作為輻射緩和劑和輻射防護(hù)劑的bpi和其同源物的制作方法
【專利摘要】本文中描述緩和個體(subject，individual)中由暴露于輻射(意外的/無意的或有意的，例如治療性的)、化學(xué)輻射療法、疾病、毒素、或藥物或生物介導(dǎo)療法引起的組織損害的方法。
【專利說明】作為輻射緩和劑和輻射防護(hù)劑的BPI和其同源物
[0001]聯(lián)邦資助研究
[0002]本發(fā)明是根據(jù)國防高級研究計劃署(Defense Advanced Research ProjeatsAgency) (DARPA)的批準(zhǔn)號HR001-08-0011和醫(yī)學(xué)對策研究試點中心(Center for MedicalCountermeasures Research Pilot)的批準(zhǔn)號5U19A1067751在政府支持下作出的。因此，政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】【背景技術(shù)】
[0003]人類暴露于輻射可造成嚴(yán)重傷害，甚至死亡。暴露可為意外的，例如由核電站的輻射泄漏引起。暴露也可為有意的，例如由恐怖活動引起。最常見的輻射暴露情況由醫(yī)學(xué)干預(yù)引起，例如用于治療癌癥。這種情況下的輻射可為局部的或全身的。當(dāng)局部施加時，輻射仍然可在輻射路徑中對健康的組織造成不期望的損害。當(dāng)全身施加(即，全身輻照)時，低劑量可導(dǎo)致骨髓損傷和胃腸道毒性。高劑量的全身輻照可導(dǎo)致永久性骨髓損傷、腸和肺毒性，且有時導(dǎo)致死亡。當(dāng)前需要保護(hù)健康的組織以及緩和暴露于電離輻射的急性和慢性效應(yīng)的有效治療方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本文中描述緩和個體(subieat, individual)中由暴露于福射(意外的/無意的或有意的，例如治療性的)、化學(xué)輻射療法或疾病引起的組織損害的方法。所述方法包含向個體(稱為有需要的個體)施予足以降低(部分或完全)暴露效應(yīng)，由此緩和個體中由輻射暴露引起的組織損害的量的殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、一種(至少一種、一種或一種以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。在某些實施例中，輻射暴露是由意外暴露于輻射(例如在核電站故障事件中發(fā)生)或有意的暴露于輻射(例如治療性輻射、化學(xué)輻射療法或輻射療法)引起。組織損害可為(例如)對造血組織(例如，骨髓)的損害或?qū)ξ改c(GD道的損害。在特定實施例中，組織損害是造血毒性。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有約 20kD 到約 25kD的近似分子量的N端片段。
[0005]在某些實施例中，BPI和/或其同源物在個體暴露于輻射之前I天與個體暴露于輻射之后2天(48小時)之間施予。BPI和/或其同源物可經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
[0006]在一些實施例中，緩和個體中由暴露于輻射(意外的/無意的或有意的，例如治療性的)、化學(xué)輻射療法或疾病引起的組織損害的方法進(jìn)一步包含向個體(有需要的個體)施予一種(至少一種、一種或一種以上)抗生素?？股乜蔀?例如)喹諾酮抗生素，例如選自由下列組成的群組的抗生素:莫西沙星(moxifloxacin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Ievofloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)和德拉沙星(delafloxacin)。
[0007]在另一個方面中，所述方法是緩和個體中由暴露于輻射(意外的/無意的或有意的，例如治療性的)、化學(xué)輻射療法、疾病、毒素或藥物或生物介導(dǎo)的療法引起的造血毒性的方法。所述方法包含向個體(稱為有需要的個體)施予足以緩和(部分或完全)個體的造血毒性的量的殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、一種(至少一種、一種或一種以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI50, rBPI (10-193) ala132和BPI的具有約20kD到約25kD的近似分子量的N端片段。
[0008]在某些實施例中，BPI和/或其同源物在個體暴露于輻射之前I天與個體暴露于輻射之后2天(48小時)之間施予。BPI和/或其同源物可經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
[0009]在一些實施例中，緩和個體中由暴露于輻射(意外的/無意的或有意的，例如治療性的)、化學(xué)輻射療法、疾病、毒素、或藥物或生物介導(dǎo)的療法引起的造血毒性的方法進(jìn)一步包含向個體(有需要的個體)施予一種(至少一種、一種或一種以上)抗生素?？股乜蔀?例如)喹諾酮抗生素，例如選自由下列組成的群組的抗生素:莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
[0010]另一實施例是用于個體中的骨髓恢復(fù)的方法，所述方法包含:向個體(稱為有需要的個體)施予足以用于個體中的骨髓恢復(fù)的量的殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、一種(至少一種、一種或一種以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23> rBPI50、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有約 20kD 到約25kD的近似分子量的N端片段。
[0011]在某些實施例中，BPI和/或其同源物在個體暴露于輻射之前I天與個體暴露于輻射之后2天(48小時)之間施予。BPI和/或其同源物可經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
[0012]在某些實施例中， 個體具有一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷。例如，個體可具有造血缺陷，例如淋巴細(xì)胞減少、髓細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、嗜中性粒細(xì)胞減少、紅細(xì)胞減少、巨核細(xì)胞減少、血小板缺陷、單核細(xì)胞缺陷、淋巴細(xì)胞缺陷、紅細(xì)胞缺陷、嗜中性粒細(xì)胞缺陷、T細(xì)胞缺陷、粒細(xì)胞缺陷和/或樹突細(xì)胞缺陷。所述一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷可由暴露于輻射、化學(xué)輻射療法、輻射療法、疾病、毒素、或藥物或生物介導(dǎo)的療法引起。
[0013]在一些實施例中，由暴露于輻射(意外的/無意的或有意的，例如治療性的)、化學(xué)輻射療法、疾病、毒素、或藥物或生物介導(dǎo)的療法引起的個體中的骨髓恢復(fù)的方法進(jìn)一步包含向個體(有需要的個體)施予一種(至少一種、一種或一種以上)抗生素。抗生素可為(例如)喹諾酮抗生素，例如選自由下列組成的群組的抗生素:莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
[0014]另一實施例是刺激個體中的血細(xì)胞生成的方法，所述方法包含:向個體(稱為有需要的個體)施予足以刺激個體中的血細(xì)胞生成的量的殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、一種(至少一種、一種或一種以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23> rBPI50、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有約 20kD到約25kD的近似分子量的N端片段。
[0015]在某些實施例中，個體具有一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷。造血缺陷可為(例如)淋巴細(xì)胞減少、髓細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、嗜中性粒細(xì)胞減少、紅細(xì)胞減少、巨核細(xì)胞減少、血小板缺陷、單核細(xì)胞缺陷、淋巴細(xì)胞缺陷、紅細(xì)胞缺陷、嗜中性粒細(xì)胞缺陷、T細(xì)胞缺陷、粒細(xì)胞缺陷和/或樹突細(xì)胞缺陷。所述一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷由(例如)暴露于輻射、化學(xué)輻射療法、輻射療法、疾病、毒素或藥物或生物介導(dǎo)的療法引起。所述方法中使用的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23> rBPI5(l、rBPI (10-193) ala132和BPI的具有約20kD到約25kD的近似分子量的N端片段。
[0016]在某些實施例中，BPI和/或其同源物在個體暴露于輻射之前I天與個體暴露于輻射之后2天(48小時)之間施予。BPI和/或其同源物可經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
