表達增加％。數值表示三個獨立的肝細胞制備(三只小鼠/基因型)的平均值土 s.d。學生t檢驗(雙尾)*P值< 0.05。
[0045]材料和方法
[0046]細胞培養(yǎng)、培養(yǎng)基、藥物和細胞處理HeLa和COS以及HEK-293T細胞購自ATCC。細胞在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng):(正常)補充有10%FBS的DMEM高葡萄糖；(饑餓)補充有IOmMHEPES、有Ca和Mg的HBSS培養(yǎng)基；(血清)補充有20%FBS的EBSS ；(氨基酸培養(yǎng)基)無葡萄糖和無血清DMEM ;藥物處理:雷帕霉素(2.5mg/ml，西格瑪公司(SIGMA)) 2_4小時，除非另有說明；巴伐洛霉素(400nM，西格瑪公司)2-4小時；胰島素(100ng/ml西格瑪公司)2 小時；EGF、FGF(BD 生物科學公司(BD biosciences)) ；LIF(100ng/ml;ESGR0,密理博公司(Millipore)) 2 小時；ΡΜΑ(1 μ g/ml) 2 小時。U0126 (MEKi)于 25mM(細胞信號轉導公司(Cell Signaling))使用，API2 (AKT抑制劑)于ImM使用。溶酶體抑制劑是抑胃酶肽和E64(10mg/ml4小時西格瑪公司)。在圖18_2的實驗中使用下列藥物:西格瑪公司的雷帕霉素(2.5 μ M5 μ M,除非另有說明);TOCRIS公司的Torinl (250nM250nM，除非另有說明)；細胞信號轉導技術公司(Cell Signaling technology)的 U0126 (50 μ M50 μ Μ);西格瑪公司的氯奎(100 μ M 100 μ M) Jeff De Brabander (德克薩斯大學西南醫(yī)學中心(UTSouthwestern))友情饋贈的水楊酰胺A (2 μ M2 μ M)。
[0047]如下述生成原代肝細胞:2月齡小鼠用阿佛丁(240mg/kg)深度麻醉，并首先用補充有IOmM HEPES和0.5mM EGTA的25ml HBSS(西格瑪公司H6648)的灌注，然后用包含100U/ml膠原酶(Wako公司)和0.05mg/ml胰蛋白酶抑制劑(西格瑪公司)的相似溶液灌注。肝在皮氏培養(yǎng)皿中分離，細胞球團在HBSS中洗滌，并且以濃度5x10s細胞/35mm涂板，并在補充有10%FBS、2mM谷胺酰胺、0.1mM胰島素、0.1mM地塞米松和青霉素/鏈霉素的威廉姆斯E培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第二天，如本文所述處理細胞。Sinl-/-和對照MEF如原先所述(46)生成，并且維持在補充有10%FBS、谷胺酰胺和青霉素/鏈霉素的DMEM中。
[0048]生成Tcfebflrai小鼠系
[0049] 申請人:使用公共可得的胚胎干細胞(ES)克隆(http://www.eucomm.0rg/),其中通過同源重組靶定Tcfeb外顯子4和5處。重組ES細胞克隆注射入胚泡中，胚泡用于生成載有工程改造等位基因的小鼠系。肝特異性KO通過雜交Flox/Flox小鼠與在白蛋白啟動子下表達CRE的轉基因系(ALB-CRE)而生成，所述轉基因系獲自杰克遜實驗室(Jacksonlaboratory)。所有涉及小鼠的方法得到貝勒醫(yī)學院動物護理和使用委員會的批準。[0050]轉染、質粒和siRNA
[0051]質粒和siRNA都用Lipofectamine LTX(英杰公司)利用反向轉染方法來轉染。經siRNA轉染的細胞于48或72小時后收集。siRNA TFEB在50nM(達馬可公司(Dharmacon))下使用，siRNA ERKI/2在IOOnM(細胞信號轉導公司)下使用。
[0052]根據生產商方法使用Lipof ectamine2000或LTX (英杰公司)，用DNA質粒pRK5-mycPATl、pCEP4-TFEB-his、pClG2-TFEB 和 p3 x FLAG-CMVTFEB 瞬時轉染細胞。定位突變根據生產商(司查塔基公司(Stratagene))指示進行,通過測序證實正確的突變。
[0053]Western 印跡
[0054]細胞或組織溶解在補充有蛋白酶抑制劑(羅氏公司(ROCHE))和磷酸酶抑制劑(西格瑪公司)的RIPA緩沖液中。加載10-30微克到4-12%Bis-Tris凝膠(NUPAGE，英杰公司)，轉移到PVDF膜，并且使用ECL方法(皮爾斯公司(Pierce))通過western印跡分析。使用以下抗體:LC3(諾復斯生物制品公司)、FLAG、b-肌動蛋白、微管蛋白(西格瑪公司)、HA (科文斯公司(Covance))、H3、ERKl/2、p-ERKl/2、p-AKT、p-70S6K (細胞信號轉導公司)、ERK2(圣克魯茲公司(Santa Cruz))。蛋白水平使用ImageJ軟件分析定量。
[0055]核/胞質分級分離
[0056]細胞以50%融合接種入6孔板，并且血清饑餓過夜(ON)。第二天在DMSO或激酶抑制劑存在下加入正常培養(yǎng)基。如原先所報導進行亞細胞分級分離。簡單說，細胞在0.5曲通 X-100 裂解緩沖液(50mM Tris-HCl.0.5% 曲通、137.5mM NaCl、10% 甘油、5mM EDTA，補充有新鮮蛋白酶和磷酸酶抑制劑)中裂解。上清液代表胞質部分，而核球團洗滌兩次，并在0.5曲通X-100緩沖液0.5%SDS中裂解并超聲處理。
[0057]長壽命蛋白的降解
