用于有效表面展示抗原蛋白的新穎表達(dá)盒的制作方法【專利摘要】表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含：(a)來(lái)自白斑綜合征病毒的iel啟動(dòng)子或其變體；(b)編碼N-端gp64信號(hào)肽的核酸序列或其變體、編碼抗原肽的核酸序列、編碼跨膜區(qū)的核酸以及編碼gp64胞質(zhì)域的核酸或其變體；其中所述啟動(dòng)子可操作地連接至所述核酸序列?！緦＠f(shuō)明】用于有效表面展示抗原蛋白的新穎表達(dá)盒發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明通常涉及生物分子表面展示系統(tǒng)，連同展示抗原肽的特定應(yīng)用，所述抗原肽例如病毒蛋白，諸如用作疫苗的病毒衣殼蛋白。特別地，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防病毒感染的方法、疫苗、免疫組合物和試劑盒，并且涉及用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)聯(lián)方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]數(shù)百種不同的已知病毒感染人類和動(dòng)物。感染人類和動(dòng)物的病毒常常通過(guò)呼吸排泄和腸排泄而傳播。例如，腸病毒71(EV71)為小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)家族中腸病毒屬(genusEnterovirus)的單股、RNA病毒。其在遺傳上分類成3組(A、B和C)以及11個(gè)基因型(A、B1-B5、C1-C5)。EV71包括4個(gè)主衣殼蛋白，例如VP1、VP2、VP3以及VP4。其中，VPl被認(rèn)為是主要負(fù)責(zé)病毒向靶細(xì)胞的附著以及因此包容病毒中和的主要表位。實(shí)際上，不同腸病毒菌株的免疫學(xué)研究已經(jīng)指出多個(gè)中和性mAbs的顯性表位位于VPl上。EV71為導(dǎo)致手足口病的一種病毒。[0003]手足口病已變成為主要的新興感染性疾病并且是重要的威脅，尤其在亞洲。1998年在臺(tái)灣發(fā)生了由于EV71感染而導(dǎo)致的HFMD大爆發(fā)，包括129，106例個(gè)案報(bào)告，405名兒童患有嚴(yán)重的并發(fā)癥，并且多于80例死亡。自1997以來(lái)，EV71感染已經(jīng)呈示出新的重要性，并且個(gè)案數(shù)量越來(lái)越多。由各種EV71菌株造成的事件已經(jīng)持續(xù)地在其他國(guó)家再現(xiàn)，例如，泰國(guó)、中國(guó)以及越南。隨著最近在新加坡爆發(fā)，EV71感染的擴(kuò)張的地理分布表明更多的人群處于危險(xiǎn)中。常用的EV71疫苗基于失活病毒，其在細(xì)胞株內(nèi)生產(chǎn)，并且通過(guò)化學(xué)手段而失活。然而，病毒的惡性本質(zhì)要求病毒在生物安全水平條件下處理，從而使用常規(guī)技術(shù)的疫苗候選者的生產(chǎn)會(huì)要求現(xiàn)有制造程序的顯著改變，如果發(fā)生爆發(fā)，這可能會(huì)延遲疫苗的生產(chǎn)。[0004]控制流行性脊髓灰質(zhì)炎和根除脊髓灰質(zhì)炎病毒的福爾馬林失活的和減活的疫苗凸顯了通過(guò)群體接種來(lái)控制EV71流行病的可能性。據(jù)此，發(fā)展福爾馬林失活EV71疫苗是對(duì)1975年保加利亞流行病的反應(yīng)而非用于控制流行病，并且從那時(shí)起一直未使用。此外，沒有可得的保加利亞疫苗效能的數(shù)據(jù)。[0005]因此，高度期望有效預(yù)防病毒感染如EV71的良好的疫苗。[0006]發(fā)明概述[0007]在第一方面，提供了表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含:[0008](a)來(lái)自白斑綜合征病毒的iel啟動(dòng)子或其截序列；[0009](b)編碼N-端gp64信號(hào)肽的核酸序列或其變體、編碼抗原肽的核酸序列、編碼跨膜區(qū)的核酸以及編碼gp64胞質(zhì)域的核酸或其變體；[0010]其中所述啟動(dòng)子可操作地連接至所述核酸序列。[0011]在第二方面，提供了表達(dá)載體，其包括本文所述的表達(dá)盒。[0012]在第三方面，提供了試劑盒，其包括本文所述的表達(dá)盒或本文所述的表達(dá)載體以及為此的包裝材料。[0013]在第四方面，提供了宿主細(xì)胞，其包含本文中所述的表達(dá)盒或本文所述的表達(dá)載體。[0014]在第五方面，提供了免疫原性組合物，其包含本文所述的表達(dá)盒、本文所述的表達(dá)載體或本文所述的宿主細(xì)胞，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑。[0015]在第六方面，提供了疫苗，其包含本文所述的表達(dá)盒、本文中所述的表達(dá)載體或本文所述的宿主細(xì)胞，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑。[0016]在第七方面，提供了抗體，其由用本發(fā)明的疫苗接種的生物體所生產(chǎn)。[0017]第八方面，提供了抗血清，其包含本發(fā)明的抗體。[0018]在第九方面，提供了用于治療或預(yù)防個(gè)體疾病的本文所述的表達(dá)盒、本文所述的表達(dá)載體、本文所述的宿主細(xì)胞、本文中所述的免疫原性組合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗體或本文所述的抗血清供，其中所述抗原肽由所述個(gè)體中的所述表達(dá)載體來(lái)表達(dá)。[0019]在第十方面，提供了用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，其中所述方法包括向個(gè)體給予有效量的本文所述的表達(dá)盒、本文所述的表達(dá)載體、本文所述的宿主細(xì)胞、本文所述的免疫原性組合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗體或本文所述的抗血清。[0020]在第十一方面，提供了本文所述的表達(dá)盒、本文所述的表達(dá)載體、本文所述的宿主細(xì)胞、本文中所述的免疫原性組合物、本文所述的疫苗、本文所述的抗體或本文所述的抗血清在制造用于調(diào)節(jié)個(gè)體的免疫反應(yīng)的藥物中的用途。[0021]在第十方面，提供了一種用于呈遞、生產(chǎn)或展示抗原肽的方法，其中所述方法包括:[0022](a)使編碼多肽的`核酸插入本文所述的表達(dá)載中；[0023](b)用表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)染至少一個(gè)宿主細(xì)胞；以及[0024](C)由所述表達(dá)載體來(lái)表達(dá)所述多肽，[0025]其中將所述多肽呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。[0026]在第十方面，提供通過(guò)本文所述的方法獲得的抗原肽。[0027]在第十一方面，提供了診斷方法，其包括使用本文所述的抗原肽。[0028]附圖簡(jiǎn)述[0029]參考下列附圖，僅以實(shí)例形式來(lái)描述本發(fā)明。[0030]圖1.如實(shí)施例1所詳細(xì)說(shuō)明的使用PCR的融合基因的結(jié)構(gòu)。執(zhí)行3個(gè)連續(xù)的PCR反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生最終PCR產(chǎn)物，其包含gp64信號(hào)序列、H3N2-HA跨膜域以及gp64的胞質(zhì)域(CTD)。[0031]圖2.根據(jù)實(shí)施例1而制造的重組型桿狀病毒載體的圖示。使用EV71基因組作為模板，表1所列的引物用于擴(kuò)增VPl基因，其然后能被插入PBac-HTA載體中。所生成的質(zhì)體被稱為pBac-VPl。[0032]圖3.rVPl蛋白在SF-9II細(xì)胞質(zhì)膜上的表面展示譜。第3示出該蛋白的GP64C-端部分位于在SF-9II細(xì)胞內(nèi)部，而H3N2跨膜域及抗原肽位于細(xì)胞外的培養(yǎng)基內(nèi)。[0033]圖4.EV71的rVPl的錨定(放大率X60)。為了確定rVPl蛋白是否恰當(dāng)?shù)匾莆恢良?xì)胞表面，細(xì)胞在無(wú)菌蓋玻片上培養(yǎng)，以為10的感染復(fù)數(shù)(MOI)來(lái)感染，以及感染后2天進(jìn)行使用共焦顯微鏡的免疫熒光染色。