基于李斯特菌屬的佐劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了使用單核細(xì)胞增生李斯特菌作為增強(qiáng)受試者中的免疫應(yīng)答的佐劑的方法和組合物。
【專利說明】基于李斯特菌屬的佐劑
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年3月11日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/451，651的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)另外要求2011年11月7日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?3/290,783的優(yōu)先權(quán)，后者是2011年2月7日提交的美國申請(qǐng)?zhí)?2/993,380的部分繼續(xù)申請(qǐng)，后者要求2009年5月19日提交的國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US09/44538的優(yōu)先權(quán)，后者要求2008年5月19日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/071，792的權(quán)益。本申請(qǐng)還要求2011年2月15日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?3/027,828的優(yōu)先權(quán)，后者要求2010年2月15日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/304，701的權(quán)益。本申請(qǐng)還要求2011年8月16日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?3/210,696的優(yōu)先權(quán)，后者是2010年11月12日提交的美國申請(qǐng)?zhí)?2/945，386的部分繼續(xù)申請(qǐng)，后者要求2009年11月11日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/260，277的權(quán)益。這些申請(qǐng)?zhí)卮送ㄟ^引用整體并入本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明提供了使用單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)作為佐劑用于增強(qiáng)受試者中的免疫應(yīng)答的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0004]佐劑在免疫療法中具有廣泛應(yīng)用。大多數(shù)基于細(xì)胞的免疫療法在提供抗原特異性的治療之前施用佐劑。通常，這些抗原包括GM-CSF、IL-1、QP-100、鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白和其它。這些佐劑通常通過靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)(IM)、真皮內(nèi)(ID)或類似的途徑全身性地施用。
[0005]單核細(xì)胞增生李斯特菌(Lm)是細(xì)胞內(nèi)病原體，其主要感染抗原呈遞細(xì)胞，且已經(jīng)適應(yīng)生活在這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。單核細(xì)胞增生李斯特菌和它產(chǎn)生的被稱作李斯特菌溶血素O(LLO)的蛋白具有強(qiáng)佐劑性能，其與用于基于細(xì)胞的免疫療法的大多數(shù)佐劑不同，可以在提供抗原特異性的治療以后施用。
[0006]為了降低受試者的患病頻率和由其引起的死亡率，需要快速地升高受試者對(duì)任意抗原的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明提供了通過利用由分泌非溶血性LLO或截短的ActA的活Lm疫苗提供的佐劑性能來升高受試者(諸如成年人和兒童)的免疫應(yīng)答的方法。
[0007]此外，提供了相同的方法，以在受試者中重建免疫應(yīng)答或促進(jìn)免疫應(yīng)答恢復(fù)至正常或大約正常水平，所述受試者由于癌癥已經(jīng)經(jīng)歷細(xì)胞毒性治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在受試者中重建免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟:給所述受試者施用活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在受試者中重建免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟:給所述受試者施用 活的減毒的李斯特菌屬疫苗株，所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼含PEST多肽的第一開放讀碼框。[0010]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在受試者中促進(jìn)細(xì)胞毒性治療后的免疫應(yīng)答恢復(fù)的方法，所述方法包括給所述受試者施用活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在受試者中促進(jìn)細(xì)胞毒性治療后的免疫應(yīng)答恢復(fù)的方法，所述方法包括給所述受試者施用活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼含PEST多肽的第一開放讀碼框。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步驟:給受試者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌屬的佐劑，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在受試者中以不依賴于抗原的方式增強(qiáng)對(duì)疾病的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述受試者施用基于李斯特菌屬的佐劑。
[0014]從下述詳細(xì)描述實(shí)施例和附圖將明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)當(dāng)理解，所述詳細(xì)描述和具體實(shí)施例盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是僅僅通過例證給出，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員從該詳細(xì)描述會(huì)明白在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是大腸桿菌-李斯特菌屬穿梭質(zhì)粒pGG55(上面)和pTV3(下面)的示意圖。CAT(-):大腸桿菌氯霉素轉(zhuǎn)移酶；CAT(+):李斯特菌屬氯霉素轉(zhuǎn)移酶；Ori Lm:李斯特菌屬的復(fù)制起點(diǎn)；0ri Ec:大腸桿菌的pl5復(fù)制起點(diǎn)；prfA:李斯特菌屬致病性調(diào)節(jié)因子A ；LL0:C-端截短的李斯特菌溶血素0，包括它的啟動(dòng)子；E7:HPV E7 ；p60-dal ；p60啟動(dòng)子和李斯特菌屬dal基因的表達(dá)盒。還描繪了選擇的限制位點(diǎn)。
[0016]圖2顯示了存在于李斯`特菌屬菌株E⑶的基因組的inlC區(qū)域的上游和下游的DNA序列。DNA-up (紅色)、inlC基因(藍(lán)色)和DNA-down (黑色)。