[0058]亞融合細胞用L-U14C-絲氨酸培養(yǎng)20小時，并且用冷培養(yǎng)基追蹤I小時以降解短壽命蛋白。隨后細胞用正常培養(yǎng)基或饑餓培養(yǎng)基(最終存在3-MA)培養(yǎng)4小時。長壽命蛋白的降解速率用培養(yǎng)基中的溶解放射性與可酸性沉淀的細胞球團中的不溶放射性的比率來計算。
[0059]RNA提取、逆轉錄、ChIP和定量PCR
[0060]使用TRIzol (英杰公司)從組織中提取或者使用RNAesy柱(凱杰公司)從細胞中提取總RNA。使用TaqMan逆轉錄試劑(應用生物系統(tǒng)公司)進行逆轉錄。溶酶體和自體吞噬基因特異性引物此前已報導2。自體吞噬基因引物和小鼠引物購自SA生物科學公司(SABiosciences)。倍數變化使用SA生物科學公司的在線數據分析網站(http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php)計算，該網站使用 DDCt 方法。簡單說，最穩(wěn)定的持家基因(GAPDH、ACTB, B2M、RPL13A、HPRT和親環(huán)素)的平均用作“標準化”基因以計算DCt值。然后，計算“對照”組和“實驗”組之間的DDCt值。最后，使用2(_DDet)計算倍數變化。將生物學重復分組以計算倍數變化值。用未配對T檢驗計算統(tǒng)計學顯著性。圖中星號指示P值〈0.05。
[0061]蛋白激酶預測
[0062] 申請人:使用T 五種方法，包括 CrPhos0.8、GPS-2.1、PhosphoMotifFinder>Networkin和PH0SIDA，采用默認參數(15-19)。根據其置信評分，進一步過濾CrPhos0.8和GPS-2.1預測。對前者而言，用假陽性率(FPR)等于或小于30%來考慮預測。對后者而言，用評分等于或大于5來考慮預測。計算GPS-2.1評分為實際評分和臨界值之間的差異。從其他三種方法中取所有預測。Networkin的情形中，結合Networkin和Networkin2的預測。各方法描述了在不同激酶分類中與S142位點相關的激酶，所述分類簡單涉及四種層次水平:激酶組、激酶家族、激酶亞族和激酶本身。為獲得各層次等級的一般共性，如果所述預測尚未以這四種層次等級的方式分類，那么我們將各預測按這四種層次等級分類。在http://kinase, org/kinbase數據庫的脊椎動物進化支和人物種下檢索缺失分類。根據各分類中的主要得票發(fā)現(xiàn)各分類的共性。
[0063]體外激酶實驗
[0064]TFEB-S-142:Seq Id N0.2 的氨基酸(aa.) 117-166:
[0065]PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNSPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0066]和TFEB-A_142:Seq Id N0.4，對應 Seq Id N0.2 的氨基酸 117-166，其中 Ser142Ala (粗體):
[0067]PPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPN A PMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMR
[0068]其由GENESCRIPT 公司合成。所述測試肽 TFEB-A-142 和 TFEB-S-142 在 50mMHEPES pH7中制成ImM?？磥頉]有溶解問題。使用密理博公司的標準放射性測量試驗，所述激酶試驗在室溫下以200 μ M ATP和100 μ M各個肽進行40分鐘。所有蛋白激酶在其標準KinaseProf iler?試驗濃度下使用。孵育之后，所有試驗通過加酸來終止，并取等分樣品點樣在P30和Filtermat A上以分離產物。所有測試進行一式三份，并且包括各蛋白激酶的常見底物作為對照。
[0069]體內基因遞送
[0070]小鼠飼養(yǎng)在貝勒醫(yī)學院的轉基因小鼠實驗室中(美國德克薩斯州休斯頓)。GFP-LC3轉基因小鼠是N.Mizushima的友情饋贈。除非另有說明，使用C57B6雌性小鼠(4周齡)。所述AAV載體由TIGEM AAV載體中心實驗室生成。簡單說，通過取代GFP序列而把小鼠TFEB (TcFEB)編碼序列克隆到pAAV2.1-CMV-GFP質粒中并與HA標簽一同并入框架中。然后將所得的PAAV2.1-CMV-TcFEB-HA與pAd-Helper和pack2/9包被質粒三重轉染入亞融合293細胞內。重組AAV2/9載體通過兩輪CsCl純化。表達為基因組拷貝數(GC/mL)的載體滴度通過使用TaqMan(馬薩諸塞州沃森姆的帕金埃爾默公司，生命和分析科學)PCR定量和點印跡分析來估算。各小鼠眼窩竇后注射1.25χ10η病毒顆粒，并在3周后處死。分析基因表達時，饑餓小鼠已缺食16小時，或者分析GFP-LC3點數目時，已缺食24小時。
[0071]組織學和免疫熒光
[0072]收集肝樣品， 并且在含4%多聚甲醛的PBS中固定過夜。在含10和30%蔗糖的PBS中冷凍保護后，樣品在OCT(加利福尼亞州托蘭斯SF公司(Sakura Finetech))中冷凍，并且切片成30 μ m厚度。在Axioplan2 (紐約州桑伍德的蔡司公司(Zeiss))上照相。對免疫熒光而言，切片在含2.5%BSA的PBS+0.1%曲通X-100中室溫封閉2小時。封閉后，樣品用一抗孵育20小時，并在PBS+0.05%TX-100中洗滌三次后，用偶聯(lián)有Alexafluor488或Alexaf luor555 (英杰公司)的二抗孵育3小時。對HA的免疫組織化學分析，使用親和素-生物素復合物(ABC)方法(Vectastain Elite ABC試劑盒)?？笹FP來自阿柏堪穆公司(Abcam);(稀釋 1:500)。