DAPI染色用于檢測(cè)細(xì)胞核，而綠熒光標(biāo)記的抗-VPl多株抗體用于檢測(cè)由Bac-VPl重組型桿狀病毒所展示的rVPl。第4圖明確地示出rVPl位于質(zhì)膜，從而展現(xiàn)出rVPl錨定于Sf-9細(xì)胞的表面上。關(guān)于更多的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見實(shí)施例1。[0034]圖5.EV71的rVPl在Bac-VPl包膜上表達(dá)的確認(rèn)。細(xì)胞以為10的MOI被感染并且感染后3天收集。采集上清液并進(jìn)行使用抗-VPl(天竺鼠)多克隆抗體、然后使用抗天竺鼠HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體的免疫印跡分析。[0035]rBac-VPl1-編碼新穎的“表達(dá)盒”的重組型桿狀病毒。[0036]rBac-VPl2-編碼帶有全長(zhǎng)gp64作為融合伙伴的表達(dá)盒的重組型桿狀病毒。[0037]如由圖5可見，在桿狀病毒-WT(野生型)中沒有檢測(cè)到蛋白。比較時(shí)，由從用rBac-Vpl1和rBac_Vpl2感染的細(xì)胞獲得的上清液看見清晰帶，表明rVPl成功地在Bac-VPl病毒包膜上表達(dá)。[0038]圖6.純化的桿狀病毒的免疫金電子顯微圖，其由抗-EV71和抗-VPl抗體作為初級(jí)抗體以及與5-nm金顆粒結(jié)合的抗小鼠IgG作為二級(jí)抗體而檢測(cè)(放大率200，000X，刻度尺=IOOnm)。金顆粒(示為黑點(diǎn))表明EV71和VPl蛋白表達(dá)的位置。沒有金顆粒展現(xiàn)在桿狀病毒-WT(對(duì)照)的表面上，然而，EV71和VPl在本發(fā)明的重組型桿狀病毒的表面上被檢測(cè)到。[0039]圖7.在重組型桿狀病毒的包膜上展示的EV71的rVPl的定量。在桿狀病毒包膜上所展示的rVPl蛋白使用抗-VPl單克隆抗體來(lái)探測(cè)。在rBac-VPl(107/ml)、rBac_VPl2(107/ml)、EV71WT(B5菌株)(107/ml)、WT桿狀病毒上的VPl的量被校正成經(jīng)純化的重組型VPl蛋白的量。免疫印跡上的帶強(qiáng)度使用ODYSSEYLICOR熒光掃描儀和軟件進(jìn)行掃描和分析。數(shù)據(jù)為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。[0040]rBac-VPl1-編碼新穎的“表達(dá)盒”的重組型桿狀病毒[0041]rBac-VPl2-編碼帶有全長(zhǎng)gp64作為融合伙伴的表達(dá)盒的重組型桿狀病毒。[0042]圖7示出rBac-VPl1(新穎表達(dá)盒)與B5-EV71和rBac-VPl2(全長(zhǎng)gp64)相比具有最高的VPl蛋白表達(dá)，由此說(shuō)明新穎的表達(dá)盒用于生產(chǎn)大量VPl抗原肽的效能。[0043]圖8.測(cè)試血清中和病毒感染性的能力。*含有100TCID5QEV71病毒的50μI病毒懸浮液在添加至96孔板中的RD細(xì)胞之前與50μI連續(xù)2倍稀釋的抗體一起預(yù)孵育30min。在37°C下3天之后，提供完整的保護(hù)免受CPE的中和性抗體滴定度被讀取為最高的稀釋。[0044]如由圖8可見，rBac-VPl與失活EV71(B5)病毒相比產(chǎn)生更高的中和滴定度。負(fù)對(duì)照PBS與桿狀病毒-WT(結(jié)果為重迭的，桿狀病毒-WT結(jié)果迭加在PBS結(jié)果上方)示出如預(yù)期那樣的可忽略的中和滴定度。[0045]圖9.帶有PCV2衣殼的表面展示衣殼區(qū)域(rBac_PCV2)的蔗糖梯度純化的桿狀病毒的免疫印跡，其使用8C2(抗0RF2)單克隆抗體(初級(jí))，然后使用抗小鼠HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體。[0046]如由圖9可見，在經(jīng)純化的桿狀病毒內(nèi)出現(xiàn)大量表達(dá)水平的各個(gè)衣殼蛋白區(qū)域。[0047]圖10.感染有PCV2的PK-15細(xì)胞的免疫熒光分析，其使用來(lái)自用純化的rBac-PCV2免疫的天竺鼠的抗體和AlexaFluor546標(biāo)記的抗天竺鼠二級(jí)抗體(放大率X40)。圖10的淡灰色部份示出AlexaFluor546染色。因而，圖10示出感染有PCV2的細(xì)胞內(nèi)PCV2蛋白的良好表達(dá)。[0048]圖11.PRRSV的蔗糖梯度純化的rBac_0RF7蛋白的免疫印跡，其使用5H2(0RF7)單克隆抗體(初級(jí))，然后使用抗小鼠HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體。[0049]圖11清楚地示出存在PRRSV的0RF7蛋白的大量表達(dá)。[0050]圖12.感染有PRRSV的MARC-145細(xì)胞的免疫熒光分析，其使用來(lái)自用純化的rBac-0RF7蛋白免疫的天竺鼠的抗體,然后使用Alexafluor546標(biāo)記的抗天竺鼠二級(jí)抗體(放大率X40)。圖11的淡灰色部份示出AlexaFluor546染色。因而，圖11示出感染有PRRSV的細(xì)胞內(nèi)ORF蛋白的良好表達(dá)。[0051]圖13.在白斑綜合征病毒(WSSV)內(nèi)的iel啟動(dòng)子的順式元件的示意圖。[0052]圖14.桿狀病毒錨定的核衣殼α蛋白的免疫印跡分析。Bac_noda、β野田村病毒(Betanodavirus)和野生型桿狀病毒進(jìn)行使用抗野田村衣殼多克隆抗體(天竺鼠)和各自二級(jí)HRP結(jié)合抗體的免疫印跡。(l)Bac-Noda，(2)β野田村病毒，(3)野生型桿狀病毒。[0053]如由圖14可見，在桿狀病毒-WT(野生型)內(nèi)沒有檢測(cè)到蛋白。比較時(shí)，由感染有rBac-VPl1和rBac_VPl2的細(xì)胞獲得的上清液觀察到清晰帶，表明rVPl成功地在Bac-VPl病毒包膜之上表達(dá)。[0054]圖15.noda衣殼α蛋白的表達(dá)和錨定(放大率X60)。(a)在感染Bac_noda的Sf9_II的質(zhì)膜上的α蛋白的錨定的確認(rèn)。(b)在感染野生型桿狀病毒的Sf9_II細(xì)胞的質(zhì)膜上觀察到?jīng)]有α蛋白的錨定。細(xì)胞在無(wú)菌的蓋玻片上培養(yǎng)并以為0.1的MOI而感染。細(xì)胞用4%PFA固定并用2%牛血清白蛋白在37°C阻斷30min。α蛋白用多克隆抗天竺鼠抗體(1:300)、然后用二級(jí)FITC-結(jié)合兔抗天竺鼠Mab(l:100稀釋，Dako)染色。[0055]圖15(a)示出rVPl位于質(zhì)膜，從而表明VPl錨定在Sf_9細(xì)胞的表面上。[0056]圖16.VPl在非洲綠猴腎臟細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)(放大率X40)。非洲綠猴腎臟細(xì)胞與為200的感染復(fù)數(shù)(MOI)—起孵育并且在感染后48h用抗-VPl單克隆抗體、然后用FITC-結(jié)合二級(jí)抗體染色，(A)活Bac-VPl-轉(zhuǎn)導(dǎo)的非洲綠猴腎臟細(xì)胞，(B)與失活Bac-VPl一起孵育的非洲綠猴腎臟細(xì)胞。`[0057]圖16的淡灰色部份示出表達(dá)VPl之處。因而，圖16示出與失活Bac-VPl相比，VPl在用活Bac-VPl轉(zhuǎn)導(dǎo)的非洲綠猴腎臟細(xì)胞內(nèi)良好表達(dá)。[0058]圖17.體內(nèi)小鼠肌肉組織的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(放大率X40)。在第一次免疫六天之后，肌肉組織樣品包埋在石蠟內(nèi)并且進(jìn)行切片。免疫組織化學(xué)染色使用抗-VPl單克隆抗體和HRP-結(jié)合兔抗小鼠抗體來(lái)進(jìn)行。示出(A)Bac-VPl，(B)WT-Bac,(C)PBS注射的小鼠。箭頭指出表達(dá)VPl之處。因而，圖17示出VPl在來(lái)自Bac-VPl轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠的小鼠肌肉組織中表達(dá)，然而，負(fù)對(duì)照內(nèi)沒有VPl的表達(dá)。[0059]圖18.來(lái)自致命性EV71病毒攻擊的小鼠的保護(hù)。小鼠組(n=6)以14天的間隔疫苗接種2次。野生型桿狀病毒和PBS免疫的小鼠用作負(fù)對(duì)照。監(jiān)測(cè)小鼠的存活，持續(xù)21天的觀察期。結(jié)果基于存活百分率來(lái)表達(dá)。如由結(jié)果可見，EV71-B5和Bac-VPl(結(jié)果重迭于第18圖上)免疫的小鼠在7天后顯示出100%的存活，相比之下，對(duì)照小鼠則無(wú)一者。