溶瘤作用中的禽偏肺病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于癌癥治療的活禽偏肺病毒(AMPV)和用于癌癥治療的包含細(xì)胞毒性量的活禽偏肺病毒(AMPV)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
【專利說明】溶瘤作用中的禽偏肺病毒
[0001]本發(fā)明涉及用于治療的禽偏肺病毒(AMPV)和用于治療的包含禽偏肺病毒(AMPV)的藥物組合物。
[0002]已知某些病毒可以根除腫瘤已有幾十年。通常已知此類病毒為溶瘤病毒。盡管可溶瘤的腫瘤數(shù)相對(duì)低，但在幾種病毒屬中發(fā)現(xiàn)了它們。尤其是以下屬的溶瘤成員是已知的:腺病毒、皰疫病毒、多瘤病毒、痘病毒、細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、正黏液病毒、副黏液病毒、彈狀病毒、冠狀病毒、小核糖核酸病毒、披膜病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。Vaha-Koskela, M.等近期的小綜述給出了溶瘤病毒在癌癥治療中的概述(Cancer Letters 254: 178-216 (2007))。
[0003]所有溶瘤病毒均要面對(duì)的問題是在第一次劑量施用后，針對(duì)所用病毒的免疫開始建立。而且，考慮到腫瘤細(xì)胞中不可預(yù)知的分化和去分化途徑，很可能某一腫瘤塊的某些個(gè)別腫瘤細(xì)胞對(duì)癌癥治療中所用的溶瘤病毒變得具有抗性。例如，這可能是由于此類腫瘤細(xì)胞喪失了對(duì)該溶瘤病毒的受體這一事實(shí)。
[0004]如果僅由于這些原因，則存在對(duì)新溶瘤病毒的需要，其可以在開始癌癥治療時(shí)使用或當(dāng)其他溶瘤病毒在癌癥治療中沒有效果時(shí)用作替代物。
[0005]目前令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，活禽病毒(火雞鼻氣管炎病毒，目前也已知為禽偏肺病毒(AMPV))出人意料地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有溶瘤作用。
[0006]火雞鼻氣管炎(TRT)病毒或禽偏肺病毒是副黏液病毒科病毒科中偏肺病毒屬的成員。偏肺病毒具有反義極性的單鏈非分段RNA基因組。
[0007]在副黏液病毒科中，直至目前，已知四個(gè)屬的病毒包括一種溶瘤成員:禽腮腺炎病毒屬中的一個(gè)成員(新城疫病毒)、麻疹病毒屬中的一個(gè)(具體麻疹毒株)、呼吸道病毒屬中的一個(gè)(仙臺(tái)病毒)和德國麻疫病毒屬中的一個(gè)(腿腺炎病毒)。
[0008]直至目前，仍不知道或者懷疑副黏液病毒科的偏肺病毒屬具有顯示出溶瘤特性的成員。
[0009]偏肺病毒屬具有兩個(gè)成員，其中之一是上述的AMPV,另一個(gè)成員是人偏肺病毒(HMPV)。兩種病毒均導(dǎo)致呼吸道疾??；在人中為HMPV以及在家禽中為AMPV。
[0010]正是偏肺病毒的融合蛋白(F)負(fù)責(zé)向性中的差異。De Graaf等已經(jīng)令人信服地顯示HMPV不能感染家禽。并且反之亦然，從未報(bào)道AMPV在哺乳動(dòng)物中導(dǎo)致疾病或甚至任何臨床癥狀。(De Graaf M.，等，J.Gen.Virol.90:1408-1416 (2009))。
[0011]此外，無論是HMPV或AMPV，均未描述任何抗腫瘤作用。
[0012]在同樣劑量下，活A(yù)MPV選擇性殺死哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞而非哺乳動(dòng)物正常分化細(xì)胞和哺乳動(dòng)物正常增殖細(xì)胞。選擇性殺死哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞這一特征將進(jìn)一步稱為抗腫瘤作用。
[0013]抗腫瘤作用表示無論作用方式如何，腫瘤的個(gè)別細(xì)胞由病毒殺死。例如，由于病毒裂解這些細(xì)胞，因此它們可以對(duì)細(xì)胞具有抗腫瘤作用:認(rèn)為裂解病毒株破壞受感染細(xì)胞的質(zhì)膜。抗腫瘤作用的另一形式例如見于非裂解病毒；它們似乎干擾細(xì)胞的代謝并且由于該作用方式而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
[0014]AMPV的抗腫瘤作用使病毒非常適合用于癌癥治療。[0015]因此，本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及用于哺乳動(dòng)物中癌癥治療的活禽偏肺病毒(AMPV)。
[0016]優(yōu)選地，AMPV用于針對(duì)乳腺癌、肺癌、前列腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌或結(jié)腸癌、或針對(duì)黑素瘤的癌癥治療。