[0073]電子顯微術
[0074]對照和TFEB過量表達細胞用PBS洗滌，并且在溶解有1%戊二醛的0.2M Hepes緩沖液(PH7.4)中室溫固定30分鐘。細胞然后在0s04中再固定2h。在梯度乙醇中脫水后，細胞包埋入Epon812(伏路卡公司(Fluka))中，并且在60°C聚合72小時。在Leica EM UC6中切出薄切片，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛復染。使用裝備有ULTRAVIEW CCD數碼照相機(荷蘭埃因霍溫的飛利浦公司(Philips))的Philips Tecna1-12電子顯微鏡，從薄切片獲得EM圖片?？张菪纬傻亩渴褂肁nalySIS軟件(德國明斯特的軟成像系統(tǒng)公司(Soft ImagingSystems))進行。定量用細胞的選擇是基于其對體視學(stereologic)分析的適宜性，即僅僅分析經其中心區(qū)域切過的細胞(基于高爾基膜的存在測定)。
[0075]動物模型
[0076]所有涉及小鼠的方法都得到貝勒醫(yī)學院動物護理和使用委員會的批準。GFP-LC3轉基因系如原先所述。如下產生Tcfeb的組織特異性過量表達:將Tcfeb_3xFlag cDNA插入CAGCAT盒[雞肌動蛋白啟動子(CAG)后有側接21oxP位點的氯霉素乙酰轉移酶(CAT) cDNA]后，并且用于生成轉基因小鼠 (貝勒醫(yī)學院轉基因中心)。小鼠然后與白蛋白_CRE(獲自杰克遜實驗室)系雜交。對48饑餓方案而言，小鼠缺食22小時，隨后進食2小時，再禁食24小時后處死。
[0077]酶活性
[0078]溶酶體酶酸性磷酸酶、β -半乳糖苷酶和β -己糖胺酶的活性采用合適的熒光或顯色底物來測定。SGSH活性按照Fraldi等Hum Mol Gen2007 (33)中所述測定。
[0079]免疫印跡和抗體
[0080]小鼠抗TFEB單克隆抗體購自MB公司(My Biosource)目錄號MBS120432。為了生成抗pS142特異性抗體，兔子免疫接種偶聯(lián)有KLH的如下肽:AGNSAPN{pSer}PMAMLHIC。第四次免疫后，處死兔子并收集血清。通過循環(huán)流過含非磷酸化抗原的柱來除去血清中非磷酸化特異性的抗體。然后使用含磷酸化肽的柱來純化磷酸化特異性抗體。
[0081]細胞用包含蛋白酶和磷酸酶抑制劑(西格瑪公司)的M-PER緩沖液(賽默公司(Thermo))裂解；如上所述分離核/胞質部分。蛋白通過SDS - PAGE(英杰公司；還原NuPAGE4 - 12%Bis_tris凝膠,MES SDS緩沖液)分離。如需要,所述凝膠使用20ml Imperial蛋白染色劑(塞摩費舍爾公司(Thermo Fisher))在室溫染色I小時，并且用水脫色。通過用1-Blot (英杰公司)把蛋白轉印到硝酸纖維素膜上來進行免疫印跡分析。所述膜用含5%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液(含0.05%吐溫20的TBS)封閉，并且用一抗抗體抗FLAG和抗TUBULIN(西格瑪公司；1:2000)、抗H3(細胞信號轉導公司；1:10000)在室溫孵育2小時，而下列抗體在 5%BSA 中孵育過夜(ON):抗 TFEB (MB 公司;1:1000)、抗 P TFEB (1:1000) ERKI/2、p-ERKI/2, p-P70S6K、P70S6K(細胞信號轉導公司；1:1000)。所述膜用TBS-T緩沖液洗滌三次，并且用堿性磷酸酶偶聯(lián)的IgG(普洛麥格公司；0.2mg/ml)室溫孵育I小時。所述膜用TBS緩沖液洗滌三次，并使所表達的蛋白通過加入IOml Western Blue穩(wěn)定底物(普洛麥格公司)而顯現(xiàn)。
[0082]高內涵核移位試驗
[0083]TFEB-GFP細胞接種入384孔板，培養(yǎng)12小時，并且用10個不同濃度(50000nM、16666.66ηΜ、5555.55ηΜ、1851.85ηΜ、617.28ηΜ、205.76ηΜ、68.58ηΜ、22.86ηΜ、22.86ηΜ、
7.62ηΜ和2.54ηΜ)的ERK抑制劑U0126 (西格瑪奧德里奇公司)和mTOR抑制劑雷帕霉素(西格瑪奧德里奇公司)、Torinl (Biomarin公司)和Torin2 (Biomarin公司)處理。37°C下RPMI培養(yǎng)基中3小時后，細胞洗滌、固定并且用DAPI染色。為了獲得圖像，通過使用共聚焦自動顯微鏡(Opera高內涵系統(tǒng)，帕金埃爾默公司)，對384孔板的各孔照10張照片。開發(fā)專門的腳本(script)來對不同圖像中的TFEB定位進行分析(Acapella軟件，帕金埃爾默公司)。所述腳本計算來自核TFEB-GFP熒光的平均強度除以TFEB-GFP熒光胞質強度均值的比值。所得結構使用相同板中的陰性(RPMI培養(yǎng)基)和陽性(HBSS饑餓)對照樣品來標準化。數據通過使用Prism軟件(GraphPad軟件)由各化合物不同濃度下的核移位百分比來表示。使用非線性回歸擬合(Prism軟件)計算各化合物的EC50。