[0060]圖19.EV71拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)RT-PCR定量。RNA由腦組織萃取并且對(duì)照的樣品以7dpi采集，并且預(yù)防性治療的小鼠樣品以20dpi采集。EV715'UTR區(qū)域的112_bp片段用作qRT-PCR引物的靶標(biāo)。編碼EV71的全長(zhǎng)基因組的質(zhì)體用于獲得定量病毒拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)為3個(gè)獨(dú)立分析的平均值土SD。[0061]如由圖19可見，與接種抗-EV71血清和Bac-VPl抗血清的小鼠相比，來(lái)自接種野生型桿狀病毒抗血清和PBS抗血清的小鼠的腦組織有顯著量的病毒RNA。因而，這表明來(lái)自Bac-VPl接種的生物體的抗血清用于提供被動(dòng)式保護(hù)對(duì)抗VPl的效能。[0062]圖20.各種表達(dá)盒的示意圖。⑷帶有iel啟動(dòng)子和gp64信號(hào)肽的表達(dá)盒；(B)帶有iel啟動(dòng)子、gp64啟動(dòng)子和跨膜區(qū)的表達(dá)盒；(C)帶有iel啟動(dòng)子、gp64啟動(dòng)子、跨膜區(qū)以及gp64胞質(zhì)域的表達(dá)盒。[0063]圖表[0064]表1.用于構(gòu)建重組型BAC-VPl融合基因的引物序列。[0065]表2.用于構(gòu)建PCV2的0RF2的重組型BAC-PCV2衣殼融合基因的引物序列。[0066]表3.用于構(gòu)建重組型BAC-PRRSV核衣殼蛋白(0RF7)融合基因的引物序列。[0067]表4.抗原肽的實(shí)例。[0068]序列[0069]SEQIDNO:1:用于擴(kuò)增帶有g(shù)p64信號(hào)序列的額外重迭區(qū)域的整個(gè)全長(zhǎng)VPl基因的正向引物。[0070]SEQIDNO:2:用于擴(kuò)增帶有H3N2-HA跨膜序列的額外重迭區(qū)域的整個(gè)全長(zhǎng)VPl基因的反向引物。[0071]SEQIDNO:3:用于擴(kuò)增帶有H3N2-HA跨膜序列的整個(gè)序列的C-端VPl的反向引物。[0072]SEQIDNO:4:用于擴(kuò)增N-端處的gp64信號(hào)序列的整個(gè)重迭區(qū)域的正向引物。[0073]SEQIDNO:5:用于擴(kuò)增C-端處的gp64胞質(zhì)域(CTD)的整個(gè)重迭區(qū)域的反向引物。[0074]SEQIDNO:6:用于擴(kuò)增iel啟動(dòng)子的正向引物。[0075]SEQIDNO:7:用于擴(kuò)增iel啟動(dòng)子的反向引物。[0076]SEQIDNO:8:用于擴(kuò)增PCV2的衣殼76F區(qū)域的正向引物。[0077]SEQIDNO:9:用于擴(kuò)增PCV2的衣殼135R區(qū)域的反向引物。[0078]SEQIDNO:10:用于擴(kuò)增PCV2的衣殼121F區(qū)域的正向引物。[0079]SEQIDNO:11:用于擴(kuò)增PCV2的衣殼180R區(qū)域的反向引物。[0080]SEQIDNO:12:用于擴(kuò)增PRRSV的衣殼0RF7F區(qū)域的正向引物。[0081]SEQIDNO:13:用于擴(kuò)增PRRSV的衣殼0RF7R區(qū)域的反向引物。[0082]SEQIDNO:14:N_端gp64信號(hào)肽的序列(20個(gè)氨基酸)。[0083]SEQIDNO:15:含有7個(gè)氨基酸的gp64細(xì)胞質(zhì)域(CTD)的全長(zhǎng)序列。[0084]SEQIDNO:16:含有6個(gè)氨基酸的gp64細(xì)胞質(zhì)域的截序列(CTD)[0085]SEQIDNO:17:H3N2_HA跨膜域的序列。[0086]SEQIDNO:18:白斑綜合征病毒iel啟動(dòng)子的序列。[0087]SEQIDNO:19:EV71病毒的VPl的序列。[0088]SEQIDNO:20:PCV2PRF2衣殼蛋白的序列。[0089]SEQIDNO:21=PRRSV衣殼蛋白的0RF7的序列。[0090]SEQIDNO:22:魚野田村病毒衣殼蛋白α的序列。[0091]SEQIDNO:23EV71_VP1-第167個(gè)-第178個(gè)氨基酸[0092]SEQIDNO:24EV71_VP1-第209個(gè)-第222個(gè)氨基酸[0093]SEQIDNO:25EV71_VP1-第240個(gè)-第260個(gè)氨基酸[0094]SEQIDNO:26PCV2-0RF2-第100個(gè)至第150個(gè)氨基酸[0095]SEQIDNO:27PCV2-0RF2-第151個(gè)至第200個(gè)氨基酸[0096]SEQIDNO:28PRRSV-0RF7-第18個(gè)至第57個(gè)氨基酸[0097]SEQIDNO:29PRRSV-0RF7-第58個(gè)至第123個(gè)氨基酸[0098]SEQIDNO:30PRRSV-0RF5-第28個(gè)至第65個(gè)氨基酸[0099]SEQIDNO:31PRRSV-0RF5-第132個(gè)至第200個(gè)氨基酸[0100]SEQIDNO:32PRRSV_0RF5-第28個(gè)至第65個(gè)以及132至第200個(gè)氨基酸的組合[0101]SEQIDNO:33對(duì)應(yīng)于核酸序列SEQIDNO:19EV71_VP1的EV71病毒的VPl的氨基酸序列[0102]SEQIDNO:34對(duì)應(yīng)于核酸序列SEQIDNO:20PCV2衣殼蛋白-PCV2PRF2的序列的PCV2衣殼蛋白的氨基酸序列[0103]SEQIDNO:35對(duì)應(yīng)于核酸序列SEQIDNO:21PRRSV衣殼蛋白的0RF7-PRRSV0RF7的序列的PRRSV衣殼蛋白的0RF7的氨基酸序列[0104]SEQIDNO:36對(duì)應(yīng)于核酸序列SEQIDNO:22:魚類野田村病毒衣殼蛋白-衣殼蛋白α的序列的魚類野田村病毒衣殼蛋白的氨基酸序列[0105]SEQIDNO:37用于擴(kuò)增野田村病毒衣殼區(qū)域的正向引物[0106]SEQIDNO:38用于擴(kuò)增野田村病毒衣殼區(qū)域的反向引物[0107]SEQIDNO:39用于擴(kuò)增野田村病毒衣殼區(qū)域的可替代的反向引物[0108]SEQIDNO:40用于檢測(cè)VPlmRNA的正向引物[0109]SEQIDNO:41用于檢測(cè)VPlmRNA的反向引物[0110]定義[0111]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含(comprising)”意指“主要包括，但是不必然唯一地包括”。此外，措詞“包含(comprising)”的變化,例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有相應(yīng)變化的意義。[0112]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療(treating)”及“治療(treatment)”是指任何的和所有的應(yīng)用，其醫(yī)治疾病狀態(tài)或征狀，預(yù)防疾病狀態(tài)或疾病的建立，或是無(wú)論以何方式預(yù)防、阻礙、延遲、改善或逆轉(zhuǎn)疾病狀態(tài)或疾病或是其他不期望的征狀的進(jìn)展。[0113]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”在其意義之內(nèi)包括無(wú)毒的但是足夠量的制劑或化合物來(lái)提供所需作用。所需要的確切的量會(huì)根據(jù)下列因素而隨個(gè)體變化，例如，待治療的物種、個(gè)體的年齡和一般疾病狀態(tài)、待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、被給藥的特定制劑和給藥方式等等。因而，不可能具體指定確切的“有效量”。然而，對(duì)于任何給定的情況，適當(dāng)?shù)摹坝行Я俊笨梢詢H由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用慣常實(shí)驗(yàn)而確定。[0114]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”可交換地使用來(lái)提及氨基酸殘基的聚合物以及提及其片段、變體、類似物、同系物(orthologues)或同源物(homologues)。因而,這些術(shù)語(yǔ)應(yīng)用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為合成的非天然存在的氨基酸，例如相應(yīng)天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物，以及應(yīng)用于天然存在的氨基酸聚合物。