[0017]圖3顯示了被克隆進(jìn)溫度敏感的質(zhì)粒PKSV7中以建立ini C缺失突變體的DNA的序列。用于克隆這些區(qū)域的限制性酶位點(diǎn)用大寫字母表示且標(biāo)有下劃線。GAATTC-EcoR1、GGATCC-BamHI 和 CTGCAg-PstI。將 EcoR1-PstI 插入序列克隆進(jìn)載體 pKSV7 中。
[0018]圖4顯示了 Lm-dd和Lm_ddD actA菌株的示意圖。凝膠顯示了使用寡核苷酸1/2和寡核苷酸3/4的PCR產(chǎn)物的大小,所述寡核苷酸使用菌株Lm-dd和Lm_ddA actA的e染色體DNA作為模板得到。
[0019]圖5顯示了存在于李斯特菌屬染色體的actA基因的上游和下游的DNA序列。以斜體字顯示的區(qū)域含有存在于Lmdd Δ actA菌株中的殘余actA序列元件。標(biāo)有下劃線的序列g(shù)tcgac代表XhoI的限制位點(diǎn)，其為actA的N-T和C-T區(qū)域之間的連接部。
[0020]圖6描繪了由Lm疫苗株⑷的施用引起的腫瘤消退。圓圈代表原初小鼠，倒三角形代表施用Lmdd-TV3的小鼠，十字叉代表施用Lm-LL0E7的小鼠。
[0021 ] 圖7顯示了腫瘤中MDSC和Treg的減少。在Lm疫苗接種(LmddAPSA和LmddAE7)以后的MDSC (右側(cè)圖)和Treg (左側(cè)圖)的數(shù)目。
[0022]圖8顯示的抑制測定數(shù)據(jù)證實(shí)，在李斯特菌屬疫苗接種后，得自TPSA23腫瘤的單核細(xì)胞MDSC更少地受到抑制。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因?yàn)橛肞SA-抗原特異性的T細(xì)胞以及用非特異性地刺激的T細(xì)胞觀察到相同的抑制減少。No MDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0023]圖9顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，李斯特菌屬對(duì)脾單核細(xì)胞MDSC沒有影響，且它們僅以抗原特異性的方式產(chǎn)生抑制。No MDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0024]圖10顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，在李斯特菌屬疫苗接種后，得自腫瘤的粒細(xì)胞MDSC具有降低的抑制T細(xì)胞的能力。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因?yàn)橛肞SA-抗原特異性的T細(xì)胞以及用非特異性地刺激的T細(xì)胞觀察到相同的抑制減少。NoMDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0025]圖11顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，李斯特菌屬對(duì)脾粒細(xì)胞MDSC沒有影響，且它們僅以抗原特異性的方式產(chǎn)生抑制。No MDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0026]圖12顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，得自腫瘤的Treg仍然是抑制性的。在該腫瘤模型中存在Treg的抑制能力的非抗原特異性的方式的輕微下降。No Treg組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入Treg來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示 了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0027]圖13顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，脾Treg仍然是抑制性的。NoTreg組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入Treg來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0028]圖14顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，常規(guī)CD4+T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞分裂沒有影響，不論它們存在于小鼠的腫瘤還是脾中。左側(cè)圖和右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0029]圖15顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，在李斯特菌屬疫苗接種后，得自4T1腫瘤的單核細(xì)胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因?yàn)橛肏er2/neu-抗原特異性的T細(xì)胞以及用非特異性地刺激的T細(xì)胞觀察到相同的抑制減少。No MDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0030]圖16顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，對(duì)脾單核細(xì)胞MDSC不存在李斯特菌屬特異性的作用。No MDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0031]圖17顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，在李斯特菌屬疫苗接種后，得自4T1腫瘤的粒細(xì)胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的這種變化不是抗原特異性的，因?yàn)橛肏er2/neu-抗原特異性的T細(xì)胞以及用非特異性地刺激的T細(xì)胞觀察到相同的抑制減少。No MDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0032]圖18顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，對(duì)脾粒細(xì)胞MDSC不存在李斯特菌屬特異性的作用。No MDSC組顯示了應(yīng)答者T細(xì)胞當(dāng)不受刺激時(shí)分裂的缺乏，且最后一組顯示了在沒有加入MDSC來抑制分裂時(shí)受刺激的細(xì)胞的分裂。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0033]圖19顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，在李斯特菌屬疫苗接種后，得自4T1腫瘤的Treg的抑制能力下降。該下降不是抗原特異性的，因?yàn)橛肏erf/neu-特異性的和非特異性的應(yīng)答者T細(xì)胞觀察到所述Treg抑制能力變化。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0034]圖20顯示的抑制基因測定數(shù)據(jù)證實(shí)，對(duì)脾Treg不存在李斯特菌屬特異性的作用。應(yīng)答者T細(xì)胞都能夠分裂，不論它們是否是抗原特異性的。左側(cè)圖顯示了每組的單個(gè)細(xì)胞分裂周期。右側(cè)圖顯示了合并的分裂周期。
[0035]圖21表明，曼森血吸蟲(S.mansoni)感染的小鼠中的IFN-Y產(chǎn)生減少。
[0036]圖22表明，具有慢性血吸蟲病的小鼠中的IL-4水平增加。
[0037]圖23表明，被曼森血吸蟲感染的小鼠中的IL-10產(chǎn)生增加。