[0084]結果
[0085]TFEB誘導自體吞噬
[0086](巨)自體吞噬是進 化保守的機制，該機制把胞質內材料靶定到溶酶體，因而在營養(yǎng)饑餓期間提供能量供應(1，3)。饑餓期間的自體吞噬活性由mTOR調節(jié)，mTOR的活性依賴
于細胞能量需要。
[0087]由于自體吞噬是自噬體和溶酶體緊密關聯(lián)的結果(1)， 申請人:測試了 TFEB是否調節(jié)自體吞噬，TFEB是控制溶酶體生物發(fā)生的轉錄因子。因為TFEB對溶酶體生物發(fā)生和功能(2)以及溶酶體的胞吐起到正向控制(圖16和17)，應該預期TFEB過量表達會由于其通過溶酶體增加降解而減少自噬體數。令人驚訝的是，如使用LC3標記所測定，HeLa細胞中穩(wěn)定的TFEB過量表達顯著增加了自噬體數，所述LC3標記特異性結合自噬體(4-7)(圖la, b)。通過HeLa和Cos細胞中瞬時過量表達TFEB獲得相似數據(圖5)。在感染慢病毒過量表達TFEB的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上，通過電子顯微術也檢測到自噬體數的增加(圖6)。在用自噬體的溶酶體抑制劑/LC3II降解巴伐洛霉素和抑胃酶肽/E64(8)處理的細胞中持續(xù)這種增加，表明TFEB激活自噬體的形成(圖1a和圖7)。在TFEB過量表達的細胞中，營養(yǎng)饑餓沒有進一步增加自噬體數(圖la，c)，提示TFEB過量表達對自體吞噬的飽和效應，并提出了 TFEB可能是饑餓誘導的自體吞噬的重要調節(jié)物的可能性。
[0088]與這些發(fā)現(xiàn)一致，HeLa細胞中TFEB的RNA干擾(RNAi)造成正常和饑餓條件下有或沒有巴伐洛霉素存在時LC3II水平都有降低(圖ld-f)。顯然，LC3II的降低與不同RNAi寡核苷酸造成的TFEB水平下調有關，這顯示了試驗的特異性(圖lg)。這些功能增減的數據提示自卩遼體和溶酶體的生物發(fā)生(biogeneses)受TFEB共同調節(jié)。 申請人:然后使用帶RFP-GFP串聯(lián)標簽的LC3蛋白測量自噬體向溶酶體運輸的速率(9)，所述蛋白區(qū)分早期溶酶體細胞器(GFP-陽性/mRFP-陽性)與酸化的自噬溶酶體(GFP-陰性/mRFP-陽性)，因為GFP信號(但mRFP不會)在酸性細胞器內被淬滅(9)。發(fā)現(xiàn)了 TFEB過量表達細胞中自噬溶酶體數高于對照細胞，表明TFEB提高自噬體一溶酶體融合，因而促進溶酶體流動(圖1h)。TFEB調節(jié)自體吞噬作用的功能證據來自以下觀察:長壽命蛋白的降解因TFEB過量而增強，因TFEB敲減而降低。自體吞噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)消除這種增強(10)(圖8)。[0089]為了測試TFEB是否調節(jié)自體吞噬基因的表達， 申請人:分析了一組51個基因的mRNA水平，這些基因據報導參與自體吞噬通路中數個步驟(1，12，13)。觀察到過量表達TFEB的細胞中自體吞噬基因表達水平的提高與饑餓期間所得提高非常相似(HeLa細胞在EBSS培養(yǎng)基中4小時)(皮爾遜(Pearson)相關:r值=0.42;p值=0.001)，而其在TFEB沉默之后下調(圖 2a 與表 I 和 2)。其中，UVRAG、WIP1、MAPLC3B、SQSTMl、VPSl1、VPS18 和ATG9B的表達受TFEB過量表達的影響最顯著(表1和2)。已知這些基因在自體吞噬的不同步驟中起作用，并且看來是TFEB的直接靶標，因為其啟動子中帶有至少一個CLEAR位點
(2)(圖9)。有趣的是，VPSl1、VPS18和UVRAG在自噬體運輸到溶酶體中起作用(14)，這與TFEB過量表達細胞中溶酶體一自噬體融合的顯著增強一致。
[0090]這些數據指示TFEB參與饑餓誘導的自體吞噬的轉錄調節(jié)。這個結論得到下面觀察的強烈支持。第一，螢光素酶報導試驗(2)顯示饑餓增強了 TFEB對靶標基因轉錄的影響(圖10)。第二，TFEB直接靶標的表達在饑餓細胞中上調，并且這種上調受TFEB沉默的抑制(圖 2a, c) ο
[0091 ] 饑餓調節(jié)TFEB的核移位和活性。
[0092]為了鑒定饑餓誘導活化TFEB的機制， 申請人:分析了饑餓細胞中TFEB的亞細胞定位和轉錄后修飾。在正常條件下，TFEB定位于胞質(2)。觀察到營養(yǎng)饑餓(EBSS培養(yǎng)基)快速誘導TFEB的核移位(圖2d，e)，以及饑餓細胞的胞質TFEB看來分子量低于正常進食細胞的TFEBjn western印跡分析所示(圖1la)。這個分子量改變發(fā)生快速但短暫，并且在向饑餓細胞中再加入正常培養(yǎng)基后I小時內消除，同時核TFEB降低(圖1la)。通過向EBSS培養(yǎng)基補充血清、氨基酸或者生長因子(即胰島素或EGF)， 申請人:觀察到TFEB核移位相較僅用饑餓培養(yǎng)基有顯著抑制(圖2f)。當EBSS補充有細胞因子(即INF或LIF)時，幾乎未見影響(圖2f)，這提示TFEB活化是受對營養(yǎng)和生長因子敏感的信號轉導機制調節(jié)的過程。 申請人:用補充有mTOR激酶抑制藥物(雷帕霉素)、PI3K-AKT激酶抑制藥物(曲西立濱)和MEK激酶抑制藥物(U0126)的正常培養(yǎng)基刺激饑餓的細胞。MEKi抑制導致TFEB核定位，其水平與饑餓類似，而AKT和mTOR抑制沒有影響(圖2g和圖1lb)。這些數據提示TFEB活性受MAP激酶調節(jié)，揭示了這個信號轉導通路在調節(jié)饑餓誘導的自體吞噬中的意外作用。此外，HeLa細胞中組成型活性MEK(caMEK)的表達導致饑餓期間TFEB靶標基因表達的下調，因而模擬了 TFEB敲減的效果(圖2h)，而TFEB消耗細胞中caMEK過量表達對TFEB靶標基因的表達沒有影響(圖2h)。