[0115]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸”可交換地使用并且表示包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸、或寡核苷酸、或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或其組合。[0116]如本文所用，在術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“多肽”、“肽”、“多核苷酸”以及“核酸”的范疇內(nèi)為片段及其變體，包括但不限于多核苷酸和核酸的反向互補(bǔ)形式和反義形式。[0117]術(shù)語(yǔ)“片段”是指多核苷酸或多肽序列，其編碼全長(zhǎng)蛋白或基因的組成或?yàn)槠涞慕M成。對(duì)于多肽，片段可擁有與全長(zhǎng)蛋白一樣的定性生物活性，例如，片段可以含有或編碼一個(gè)或多個(gè)表位，例如免疫顯性表位，其允許對(duì)該片段或由該片段編碼的序列產(chǎn)生相似的免疫反應(yīng)，如同全長(zhǎng)序列或由該片段編碼的序列。[0118]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“變體”是指基本相似的序列。一般而言，核酸序列變體可以編碼具有共同的定性生物活性的多肽。一般而言，多肽序列變體亦可以擁有共同的定性的生物活性。此外，這些多肽序列變體可以共有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。[0119]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指具有在細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中賦予其所可操作地連接的核酸片段表達(dá)的能力的核酸。在本發(fā)明的上下文中，要了解的是，包含如本文所定義的啟動(dòng)子的表達(dá)載體可以為質(zhì)體、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組片段或基因組片段，或能夠維持和/或復(fù)制其被引入細(xì)胞的可表達(dá)形式的異源DNA的其他核酸。[0120]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)系統(tǒng)”是指表達(dá)載體和該載體的宿主的組合，所述表達(dá)系統(tǒng)提供了環(huán)境以允許在宿主細(xì)胞中的外來(lái)基因表達(dá)，即，使以可檢測(cè)水平生產(chǎn)蛋白。表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于:病毒表達(dá)系統(tǒng)，基于細(xì)菌的系統(tǒng)如大腸桿菌(Escherichiacoli),酵母菌系統(tǒng)如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)，基于昆蟲細(xì)胞的系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)如非洲綠猴腎臟系統(tǒng)，其他真核系統(tǒng)如利什曼(Leishamani)表達(dá)系統(tǒng)。[0121]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指用于生產(chǎn)本發(fā)明表達(dá)盒之內(nèi)所編碼的蛋白的細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括真核細(xì)胞或更多的特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；魚細(xì)胞；酵母細(xì)胞；或植物細(xì)胞。這樣的細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于:人類TK-143b細(xì)胞、猴Marc145細(xì)胞、非洲綠猴腎臟`細(xì)胞和豬PK15細(xì)胞、草地夜蛾Sf9和Sf_21細(xì)胞、Hink’s粉紋夜蛾Tn-368和ΒΤΙ-ΤΝ-5Β1-4細(xì)胞、鯉魚上皮瘤乳頭狀細(xì)胞(EPC)、CHSE-214、黑頭呆魚(FHM)、石紋棕真鮰(brownbullhead)(BB)、藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(bluegillfry)(BF2)或白鱘魚皮膚(WSSK-1)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“盒”是指表達(dá)載體的一部份，其編碼由載體表達(dá)的目標(biāo)序列。例如，盒可以指表達(dá)載體的一部份，其編碼N-端gp64信號(hào)肽和抗原肽。盒可以進(jìn)一步包含編碼其他組份的序列，例如C-端血球凝集素(例如H3N2-HA跨膜域)跨膜域和gp64胞質(zhì)域。[0122]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指轉(zhuǎn)錄的和轉(zhuǎn)譯的調(diào)節(jié)性多核苷酸，其以使多核苷酸被轉(zhuǎn)錄和多肽被轉(zhuǎn)譯的方式而相對(duì)于編碼多肽的多核苷酸來(lái)定位。[0123]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”包括基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括TATA盒或起始子元件，其可能是準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)所需要的，伴隨有或沒有額外的調(diào)節(jié)元件，其對(duì)發(fā)展和/或外部刺激的反應(yīng)而改變基因表達(dá)，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)。在上下文中，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”亦用于描述重組型、合成或融合分子，或衍生物或片段，例如啟動(dòng)子的截序列，其賦予、活化或提高其所可操作地連接的核酸分子的表達(dá)，以及編碼肽。[0124]iel啟動(dòng)子內(nèi)的順式元件在圖13中示出。如圖13所示，可以使用熒光素酶基因報(bào)導(dǎo)分析進(jìn)行截?cái)喾治鰜?lái)識(shí)別最小的啟動(dòng)子區(qū)域。iel啟動(dòng)子的最小區(qū)域通過(guò)漸進(jìn)地由5’端刪除啟動(dòng)子而確定。在一實(shí)施方案中，對(duì)于白斑綜合征病毒(WSSV)的iel啟動(dòng)子，觀察到最小的啟動(dòng)子活性在基因的位置-189和+1之間。[0125]如本文所用，措辭“與病毒相關(guān)的疾病”意指由病毒造成的或是與病毒相關(guān)的任何疾病、疾病狀態(tài)或病癥。[0126]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗原”是指能夠由生物體的免疫系統(tǒng)識(shí)別的物質(zhì)。免疫原為當(dāng)向生物體給予時(shí)能刺激免疫反應(yīng)的抗原。二個(gè)術(shù)語(yǔ)都可交換地在本文中使用。如本文所用，“抗原肽”為能夠在本文表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的肽或多肽序列。[0127]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”當(dāng)涉及免疫反應(yīng)而使用時(shí)意指直接地或間接地增加或減少對(duì)抗抗原的免疫反應(yīng)。[0128]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”是指氨基酸序列，其能夠引發(fā)其所可操作地連接的多肽的進(jìn)入宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。信號(hào)肽通常由肽鏈內(nèi)切酶(例如特定的位于ER的信號(hào)肽酶)切開以釋放(成熟的)多肽，雖然存在信號(hào)肽可以不切割的情況。信號(hào)肽的長(zhǎng)度典型地為約10個(gè)至約40個(gè)氨基酸。