[0038]圖24表明，血吸蟲感染不會(huì)改變針對(duì)免疫顯性CTL和輔助表位的抗原特異性的疫
苗應(yīng)答。
【具體實(shí)施方式】
[0039]新穎的且迄今未開發(fā)的用途是，建立沒有外源性抗原的、活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。
[0040]新穎的且迄今未開發(fā)的用途是，建立沒有抗原的、活的減毒的李斯特菌屬疫苗株，這使得所述李斯特菌屬能夠僅分泌非溶血形式的LLO(Lm-LLO)或截短的ActA(Lm-ActA)作為佐劑。本文中提供的發(fā)明實(shí)現(xiàn)了第一種活佐劑。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了在受試者中重建免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟:給所述受試者施用活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含`編碼含PEST多肽的第一開放讀碼框。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬過表達(dá)所述含PEST多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了在受試者中促進(jìn)細(xì)胞毒性治療后的免疫應(yīng)答恢復(fù)的方法，所述方法包括給所述受試者施用活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼含PEST多肽的第一開放讀碼框。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步驟:給受試者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌屬的佐劑，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了在受試者中以不依賴于抗原的方式增強(qiáng)對(duì)疾病的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述受試者施用基于李斯特菌屬的佐劑。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了用于生物工程改造活Lm細(xì)菌的組合物和方法，所述活Lm細(xì)菌感染特定細(xì)胞(包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)、肝巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮、骨髓和其它)以及諸如實(shí)體瘤和脾等結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在需要并使用佐劑來刺激免疫應(yīng)答的情況下，所述活Lm佐劑隨后在原位合成和分泌經(jīng)修飾的LLO片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述活Lm合成ActA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不同于以前的佐劑，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在原位制備佐劑的能力，且不涉及免疫佐劑的全身性施用。
[0047]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了在新生兒受試者中引起成年人水平的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟:給所述受試者施用重組李斯特菌屬疫苗株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼非溶血性李斯特菌溶血素O(LLO)或ActA的第一開放讀碼框，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放讀碼框，其中所述代謝酶補(bǔ)充在所述重組李斯特菌屬菌株的染色體中缺少的內(nèi)源基因。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了在受試者中促進(jìn)細(xì)胞毒性治療后的免疫應(yīng)答恢復(fù)的方法，所述方法包括給所述受試者施用重組李斯特菌屬疫苗株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼非溶血性李斯特菌溶血素O或ActA的第一開放讀碼框 ，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放讀碼框，其中所述代謝酶補(bǔ)充在所述重組李斯特菌屬菌株的染色體中缺少的內(nèi)源基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是成年人受試者。
[0049]佐劑的增加對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的能力通常表現(xiàn)為免疫介導(dǎo)的保護(hù)的顯著增加。例如，體液免疫的增加通常表現(xiàn)為針對(duì)抗原產(chǎn)生的抗體的滴度的顯著增加，且T-細(xì)胞活性的增加通常表現(xiàn)為增加的細(xì)胞增殖、增加的細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或抗原特異性的細(xì)胞裂解活性。佐劑也可以改變免疫應(yīng)答，例如，通過實(shí)現(xiàn)針對(duì)持久的Th2表型背景的Thl應(yīng)答。
[0050]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防疾病、治療疾病和給人受試者接種疫苗的方法和組合物。
[0051]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及增強(qiáng)人、新生兒或由于癌癥而已經(jīng)經(jīng)歷細(xì)胞毒性治療的人的免疫應(yīng)答。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方案中，基于李斯特菌屬的佐劑表示活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基于李斯特菌屬的佐劑是Lm-LLO或Lm-ActA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Lm-LLO表達(dá)非溶血性LLO。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Lm-ActA表達(dá)截短的ActA蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Lm-LLO或Lm-ActA可以單獨(dú)使用，或者與其中佐劑為適當(dāng)?shù)娜我獐煼?lián)合使用，且可以用于通常不使用佐劑的場合，諸如化學(xué)療法或放射療法。
[0053]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的李斯特菌屬菌株還包含編碼代謝酶的第三開放讀碼框。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝酶是氨基酸代謝酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述由第二開放讀碼框編碼的代謝酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述由第三開放讀碼框編碼的代謝酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝酶由dal基因編碼，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述dal基因得自枯草芽孢桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝酶由dat基因編碼。