[0093]絲氨酸磷酸化調節(jié)TFEB活化
[0094]為了更詳細分析MAPK信號轉導和TFEB之間的關系， 申請人:進行了質譜分析，并且鑒定了至少三個絲氨酸(即S142、S332和S402)在營養(yǎng)富集培養(yǎng)基中被磷酸化，但是在饑餓培養(yǎng)基中則不然。把這三個絲氨酸各自突變成丙氨酸以消除磷酸化。在HeLa細胞中表達各突變的TFEB蛋白，并且分析TFEB核移位。TFEB(S142A)突變顯示核定位比TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)顯著增加(圖3a和圖12a)。相反，磷酸模擬突變(TFEB S142D)在營養(yǎng)饑餓中不能移位入核(圖12b)。S142A TFEB突變在正常培養(yǎng)基中以較低分子量遷移，但是在饑餓培養(yǎng)基中則不然，而S142D突變在饑餓期間顯示比WT TFEB的變化減弱(圖12c，d)，進一步證明了 S142在正常培養(yǎng)基中磷酸化，但是饑餓培養(yǎng)基中則不然。TFEB(S142A)的表達造成TFEB靶標基因表達水平相較TFEB(WT)、TFEB(S332A)和TFEB(S402A)有提高(圖3b)。一致地，TFEB (S142A)導致的自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的誘導強于wt TFEB，如自噬體(圖3c和圖13)、溶酶體(圖3d)和自噬溶酶體(圖3e)數目增加所顯示。因此，TFEB核移位和活化受絲氨酸142磷酸化的調節(jié)。
[0095]為了鑒定負責絲氨酸142磷酸化的具體激酶， 申請人:進行生物信息學分析，所用分析方法基于在一組實驗確證的磷酸化位點基礎上構建的計算模型(15-19)(詳細見方法)。與前面結果一致， 申請人:鑒定出絲氨酸特異性胞外調節(jié)激酶(ERK)作為絲氨酸142磷酸化的一流(top-ranking)候選(表3)。有趣地是,絲氨酸142在其他HLH-亮氨酸拉鏈基因家族成員中高度保守，例如小眼畸形(Microphthalmia)轉錄因子(MITF)(圖14)，發(fā)現(xiàn)其由ERK2磷酸化(20)。ERK2介導TFEB磷酸化的其他證據來自在正常培養(yǎng)基中ERK2-TFEB的免疫共沉淀(圖3f)，但是在饑餓培養(yǎng)基中則不然。此外，siRNA介導的ERK1/2蛋白敲減誘導的TFEB核移位程度與營養(yǎng)饑餓相似(圖3h)。
[0096]TFEB介導的自體吞噬誘導的體內分析。
[0097] 申請人:分析了 GFP-LC3轉基因小鼠體內溶酶體/自體吞噬通路的TFEB介導控制的生理相關性(11)。由于有報導觀察到營養(yǎng)耗減時肝中的自體吞噬反應， 申請人:關注于肝的研究。肝中，GFP陽性囊泡數在禁食24小時后開始增加，并且在48小時達到峰值(48小時饑餓方案見材料和方法)(圖4a)，而自體吞噬和溶酶體TFEB靶標基因的轉錄誘導在禁食16小時后顯現(xiàn)(圖4b)。因此，轉錄活化先于自噬體的體內形成。重要地是，禁食16小時時，TFEB亞細胞定位完 全在核中(圖4c，d)，并且ERK磷酸化水平比進食動物有降低(圖4e)，饑餓表明調節(jié)體內TFEB活性，這與培養(yǎng)細胞中觀察到的相似。
[0098] 申請人:使用病毒和轉基因介導的TFEB過量表達來評價TFEB是否足以誘導體內自體吞噬。用包含帶HA表位標簽的鼠TcfebcDNA的腺關聯(lián)病毒(AAV)載體(AAV2/9 -Tcfeb-ΗΑ)全身注射GFP-LC3轉基因小鼠(11)(圖15a，b)。來自Tcfeb注射動物的肝樣品顯示GFP陽性囊泡數顯著增加，并且這種增加由饑餓進一步增強(圖4e，f)。另外，來自條件Tcfeb-3xFLAG轉基因小鼠的肝樣品(其中轉基因表達由肝特異性CRE重組酶驅動(即白蛋白-CRE)(圖15c))顯示溶酶體和自體吞噬基因的表達和自噬體數相比對照同胞仔都有顯著增加(圖4g，h)?？傊@些數據表明饑餓誘導TFEB在自體吞噬的轉錄調節(jié)中的重要作用。
[0099]TORCl調節(jié)TFEB亞細胞定位
[0100]然后在HeLa和HEK-293T細胞中分析TFEB亞細胞定位，所述細胞瞬時轉染有TFEB - 3 X FLAG質粒，并經溶酶體功能抑制劑處理過夜。這些處理包括使用溶酶體pH梯度抑制劑氯奎和ν-ΑΤΡ酶選擇性抑制劑水楊酰胺A(SalA) (38)。核/胞質分級分離后進行的免疫印跡顯示溶酶體應激也誘導外源表達TFEB的核移位，并且TFEB核積聚也與TFEB - 3 xFLAG向更低分子量變化有關，提示溶酶體應激可能影響TFEB磷酸化狀態(tài)(圖18)。