在本文所用的一實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“編碼信號(hào)肽的核酸序列”在其范圍內(nèi)不包括編碼同源多肽的全長(zhǎng)序列的核酸序列，因?yàn)樾盘?hào)肽天然引發(fā)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?？赡艿男盘?hào)肽的實(shí)例包括熒光素酶信號(hào)肽以及蜜蜂蜂毒肽信號(hào)肽。例如，在一實(shí)施方案中，可以使用gp64的信號(hào)肽。在特定實(shí)施方案中，gp64的信號(hào)肽為由SEQIDNO:14所編碼的蛋白或其變體。[0129]本文所述的核酸序列可以視需要包括額外的核苷酸，例如以促進(jìn)表達(dá)。例如，連接子序列(若存在)可以視需要在信號(hào)肽與抗原肽之間和/或在抗原肽與跨膜域之間提供。核酸序列可以視需要進(jìn)一步或是可替代地在表達(dá)盒內(nèi)所含有的任何其他序列之間包含連接子序列。這樣的連接子序列可以為異源的或是同源的。連接子序列可以為I個(gè)至40個(gè)氨基酸，10個(gè)至25個(gè)氨基酸，6個(gè)至10個(gè)氨基酸或?yàn)槔?、3、4或5個(gè)氨基酸。[0130]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指成為非病原性或較少病原性的整個(gè)的(活的或失活的)或分次的細(xì)菌/病毒的懸浮液。疫苗可以概括地分類成3個(gè)一般組:減毒病毒、失活(殺滅)的病毒體，以及純化的病毒組份(亞單位疫苗)。基于本發(fā)明表達(dá)盒而獲得的疫苗屬于次單位疫苗組。[0131]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指可以刺激免疫系統(tǒng)并增加對(duì)抗原或免疫原的反應(yīng)的制劑。[0132]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“接種載體”是指當(dāng)被引入合適的宿主細(xì)胞中時(shí)會(huì)導(dǎo)致抗原肽的表達(dá)的表達(dá)載體，抗原肽的表達(dá)可以被調(diào)整以刺激一系列免疫反應(yīng)，包括抗體、T輔助細(xì)胞(⑶4+T細(xì)胞)以及胞毒型T淋巴球(CTL，⑶8+T細(xì)胞)介導(dǎo)的免疫。[0133]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“免疫原性組合物”是指當(dāng)向人類或是動(dòng)物給予時(shí)導(dǎo)致免疫反應(yīng)的組合物，所述免疫反應(yīng)包括抗體、T輔助細(xì)胞(⑶4+T細(xì)胞)以及胞毒型T淋巴球(CTL，⑶8+T細(xì)胞)介導(dǎo)的免疫。[0134]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“胞質(zhì)域”(或“CTD”)是指提供了錨定域的氨基酸序列，該錨定域允許融合蛋白在重組型病毒如桿狀病毒的包膜表面上表達(dá)。胞質(zhì)域可以為5個(gè)至40個(gè)氨基酸，10個(gè)至25個(gè)氨基酸，6個(gè)至10個(gè)氨基酸或?yàn)槔纾?、3、4或5個(gè)氨基酸。[0135]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“gp64胞質(zhì)域”為如SEQIDNO:15所示的7個(gè)氨基酸的區(qū)域。在一實(shí)施方案中，gp64胞質(zhì)域?yàn)槿鏢EQIDNO:16所示的gp64CTD的變體。gp64胞質(zhì)域的變體的其他實(shí)例可以包含gp64胞質(zhì)域，其對(duì)SEQIDNO:15具有80%或85%或90%或92%或95%或96%或98%或99%的序列同一性。[0136]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“跨膜域”是指橫跨細(xì)胞膜之內(nèi)的氨基酸序列?？缒び蚩梢詾榧s5個(gè)至約60個(gè)氨基酸,約5個(gè)至約40個(gè)氨基酸,約10個(gè)至約25個(gè)氨基酸,約6個(gè)至約10個(gè)氨基酸，或例如，序列可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)氨基酸或是由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)氨基酸所組成?？缒び蚩梢詾間p64跨膜域，或可以為適合用于該系統(tǒng)內(nèi)的任何其他跨膜域，例如，跨膜域可以為糖蛋白跨膜域，例如血球凝集素跨膜域，其為流感表面上的糖蛋白并允許病毒結(jié)合至細(xì)胞唾液酸并與宿主膜融合。血球凝集素跨膜域的實(shí)例包括但不限于:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15以及H16。[0137]在一實(shí)施方案中，血球凝集素跨膜域?yàn)镠3N2跨膜域或H5N1跨膜域。H3N2跨膜域例如含有半胱氨酸殘基，其可以經(jīng)受軟脂?；?pamitoylation)并由此與SF9-1I質(zhì)膜連接并使VPl蛋白能在表面上定位。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“gp64跨膜域”為如SEQIDN0:17所示的27個(gè)氨基酸的區(qū)域。在一實(shí)施方案中，gp64胞質(zhì)域?yàn)間p64跨膜域的截序列并且包含以下或是由以下組成:約10個(gè)至約25個(gè)氨基酸，約6個(gè)至約10個(gè)氨基酸或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)氨基酸，所述氨基酸如SEQIDNO:17所示。[0138]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“功能性片段”是指能夠執(zhí)行蛋白域的全部功能的蛋白領(lǐng)域的片段。[0139]在本發(fā)明中，可以使用不同的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本文所述的表達(dá)盒。這樣的表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于:病毒表達(dá)系統(tǒng)如腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，基于細(xì)菌的系統(tǒng)如大腸桿菌，酵母系統(tǒng)如啤酒酵母、畢赤酵母，基于昆蟲細(xì)胞的系統(tǒng)如InsectSelectStable表達(dá)系`統(tǒng)，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)如非洲綠猴腎臟系統(tǒng)，以及其他真核系統(tǒng)如利什曼表達(dá)系統(tǒng)。在一實(shí)例中，使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。[0140]桿狀病毒起初被認(rèn)為僅感染昆蟲和無(wú)脊椎動(dòng)物，并已經(jīng)廣泛地用于昆蟲細(xì)胞內(nèi)許多重組型蛋白的生產(chǎn)。然而，在20世紀(jì)80年代早期，苜蓿銀紋夜蛾多核多角體病毒(AcMNPV)發(fā)展成真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)標(biāo)志著這種病毒開始廣泛用于使異源蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。從那時(shí)以來(lái)，已經(jīng)做出許多嘗試來(lái)發(fā)展桿狀病毒載體，其可以攜帶哺乳動(dòng)物表達(dá)盒以用于體外和體內(nèi)基因療法研究、藥物篩選以及重組型蛋白表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)包括其大的插入容量、其相對(duì)容易的構(gòu)建，以及存在強(qiáng)大的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)譯后加工能力。[0141]使用gp64全長(zhǎng)蛋白，在20世紀(jì)90年代中期首次發(fā)展出外來(lái)蛋白在桿狀病毒膜之上的表達(dá)(表面展示)。典型地，包含編碼目標(biāo)異源蛋白或肽的基因的“表達(dá)載體”在多角體蛋白或PlO啟動(dòng)子的控制下框內(nèi)融合在全長(zhǎng)gp64基因的N-端。這樣的構(gòu)造然后使用各種適合的方法而整合入桿狀病毒基因組，例如Bac-To-Bac系統(tǒng)(Invitrogen)。