[0017]更優(yōu)選地，AMPV用于針對(duì)結(jié)腸癌的癌癥治療。
[0018]為了具有抗腫瘤作用，AMP病毒必須以對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的量來施用。該量稱為細(xì)胞毒性量。因此,AMPV的細(xì)胞毒性量是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡所必需的病毒的量。
[0019]理論上說,一個(gè)AMPV可以感染并殺死一個(gè)腫瘤細(xì)胞。因此對(duì)于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡所必需的AMPV的細(xì)胞毒性量將為每個(gè)細(xì)胞一個(gè)病毒。
[0020]然而，在實(shí)際環(huán)境中，技術(shù)人員將施用是待感染的腫瘤細(xì)胞數(shù)的多倍的量。
[0021]盡管如此，將需要非常少量的病毒以誘導(dǎo)抗腫瘤作用。每劑量IO3個(gè)蝕斑形成單位(Pfu)的病毒數(shù)已經(jīng)足以攻擊少量的腫瘤細(xì)胞。因此`，對(duì)于許多實(shí)踐目的，低至IO3 pfu個(gè)病毒的數(shù)目已經(jīng)能夠認(rèn)為是細(xì)胞毒性量。
[0022]然而，將清楚的是，如果施用的病毒量太少以致于僅少量腫瘤細(xì)胞被感染，則在第一輪感染已經(jīng)產(chǎn)生了能夠感染進(jìn)一步的腫瘤細(xì)胞的新的子代病毒之前，會(huì)過去一些時(shí)間。對(duì)于后續(xù)的復(fù)制輪次同樣是這樣，并且同時(shí)將建立針對(duì)病毒的免疫應(yīng)答并干擾病毒。因此，優(yōu)選一次施用更高數(shù)量的病毒。在那種情況下，許多腫瘤細(xì)胞將同時(shí)獲得感染，并且因此許多腫瘤細(xì)胞將在建立針對(duì)病毒的免疫之前獲得感染。
[0023]病毒對(duì)哺乳動(dòng)物中非腫瘤細(xì)胞非常輕微的或甚至不存在的作用允許施用此類相對(duì)高的劑量。所以，盡管在IO3-1O12 Pfu的寬范圍內(nèi)劑量將是可接受的劑量，但在IO6-1O12Pfu范圍內(nèi)的劑量對(duì)于會(huì)從大量病毒中獲益的大部分應(yīng)用而言將是優(yōu)選劑量。在IO9-1O12pfu范圍內(nèi)的劑量將是更優(yōu)選的。
[0024]本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用于哺乳動(dòng)物中癌癥治療的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含細(xì)胞毒性量的活禽偏肺病毒(AMPV)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0025]“藥學(xué)上可接受的載體”的概念在別處解釋(見下文)。
[0026]尤其是當(dāng)腫瘤為已達(dá)到幾個(gè)細(xì)胞層厚度的巨大腫瘤時(shí)，內(nèi)層可能不會(huì)直接暴露于病毒攻擊下。對(duì)于具有低水平的血管形成的腫瘤而言尤其是這樣的。因此，重要的是，在上面的細(xì)胞層被殺死后，來源于殺死的腫瘤細(xì)胞的子代病毒或新施用的病毒能夠感染腫瘤內(nèi)更深的細(xì)胞層。
[0027]為此原因，并且考慮到遲早將會(huì)建立針對(duì)AMPV的免疫應(yīng)答，在用AMPV治療之前和/或期間，向患者施用免疫抑制劑可能是有利的。這將推遲或抑制針對(duì)病毒的免疫應(yīng)答，從而后續(xù)輪次的感染可以發(fā)生直至殺死所有易感的腫瘤細(xì)胞。免疫抑制劑在本領(lǐng)域是廣泛知曉的。此類免疫抑制劑的實(shí)例尤其為:抑制編碼白細(xì)胞介素和TNF-Y的基因的糖皮質(zhì)激素；細(xì)胞抑制劑諸如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤；針對(duì)CD25和CD3的抗體諸如放線菌素D ;作用于抑免蛋白的藥物諸如環(huán)孢素和他克莫司；和其他藥物諸如干擾素類、阿片類物質(zhì)、TNF結(jié)合蛋白、霉酚酸酯以及小生物制劑諸如芬戈莫德(Fingolimod)和多球殼菌素。此類免疫抑制劑的使用將由這些試劑的銷售者說明。
[0028]因此，本實(shí)施方案的優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于所述組合物還包含免疫抑制劑。[0029]免疫抑制劑可以施用一次，但例如為了保持免疫抑制作用一段時(shí)間，它們還可以在更長時(shí)期內(nèi)以重復(fù)劑量施用。