[0055]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組李斯特菌屬是減毒的營養(yǎng)缺陷型菌株。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述減毒的菌株是Lmdd。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述減毒的菌株是Lmdda。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述減毒的菌株是Lm Λ PrfA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述減毒的菌株是LmAPlcB。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述減毒的菌株是Lm Λ PlcA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述減毒的菌株是LmddA Δ inlC。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述LmddA Δ inlC突變株使用Lm的E⑶菌株產(chǎn)生，后者不同于背景菌株10403S，即Lm dal datactA(LmddA)的親本菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該菌株發(fā)揮強(qiáng)佐劑作用，后者是基于李斯特菌屬的疫苗的固有性質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該菌株從EGD李斯特菌屬骨架構(gòu)建得到。
[0057]在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的菌株是表達(dá)非溶血性LLO的李斯特菌屬菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬菌株是PrfA突變體、ActA突變體、plcB缺失突變體、或缺少PlcA和plcB的雙重突變體。所有這些李斯特菌屬菌株被涵蓋用于本文提供的方法中。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案。[0058]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LmddAA inlC突變株可安全地用于人類，并誘導(dǎo)高水平的先天性免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述inlC缺失突變體產(chǎn)生非抗原特異性的增強(qiáng)水平的先天性免疫應(yīng)答。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，李斯特菌屬向鄰近細(xì)胞的易位通過2個(gè)單獨(dú)的機(jī)制受到抑制:actA和inlC基因(它們二者都涉入該過程)的缺失，由此導(dǎo)致意外高水平的減毒、增加的免疫原性和作為疫苗骨架的實(shí)用性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，李斯特菌屬向鄰近細(xì)胞的易位通過2個(gè)單獨(dú)的機(jī)制受到抑制:actA或inlC基因(它們二者都涉入該過程)的缺失，由此導(dǎo)致意外高水平的減毒、增加的免疫原性和作為疫苗骨架的實(shí)用性。
[0060]內(nèi)化蛋白與增加的毒力有關(guān)，且它們的存在與李斯特菌屬的增加的免疫原性有關(guān)，但是，在本發(fā)明中，切除inlC基因會(huì)增加本文中提供的李斯特菌屬疫苗載體的免疫原性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了下述新穎性:從缺失actA的載體切離inlC基因，由此除去下述兩種能力，形成肌動(dòng)蛋白鞭毛(其為穿過宿主細(xì)胞膜移動(dòng)和進(jìn)入鄰近細(xì)胞所必需)的能力，和形成跨膜通道的能力。因此，這2種缺失的組合會(huì)產(chǎn)生李斯特菌屬疫苗載體與野生型李斯特菌屬菌株或單個(gè)突變株相比降低的毒力和增加的免疫原性的驚人結(jié)果。
[0061]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的核酸分子會(huì)整合進(jìn)李斯特菌屬基因組中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子是在本文也提供的重組李斯特菌屬疫苗株的質(zhì)粒中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在不存在抗生素選擇的情況下，本文提供的質(zhì)粒會(huì)穩(wěn)定地維持在重組李斯特菌屬疫苗株中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒不會(huì)給所述重組李斯特菌屬賦予抗生素抗性。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的重組李斯特菌屬菌株是減毒菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組李斯特菌屬缺少ActA毒力基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組李斯特菌屬缺少PrfA毒力基因。
[0063]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組李斯特菌屬疫苗株包含佐劑，其中所述佐劑是李斯特菌溶血素O。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組李斯特菌屬疫苗株包含佐劑，其中所述佐劑是ActA。
[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬疫苗株是LmddAinlC142菌株。LmddAinlC142是基于這樣的李斯特菌屬疫苗載體:其由于inlC基因的缺失而減毒，且通過dal基因的互補(bǔ)而保留用于PSA體內(nèi)和體外表達(dá)的質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LmddAinlC142引起強(qiáng)烈的且抗原特異性的抗腫瘤應(yīng)答，具有破壞受試者中對(duì)異種抗原的耐受性的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述LmddAinlC142菌株是高度減毒的，且具有比以前的李斯特菌屬疫苗代更好的安全性譜，因?yàn)樗杆俚貜谋幻庖叩男∈蟮钠⑶宄?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LmddAinlC142菌株是高度免疫原性的，能夠破壞對(duì)異種抗原的耐受性，并在受試者中防止腫瘤形成。
[0065]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的方法還提供了克服或“破壞”對(duì)作為自體抗原的異種抗原的耐受性的方法。這樣的抗原可以由多種腫瘤異常地表達(dá)，使用本文提供的方法和組合物對(duì)所述腫瘤進(jìn)行在本發(fā)明的范圍內(nèi)的治療或預(yù)防。