融合蛋白在表達(dá)為額外的拷貝之后移位至質(zhì)膜并且并入病毒包膜中，導(dǎo)致異源蛋白在桿狀病毒膜表面上表達(dá)。[0142]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及表達(dá)盒，其包含ieI啟動(dòng)子或其截序列、N-端gp64信號(hào)肽和抗原肽，其中啟動(dòng)子可操作地連接至核酸序列(見圖20A)。在一實(shí)施方案中，前面提及的gp64信號(hào)肽由SEQIDNO:14或其變體編碼。[0143]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及新穎的“表達(dá)盒”，其包含iel啟動(dòng)子或其變體、N-端信號(hào)肽(例如N-端gp64信號(hào)肽)、抗原肽以及跨膜區(qū)，其中啟動(dòng)子可操作地連接至核酸序列(見圖20B)。在一實(shí)施方案中，前面提及的跨膜區(qū)為H3N2或H5N1或H3N2-HA(SEQIDNO:17或其變體)跨膜區(qū)。[0144]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及表達(dá)盒，其包含iel啟動(dòng)子或其截序列、N-端信號(hào)肽(例如N-端gp64信號(hào)肽)、抗原肽、跨膜區(qū)以及gp64胞質(zhì)域，其中啟動(dòng)子可操作地連接至核酸序列(見圖20C)。在一實(shí)施方案中，前面提及的胞質(zhì)域由SEQIDNO:15或16或是其變體編碼。[0145]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及表達(dá)盒，其至少編碼N-端gp64信號(hào)肽(20個(gè)氨基酸[aa])、抗原衣殼蛋白、C-端H3N2-HA-跨膜域(27aa)和gp64_胞質(zhì)域(6aa)，并且其由WSSV立即早期iel啟動(dòng)子(SEQIDNO:18)或其片段或截?cái)喟姹巨D(zhuǎn)錄地控制。[0146]在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列為WSSViel啟動(dòng)子的區(qū)域。在一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列為WSSViel啟動(dòng)子的區(qū)域，其包含由基因的位置-189至+1的核苷酸的序列或是由其組成?！氨磉_(dá)盒”可以并入適于用于病毒表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒的“表達(dá)載體”中，并隨后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種手段而并入桿狀病毒基因組中。[0147]特別地，發(fā)明人已經(jīng)闡明通過(guò)抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣殼蛋白)的協(xié)同表面展示和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)將病毒表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用作抗病毒的免疫試劑。在重組型病毒如桿狀病毒的表面上有效率地展示顯性免疫蛋白賦予了接種策略方面的主要優(yōu)點(diǎn)。如本文所述，除了將這種病毒表達(dá)系統(tǒng)用作EV71、PCV2、PRRSV、野田村病毒的接種載體之外，病毒膜展示系統(tǒng)還可以用于表征廣泛種類的抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣殼蛋白)的結(jié)構(gòu)和功能。[0148]例如，在來(lái)自白斑綜合征病毒的iel啟動(dòng)子的控制之下，VPl病毒衣殼基因使用病毒載體如桿狀病毒載體而有效率地在昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞二者之中表達(dá)。小鼠體內(nèi)通過(guò)使用桿狀病毒表面展示的VPl作為免疫原而產(chǎn)生的抗體有效率地中和體外EV71感染性。因此，重組型桿狀病毒是用于治療例如EV71感染的良好的疫苗。[0149]在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)而克隆入適合用于所選蛋白表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體中，例如Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)。[0150]然后，多拷貝的表達(dá)載體通過(guò)使表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞株如大腸桿菌中而獲得。然后,表達(dá)載體系被轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞株如昆蟲Sf9中，并且被釋放入宿主細(xì)胞株所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的出芽病毒顆粒在轉(zhuǎn)染后4天進(jìn)行收集。然后，病毒顆粒用作小鼠接種的亞單元疫苗。[0151]使用“表達(dá)盒”設(shè)計(jì)的相同策略也用于產(chǎn)生遺傳工程病毒以表達(dá)豬環(huán)狀病毒(PCV2)和豬呼吸與生殖癥候群病毒(PRRSV)的免疫原性肽或蛋白。使表達(dá)盒插入病毒基因組如桿狀病毒基因組中，并且發(fā)現(xiàn)得到大量地表達(dá)且在各個(gè)病毒表面上展示。在本文所述的一實(shí)例中，基因重組型桿狀病毒展示來(lái)自PCV2或PRRSV的免疫原性肽，并且用于免疫天竺鼠，生產(chǎn)有效率地中和各病毒的感染性(中和性)抗體。[0152]本文所提及的表達(dá)來(lái)自PCV2或PRRSV的免疫原性肽的重組型桿狀病毒的產(chǎn)生以及其作為抗各病毒的感染的免疫原的效能，表現(xiàn)出本文“表達(dá)盒”的設(shè)計(jì)的廣泛效能并說(shuō)明其作為工具的可能性，所述工具用于產(chǎn)生對(duì)抗抗原肽如病毒蛋白(例如任何病毒的衣殼蛋白)的疫苗以及還用于生產(chǎn)供診斷試劑盒內(nèi)使用的抗原。[0153]用于呈遞或展示生物分子的方法、試劑盒以及系統(tǒng)[0154]本發(fā)明公開了生物分子表面展示系統(tǒng)，連同這樣的系統(tǒng)用于展示作為疫苗的肽的特定應(yīng)用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)顯而易見的，這些生物分子表面展示系統(tǒng)不限于本文所公開的特定應(yīng)用，而是在其中期望呈遞生物分子、特別是抗原肽如病毒蛋白(例如病毒衣殼蛋白)的任何情況中得到廣泛應(yīng)用。[0155]因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了用于涉及肽的表面展示的疫苗生產(chǎn)的方法、試劑盒以及系統(tǒng)。這些方法、試劑盒以及系統(tǒng)可以例如使用本文所例示的與生產(chǎn)抗病毒的疫苗相關(guān)的基于桿狀病毒的表面展示系統(tǒng)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)且理解到，用于涉及肽的表面顯示的疫苗生產(chǎn)的方法、試劑盒以及系統(tǒng)不限于本文所公開的疫苗生產(chǎn)。[0156]因此，本發(fā)明提供了用于呈遞或展示多肽的方法，其中所述方法包括:[0157](a)使編碼所述多肽的核酸插入本文所公開的表達(dá)載體中；[0158](b)用所述表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)染至少一個(gè)宿主細(xì)胞；以及[0159](c)由所述表達(dá)載體來(lái)表達(dá)所述多肽，[0160]其中所述多肽呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。[0161]本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于呈遞或展示多肽的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括:[0162](a)插入表達(dá)載體中的編碼所述多肽的核酸，其中所述表達(dá)載體包含來(lái)自白斑綜合征病毒的iel啟動(dòng)子；[0163](b)用于使用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一個(gè)宿主細(xì)胞的構(gòu)件；以及[0164](C)用于由所述表達(dá)載體表達(dá)所述多肽的構(gòu)件，[0165]其中所述多肽呈遞或展示在病毒如桿狀病毒的表面膜上。