[0101]基于mTORCl位于溶酶體膜且其活性依賴于營養(yǎng)和溶酶體功能(39，40)， 申請人:假定溶酶體應激對TFEB核移位的影響可能受mTORCl介導。與這個觀點一致，按已知mTORCl底物P-P70S6K的水平所測得，氯奎或SalA抑制mTORCl活性，(圖19A) (40)。mTOR的參與看來與原先觀察到已知mTOR抑制劑雷帕霉素不影響TFEB活性的情形相反。然而，近期數據指示雷帕霉素是mTOR的部分抑制劑，因為在這種藥物存在下，一些底物仍然被有效地磷酸化(41)。因此， 申請人:使用激酶抑制劑Torinl和Torin2 (屬于祀向mTOR催化位點的新分子類型)由此完全抑制mTOR活性(41，47，48)。
[0102] 申請人:用補充有Torinl (250nM)、雷帕霉素(2.5 μ M)或ERK抑制劑U0126 (50 μ Μ)的富氨基酸培養(yǎng)基刺激饑餓細胞，在所述細胞中TFEB被磷酸化并且定位到核。僅用營養(yǎng)刺激饑餓細胞誘導TFEB分子量顯著變化，并且重新定位到胞質中(圖19Β)。在濃度為50 μ M的ERK抑制劑U0126存在下，營養(yǎng)刺激僅誘導部分TFEB分子量變化，提示受ERK的磷酸化部分導致TFEB胞質定位。用2.5 μ M雷帕霉素處理也造成部分分子量變化，但是不影響TFEB的亞細胞定位(圖19Β)。然而，Torinl (250ηΜ)處理完全阻止營養(yǎng)誘導的分子量變化，并繼而造成大量TFEB核積聚。使用穩(wěn)定過量表達融合有綠色熒光蛋白的TFEB (TFEB-GFP)的HeLa細胞在基于細胞的高內涵試驗中證實了這些數據。在這個試驗中，通過自動共聚焦顯微鏡(OPERA系統(tǒng))獲得經處理細胞的圖像，并且用Acapella圖像軟件分析這些圖像以計算細胞的胞質和核之間TFEB-GFP的平均熒光強度之比(詳細見材料和方法)(圖19C和D)。因為Torinl抑制mTORCl和mT0RC2復合物， 申請人:然后評價了各復合物對TFEB調節(jié)的作用。下面三個觀察提示TFEB主要受mTORCl調節(jié):(I)用氨基酸刺激饑餓細胞(所述氨基酸活化mTORCl但是不活化mT0RC2)誘導了廣泛的TFEB分子量變化，強烈提示磷酸化活動(圖19E) ; (2)調節(jié)氨基酸向mTORCl信號的RagC和RagD的敲減造成TFEB核積聚，即使在保持于全營養(yǎng)培養(yǎng)基的細胞中亦然(圖19F) ; (3)在mT0RC2信號被破壞的細胞(Sinl-/-小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)) (49，50，46)中，TFEB在Torinl處理后經歷與對照細胞相似的分子量變化和核移位(圖19G)。
[0103] mTORCl通過S142磷酸化控制TFEB亞細胞定位
[0104]為了測試mTORCl是否在S142磷酸化TFEB， 申請人:生成了僅識別S142磷酸化的TFEB的磷酸特異性抗體。使用這種抗體， 申請人:觀察到在營養(yǎng)耗盡培養(yǎng)基中培養(yǎng)的穩(wěn)定過量表達TFEB-3 X FLAG的HeLa細胞中，TFEB不再有S142磷酸化，這與 申請人:上面報導的結果一致(圖20A)。
[0105]然后，分析了在補充以含或不含Torinl或雷帕霉素的正常培養(yǎng)基的饑餓細胞中的S142磷酸化水平。Torinl清楚地減弱營養(yǎng)誘導的S142磷酸化時，但雷帕霉素卻沒有這種效果，提示S142表示雷帕霉素抗性mTORCl位點(圖20A)。這些結果清楚地表明TFEB是mTOR底物，并且S142是mTOR對TFEB磷酸化的關鍵殘基。
[0106]近期的發(fā)現(xiàn)提示mTORCl在多個位點磷酸化其靶標蛋白(42，43，44)。為了鑒定可被mTOR磷酸化的其他絲氨酸殘基， 申請人:檢索了 TFEB編碼序列中mTORCl的共有磷酸受體基序(42)(圖20B和C)。將所有推定為mTORCl靶標的TFEB氨基酸殘基突變成丙氨酸。然后測試了各個突變對TFEB亞細胞定位的影響，并且發(fā)現(xiàn)，與S142A相似，位點211的絲氨酸-向-丙氨酸突變(S211A)造成TFEB的組成型核定位(圖20D)。其他絲氨酸殘基的突變與野生型TFEB的表現(xiàn)相似(圖20D)。
[0107]總之，這些數據表明，除S142以外，S211也在TFEB亞細胞定位中起作用，并且提示S211表示mTORCl的額外祀標位點。
[0108]溶酶體調節(jié)TFEB中的基因表達[0109]因為TFEB與mTORCl的相互作用控制TFEB核移位， 申請人:測試TFEB調芐基因表達的能力是否也受這種相互作用影響。在來自肝中刪除TFEB的條件敲除小鼠系(Tcfebfiwfl0X;alb-CRE)和對照小鼠系(Tcfebfl°x/fl°x)的原代肝細胞中，測試已顯示為TFEB靶標的數個溶酶體/自體吞噬基因的表達(37)。細胞用氯奎或Torinl處理，或保持不處理。按p-S6K水平所測，這些處理抑制mTOR，而p-ERK的水平沒有受影響(圖21A)。相較對照肝細胞，從TFEB條件敲除小鼠中分離并且在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原代肝細胞在數個TFEB靶標基因的表達水平上沒有顯示顯著差異。然而，盡管TFEB靶標基因的表達在用氯奎處理后的對照小鼠肝細胞中有上調，但是這種上調在TFEB條件敲除小鼠的肝細胞中顯著減弱(圖21B)。相似地，對Torinl處理的轉錄反應在TFEB條件敲除小鼠的肝細胞中顯著減弱(圖21C)?？傊?，這些結果表明TFEB在通過mTOR的溶酶體誘導的轉錄反應中起關鍵作用。