[0066]在一個(gè)實(shí)施方案中，與其它治療模式相組合的、表達(dá)李斯特菌溶血素O的重組的減毒的不含抗生素的李斯特菌屬可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，以及用于預(yù)防和治療癌癥或?qū)嶓w瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單獨(dú)的或與其它治療劑相組合的、表達(dá)李斯特菌溶血素O的重組的減毒的不含抗生素的李斯特菌屬可用于預(yù)防和治療受試者的感染性疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是新生兒、兒童或成年人。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，與其它治療模式相組合的、表達(dá)ActA的重組的減毒的不含抗生素的李斯特菌屬可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，以及用于預(yù)防和治療癌癥或?qū)嶓w瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單獨(dú)的或與其它治療劑組合的、表達(dá)ActA的重組的減毒的不含抗生素的李斯特菌屬可用于預(yù)防和治療受試者的感染性疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是新生兒、兒童或成年人。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中 ，由本文提供的方法和組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是治療性免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它是預(yù)防性免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與本領(lǐng)域可用于在罹患本文提供的病癥的受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法相比，它是增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答會(huì)導(dǎo)致折磨受試者的本文提供的疾病的清除。
[0069]應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法可以用于治療任何傳染性疾病，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述傳染性疾病是細(xì)菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于抑制或遏制受試者的細(xì)菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中引起針對(duì)細(xì)菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它們的組合的細(xì)胞毒性的T-細(xì)胞應(yīng)答的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在Thl無應(yīng)答的受試者中誘導(dǎo)針對(duì)細(xì)菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它們的組合的Thl免疫應(yīng)答的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述感染是病毒感染，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒是HIV。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述感染是細(xì)菌感染，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌是分枝桿菌屬，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌感染是結(jié)核病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述感染是真核生物感染，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核生物是瘧原蟲屬，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核生物感染是瘧疾。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了在具有伴隨性蠕蟲感染的Thl無應(yīng)答的受試者中誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答的方法，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用李斯特菌屬疫苗載體。
[0071]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括給受試者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌屬的佐劑，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法能夠治療所述疫苗對(duì)其具有特異性的疾病。
[0072]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了以不依賴于抗原的方式增強(qiáng)對(duì)疾病的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給受試者施用基于李斯特菌屬的佐劑。
[0073]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基于李斯特菌屬的佐劑是表達(dá)LLO的李斯特菌屬菌株或LLO蛋白或其非溶血片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基于李斯特菌屬的佐劑是表達(dá)ActA的李斯特菌屬菌株或ActA蛋白或其截短片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基于李斯特菌屬的佐劑單獨(dú)使用，或者與其它佐劑相組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它佐劑是非核酸佐劑，包括鋁佐劑、弗氏佐劑、MPLj^U、GM-CSF, QS21、SBAS2，含有CpG的寡核苷酸，編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的核苷酸分子，所述佐劑是或包含細(xì)菌促分裂原或細(xì)菌毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述LLO蛋白或其溶血片段與所述疫苗混合或者化學(xué)偶聯(lián)。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗選自:乙型肝炎病毒血液-衍生的疫苗、乙型肝炎病毒基因工程蛋白疫苗、HBV病毒載體疫苗、乙型肝炎病毒細(xì)菌載體疫苗、乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因植物疫苗、狂犬病病毒血液-衍生的疫苗、狂犬病病毒基因工程蛋白疫苗、狂犬病病毒載體疫苗、狂犬病病毒細(xì)菌載體疫苗和狂犬病病毒轉(zhuǎn)基因植物疫苗，且所述DNA疫苗選自:乙型肝炎病毒DNA疫苗和狂犬病DNA疫苗。
[0075]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基于李斯特菌屬的佐劑單獨(dú)使用，或者與其它佐劑相組合。