[0166]抗原肽[0167]本發(fā)明所用的抗原肽包括能夠在本表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多肽或肽。本文所用的抗原肽可以為細(xì)菌、病毒或原蟲抗原，其包括但不限于:病毒包膜、病毒衣殼、病毒顯性免疫區(qū)或病毒表面抗原。在一實(shí)施方案中，抗原為病毒衣殼肽抗原。使用本文所述的系統(tǒng)，可以表達(dá)病毒包膜和非包膜蛋白二者。本文所用的抗原肽在其范圍內(nèi)可以包括或可以不包括編碼全長(zhǎng)序列的多肽的核酸序列。本文所用的抗原肽可以為能含有或編碼一個(gè)或多個(gè)表位如顯性免疫表位的片段，相對(duì)于全長(zhǎng)序列或由該片段編碼的序列，所述表位允許對(duì)該片段或由該片段編碼的序列產(chǎn)生相似的免疫反應(yīng)?？乖慰梢詾?-500個(gè)氨基酸，20-400個(gè)氨基酸，30-300個(gè)氨基酸，例如，片段可以為約100、200、250、300或350個(gè)氨基酸。[0168]抗原肽可以為病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物肽，例如病毒衣殼肽，其選自以下細(xì)菌:疏螺旋體屬、克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、巨細(xì)胞病毒、登革熱、艾-巴病毒、EV71、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、皰疹、HIV、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)、流感病毒如H5N1、H1N1、惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、間日痕原蟲(Plasmodiumvivax)、卵形痕原蟲(Plasmodiumovale)、三日痕原蟲(Plasmodiummalariae)、麻疫病毒、野田村病毒、β野田村病毒、PCV2、PRRSV、風(fēng)疫病毒、SARS冠狀病毒、弓形蟲、梅毒螺旋體(Treponemapallidum)、西尼羅病毒或水痘病毒。肽可以由病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物來(lái)表達(dá)或衍生自病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物。肽可以為重組型或經(jīng)純化的。[0169]本文所用的抗原肽可以為病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒或其免疫原性片段的衣殼蛋白。[0170]本文所用的抗原肽可以得自EV71病毒，例如抗原肽選自VP0、VP1以及VP3或其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所組成:VPl的氨基酸167-178(SEQIDNO:23);VPl的氨基酸209-222(SEQIDNO:24);和/或VPl的氨基酸240-260(SEQIDNO:25)或其免疫原性片段。抗原肽的示例性實(shí)施方案在第3圖中示出。[0171]本文所用的抗原肽可以得自PCV2病毒，例如抗原肽為由0RF2編碼的PCV2衣殼蛋白，或是其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所組成:0RF2的氨基酸100-150(SEQIDNO:26)和/或0RF2的氨基酸151-200(SEQIDNO:27)或其免疫原性片段。[0172]本文所用的抗原肽可以得自PRRSV病毒，例如抗原肽由選自以下的ORF所編碼:0RF-4、0RF-5(主要包膜蛋白)以及0RF-7(核衣殼蛋白)或其表位或片段，例如抗原肽可以包含以下或由以下所組成:0RF7的氨基酸18-57(SEQIDNO:28);0RF7的氨基酸58-123(SEQIDNO:29);0RF5的氨基酸28-65(SEQIDNO:30)和/或0RF7的氨基酸132-200(SEQIDNO:31)或其免疫原性片段。[0173]本文所用的抗原肽可以得自來(lái)自螺旋體屬的細(xì)菌，例如抗原肽選自P41和C6或其表位或片段。[0174]本文所用的抗原肽可以得自克氏錐蟲，例如抗原肽為TcF或是其表位或片段。[0175]本文所用的抗原肽可`以得自衣原體細(xì)菌，例如抗原肽為主要外膜蛋白或其表位或片段。[0176]本文所用的抗原肽可以得自登革熱病毒，例如抗原肽為非結(jié)構(gòu)性蛋白I或其表位或片段。[0177]本文所用的抗原肽可以得自艾-巴病毒，例如抗原肽為非結(jié)構(gòu)性蛋白I或是其表位或片段。[0178]本文所用的抗原肽可以得自A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎，并且抗原肽例如為HBsAg或El肽，或其表位或片段。[0179]本文所用的抗原肽可以得自皰疹病毒，例如抗原肽為Hl或其表位或片段。[0180]本文所用的抗原肽可以得自于HIV病毒，例如抗原肽為gpl20或是其表位或片段。[0181]本文所用的抗原肽可以得自人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)，例如抗原肽為gp46或是其表位或片段。[0182]本文所用的抗原肽可以得自流感病毒，例如H5N1或是HlNl，并且抗原肽例如為血球凝集素或其表位或片段。[0183]本文所用的抗原肽可以得自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲，并且抗原肽為例如為裂殖子表面蛋白2(MSP2)或其表位或片段。[0184]本文所用的抗原肽可以得自麻疹病毒，例如抗原肽為麻疹或其表位或片段。[0185]本文所用的抗原肽可以得自風(fēng)疹病毒，例如抗原肽為El或是其表位或片段。[0186]本文所用的抗原肽可以得自于SARS冠狀病毒，并且抗原肽例如為S蛋白或其表位或片段。[0187]本文所用的抗原肽可以得自弓形蟲，并且抗原肽例如為SAG-1或P30或其表位或片段。[0188]本文所用的抗原肽可以得自梅毒螺旋體，并且抗原肽例如為主要外鞘蛋白(Msp)或其表位或片段。[0189]本文所用的抗原肽可以得自西尼羅病毒，并且抗原肽例如為E蛋白或其表位或片段。[0190]本文所用的抗原肽可以得自野田村病毒，例如抗原肽為野田村病毒的衣殼蛋白或其表位或片段。[0191]可以用于本發(fā)明的抗原肽的實(shí)例在以下表4中示出:[0192]表4[0193]【權(quán)利要求】1.表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含:(a)來(lái)自白斑綜合征病毒的iel啟動(dòng)子或其變體；(b)編碼N端gp64信號(hào)肽的核酸序列或其變體、編碼抗原肽的核酸序列、編碼跨膜區(qū)的核酸以及編碼gp64胞質(zhì)域的核酸或其變體；其中所述啟動(dòng)子可操作地連接至所述核酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述抗原肽來(lái)自病毒、或逆轉(zhuǎn)錄病毒、或細(xì)菌、或原生動(dòng)物、或其免疫原性片段。3.如權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)盒，其中所述抗原肽是來(lái)自以下細(xì)菌的肽:疏螺旋體屬，或克氏錐蟲，或衣原體屬，或巨細(xì)胞病毒，或登革熱病毒，或EV71，或PCV2，或PRRSV，或HSV-1，或HSV-2，或艾-巴病毒，或脊髓灰質(zhì)炎病毒，或A型肝炎病毒，或B型肝炎病毒，或C型肝炎病毒，或D型肝炎病毒，或E型肝炎病毒(HEV)，或β野田村病毒，或皰疹，或HIV，或HTLV,或流感病毒如Η5Ν1、HlNl，或麻疹病毒，或野田村病毒，或風(fēng)疹病毒，或SARS病毒，或西尼羅病毒，或水痘病毒，或弓形蟲，或密螺旋體，或惡性瘧原蟲，或間日瘧原蟲，或卵形瘧原蟲，或三日瘧原蟲。4.如權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)盒，其中所述抗原肽選自:P41、C6、TcF、主要外膜蛋白、非結(jié)構(gòu)性蛋白1、HBsAg,EUHUgpl20、gp46、血球凝集素、裂殖子表面蛋白2(MSP2)、S蛋白、SAG-1、P30、主要外鞘蛋白(Msp)以及E蛋白。5.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其中所述病毒為EV71，并且所述抗原肽選自:VP0、VP1、VP3及其片段。6.