[0017]在某些實施例中，刺激個體中的血細(xì)胞生成的方法進(jìn)一步包含向個體(有需要的個體)施予一種(至少一種、一種或一種以上)抗生素?？股乜蔀?例如)喹諾酮抗生素，例如選自由下列組成的群組的抗生素:莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
[0018]如本文中所描述，在某些實施例中，所述方法包含向有需要的個體施予(a)殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、一種(至少一種、一種或一種以上)BPI同源物或BPI和BPI同源物二者，和(b) —種(至少一種、一種或一種以上)抗生素。在這些實施例中，殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、BPI同源物或BPI和BPI同源物二者與抗生素可同時(一起)或順序施予。在殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、BPI同源物或BPI和BPI同源物二者與抗生素同時施予的情況下，它們可在一種組合物中或在單獨組合物中施予。在殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)、BPI同源物或BPI和BPI同源物二者與抗生素順序施予的情況下，它們可以任一次序施予且需要在足夠接近的時間施予以具有所需的緩和效應(yīng)。
[0019]個體是動物，通常為哺乳動物。在一個方面中，個體是狗、貓、馬、綿羊、山羊、?；驀X類動物。在重要的實施例中，個體是人類。在上述實施例中的任一者中，個體在其它方面不需要用BPI和/或其同源物治療。在一些所述實施例中，個體未患有傳染性疾病。
[0020]參照【具體實施方式】將明白本發(fā)明的這些和其它方面以及各種優(yōu)點和效用。如所了解，本發(fā)明的每一個方面可涵蓋各個實施例。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1.在人類骨髓清除性HSCT之后觀察到的嗜中性粒細(xì)胞(ANC)和血小板(PLT)的循環(huán)水平、mCD14和TLR4的單核細(xì)胞表面水平、內(nèi)毒素、BPI和IL-6的血漿水平以及發(fā)熱的發(fā)生率的改變。(A)發(fā)生嚴(yán)重的嗜中性粒細(xì)胞減少(n=46)及血小板減少(n=48，最低點在D7)。數(shù)據(jù)代表以原始單位標(biāo)記的對數(shù)轉(zhuǎn)換值的幾何平均值+SEM。(B)通過內(nèi)毒素活性分析(EAA)評估18名患者在基線(B ；n=17)和骨髓清除之后DO (n=17)、D7(n=10)、D14(n=15)、D21(n=15)和D28(n=3)的血漿內(nèi)毒素且以EAA單位報告。水平的虛線(在0.4個EA單位)指示檢測下限(LLD)。通過 ELISA 評價在 B (n=48)、DO (n=46)、D7 (n=48)、D14 (n=48)、D21 (n=47)和 D28 (n=33)的血漿 BPI 濃度(pg/mL)。點線指示 BPI ELISA 的 LLD (小于100pg/ml)。降到LLD水平之下的試樣指定50% LLD的值。(C)通過流式細(xì)胞術(shù)測量單核細(xì)胞mCD14和TLR4表面表達(dá)表明，mCD14的最低點在D0(n=10)且同時在D0(n=9)出現(xiàn)峰值TLR4表達(dá)。數(shù)據(jù)代表平均熒光強(qiáng)度(mCD14)或結(jié)合指數(shù)(TLR4)的以原始單位標(biāo)記的對數(shù)轉(zhuǎn)換值的幾何平均值+SEM。(D)血漿IL-6(n=37)和發(fā)熱發(fā)生率(n=48)的峰值均在D7。IL-6數(shù)據(jù)代表以原始單位標(biāo)記的對數(shù)轉(zhuǎn)換值的幾何平均值+SEM。 [0022]圖2.BALB/c小鼠在7Gy下展現(xiàn)BM清除和死亡率。(A) 6 (η=10)、6.5 (η=20)和7(n=20)Gy TBI之后的D30死亡率因劑量而不同(p〈0.001，曼特爾-考克斯(Mantel-Cox)對數(shù)秩)。出打81之后03(11=5)的峰值結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡證明粘膜損傷快速發(fā)作，此與血漿瓜氨酸水平的最低點(n=7) —致，繪示正規(guī)化到TBI之前的水平(D0=100%)。數(shù)據(jù)代表平均值土 SEM。與DO相比，通過1-試樣t檢驗進(jìn)行分析，*p〈0.05 ;通過曼-惠特尼進(jìn)行分析，**p〈0.001。(C)代表性H&E染色的股骨切片展示在7Gy TBI之后D3BM清除(4 X放大倍率)。(D)在OGy (正常對照，n=3/時間點)、6.5Gy (n=8/時間點)和7Gy (在第3天和第10天，n=8,由于較高的死亡率,在D15, n=6)之后計數(shù)的BM MNC。數(shù)據(jù)是個別計數(shù)的平均值土SD。在 7Gy 對 6.5Gy (D3p=0.05，DlOp=0.0002, D15p=0.02)之后呈現(xiàn)較少的 BM MNC。相同小鼠的BM中LK(E)和LSK細(xì)胞(F)的流式細(xì)胞術(shù)分析指示7Gy產(chǎn)生延長的祖細(xì)胞和HSC數(shù)量的降低。截止D15，6.5小鼠比7Gy小鼠具有較大的LK和LSK細(xì)胞數(shù)量(對于LK和LSK 二者，p=0.01)。各符號代表來自個別動物的一肢的BM內(nèi)的絕對LK或LSK數(shù)量。水平條(horizontal bar)指示中值/組。通過曼-惠特尼分析血液學(xué)數(shù)據(jù)。 [0023]圖3.rBPI21與ENR的組合增強(qiáng)7Gy TBI之后BALB/c小鼠的存活率。㈧用7Gy輻照且在輻照之后24小時給予ENR加rBPI21或VEH、單獨ENR且持續(xù)30天、或未治療(表示為7Gy)的小鼠的存活率。在三個重復(fù)實驗的復(fù)合分析中，用BPI21/ENR治療的小鼠的存活率超過其它組(通過曼特爾-考克斯對數(shù)秩，P〈0.0001, n=70只小鼠/組)。rBPI21/ENR組的存活率也超過VEH/ENR、ENR和7Gy (通過成對曼特爾-考克斯對數(shù)秩，分別地，P〈0.0001、0.008和〈0.0001)。(B)用7Gy輻照且在輻照之后24小時給予rBPI21或VEH(持續(xù)14天或30天)加ENR(持續(xù)30天)或未治療(表示為7Gy)的小鼠的存活率。持續(xù)rBPI21治療不影響存活率。通過成對曼特爾-考克斯對數(shù)秩分析數(shù)據(jù)(n=20只小鼠/組)。
[0024]圖4.rBPI21/ENR促進(jìn)TBI誘發(fā)的發(fā)育不全后的造血恢復(fù)。在各種治療之后第10、15和19天，評價BALB/c BM MNC計數(shù)(一個后肢)和組織病理學(xué)(來自對側(cè)后肢)。顯示的數(shù)據(jù)針對㈧未治療的年齡匹配的對照(正常)或⑶經(jīng)7Gy輻照的小鼠。其它小鼠接受7Gy TBI和在輻照之后24hr開始的以下治療二者:(C)ENR，(D)VEH/ENR,或(E)rBPI21/ENR。左側(cè)圖:各圖顯示從8只個別小鼠/組的后腿沖洗的BM MNC的計數(shù)(平均值土SD)，(B)除外，其中單獨給予7Gy的小鼠經(jīng)歷高死亡率(中值存活期為12到15天)，導(dǎo)致n=2到8/時間點。通過曼-惠特尼，與7Gy、ENR和VEH/ENR相比，在DlO (分別地，p=0.0003、0.001 和〈0.0001)、D15(分別地，P=0.0007, p=0.001 和 p=0.001)和 D19 (分別地，p=0.0006，p〈0.0001和p〈0.0001)，rBPI21/ENR組合達(dá)成改善的BM細(xì)胞結(jié)構(gòu)。從兩個重復(fù)研究集合數(shù)據(jù)。在兩個研究中獲得類似的結(jié)果。右側(cè)圖:接受所指示治療的動物的股骨的代表性D19H&E染色切片展示BM MNC計數(shù)與BM組織學(xué)密切相關(guān)。
[0025]圖5.rBPI21/ENR治療使得截止輻照之后D30BM細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)到正常水平。在存活到D30的小鼠中評價BM組織病理學(xué)(一個后肢)和MNC計數(shù)(對側(cè)后肢)。顯示代表性股骨組織學(xué):(A)未治療的年齡匹配的對照(正常)，或⑶經(jīng)7Gy輻照的小鼠。其它小鼠接受7Gy TBI和在輻照之后24hr開始的以下治療二者:(C)ENR，(D)VEH/ENR，或(E)rBPI21/ENR。除組織學(xué)以外，測定從個別小鼠的后腿沖洗的BM MNC的對應(yīng)計數(shù)(F)。各條顯示平均值土SD，分別地，n=4、3、12、16和7只小鼠/組。單獨7Gy和VEH/ENR治療的小鼠的早期高死亡率限制這些隊列的大小。僅rBPI21/ENR治療達(dá)成與OGy在統(tǒng)計學(xué)上不能區(qū)別的BM MNC計數(shù)。rBPI21/ENR MNC計數(shù)也不同于7Gy、ENR和VEH/ENR的計數(shù)(分別地，p=.01，P=0.0002，p=0.001)。顯示來自兩個重復(fù)研究的數(shù)據(jù)。在所有研究中獲得類似的結(jié)果。通過曼-惠特尼分析數(shù)據(jù)。