[0030]因此，無論它是否包含免疫抑制劑，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選向接受用免疫抑制劑治療的哺乳動(dòng)物施用。
[0031]如上所述，不施用免疫抑制劑，遲早將建立針對(duì)AMPV的免疫應(yīng)答，其對(duì)感染在第一輪感染中沒有被病毒感染的細(xì)胞的可能性具有負(fù)面結(jié)果。這一問題可以通過施用具有抗腫瘤作用的另一種(現(xiàn)在是非AMP)病毒(例如，見上文)以可選方法來避免。此類病毒將不會(huì)被針對(duì)AMPV的免疫應(yīng)答所阻斷。
[0032]優(yōu)選地，施用AMPV和$g AMPV (或非AMPV和AMPV，見下文)之間的時(shí)間間隔將為2-56周。第一種和第二種病毒施用之間的2-56周的時(shí)期按照如下原理:某些腫瘤為快速生長的，而其他腫瘤或者甚至轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞可能為緩慢生長的或甚至“休眠”相當(dāng)一段時(shí)間。因此，根據(jù)腫瘤的特征，在時(shí)間上或早或晚給予第二種病毒可能是有利的。在許多情況下，第一種和第二種病毒施用之間的時(shí)期會(huì)更短，這是由于“休眠”時(shí)間少于56周。并且此外，技術(shù)人員可能想要避免細(xì)胞更早向外生長的風(fēng)險(xiǎn)。因此，優(yōu)選時(shí)期將為2-28周，更優(yōu)選2-20,2-16,2-12或者甚至2_8周，這是優(yōu)先的順序。
[0033]因此，本實(shí)施方案的另一形式涉及本發(fā)明的用于哺乳動(dòng)物中癌癥治療的藥物組合物，其特征在于所述癌癥治療包括向所 述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的活A(yù)MPV的步驟，隨后在所述施用細(xì)胞毒性量的活A(yù)MPV的2-56周內(nèi)向所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的非AMPV的步驟。
[0034]清楚的是,在癌癥治療中的該用途能夠通過改動(dòng)還應(yīng)用于更早已用非AMPV治療過的動(dòng)物中。此類用途將應(yīng)用于包括在施用細(xì)胞毒性量的非AMPV后2-56周內(nèi)施用細(xì)胞毒性量的活A(yù)MPV的步驟的治療中。
[0035]因此，本實(shí)施方案的又另一形式涉及本發(fā)明的用于哺乳動(dòng)物中癌癥治療的藥物組合物，其特征在于所述癌癥治療包括在向所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的非AMPV的步驟后2-56周內(nèi)向所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的活A(yù)MPV的步驟。
[0036]上述的溶瘤非AMP病毒中，最常用于癌癥治療中的病毒是另一種細(xì)胞毒性副黏液病毒(新城疫病毒(NDV))。使用NDV的充分指導(dǎo)在下文中給出。
[0037]因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，非AMPV為NDV。
[0038]除了在使用AMPV之前或鄰近使用AMPV時(shí)使用免疫抑制劑并使用其他細(xì)胞毒性(非AMPV)病毒，還存在幾種方法來增強(qiáng)向腫瘤細(xì)胞的病毒遞送。一種方法是用化合物諸如蛋白水解酶例如透明質(zhì)酸酶和膠原酶預(yù)先處理腫瘤組織。(McKee, T.D.等，Cancer Res.66:2509-2513 (2006), Cairns, R.等，Mo 1.Cancer Res.4:61-70 (2006),Minchinton, A.1.等，Nat.Rev.Cancer 6:583-592 (2006))。
[0039]另一種提高血液-腫瘤透性的方法是通過施用血管活性或血管正?；衔?，諸如bradikynin、紫杉醇或白細(xì)胞三烯(Ieukotrines)。
[0040]此類化合物的使用將由這些化合物的銷售者說明。
[0041]此類治療促進(jìn)病毒侵入并因此促進(jìn)病毒向腫瘤細(xì)胞的遞送。此類化合物還稱作增強(qiáng)病毒遞送的化合物。
[0042]因此，本實(shí)施方案的另一優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于所述組合物還包含增強(qiáng)病毒遞送的化合物。
[0043]而且，已經(jīng)提出了依賴于增強(qiáng)病毒遞送的物理方法的方法(例如通過提高腫瘤的氧合)作為提高血液-腫瘤透性的方法。此類方法例如依賴于吸入含氧量高的氣體或局部體溫過高。此類方法還稱作增強(qiáng)病毒遞送的方法。
[0044]增強(qiáng)病毒遞送的化合物可以施用一次，但例如為了保持作用一段時(shí)間，它們還可以在更長時(shí)期內(nèi)以重復(fù)劑量施用。