`[0076]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑與其它佐劑共同施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法和組合物中使用的其它佐劑是，在另一個(gè)實(shí)施方案中，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含GM-CSF蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是編碼GM-CSF的核苷酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含編碼GM-CSF的核苷酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是皂苷QS21。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含皂苷QS21。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是單磷酰脂質(zhì)A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含單磷酰脂質(zhì)A。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是SBAS2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含SBAS2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是免疫刺激性細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含免疫刺激性細(xì)胞因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的核苷酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑包含編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的核苷酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是或包含羽管糖苷(quill glycoside)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是或包含細(xì)菌促分裂原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是或包含細(xì)菌毒素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述佐劑是或包含本領(lǐng)域已知的任意其它佐劑。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案。
[0077]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了核酸分子，其編碼本發(fā)明的佐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子被用于轉(zhuǎn)化李斯特菌屬，以便獲得重組李斯特菌屬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的用于轉(zhuǎn)化李斯特菌屬的核酸缺少毒力基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，整合進(jìn)李斯特菌屬基因組中的核酸分子攜帶無功能的毒力基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒力基因在重組李斯特菌屬中發(fā)生突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述核酸分子將存在于李斯特菌屬基因組中的內(nèi)源基因滅活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒力基因是ActA基因、inlC基因或PrfA基因。技術(shù)人員會(huì)理解，所述毒力基因可以是本領(lǐng)域已知的與重組李斯特菌屬的毒力有關(guān)的任何基因。[0078]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述李斯特菌屬菌株的染色體中缺少所述代謝基因、所述毒力基因等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述李斯特菌屬菌株的染色體中和任意附加型遺傳元件中缺少所述代謝基因、所述毒力基因等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述毒力菌株的基因組中缺少所述代謝基因、所述毒力基因等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒力基因在染色體中發(fā)生突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒力基因從染色體缺失。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案。
[0079]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的核酸和質(zhì)粒不會(huì)給重組李斯特菌屬賦予抗生素抗性。
[0080]在另一個(gè)實(shí)施方案中，“核酸分子”表示質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語表示整合載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語表示包含整合載體的質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述整合載體是位點(diǎn)特異性的整合載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物的核酸分子由本領(lǐng)域已知的任意類型的核苷酸組成。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案。
[0081]在另一個(gè)實(shí)施方案中，“代謝酶”表示，在宿主細(xì)菌需要的營養(yǎng)物的合成中涉及的酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語表示宿主細(xì)菌需要的營養(yǎng)物的合成所需的酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語表示在宿主細(xì)菌所利用的營養(yǎng)物的合成中涉及的酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語表示在宿主細(xì)菌的持續(xù)生長所需的營養(yǎng)物的合成中涉及的酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶是營養(yǎng)物的合成所必需的。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案。