[0026]圖6.rBPI21/ENR治療使得在7Gy TBI之后早期造血細(xì)胞更快速地擴(kuò)增。使用流式細(xì)胞術(shù)來定量年齡匹配的未治療對照(OGy)或施予7Gy且在其后24小時開始未治療(7Gy)、ENR、rBPI21/ENR或VEH/ENR治療的小鼠的BM MNC內(nèi)含有的LK(左側(cè)圖)和LSK(右側(cè)圖)細(xì)胞。顯示來自D10(頂部圖)、D19(中間圖)和D30(底部圖)的結(jié)果。盒須圖(Box and whisker graph)繪示來自各治療組中各動物的一個后肢的BM內(nèi)的LK或LSK表型細(xì)胞的間距(range)、第25百分位數(shù)和第75百分位數(shù)以及中值數(shù)。對于OGy對照，在所有時間點，N=4。在D10，N=8只小鼠/治療。在D19，N=6到8只小鼠/治療。到D30的較大存活率差異導(dǎo)致 n=3 (7Gy)、12 (ENR)、16 (rBPI21/ENR)和 7 (VEH/ENR)只小鼠 / 組。與 7Gy、ENR或VEH/ENR相比，rBPI21/ENR治療使得在早期時間點LK和LSK細(xì)胞的數(shù)量較大(對于所有比較，在DIO, p=0.004，且在D19，分別地，p=0.004,0.0003和0.0001)。所有組(包括對照)的D30LK和LSK含量相等。顯示來自兩個重復(fù)實驗的數(shù)據(jù)。在所有研究中獲得類似的結(jié)果。通過曼-惠特尼分析數(shù)據(jù)。[0027]圖7.對BALB/c小鼠的7Gy輻照與隨后的內(nèi)毒素血癥有關(guān)。在所指示的天數(shù)獲得血液試樣以通過LAL進(jìn)行內(nèi)毒素分析,且顯示為平均值土SEM。從D3起存在內(nèi)毒素。在第0、3、12天，N=9只小鼠/時間點，在D6，n=6，且在D9，n=8。單獨7Gy處理的死亡率使得在D12之后不能評估足夠的小鼠進(jìn)行分析。
[0028]圖8.由BID注射rBPI21* VHl引起注射部位損害和發(fā)炎。在這些輻射緩和研究期間，一些經(jīng)7Gy輻照的BALB/c小鼠僅接受口服ENR。其它經(jīng)7Gy輻照的小鼠接受ENR并且使用具有固定28.5G針的無菌一次性胰島素針每天注射兩次250 μ IrBPI21或其調(diào)配物緩沖液(表示為VEH)。注射在輻射之后24小時開始并繼續(xù)到直到第30天。在第15天(B)或第19天(A、C)，人道地殺死小鼠并暴露背側(cè)皮膚的下側(cè)，以獲得局部組織損害的照片文件。用尼康(Nikon)D90數(shù)碼相機(jī)攝取圖像。
[0029]圖9.用rBPI21/ENR治療的小鼠的細(xì)胞BM中的三譜系血細(xì)胞生成。用7GY輻照BALB/c小鼠并在其后24小時開始rBPI21/ENR。在輻照之后第19天使小鼠無痛致死。圖3中顯示用rBPI21/ENR治療的小鼠的股骨的H&E染色的冠狀切片的低功耗圖像。這些圖像在(A) 20X和(B)40X顯示較高功耗圖像。BM展示沒有發(fā)育異常的三譜系血細(xì)胞生成、相對的髓細(xì)胞增生和穩(wěn)健的巨核細(xì)胞恢復(fù)。
[0030]圖10.用于通過FACS測定BALB/c小鼠的BM中的LK和LSK細(xì)胞的門控策略。在BM細(xì)胞的FSC對SSC點圖上畫一個門以排除小的碎片。在FL-4通道(APC陽性)中相對于SSC測定定向譜系細(xì)胞，且所畫的門將這些細(xì)胞與譜系標(biāo)記表達(dá)呈陰性(陰性-低APC熒光)的細(xì)胞分開。通過使用也結(jié)合到APC的匹配的同種型對照混合證實門控。在Sca-1PE X c-kit-PerCP5.5雙重?zé)晒恻c圖上顯現(xiàn)譜系陰性細(xì)胞，以評價小鼠BM中Lin_Sca-rc-kit+(LK-祖細(xì)胞)和Lin_Sca-l+c-kit+(LSK-干細(xì)胞)的含量。所顯示的直方圖來自對正常小鼠的分析。
[0031]圖11.在經(jīng)歷同種異體HSCT的患者中輸注rBPI21的有限試點臨床試驗支持在骨髓清除療法之后的耐受性。在骨髓清除性HSCT的背景下，6名招募到IRB批準(zhǔn)的多機(jī)構(gòu)1-1I期rBPI21施予試點試驗的第一隊列中的患者中的4名患者接受基于輻射的治療。所有患者均患有血液惡性腫瘤，年齡為50到65歲(中值為55歲)，并簽署同意書。個體接受環(huán)磷酰胺和1360 (n=3)或1400 (n=l)分割TBI以進(jìn)行骨髓清除性調(diào)節(jié)。㈧所有患者在第_1天接受4mg/kg濃注IV rBPI21,隨后連續(xù)IV輸注6mg/kg/天，持續(xù)72小時。根據(jù)所顯示的設(shè)計逐步升高連續(xù)輸注的劑量和持續(xù)時間，但當(dāng)藥物的研究批號(study lot)過期時，由資助者(XOMA(US)LLc)停止試驗。(B)顯示在HSCT進(jìn)入期間經(jīng)歷的重大不利事件。
[0032]圖12.14天和30天的rBPI21加ENR對骨髓單核細(xì)胞、L K和LK細(xì)胞的效應(yīng)是相當(dāng)?shù)?。?Gy輻照BALB/c小鼠并在其后24小時開始治療。一些小鼠每天接受兩次皮下rBPI21與ENR的組合直到D15，此時將剩余小鼠平分，在一個組(稱為rBPI21 (14)/ENR)中停止rBPI21，但繼續(xù)ENR直到D30,且在另一組(rBPI21 (30) /ENR)中繼續(xù)rBPI21和ENR 二者直到D30。如先前所述治療VEH/ENR組。rBPI21 (14) /ENR和rBPI21 (30) /ENR在所有時間點都具有相當(dāng)水平的骨髓單核細(xì)胞(圖A、D)、LK(圖B、E)和LSK(圖C、F)。按照方法實施定量。條形圖+SD繪示骨髓單核細(xì)胞，且盒須圖繪示來自各治療組中各動物的一個后肢的骨髓內(nèi)的LK或LSK表型細(xì)胞的間距、第25百分位數(shù)和第75百分位數(shù)以及中值數(shù)。對于rBPI21(14)/ENR 和 rBPI21 (30)/ENR 組，D15:n=4/ 組，D18:n=5 到 6/ 組，且 D30:8 到 10/組。由于早期死亡率，在D18，n=l(7Gy)和n=2 (VEH/ENR)，且在D30，在這些組中沒有存活者。從2只正常動物獲得的值繪示為OGy值。顯示從單一研究獲得的數(shù)據(jù)。
[0033]圖13.在14天或30天的rBPI21加ENR治療之后外周血計數(shù)相當(dāng)。與用rBPI21治療30天(rBPI21(30)/ENR-灰色圓圈)相比，在用rBPI21治療14天(rBPI21 (14)/ENR-紅色圓圈)的BALB/c小鼠的外周血中測量到相當(dāng)水平的白血球(WBC)、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板和血紅蛋白。治療在7Gy輻照之后24小時開始。如方法中所述獲得外周血計數(shù)。所有小鼠每天接受兩次皮下rBPI21與ENR的組合直到D15，此時對4只小鼠抽血以用于外周血細(xì)胞分析。將剩余小鼠平分，在一個組(稱為rBPI21(14)/ENR)中停止rBPI21，但繼續(xù)ENR直到D30，且在另一組(rBPI21(30)/ENR)中繼續(xù)rBPI21和ENR 二者直到D30。結(jié)果顯示在D18:n=5到6/組和D30:8到10/組測量的外周血計數(shù)值的平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差。從2只正常動物獲得的值繪示為DO值。顯示從單一研究獲得的數(shù)據(jù)。
[0034]圖14.(A到F)在輻照和未受輻照的小鼠中粒細(xì)胞刺激因子(G-CSF)的水平因應(yīng)rBPI21治療而增加。
[0035]圖15.(A到C)在未受輻照的小鼠中鼠類角質(zhì)形成細(xì)胞化學(xué)引誘物(鼠類KC)的水平因應(yīng)rBPI21治療而增加。先前輻照加強(qiáng)rBPI21治療對鼠類KC的刺激。
[0036]圖16.單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)(也稱為趨化因子(C_C基序)配體2(CCL2))的水平因rBPI21治療而增加。
【具體實施方式】
[0037]在一個方面中，本發(fā)明涉及令人驚奇的發(fā)現(xiàn):殺菌/滲透性增加蛋白(BPI)和/或其同源物單獨或與抗生素組合可緩和由暴露于輻射、化學(xué)療法或疾病引起的組織損害。如本文中所描述，BPI和/或其同源物單獨或與抗生素組合可用于在暴露于意外的或偶然的輻射的個體中和/或在具有嚴(yán)重骨髓清除(涉及骨髓細(xì)胞的耗盡/衰竭)的個體中緩和造血毒性，刺激血液功能和幫助骨髓恢復(fù)。
[0038]如本文所用的需要BPI和/或其同源物療法的個體是骨髓功能降低(部分或完全)的個體。在一些實施例中，個體在一種或一種以上血細(xì)胞類型或血液譜系方面具有不足的血細(xì)胞生成。在一些實施例中，個體暴露于輻射、化學(xué)輻射療法或毒素，或患有疾病、或藥物或生物介導(dǎo)的造血損害，導(dǎo)致個體中的骨髓功能降低(部分或完全)。造成骨髓功能降低(部分或完全)的疾病的實例包括(但不限于)急性和慢性發(fā)炎、感染、再生障礙性貧血、范科尼貧血(Fanconi anemia)、布盧姆綜合征(Bloom syndrome)、網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)育不全、科斯特曼綜合征(Kostmann syndrome)、先天性良性嗜中性粒細(xì)胞減少、新生兒敗血癥、骨髓增生異常綜合征、戴-布二氏貧血(Diamond-Blackfan anemia)以及先天性或獲得性骨髓衰竭綜合征。個體在其它方面不需要用BPI和/或其同源物治療。在一些所述實施例中，個體未患有傳染性疾病。