[0045]因此，無論它是否包含增強(qiáng)病毒遞送的化合物，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選向接受用增強(qiáng)病毒遞送的化合物治療的哺乳動(dòng)物施用。
[0046]同樣，增強(qiáng)病毒遞送的方法可以向動(dòng)物應(yīng)用延長的時(shí)期。
[0047]因此，無論它是否包含增強(qiáng)病毒遞送的化合物，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選向接受用增強(qiáng)病毒遞送的方法治療的哺乳動(dòng)物施用。
[0048]能夠成功與本發(fā)明的AMPV治療組合應(yīng)用的另一方法是使用細(xì)胞抑制化合物的更經(jīng)典方法。此類化合物在本領(lǐng)域是熟知的，并且它們包括烷化劑諸如苯丁酸氮芥和異環(huán)磷酰胺、抗代謝物諸如巰嘌呤、植物生物堿和萜類化合物諸如長春新堿、鬼白毒素和單寧(tannanes)、和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑諸如伊立替康和安吖唳。并且如同對(duì)于上述的免疫抑制劑、酶和化合物一樣，此類酶或化合物的使用將由細(xì)胞抑制化合物的銷售者說明。
[0049]因此，本實(shí)施方案的又另一優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于所述組合物還包含細(xì)胞抑制化合物。
[0050]細(xì)胞抑制劑可以施用一次，但例如為了保持細(xì)胞抑制作用一段時(shí)間，它們還可以在更長時(shí)期內(nèi)以重復(fù)劑量施用。
[0051]因此，無論它是否包含細(xì)胞抑制劑，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選向接受用細(xì)胞抑制化合物治療的哺乳動(dòng)物施用。
[0052]關(guān)于哺乳動(dòng)物的性質(zhì)，可以提及以下內(nèi)容:無需說明本發(fā)明用于癌癥治療的用途非常適合于人。由于經(jīng)濟(jì)原因，在非人哺乳動(dòng)物即獸醫(yī)應(yīng)用中的用途將尤其適用于伴侶動(dòng)物，諸如馬、犬或貓物種。
[0053]因此，另一優(yōu)選實(shí)施方案涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于哺乳動(dòng)物屬于人、馬、犬或貓物種。
[0054]關(guān)于施用的途徑或部位，原則上，病毒可以口服、經(jīng)吸入和通過全身應(yīng)用來施用。全身應(yīng)用包括肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)和腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍施用。
[0055]對(duì)于呼吸道中的腫瘤，靜脈內(nèi)途徑和吸入途徑將是優(yōu)選途徑。
[0056]對(duì)于大部分其他腫瘤，靜脈內(nèi)和/或腫瘤內(nèi)和/或腫瘤周圍施用將是選擇的優(yōu)選方法 。
[0057]因此，本實(shí)施方案的另一優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用部位為腫瘤內(nèi)的。腫瘤內(nèi)施用為向腫瘤塊內(nèi)的施用。
[0058]本實(shí)施方案的又另一優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用部位為腫瘤周圍的。腫瘤周圍施用為在腫瘤塊周圍的施用。
[0059]而且，本實(shí)施方案的另一優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用部位為靜脈內(nèi)的。
[0060]本實(shí)施方案的還另一優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用途徑為經(jīng)吸入。
[0061]本領(lǐng)域中存在的關(guān)于施用另一種細(xì)胞毒性副黏液病毒(新城疫病毒(NDV))的大量知識(shí)還應(yīng)給予技術(shù)人員大量指導(dǎo)。僅僅作為本領(lǐng)域的實(shí)例，提供以下概述:
如同 Schirrmacher V., Griesbach A., Ahlert T., Int.J.0ncol.18: 945-52，2001中綜述，在動(dòng)物研究中，NDV感染已經(jīng)通過尤其是腫瘤內(nèi)途徑、腹膜內(nèi)途徑和靜脈內(nèi)途徑來完成。經(jīng)肌內(nèi)或皮下途徑的NDV感染已經(jīng)由尤其是Heicappell R., Schirrmacher V.,von Hoegen P.，等，Int.J.Cancer 37: 569-577 (1986)綜述。[0062]在人研究中，在其中患者已經(jīng)被NDV的裂解株感染的情況下，已經(jīng)使用腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射(Cassel ff.A., Garrett R.E., Cancer 18:863-868 (1965), CsataryL.K., Moss R.ff., Beuth J.,等 Anticancer Res.19:635-638 (1999), Pecora A.L.,Rizvi N., Cohen G.1.,等，J.Clin.0ncol.20:2251-2266 (2002)，Csatary L.K.,Bakacs T., JAMA 281:1588-1589 (1999)，Wheelock E.F., Dingle J.H., N.Engl.J.Med.271:645-651 (1964)，Csatary L.K., Lancet 2 (7728):825 (1971)。還使用以下途徑:吸入和向結(jié)腸內(nèi)直接注射(即，經(jīng)結(jié)腸造口術(shù)開口)。(Csatary L.K., MossR.ff., Beuth J.,等Anticancer Res.19:635-638 (1999), Csatary L.K., Eckhardt S.，Bukosza 1.,等，Cancer Detect.Prev.17:619-27 (1993))。
[0063]為了允許AMPV的施用，本發(fā)明的藥物組合物原則上應(yīng)包含在藥學(xué)上可接受的載體中的AMPV。
[0064]“藥學(xué)上可接受的載體”旨在幫助化合物的有效施用，而不對(duì)它施用的動(dòng)物的健康產(chǎn)生(嚴(yán)重的)副作用。藥學(xué)上可接受的載體例如可以是無菌水或無菌的生理鹽溶液。在更復(fù)雜的形式中，載體例如可以是緩沖液，其可以包含其它的添加劑，諸如穩(wěn)定劑或防腐劑。載體的性質(zhì)尤其依賴于施用途徑。如果施用途徑為經(jīng)吸入，則載體可以簡單為無菌水、生理鹽溶液或緩沖液。如果注射為優(yōu)選途徑，則載體應(yīng)該優(yōu)選為等滲的并且具有使其適合于注射的PH限制。然而，此類載體在本領(lǐng)域是廣泛知曉的。
[0065]細(xì)節(jié)和實(shí)例例如描述于眾所周知的手冊(cè)，例如:諸如:“Remington: the scienceand practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN:683306472)。
[0066]用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括穩(wěn)定劑諸如SPGA、碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白諸如白蛋白或酪蛋白、含蛋白的試劑諸如牛血清或脫脂牛奶和緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)。優(yōu)選地，穩(wěn)定劑無動(dòng)物來源的化合物，或者甚至為化學(xué)確定的，如公開于WO 2006/094，974中。尤其是當(dāng)此類穩(wěn)定劑加入到藥物組合物中時(shí)，藥物組合物非常適合于冷凍干燥。冷凍干燥是阻止AMPV滅活的非常適合的方法。因此，在更優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的藥物組合物為冷凍干燥形式。
[0067]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1:用TRT感染后細(xì)胞裂解的表現(xiàn) 細(xì)胞群的代表性圖像。
[0068]圖片a-c:CIPp細(xì)胞，在感染后7天拍攝的圖片。
[0069]圖片d-f:HMP0S細(xì)胞，在感染后3天拍攝的圖片。
[0070]圖片g-1:Mel-T4細(xì)胞，在感染后3天拍攝的圖片。
[0071]在a、d、g中的細(xì)胞為模擬感染的，在b、e、h中的細(xì)胞為用0.1的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染的，在C、f、I中的細(xì)胞為用I的MOI感染的。
實(shí)施例
[0072]實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng):
具有ATCC序號(hào)CL188的人結(jié)腸癌細(xì)胞系LS 174T按照由ATCC提供的說明書生長直至
半?yún)R合。
[0073]病毒的預(yù)處理:
用在細(xì)胞培養(yǎng)基中的TRT病毒懸浮液進(jìn)行感染，其用胰蛋白酶如下預(yù)處理:將10 USPTU/ml胰蛋白酶加入到病毒懸浮液中，并將混合物孵育30分鐘。為了抑制胰蛋白酶活性，將10% FBS (Biochrome AG)加入到病毒懸浮液中。
[0074]人結(jié)腸癌細(xì)胞系LS 174T的感染:
從CL188細(xì)胞中去除培養(yǎng)基，并以感染復(fù)數(shù)(MOI)0.l和MOI 0.01加入I ml病毒懸浮液。在組織培養(yǎng)條件(37 °C，5% CO2)下I小時(shí)孵育后，加入含有10%胎牛血清、如通常用于細(xì)胞培養(yǎng)中的標(biāo)準(zhǔn)量的新霉素、匹馬霉素(pymafusin)和泰樂菌素以及2ug/ml兩性霉素B(Gibco)的4 ml完全組織培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在組織培養(yǎng)條件下保持3天。隨后，收集細(xì)胞上清液，并貯存于_70°C。將新鮮的完全組織培養(yǎng)基加入到細(xì)胞中，并在感染后7天，收集細(xì)胞上清液。隨后，將I ml PBS-紅加入到細(xì)胞中，隨后將其刮下以將它們從細(xì)胞培養(yǎng)表面分離。最后，測定接種物、細(xì)胞上清液收集物和收集的細(xì)胞的病毒滴度(LoglO TCID50/ml)。
[0075]結(jié)果
表1顯示了接種物、在接種后3天和7天的細(xì)胞上清液和收集的細(xì)胞的TRT滴度(LoglOTCID50/ml)。
[0076]表1:TRT病毒滴度。
【權(quán)利要求】
1.活禽偏肺病毒(AMPV)，其用于哺乳動(dòng)物中癌癥治療。
2.藥物組合物，其用于哺乳動(dòng)物中癌癥治療，其特征在于所述組合物包含細(xì)胞毒性量的活禽偏肺病毒(AMPV)和藥學(xué)上可接受的載體。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于所述組合物還包含免疫抑制劑。
4.權(quán)利要求2或3的藥物組合物，其特征在于所述哺乳動(dòng)物接受用免疫抑制劑的治療。
5.權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于所述組合物還包含細(xì)胞抑制化合物。
6.權(quán)利要求2或5的藥物組合物，其特征在于所述哺乳動(dòng)物接受用細(xì)胞抑制化合物的治療。
7.權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于所述組合物還包含增強(qiáng)病毒遞送的化合物。
8.權(quán)利要求2或7的藥物組合物，其特征在于所述哺乳動(dòng)物接受用增強(qiáng)病毒遞送的化合物和/或方法的治療。
9.權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于所述癌癥治療包括向所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的活A(yù)MPV的步驟，隨后在所述施用細(xì)胞毒性量的AMPV的2-56周內(nèi)向所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的活非AMPV的步驟。
10.權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于所述癌癥治療包括在向所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的非AMPV步驟后的2-56周內(nèi)向所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞毒性量的活A(yù)MPV的步驟。
11.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其特征在于所述哺乳動(dòng)物屬于人、馬、犬或貓物種。
12.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用部位為腫瘤內(nèi)的。
13.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用部位為腫瘤周圍的。
14.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用部位為靜脈內(nèi)的。
15.權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的施用途徑為經(jīng)吸入。
【文檔編號(hào)】A61K35/76GK103491970SQ201280017841
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月12日
【發(fā)明者】C.C.施里爾 申請(qǐng)人:英特維特國際股份有限公司