[0082]在另一個(gè)實(shí)施方案中，“穩(wěn)定地維持”表示，在不存在選擇(例如抗生素選擇)的情況下，核酸分子或質(zhì)粒維持10代，而沒有可檢測的丟失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是15代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是20代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是25代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是30代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是40代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是50代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是60代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是80代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是100代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是150代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是200代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是300代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是500代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述時(shí)段是很多代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子或質(zhì)粒在體外(例如在培養(yǎng)物中)穩(wěn)定地維持。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子或質(zhì)粒在體內(nèi)穩(wěn)定地維持。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子或質(zhì)粒在體外和在體內(nèi)穩(wěn)定地維持。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案。
[0083]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的方法和組合物的代謝酶是氨基酸代謝酶，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝酶是D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝酶會(huì)催化在重組李斯特菌屬菌株中用于細(xì)胞壁合成的氨基酸的形成，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。
[0084]在另一個(gè)實(shí)施方案中，在李斯特菌屬p60啟動(dòng)子控制下，表達(dá)編碼所述代謝酶的基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用inlA(編碼內(nèi)化蛋白)啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用hly啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用ActA啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在任意其它革蘭氏陽性的啟動(dòng)子控制下，表達(dá)所述整合酶基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在任意其它在李斯特菌屬中起作用的啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)編碼所述代謝酶的基因。技術(shù)人員會(huì)明白，可以使用其它啟動(dòng)子或多順反子表達(dá)盒來驅(qū)動(dòng)所述基因的表達(dá)。每種可能性代表本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案。
[0085]在一個(gè)實(shí)施方案中，在本文提供的方法和組合物中使用的LLO是李斯特菌的L0。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于衍生出LLO的李斯特菌屬是單核細(xì)胞增生李斯特菌(Lm)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬是伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述李斯特菌屬是威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述李斯特菌屬是斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LLO蛋白由在(SEQ ID NO:1)中闡述的下述核酸序列編碼。
【權(quán)利要求】
1.一種在受試者中重建免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟:給所述受試者施用活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼含PEST多肽的第一開放讀碼框。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述李斯特菌屬過表達(dá)所述含PEST多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬包含基因組內(nèi)化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突變或缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放讀碼框，其中所述代謝酶補(bǔ)足在所述重組李斯特菌屬菌株的染色體中缺少的內(nèi)源基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述李斯特菌屬還包含編碼代謝酶的第三開放讀碼框。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中由所述第二開放讀碼框編碼的所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中由所述第三開放讀碼框編碼的所述代謝酶是D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌屬基因組內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述核酸分子在質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒在不存在抗生素選擇的情況下穩(wěn)定地維持在所述重組李斯特菌屬疫苗株中。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬菌株已經(jīng)通過動(dòng)物宿主進(jìn)行傳代。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者是成年人或兒童。
14.一種在受試者中促進(jìn)細(xì)胞毒性治療后的免疫應(yīng)答恢復(fù)的方法，所述方法包括給所述受試者施用活的減毒的李斯特菌屬疫苗株。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述李斯特菌屬菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼含PEST多肽的第一開放讀碼框。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述李斯特菌屬過表達(dá)所述含PEST多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬包含基因組內(nèi)化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突變或缺失。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放讀碼框，其中所述代謝酶補(bǔ)足在所述重組李斯特菌屬菌株的染色體中缺少的內(nèi)源基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述李斯特菌屬還包含編碼代謝酶的第三開放讀碼框。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中由所述第二開放讀碼框編碼的所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中由所述第三開放讀碼框編碼的所述代謝酶是D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌屬基因組內(nèi)。