[0039] 在一些實施例中，個體暴露于足以造成不期望的組織損害和/或造血毒性的水平的輻射。在一些實施例中，個體在BPI和/或其同源物療法之前已經(jīng)暴露于足以造成組織損害和/或造血毒性的輻射。在一些實施例中，個體尚未暴露于輻射，且預(yù)期以后會暴露于輻射，在足以造成組織損害和/或造血毒性的暴露輻射之前接受BPI和/或其同源物的治療。在一些實施例中，個體在BPI和/或其同源物療法期間暴露于輻射。輻射暴露包括(但不限于)意外的暴露、由核攻擊引起的暴露和醫(yī)學(xué)輻射療法(例如局部療法以及低和高劑量全身輻照)。在一些實施例中，個體患有癌癥，且已經(jīng)經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或?qū)⒔?jīng)歷輻射療法、化學(xué)輻射療法和/或化學(xué)療法。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供緩和任一類型的輻射誘發(fā)的組織損害的方法。暴露于輻射在低劑量下具有毒性且在高劑量下威脅生命。最易受輻射誘發(fā)的損傷攻擊的組織包括造血系統(tǒng)和胃腸道(GI)。中等劑量的輻射可造成血細(xì)胞計數(shù)快速降低，包括循環(huán)淋巴細(xì)胞的損失和有絲分裂活性造血祖細(xì)胞的減少。血細(xì)胞計數(shù)的降低尤其與感染的風(fēng)險增加和癌癥發(fā)生有關(guān)。較高劑量的輻射可導(dǎo)致由骨髓干細(xì)胞群體損失引起的更嚴(yán)重且通常更持久的骨髓損傷。因此，組織損害可為(例如)血細(xì)胞計數(shù)的降低、骨髓干細(xì)胞群體的損失或造血毒性。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供緩和造血毒性的方法。所述方法包含單獨或與抗生素組合施予BPI和/或其同源物。術(shù)語‘造血毒性’是指大體上由不利地影響個體的造血系統(tǒng)的輻射暴露引起的毒性?；蛘?，造血毒性可由個體暴露于毒素或疾病或造血損害遺傳素質(zhì)引起。此不利效應(yīng)可在個體中廣泛地表現(xiàn)，即由輻射暴露、化學(xué)療法、毒素或疾病引起的許多造血細(xì)胞類型的水平改變(不同于認(rèn)為正常的水平)，或所述不利效應(yīng)可在個體中更具體地表現(xiàn)，即由暴露于輻射、化學(xué)療法、毒素或疾病引起的僅一種或數(shù)種造血細(xì)胞類型不同于認(rèn)為正常的水平。
[0042]施予BPI和/或其同源物以及抗生素以緩和組織損害，例如造血毒性。如本文所用，術(shù)語“緩和”是指疾病、化學(xué)療法、毒素或輻射誘發(fā)的組織損傷的程度的降低(損傷的程度低于不存在BPI/同源物治療下會發(fā)生的損傷程度)。因此，疾病、化學(xué)療法、毒素或輻射誘發(fā)的組織損傷的程度的降低可在所治療個體中的組織的健康改善方面進(jìn)行評估。所治療個體的組織的健康的改善可通過檢查所治療個體的組織的健康對對照個體(接受相同量的輻射暴露治療個體但不接受BPI療法的個體)的組織的健康來測定。組織的健康可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任一種方法來測量，包括直接和間接測量。直接測量是例如測量細(xì)胞計數(shù)的那些測量。在一些實施例中，測量的組織損害可為組織的壞死和/或血細(xì)胞計數(shù)的降低。在一些實施例中，組織健康的改善可通過使用諸如下述終點評估造血系統(tǒng)的功能來測量:血細(xì)胞比容、白血球計數(shù)、氚化胸腺嘧啶到骨髓DNA中的納入、脾重量、來自脾或從肱骨或股骨獲得的骨髓的爆式紅系(erythroid)形成單位數(shù)或集落形成單位數(shù)(紅系、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞形成譜系)或外周循環(huán)中循環(huán)造血干細(xì)胞或其它原始造血細(xì)胞的計數(shù)。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供骨髓恢復(fù)的方法。所述方法包含單獨或與抗生素組合地施予BPI和/或其同源物?！肮撬杌謴?fù)”意指已經(jīng)被輻射、化學(xué)療法、疾病或毒素?fù)p傷的骨髓恢復(fù)到其正?；蚪咏顟B(tài)(功能)或獲得骨髓功能的可測量的改善的過程。骨髓功能是從造血(血液)干細(xì)胞產(chǎn)生各種血細(xì)胞類型或譜系的過程。可用于測量骨髓恢復(fù)的終點包括(但不限于)血細(xì)胞比容、白血球計數(shù)、氚化胸腺嘧啶到骨髓DNA中的納入、脾重量、來自脾或從肱骨或股骨獲得的骨髓的爆式紅系形成單位數(shù)或集落形成單位數(shù)(紅系、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞形成譜系)或外周循環(huán)中循環(huán)造血干細(xì)胞或其它原始造血細(xì)胞的計數(shù)。在一些實施例中，個體暴露于輻射或毒素，或患有疾病，或藥物或生物介導(dǎo)的造血損害，導(dǎo)致個體中的骨髓功能降低(部分或完全)。造成骨髓功能降低(部分或完全)的疾病的實例包括(但不限于)急性和慢性發(fā)炎、感染、再生障礙性貧血、范科尼貧血、布盧姆綜合征、網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)育不全、科斯特曼綜合征、先天性良性嗜中性粒細(xì)胞減少、新生兒敗血癥、骨髓增生異常綜合征、戴-布二氏貧血以及先天性或獲得性骨髓衰竭綜合征。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供刺激血細(xì)胞生成的方法。所述方法包含單獨或與抗生素組合施予BPI和/或其同源物?！按碳ぱ?xì)胞生成”通常是指一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的增加，且尤其涉及在個體具有一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷的情況下一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的刺激或增強(qiáng)。所述一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷可由暴露于輻射或毒素、疾病、藥物或生物介導(dǎo)的造血損害引起。造成一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷的疾病的實例包括(但不限于)急性和慢性發(fā)炎、感染、再生障礙性貧血、范科尼貧血、布盧姆綜合征、網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)育不全、科斯特曼綜合征、先天性良性嗜中性粒細(xì)胞減少、新生兒敗血癥、骨髓增生異常綜合征、戴-布二氏貧血以及先天性或獲得性骨髓衰竭綜合征。造血缺陷可包含淋巴細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、嗜中性粒細(xì)胞減少、紅細(xì)胞減少、巨核細(xì)胞減少、血小板缺陷、單核細(xì)胞缺陷、淋巴細(xì)胞缺陷、紅細(xì)胞缺陷、嗜中性粒細(xì)胞缺陷、T細(xì)胞(或特定來說B細(xì)胞)缺陷、粒細(xì)胞缺陷和/或樹突細(xì)胞缺陷。
[0045]可用于本發(fā)明方法中的化合物是BP1、其生物活性片段、類似物、變體和/或其同源物。BPI是最初在人類多形核嗜中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中發(fā)現(xiàn)的50kDa到55kDa的陽離子抗微生物蛋白，其對多種與細(xì)菌有關(guān)且無細(xì)胞的內(nèi)毒素形式具有最高親和力(pM-nM)。結(jié)合內(nèi)毒素的BPI促進(jìn)殺死和清除革蘭氏陰性細(xì)菌且通過阻止內(nèi)毒素結(jié)合到由mCD14、MD-2和TLR4構(gòu)成的細(xì)胞促炎內(nèi)毒素受體復(fù)合物而抑制內(nèi)毒素誘發(fā)的發(fā)炎和細(xì)胞凋亡。大多數(shù)BPI在細(xì)胞內(nèi)，但BPI的血漿水平隨嗜中性粒細(xì)胞的激活和脫粒而升高。穩(wěn)定的BPI同源物包括(但不限于)rBPI21、rBPI23、rBPI5Q、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有大約介于 20kD到25kD之間的分子量的N端片段。BPI和其同源物的制備已經(jīng)在業(yè)內(nèi)出版物中描述，例如美國專利第6268345號、美國專利第6599880號、美國專利第5420019號、美國專利5980897和美國公開案第2008/0031874號。
[0046]BPI和/或其 同源物可與抗生素(至少一種、一種或一種以上抗生素)組合給予。在一些實施例中，抗生素是喹諾酮。在一些實施例中，喹諾酮是具有附接到中心環(huán)系統(tǒng)的氟原子(通常在6位或7位)的氟喹諾酮。與BPI和/或其同源物組合施予的喹諾酮抗生素的實例包括(但不限于)莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