[0110]已經描述了調節(jié)自體吞噬的轉錄依賴性機制(24，25)和不依賴性機制(26，27)。這個研究鑒定了新的激酶依賴性調節(jié)回路，所述回路控制自噬體通路的多個關鍵步驟，例如自噬體形成、自噬體一溶酶體融合和溶酶體介導的自噬體內容物降解。有趣的是， 申請人:觀察到自體吞噬/溶酶體基因的轉錄誘導先于自噬體形成。可以設想的是這種轉錄依賴性機制保證了更長久且持續(xù)的自體吞噬活化。
[0111]自體吞噬功能障礙與數種遺傳疾病有關(28-30)，相反，原先的研究顯示了在神經退行性疾病和肝纖維化的動物模型中自體吞噬的增強有治療效果(29，31，32)。
[0112]在轉錄水平控制溶酶體一自體吞噬通路的新機制的發(fā)現(xiàn)提示調節(jié)這些疾病中細胞清除的新方法。另外，提供了基于溶酶體酶的治療方法的副產品，提示提高細胞系生成內源或重組溶酶體酶的產量的新策略(圖16和17)。另外，TFEB過量表達能提高底物清除，并且拯救LSD中細胞空泡形成(45);因此，調節(jié)TFEB活性的磷酸化介導機制的鑒定提供了促進健康和疾病中細胞清除的新工具。
[0113]表1:響應TFEB過量表達或細胞饑餓5的基因表達變化(皮爾森相關0.42)
【權利要求】
1.一種組成型定位在真核細胞核內的TFEB變體蛋白。
2.如權利要求1所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述變體包含絲氨酸殘基取代以使其對磷酸化不敏感。
3.如前述權利要求中任一項所述的TFEB變體蛋白，其特征在于,所述變體蛋白由Seq.1d N0.2所含氨基酸序列組成，并且其中所述絲氨酸殘基取代是在Seq.1d.N0.2的SER142和 / 或 SER211。
4.如權利要求3所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述Seq.1d N0.2中所含氨基酸序列是從氨基酸117到氨基酸166，并且所述絲氨酸殘基取代是在Seq.1d N0.2中的SER142，如 Seq Id N0.4 所示。
5.如權利要求3或4所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述在Seq.1d.N0.2中SER142和/或SER211的取代是ALA取代。
6.如上述權利要求中任一項所述的TFEB變體蛋白用于醫(yī)學應用。
7.如權利要求6所述的TFEB變體蛋白用于治療需要誘導細胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)的疾病中的應用。
8.如權利要求6所述的TFEB變體蛋白用于治療下列病癥中的應用:溶酶體貯積癥、神經退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
9.如權利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述溶酶體貯積癥包含:激活因子缺乏癥/GM2神經節(jié)苷脂沉積病、α -甘露糖苷貯積癥、天冬氨?；咸烟前纺颉⒛懝檀减ベA積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯(Farber)病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇(Gaucher)病(包含I型、II型和III型)、GM1神經節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/少年型、成年型/慢性)、1細胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質營養(yǎng)不良、假性赫爾利多營養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合征、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合征、A型沙費利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費利波綜合征/MPS IIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神經元蠟樣質脂褐質沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成人發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經元蠟樣脂褐質沉積癥/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積病、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡/GM2神經節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
10.如權利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述肝病選自αI抗胰蛋白酶缺陷和脂肪肝病。
11.如權利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述肌肉疾病選自自體吞噬液泡肌病和過度自噬X連鎖肌病。
12.如權利要求8所述的TFEB變體蛋白， 其特征在于，所述代謝疾病選自高膽固醇血癥和脂肪肝病。