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其中所述病毒為PCV2，并且所述抗原肽為由0RF-2編碼的PCV2衣殼肽或其片段。`7.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其中所述病毒為PRRSV，并且所述抗原肽為由選自以下的ORF所編碼:0RF-4、0RF-5(主要包膜蛋白)、0RF-7(核衣殼蛋白)及其片段。8.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其中所述病毒為野田村病毒，并且所述抗原肽選自野田村病毒的衣殼肽及其片段。9.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其中所述病毒為β野田村病毒，并且所述抗原肽選自β野田村病毒的衣殼肽及其片段。10.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，其中所述跨膜區(qū)為糖蛋白跨膜區(qū)。11.如權(quán)利要求10所述的表達(dá)盒，其中所述糖蛋白跨膜區(qū)為血球凝集素跨膜區(qū)。12.如權(quán)利要求11所述的表達(dá)盒，其中所述血球凝集素跨膜區(qū)選自:Η1、Η2、Η3、Η4、Η5、Η6、Η7、Η8、Η9、Η10、Η11、Η12、Η13、Η14、Η15以及Η16。13.如權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其中所述血球凝集素跨膜區(qū)選自Η3Ν2、Η5Ν1以及Η3Ν2-ΗΑ。14.如權(quán)利要求13所述的表達(dá)盒，其中所述Η3Ν2跨膜區(qū)由SEQIDNO:17或其變體所編碼。15.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，其中所述gp64胞質(zhì)域由SEQIDNO:15或SEQIDNO:16或其變體所編碼。16.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，其中所述N端gp64信號(hào)肽由SEQIDNO:14或其變體所編碼。17.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，其中所述iel啟動(dòng)子為SEQIDNO:18或其變體。18.表達(dá)載體，其包含前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒。19.如權(quán)利要求18所述的表達(dá)載體，其中所述載體與蛋白表達(dá)系統(tǒng)相容，所述蛋白表達(dá)系統(tǒng)包含選自以下的宿主細(xì)胞:細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、魚細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞以及植物細(xì)胞。20.如權(quán)利要求19所述的表達(dá)載體，其中所述宿主細(xì)胞為Sf9-1I。21.如權(quán)利要求18至20中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體適用于病毒表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)。22.如權(quán)利要求21所述的表達(dá)載體,其中所述病毒表達(dá)系統(tǒng)選自:腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及桿狀病毒。23.如權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體,其中所述病毒表達(dá)系統(tǒng)為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。24.試劑盒，其包含權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒或權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體以及為此的包裝材料。25.分離的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒或權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體。26.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，或權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑中的一種或多種。27.疫苗，其包含權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體，連同藥物可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑中的一種或多種。28.抗體，其從接種權(quán)利要求27所述的疫苗的生物體而獲得。29.抗血清，其含有權(quán)利要求28所述的抗體。30.用于治療或預(yù)防個(gè)體的疾病的權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，或權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體，或權(quán)利要求26所述的免疫原性組合物，或權(quán)利要求27所述的疫苗，其中所述抗原肽由所述表達(dá)載體在所述個(gè)體中表達(dá)。31.用于治療或預(yù)防個(gè)體的疾病的權(quán)利要求28所述的抗體或權(quán)利要求29所述的抗血清。32.用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法，其中所訴方法包括向主體給予有效量的權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，或權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體，或權(quán)利要求26所述的免疫原性組合物，或權(quán)利要求27所述的疫苗，或權(quán)利要求28所述的抗體，或權(quán)利要求29所述的抗血清。33.權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)盒，或權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體，或權(quán)利要求26所述的免疫原性組合物，或權(quán)利要求27所述的疫苗，或權(quán)利要求28所述的抗體，或權(quán)利要求29所述的抗血清制在造用于調(diào)節(jié)個(gè)體免疫反應(yīng)的藥物中的用途。34.如權(quán)利要求30所述的表達(dá)盒或表達(dá)載體或免疫原性組合物或疫苗；或權(quán)利要求31所述的抗體或抗血清；或權(quán)利要求32所述的方法；或權(quán)利要求33所述的用途；其中所述個(gè)體為哺乳動(dòng)物，或鳥類，或甲殼類動(dòng)物，或無(wú)顎魚，或多骨魚，或爬蟲類動(dòng)物或兩棲動(dòng)物。35.如權(quán)利要求34所述的表達(dá)盒或表達(dá)載體或免疫原性組合物或疫苗或抗體或抗血清或方法或用途，其適用于口服給藥。36.如權(quán)利要求30所述的表達(dá)盒或表達(dá)載體或免疫原性組合物或疫苗；或權(quán)利要求31所述的抗體或抗血清；其中所述疾病選自:手足口病、斷奶后多系統(tǒng)消耗性癥候群、豬生殖與呼吸癥候群、皰疹、流感、癌癥、肝炎、弓形蟲癥、梅毒、瘧疾以及病毒性神經(jīng)壞死病。37.用于呈遞、生產(chǎn)或展示抗原肽的方法，其中所述方法包括:(a)將編碼所述抗原肽的核酸插入權(quán)利要求18至23中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體內(nèi)；(b)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至少一個(gè)宿主細(xì)胞；以及(c)由所述表達(dá)載體表達(dá)所述抗原肽；其中所述抗原肽被呈遞或展示在桿狀病毒的表面膜上。【文檔編號(hào)】A61K39/125GK103562389SQ201280016937【公開日】2014年2月5日申請(qǐng)日期:2012年2月8日優(yōu)先權(quán)日:2011年2月8日【發(fā)明者】普萊莫南德·巴爾拉賈,況慧星,安布·庫(kù)馬爾·卡魯帕南申請(qǐng)人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司