[0047]BPI和/或其同源物以及抗生素可同時或順序施予。當(dāng)BPI和/或其同源物以及抗生素同時施予時，它們可在相同或單獨的調(diào)配物中施予，且大體上同時施予?？股匾约癇PI和/或其同源物也可順序施予；二者僅需要在足夠接近的時間施予以具有所需的對骨髓功能的效應(yīng)。在某些實施例中，抗生素在BPI和/或其同源物之前或在施予BPI和/或其同源物之后施予。施予這些化合物之間的時間間隔可為幾分鐘、5小時、12小時、24小時、48小時或96小時，或它可較長。 [0048]本發(fā)明化合物是以有效量施予。有效量是足以提供醫(yī)學(xué)上所需的結(jié)果的劑量且可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)方法來測定。在輻射誘發(fā)的組織損傷的治療中，有效量將為抑制(部分或完全)由暴露于輻射造成的組織損傷所需要的量。在一些實施例中，有效量是達(dá)成所治療病況的改善的量。在一些實施例中，有效量可取決于輻射暴露的類型和程度，和/或一種或一種以上其它治療劑的使用。然而，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于(例如)活體外和/或活體內(nèi)測試和/或關(guān)于化合物劑量的其它知識測定BPI/同源物以及抗生素的合適使用劑量和范圍。應(yīng)了解，在一些實施例中，本文中描述的BPI和/或其同源物以及抗生素可以抑制非癌性組織和細(xì)胞的輻射造成的損害而不實質(zhì)上干擾癌性組織和細(xì)胞的殺死的劑量施予。
[0049]當(dāng)施予個體時，BPI/同源物以及抗生素的有效量將取決于(例如)損害的嚴(yán)重程度；個別患者的參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體格和重量、并行的治療、治療的頻率和施予方式。這些因素已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知且可在只進(jìn)行常規(guī)實驗下解決。在一些實施例中，使用最大劑量，即根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。
[0050]有效量通常將在約0.001mg/kg 到約 1000mg/kg、約 0.01mg/kg 到約 750mg/kg、約
0.lmg/kg 到約 500mg/kg、約 1.0mg/kg 到約 250mg/kg、約 10.0mg/kg 到約 150mg/kg 的范圍內(nèi)變化，以一次或一次以上劑量施予一天或若干天或許多天(取決于施予方式和上文所討論的因素)。
[0051]BPI/同源物以及抗生素的實際劑量水平可變化，以獲得對于特定的患者、組合物和施予方式有效達(dá)成所需治療反應(yīng)的量。所選劑量水平取決于特定化合物的活性、施予途徑、輻射暴露的嚴(yán)重程度和所治療患者的先前醫(yī)學(xué)史。然而，此項技術(shù)涵蓋以低于達(dá)成所需治療效果所需的水平的化合物劑量開始治療且逐漸增加劑量直到達(dá)成所需效果。
[0052]BPI和/或其同源物以及抗生素可在確診個體骨髓功能降低(部分或完全)之后的任何時間施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在確診個體與預(yù)期的正常水平相比具有降低的血細(xì)胞計數(shù)之后的任何時間施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在個體暴露于造成組織損傷的輻射水平之前、期間或之后施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射暴露之前施予，但施予和輻射暴露在時間上足夠接近以抑制輻射誘發(fā)的組織損傷。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射暴露之前至多I天的任何時間施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射暴露之前介于I小時與24小時之間施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射暴露的12小時以內(nèi)施予。BPI和/或其同源物以及抗生素也可在輻射暴露期間施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射暴露之后施予，但施予和輻射暴露在時間上足夠接近以具有所需的保護(hù)組織免于輻射誘發(fā)的組織損害的效應(yīng)。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在暴露之后至多3天的任何時間施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射暴露之后介于I小時到60小時之間施予。在一些實施例中，BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射暴露的24小時或48小時以內(nèi)施予。在一些實施例中，個體患有癌癥，且BPI和/或其同源物以及抗生素是在輻射療法、化學(xué)輻射療法或化學(xué)療法之后至少I小時、至少12小時、至少24小時或至少48小時但不超過輻射療法、化學(xué)輻射療法或化學(xué)療法之后72小時施予。 [0053]通過任一適宜途徑將BPI和/或其同源物以及抗生素和含有BPI和/或其同源物以及抗生素的醫(yī)藥組合物施予個體。例如，組合物可以下列方式施予:經(jīng)口，包括舌下、經(jīng)直腸、非經(jīng)腸、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部和經(jīng)皮(作為粉末、軟膏或滴劑)、經(jīng)頰或經(jīng)鼻。如本文所用的術(shù)語“非經(jīng)腸”施予是指除通過胃腸道以外的施予方式，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、乳房內(nèi)、眼內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下以及關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。也涵蓋外科植入，包括(例如)將本發(fā)明組合物包埋于體內(nèi)，例如腦內(nèi)。在一些實施例中，組合物可全身施予。
[0054]本發(fā)明的用于非經(jīng)腸注射的醫(yī)藥組合物包含醫(yī)藥上可接受的無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及在即將使用之前重構(gòu)成無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的水性和非水性載劑、稀釋劑、溶劑或媒劑的實例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和其適宜混合物、植物油(例如，橄欖油)以及可注射有機(jī)酯(例如油酸乙酯)。適當(dāng)流動性可通過(例如)使用包衣材料(例如，卵磷脂)、通過維持所需粒徑(在分散液的情況下)和通過使用表面活性劑來維持。
[0055]這些組合物還可含有防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。微生物作用的防止可通過納入各種抗細(xì)菌和抗真菌劑來確保，例如，對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸等。也可期望包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等?？赏ㄟ^納入延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)達(dá)成可注射醫(yī)藥形式的長效吸收。
[0056]在一些情況下，為延長藥物的效應(yīng)，期望減緩來自皮下或肌內(nèi)注射的藥物的吸收。此結(jié)果可通過使用弱水溶性的非晶形材料的液體懸浮液來達(dá)成。非經(jīng)腸施予的藥物的延遲吸收還可通過將藥物溶解或懸浮于油性媒劑中來達(dá)成。另外，通過在生物可降解聚合物(例如，聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成藥物的微囊基質(zhì)來制備可注射儲積形式。根據(jù)藥物對聚合物的比率和所用特定聚合物的性質(zhì)可控制藥物釋放速率。其它生物可降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)?？勺⑸鋬Ψe調(diào)配物還可通過將藥物包裹于與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳液中來制備。