13.如權利要求8所述的TFEB變體蛋白，其特征在于，所述神經退行性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費爾特-雅各布病和脊髓性小腦萎縮癥。
14.一種核酸，所述核酸包含編碼如權利要求1-5中任一項所述的TFEB變體蛋白的編碼序列。
15.如權利要求14所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SeqId N0.3的序列。
16.一種表達載體，所述表達載體在適當調節(jié)序列下包含如權利要求14或15所述核酸。
17.如權利要求16所述的表達載體用于基因治療。
18.一種提高離體培養(yǎng)細胞中內源或重組溶酶體酶產量的方法，所述方法包含如下步驟:_將權利要求14或15所述的核酸或者權利要求16所述的表達載體導入所述細胞，和-使所編碼的TFEB變體蛋白得以表達。
19.一種通過給予對象藥學有效量的如權利要求1-5中任一項所述的TFEB變體蛋白來治療疾病的方法，其特征在于，所述疾病通過誘導細胞自體吞噬/溶酶體系統(tǒng)來緩解。
20.一種通過給予藥學有效量的如權利要求1-5中任一項所述的TFEB變體蛋白來治療疾病的方法，其特征在于，所述疾病選自:溶酶體貯積癥、神經退行性疾病、肝病、肌肉疾病和代謝疾病。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是代謝疾病，其中所述代謝疾病是高膽固醇血癥或脂肪 肝病。
22.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是神經退行性疾病，并且所述神經退行性疾病是阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、克羅伊茨費爾特-雅各布病或脊髓性小腦萎縮癥。
23.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是溶酶體貯積癥，并且所述溶酶體疾病是:激活因子缺乏癥/GM2神經節(jié)苷脂沉積病、α -甘露糖苷貯積癥、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶A缺乏癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯(Farber)病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖涎酸貯積癥、高歇(Gaucher)病(包含I型、II型和III型)、GMl神經節(jié)苷脂沉積病(包含嬰兒型、晚嬰型/少年型、成年型/慢性)、I細胞疾病/黏脂沉積癥II型、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(包含嬰兒發(fā)病、遲發(fā)性)、異染性腦白質營養(yǎng)不良、假性赫爾利多營養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積癥IIIA型、MPS I型賀勒綜合征、MPS I型施艾氏綜合征、MPS I型賀勒氏-施艾氏綜合征、MPS II型亨特綜合型、A型沙費利波綜合征/MPS IIIA型、B型沙費利波綜合征/MPSIIIB型、A型莫奎歐氏癥/MPS IVA型、B型莫奎歐氏癥/MPS IVB型、MPS IX型透明質酸酶缺乏癥、尼曼-匹克氏病(包含A型、B型和C型)、神經元蠟樣質脂褐質沉積病(包含CLN6病、非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、幼年巴-斯-沃三氏/少年型NCL/CLN3病、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-比二氏病/晚嬰型CLN2/TPP1病、Kufs/成人發(fā)病型NCL/CLN4病、北方癲癇/異晚嬰型CLN8和神經元蠟樣脂褐質沉積癥/嬰兒型CLN1/PPT病)、β -甘露糖苷貯積病、龐培氏病/11型糖原貯積病、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病型/GM2神經節(jié)苷脂累積病、嬰幼兒山霍夫氏病/GM2神經節(jié)苷脂累積病、青少年山霍夫氏病/GM2神經節(jié)苷脂累積病少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡/GM2神經節(jié)苷脂累積病、Wolman病、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥。
24.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是肝病，并且所述肝病是α?抗胰蛋白酶缺陷或脂肪肝病。
25.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述疾病是肌肉疾病，并且所述肌肉疾病是自體吞噬液泡肌病或過度 自噬X連鎖肌病。
【文檔編號】A61P43/00GK103619873SQ201280012155
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年3月7日 優(yōu)先權日:2011年3月7日
【發(fā)明者】C·塞滕布里, A·巴拉比奧, D·L·梅迪納薩納巴里 申請人:泰萊托恩基金會