[0057]本發(fā)明提供經(jīng)口施予本發(fā)明醫(yī)藥組合物的方法。口服固體劑型概括描述于雷明頓醫(yī)藥科學(xué)(Remington, s Pharmaceutical Sciences),第 18 版，1990 年(馬克出版公司(Mack Publishing C0.)伊斯頓(Easton)賓夕法尼亞州(Pa.) 18042)的第89章中。用于口服施予的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉末、含錠或糖錠、扁囊劑、小藥丸和顆粒。而且，可使用脂質(zhì)體或類蛋白質(zhì)囊封來調(diào)配本發(fā)明組合物(例如，作為美國專利第4，925，673號中報道的類蛋白質(zhì)微球體)。脂質(zhì)體囊封可包括經(jīng)各種聚合物衍生化的脂質(zhì)體(例如，美國專利第5,013, 556號)。[0058]在所述固體劑型中，活性化合物與至少一種醫(yī)藥上可接受的惰性賦形劑或載劑混合，或者經(jīng)化學(xué)改質(zhì)以包括至少一種醫(yī)藥上可接受的惰性賦形劑或載劑。賦形劑或載劑可容許增加的化合物攝取、化合物的總體穩(wěn)定性和/或化合物在體內(nèi)的循環(huán)時間。賦形劑和載劑包括(例如)檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或(a)填充劑或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、纖維素、改質(zhì)葡聚糖、甘露糖醇和硅酸，以及無機(jī)鹽，例如三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉，和市售稀釋劑，例如FAST-FLO?、EMDEX?、STA-RX 1500?、易考瑞思(EMCOMPRESS產(chǎn)和艾維素(AVICELf , (b)結(jié)合劑，例如，甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、膠質(zhì)(例如，海藻酸鹽、阿拉伯膠)、明膠、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖，(c)保濕劑，例如甘油，(d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽、碳酸鈉、淀粉，包括基于淀粉的商業(yè)崩解劑、易科考特(EXPLOTAB)?、羧甲淀粉鈉、安柏萊特(AMBERLITE)'羧甲基纖維素鈉、超支化支鏈淀粉(ultramylopectin)、明膠、橙皮、羧甲基纖維素、天然海綿、膨潤土、不溶性陽離子型交換樹脂和粉末狀膠質(zhì)，例如瓊脂、卡拉牙膠(karaya)或黃蓍膠；(e)溶液阻滯劑，例如石蠟，(f)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物和脂肪酸，包括油酸、亞油酸和亞麻酸，(g)潤濕劑，例如，鯨蠟醇和甘油單硬脂酸酯，陰離子型洗滌劑表面活性劑，包括十二烷基硫酸鈉、丁二酸二辛基磺酸鈉和二辛基磺酸鈉，陽離子型洗滌劑，例如苯扎氯銨或芐索氯銨，非離子型洗滌劑，包括聚桂醇400、聚氧乙烯(40)單硬脂酸酯(polyoxyl 40 stearate)、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、甘油單硬脂酸酯、聚山梨酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素；(h)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土粘土，⑴潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油、蠟、卡波蠟(CARBOWAXf 4000、卡波蠟? 6000、十二烷基硫酸鎂和其混合物；(i)改善藥物在調(diào)配期間的流動性質(zhì)且?guī)椭趬嚎s期間重排的助流劑，包括淀粉、滑石粉、熱解硅膠和水合硅鋁酸鹽。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，劑型還可包含緩沖劑。
[0059]片劑、糖衣片、 膠囊、丸劑和顆粒的固體劑型可制備有包衣和外殼，例如腸溶包衣和其它醫(yī)藥調(diào)配領(lǐng)域中熟知的包衣。用于口服施予的液體劑型包括醫(yī)藥上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除活性化合物以外，液體劑型可含有業(yè)內(nèi)常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐基酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(具體來說，棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、山梨醇酐脂肪酸酯和其混合物。
[0060]本文還涵蓋本發(fā)明化合物的肺部遞送。將化合物在吸氣時遞送到哺乳動物的肺。各種設(shè)計用于治療產(chǎn)品的肺部遞送的機(jī)械裝置考慮用于實踐本發(fā)明，包括(但不限于)噴霧器、定量式吸入器和粉末吸入器，所有這些與所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的那些類似。所有所述裝置需要使用適于分配本發(fā)明化合物的調(diào)配物。通常，各調(diào)配物對于所采用的裝置類型具有特異性，且可包括使用除可用于療法中的稀釋劑、佐劑和/或載劑以外的合適推進(jìn)劑材料。
[0061]利用以下實例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明，所述實例決不應(yīng)視為進(jìn)一步限制。通篇本申請案中所引用的所有參考文獻(xiàn)(包括著作文獻(xiàn)、授權(quán)的專利、公開的專利申請案和同在申請中的專利申請案)的全部內(nèi)容都明確地以引用的方式并入本文中。
[0062]SM
[0063]材料和方法
[0064]患者特征
[0065]前瞻性地招募從2005年到2009年在波士頓兒童醫(yī)院(Children，s HospitalBoston) (CHB)或布萊根婦女醫(yī)院(Brigham and Women’s Hospital) (BffH)經(jīng)歷骨髓清除性同種異體HSCT的患者(n=48)進(jìn)行經(jīng)機(jī)構(gòu)審查委員會(Institutional Review Board)批準(zhǔn)的研究。所有參與者和/或法定監(jiān)護(hù)人都視需要表明同意和/或贊成。年齡在I歲到60歲的范圍內(nèi)。血液惡性腫瘤(n=46)的骨髓清除方案是用TBI的化學(xué)輻射療法，1400cGy (n=38)或1375 cGy(n=l),或組合化學(xué)療法，包括白消安(busulfan) >14mg/kg 口服或IV等效(η=7) ο再生障礙性貧血的骨髓清除是200mg/kg(6gm/M2)環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)加ATG(n=2)。16名患者接受BM且32名患者接受PB干細(xì)胞。按照機(jī)構(gòu)常規(guī)進(jìn)行支持性護(hù)理。(48、49)。施予預(yù)防性口服非吸收性抗生素:桿菌肽(bacitracin)以及多粘菌素(polymyxin) (BffH)或萬古霉素(vancomycin) (CHB)。按照常規(guī)在臨床實驗室實施血液計數(shù)和培養(yǎng)。16名患者患有革蘭氏陽性(n=15)或革蘭氏陰性(n=l)生物體菌血癥。使用獲得試樣± I天以內(nèi)的最大值記錄體溫。當(dāng)可進(jìn)行內(nèi)毒素活性分析(EAA)時，增加EAA測量。
[0066]血液采集和血漿制備
[0067]在調(diào)節(jié)之前(基線，B)、HSCT當(dāng)天(DO)和每周±1天，將PB試樣抽到K2-EDTA或肝素鈉真空采血管(Vacutainers)?(碧迪醫(yī)療(Becton-Dickinson) (BD),富蘭克林湖(Franklin Lakes),新澤西州(NJ))中。將PB在1200g和4°C下旋轉(zhuǎn)5min,回收,并以分液儲存在_80°C下的無熱原管中。
[0068]人類BPI ELISA
[0069]通過ELISA(赫卡特(HyCult),烏登(Uden),荷蘭(The Netherlands))按照制造商說明書測量BPI。
[0070]人類PB中的內(nèi)毒素測量
[0071]通過EAA按照制造商說明書(光譜診斷公司(Spectral Diagnostics),多倫多(Toronto)，加拿大(Canada))測量內(nèi)毒素。(27)
[0072]人類IL-6ELISA
[0073]通過流式細(xì)胞術(shù)(MoFlo,達(dá)可斯通(DakoCytomation),格洛斯楚普(Glostrup),丹麥(Denmark))使用涂覆抗體的熒光珠粒(細(xì)胞計數(shù)珠粒分析碧迪公司靈活套件(Cytometric Bead Array BD Flex Sets),碧迪生物科技(BD BioSciences),圣何塞市(SanJose),加利福尼亞州(CA))和薩米特(Summit)ν4.0軟件(達(dá)可斯通)來測量IL-6。
[0074]mCD14 和 TLR4 的測量
[0075]如先前所述使用抗原特異性或同種型對照單克隆抗體(生物科技(eBioSciences),圣地亞哥(San Diego),加利福尼亞州)測量0)14和TLR4的單核細(xì)胞表面表達(dá)。(50)
[0076]用rBPI21和恩氟沙星(enrof1xacin)的活體內(nèi)福射緩和研究
[0077]在12周齡在輻照之前使雄性BALB/c小鼠(庫存編號為028，查理斯河(CharlesRiver),威爾明頓(Wilmington),馬薩諸塞州(MA))適應(yīng)環(huán)境。根據(jù)達(dá)納法伯癌癥研究所(Dana-Farber Cancer Institute)的經(jīng)A⑶C批準(zhǔn)的政策和方案實施研究。將小鼠置于Rad Disk?嚙齒類動物微隔離輻照籠(布雷茵特里科技(Braintree Scientific)，布雷茵特里(Braintree),馬薩諸塞州)中，并通過Gammaccll? 40Exactor (貝斯特思科(BestTheratronics),渥太華(Ottawa),安大略省(Ontario))銫源福照儀施予單次7Gy劑量。此后24小時，小鼠不予治療(7Gy),或接受以下治療中的一種或一種以上，持續(xù)30天:I)rBPI21 (ΧΟΜΑ(US) LLC,伯克利(Berkeley)，加利福尼亞州)，每次注射250 μ I,其為以2mg/ml在調(diào)配物緩沖液中構(gòu)成的原液并且每天經(jīng)SC施予兩次，相隔6到8小時(rBPI21/小鼠為約42mg/kg/天)；2)250μ I rBPI21調(diào)配物緩沖液(表示為VEH)，其由0.33g/L檸檬酸、1.0lg/L檸檬酸鈉、8.76g/L氯化鈉、2.0g/L泊洛沙姆(Poloxamer) P188和2.0g/L聚山梨酯80 (所有都來自西格瑪(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密蘇里州(MO))溶解于注射用水中組成，pH調(diào)節(jié)至5.0,并過濾滅菌；3)貝惠(Baytril)? (恩氟沙星,MedVets,桑迪城(Sandy),猶他州(UT))，經(jīng)由25G喂食針(鏗騰科技(Cadence Science)，克蘭斯敦(Cranston)，美國羅得島(RI))通過口服管飼法在10mg/kg/天下保持前5到7天，此后小鼠隨意地繼續(xù)接受存于水瓶中的抗生素，直到研究終止或死亡。所有小鼠每天至少觀察兩次。經(jīng)由CO2窒息使垂死的小鼠無痛致死。在預(yù)定的時間點，經(jīng)由異氟醚麻醉服藥過量人道地殺死小鼠(IsoFlo?-雅培實驗室(Abbott Labs),雅培公園(Abbott Park),伊利諾州(IL))。 [0078]血液和組織制備
[0079]在Hemavet 950 FS血液分析儀(德魯科技(Dfew Scientific),沃特伯里市(Waterbury)，康涅狄格州(CT))上用經(jīng)EDTA抗凝的心臟血液(碧迪醫(yī)療，富蘭克林湖，新澤西州)實施CBC。通過將血液與無熱原肝素(APP醫(yī)藥(APP Pharmaceutical),紹姆堡(Schaumburg),伊利諾斯州(IL))在無熱原埃彭道夫管(Eppendorf tube) (USA科技(USA Scientific))中混合并在14，OOOrpm下離心10分鐘來獲得血衆(zhòng)。將單次使用的分液儲存在_80°C下。在一些研究中，解剖來自一條腿/動物的股骨和脛骨，在10%中性緩沖福爾馬林(formalin)(飛世爾科技(Fisher Scientific),匹茲堡(Pittsburg),賓夕法尼亞州(PA))中固定24小時，并處理，包括冠狀切片以及蘇木精和伊紅(H&E)染色(專門組織病理學(xué)服務(wù)-朗伍德(Specialized Histopathology Services-Longwood),波士頓(Boston)，馬薩諸塞州)。取對側(cè)股骨和脛骨，以通過用補(bǔ)充有10% FBS (JRH生物科技(JRH Biosciences),列涅薩(Lenexa),堪薩斯市(KS) )、L-谷氨酰胺、HEPES、青霉素/鏈霉素(pen/strep)和慶大霉素(gentamicin)(所有都來自英杰公司(Invitrogen),卡爾斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亞州)的冷RPMI1640培養(yǎng)基從骨沖洗細(xì)胞進(jìn)行BM MNC計數(shù)和流式細(xì)胞術(shù)。用低滲溶解緩沖液(西格瑪)溶解紅血球。通過錐蟲藍(lán)染色計數(shù)BM MNC;生存力通常大于90%到95%。
[0080]瓜氨酸的測定
[0081]用瑪斯塔克(MassTrak)氨基酸分析(AAA)系統(tǒng)(沃特世(Waters),米爾福德(Milford),美國馬薩諸塞州)利用AccQTag(tm)衍生化和紫外/可見檢測分析試樣。
[0082]組織病理學(xué)評估
[0083]經(jīng)委員會認(rèn)證的(board-certified)血液病理學(xué)家(JK)使用奧林巴斯(Olympus)BX51顯微鏡和具有DP捕獲軟件的奧林巴斯DP71相機(jī)評價脫鈣的、福爾馬林固定的、H&E染色石蠟固定的切片的股骨BM細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對于各動物，針對由造血細(xì)胞占據(jù)的BM空間的百分比對兩個載玻片進(jìn)行評分，其中每個載玻片兩個視野。經(jīng)委員會認(rèn)證的病理學(xué)家(J-AV)計數(shù)經(jīng)H&E染色石蠟固定的結(jié)腸切片的三份相同試樣中的細(xì)胞凋亡小體/400X視野。識別來自正常小鼠的試樣，但所有其它試樣經(jīng)去識別化且以隨機(jī)順序呈現(xiàn)以用于分析。
[0084]鼠類血漿中的內(nèi)毒素測量
[0085]使用當(dāng)阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物(Limulus amoebocyte lysate) (LAL)分析按照制造商說明書(查理斯河，波士頓，馬薩諸塞州)且如先前所述來測量內(nèi)毒素。(51)
[0086]BM FACS 分析
[0087]將BM細(xì)胞與2%大鼠抗小鼠⑶16/⑶32和I %正常大鼠血清一起預(yù)培育以進(jìn)行Fe阻斷，隨后用結(jié)合APC的譜系特異性抗體或等效濃度的結(jié)合APC的同種型對照免疫球蛋白、PE-大鼠抗小鼠Scal(克隆體D7)和PerCP-Cy5.5-大鼠抗小鼠c-Kit(克隆體2B8)的1:20稀釋物的混合物(所有都來自碧迪)染色具有造血譜系標(biāo)記(⑶3 ε、⑶45/Β220、⑶lib、Ly-6G/Ly-6C、TERl 19)的細(xì)胞。將細(xì)胞在4°C下染色25分鐘，用冷DPBS洗滌2次，并再懸浮于0.4%多聚甲醛中。在FACScalibur?流式細(xì)胞儀(碧迪)上獲取100，000個事件并用 FlowJo V.7.0.5(樹星(Treestar))軟件進(jìn)行分析。針對BM 中 lirTSca-rc-kit+(LK)和lin-Sca-l+c-kit+(LSK)的百分比評價譜系標(biāo)記表達(dá)呈陰性的細(xì)胞(圖10，門控策略)。來自正常小鼠的數(shù)據(jù)與已公開的天然BALB/c小鼠中的報告一致。(52)[0088]統(tǒng)計學(xué)
[0089]對于人類HSCT研究，給具有不可檢測到的分析物的試樣指定為檢測下限一半的值。對于ANC、PLT、BP1、TLR4和IL-6，在對數(shù)轉(zhuǎn)換之后分析數(shù)據(jù)，因為此獲得更接近正態(tài)的分布。對于這些數(shù)據(jù)，隨后將幾何平均值和誤差棒(指示對數(shù)值的平均值的+1標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM))轉(zhuǎn)換回原始單位并繪示于對數(shù)軸上。當(dāng)比較相同患者在不同時間點的值時，使用配對威爾科克森符號秩檢驗(Wilcoxon signed rank test),其中將各值與基線進(jìn)行比較。使用曼-惠特尼檢驗評估發(fā)熱或不發(fā)熱個體之間的比較。當(dāng)評價不同參數(shù)之間的相關(guān)性時，使用斯皮爾曼(Spearman)相關(guān)系數(shù)和來自多個時間點的數(shù)據(jù)計算個體內(nèi)相關(guān)性。在不同個體范圍內(nèi)取所計算系數(shù)的平均值并用符號秩檢驗來檢驗顯著性。除非另外說明，否則所有P值均為雙側(cè)的。使用Prism v.4.0a (格拉芙帕德軟件(GraphPad Software);圣地亞哥，加利福尼亞州)和SAS V.9.1 (賽仕軟件研究所(SAS Institute),卡雷(Cary),北卡羅來納州(NC))產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)顯著性和圖形輸出。用格拉芙帕德Prism Version5實施鼠類實驗的統(tǒng)計學(xué)分析。使用曼特爾-考克斯對數(shù)秩比較存活曲線。除瓜氨酸數(shù)據(jù)(通過1-試樣t檢驗分析數(shù)據(jù)，與100%理論平均值進(jìn)行比較)和血液學(xué)分析(表1)(實施非成對t檢驗)以外，自始至終實施雙尾t檢驗(曼-惠特尼)。非成對t檢驗未假設(shè)均等方差。在所有實驗中，使用小于0.05的P值來拒絕零假設(shè)。在指示于圖中的情況下，*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，
**ρ〈0.0Olo
[0090]表1.TBI之后各治療組的外周血計數(shù).[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種緩和個體中由暴露于輻射引起的組織損害的方法，所述方法包含: 向有需要的個體施予有效緩和所述個體的由輻射暴露造成的組織損害的量的殺菌/滲透性增加蛋白BPI和/或其同源物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組織損害包含造血毒性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1到2中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述輻射暴露是由意外暴露于輻射、化學(xué)輻射療法或輻射療法引起。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI同源物選自由下列組成的群組:rBPI21、rBPI23、rBPI5Q、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有約 20kD 到約 25kD 的近似分子量的N端片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包含施予抗生素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗生素是喹諾酮抗生素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述喹諾酮抗生素選自由下列組成的群組:莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI和/或其同源物在所述個體暴露于所述輻射暴露之前I天與之后2天之間施予。
9.根據(jù)權(quán)利要 求8所述的方法，其中BPI和/或其同源物在所述輻射暴露之后48小時以內(nèi)施予。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI和/或其同源物是經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
11.一種緩和個體中由暴露于輻射引起的造血毒性的方法，所述方法包含: 向有需要的個體施予有效緩和所述個體的造血毒性的量的殺菌/滲透性增加蛋白BPI和/或其同源物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述造血毒性是由意外暴露于輻射、化學(xué)輻射療法或輻射療法引起。
13.根據(jù)權(quán)利要求11到12中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI同源物選自由下列組成的群組:rBPI21、rBPI23> rBPI50、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有大約介于 20kD 到 25kD之間的分子量的N端片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包含施予抗生素。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述抗生素是喹諾酮抗生素。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述喹諾酮抗生素選自由下列組成的群組:莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
17.根據(jù)權(quán)利要求11到16中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI和/或其同源物在所述個體暴露于所述輻射暴露之前I天與之后2天之間施予。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中BPI和/或其同源物是在所述輻射暴露之后，但在所述福射暴露的48小時以內(nèi)施予。
19.根據(jù)權(quán)利要求11到17中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI和/或其同源物是經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
20.一種用于個體中的骨髓恢復(fù)的方法，所述方法包含: 向有需要的個體施予有效用于所述個體中的骨髓恢復(fù)的量的殺菌/滲透性增加蛋白BPI和/或其同源物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述個體具有一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷。
22.根據(jù)權(quán)利要求20到21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述個體具有造血缺陷，包含淋巴細(xì)胞減少、髓細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、嗜中性粒細(xì)胞減少、紅細(xì)胞減少、巨核細(xì)胞減少、血小板缺陷、單核細(xì)胞缺陷、淋巴細(xì)胞缺陷、紅細(xì)胞缺陷、嗜中性粒細(xì)胞缺陷、T細(xì)胞缺陷、粒細(xì)胞缺陷和/或樹突細(xì)胞缺陷。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷是由暴露于輻射、化學(xué)輻射療法、輻射療法、疾病、毒素或藥物或生物介導(dǎo)療法引起。
24.根據(jù)權(quán)利要求20到23中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI同源物選自由下列組成的群組:rBPI21、rBPI23> rBPI50、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有大約介于 20kD 到 25kD之間的分子量的N端片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求20到24中任一權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包含施予抗生素。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗生素是喹諾酮抗生素。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述喹諾酮抗生素選自由下列組成的群組:莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
28.根據(jù)權(quán)利要求20到27中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI和/或其同源物是經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
29.—種刺激個體中的血細(xì)胞生成的方法，所述方法包含: 向有需要的個體施予有效刺激所述個體中的血細(xì)胞生成的量的殺菌/滲透性增加蛋白BPI和/或其同源物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述個體具有一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷。
31.根據(jù)權(quán)利要求29到30中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述個體具有造血缺陷，包含淋巴細(xì)胞減少、髓細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、嗜中性粒細(xì)胞減少、紅細(xì)胞減少、巨核細(xì)胞減少、血小板缺陷、單核細(xì)胞缺陷、淋巴細(xì)胞缺陷、紅細(xì)胞缺陷、嗜中性粒細(xì)胞缺陷、T細(xì)胞缺陷、粒細(xì)胞缺陷和/或樹突細(xì)胞缺陷。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述一種或一種以上造血細(xì)胞類型或譜系的缺陷是由暴露于輻射、化學(xué)輻射療法、輻射療法、疾病、毒素或藥物或生物介導(dǎo)療法引起。
33.根據(jù)權(quán)利要求29到32中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI同源物選自由下列組成的群組:rBPI21、rBPI23> rBPI50、rBPI (10-193) ala132 和 BPI 的具有大約介于 20kD 到 25kD之間的分子量的N端片段。
34.根據(jù)權(quán)利要求29到33中任一權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包含施予抗生素。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述抗生素是喹諾酮抗生素。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述喹諾酮抗生素選自由下列組成的群組:莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加雷沙星和德拉沙星。
37.根據(jù)權(quán)利要求29到36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中BPI和/或其同源物是經(jīng)口、靜脈內(nèi)或皮下施予。
【文檔編號】A61K38/04GK103648515SQ201280016834
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月5日
【發(fā)明者】伊娃·蓋娜, 歐芙·利維 申請人:達(dá)納-法伯癌癥研究所有限公司, 兒童醫(yī)療中心公司