24.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述核酸分子在質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒在不存在抗生素選擇的情況下穩(wěn)定地維持在所述重組李斯特菌屬疫苗株中。
25.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬菌株已經(jīng)通過動(dòng)物宿主進(jìn)行傳代。
26.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受試者是成年人或兒童。
27.一種提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步驟:給受試者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌屬的佐劑，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑是李斯特菌屬菌株，所述菌株包含含有第一開放讀碼框的核酸分子，所述第一開放讀碼框表達(dá)含PEST多肽或其片段。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述李斯特菌屬過表達(dá)所述含PEST多肽或其片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述李斯特菌屬菌株包含基因組內(nèi)化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、`PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突變或缺失。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述核酸分子包含編碼代謝酶的第二開放讀碼框，其中所述代謝酶補(bǔ)足在所述重組李斯特菌屬菌株的染色體中缺少的內(nèi)源基因。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述李斯特菌屬還包含編碼代謝酶的第三開放讀碼框。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中由所述第二開放讀碼框編碼的所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中由所述第三開放讀碼框編碼的所述代謝酶是D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。
36.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌屬基因組內(nèi)。
37.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述核酸分子在質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒在不存在抗生素選擇的情況下下穩(wěn)定地維持在所述重組李斯特菌屬疫苗株中。
38.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬菌株已經(jīng)通過動(dòng)物宿主進(jìn)行傳代。
39.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述受試者是成年人或兒童。
40.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑單獨(dú)使用，或者與其它佐劑相組合。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述其它佐劑是非核酸佐劑，包括鋁佐劑、弗氏佐劑、10^、乳劑、61^3?、0321、38432，含有CpG的寡核苷酸，編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的核苷酸分子，所述佐劑是或包含細(xì)菌促分裂原或細(xì)菌毒素。
42.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述方法能夠治療所述疾病。
43.一種在受試者中以不依賴于抗原的方式增強(qiáng)對(duì)疾病的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述受試者施用基于李斯特菌屬的佐劑。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑是李斯特菌屬菌株，所述菌株包含含有第一開放讀碼框的核酸分子，所述第一開放讀碼框表達(dá)含PEST多肽或其片段。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述李斯特菌屬過表達(dá)所述含PEST多肽或其片段。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述李斯特菌屬菌株包含基因組內(nèi)化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突變或缺失。
48.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述核酸分子包含編碼代謝酶的第二開放讀碼框，其中所述代謝酶補(bǔ)足在所述重組李斯特菌屬菌株的染色體中缺少的內(nèi)源基因。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述李斯特菌屬還包含編碼代謝酶的第三開放讀碼框。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中由所述第二開放讀碼框編碼的所述代謝酶是丙氨酸消旋酶。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中由所述第三開放讀碼框編碼的所述代謝酶是D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。
52.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌屬基因組內(nèi)。
53.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述核酸分子在質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒在不存在抗生素選擇的情況下穩(wěn)定地維持在所述重組李斯特菌屬疫苗株中。
54.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬菌株已經(jīng)通過動(dòng)物宿主進(jìn)行傳代。
55.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述受試者是成年人或兒童。
56.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述基于李斯特菌屬的佐劑單獨(dú)使用，或者與其它佐劑相組合。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述其它佐劑是非核酸佐劑，包括鋁佐劑、弗氏佐劑、10^、乳劑、61^3?、0321、38432，含有CpG的寡核苷酸，編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的核苷酸分子，所述佐劑是或包含細(xì)菌促分裂原或細(xì)菌毒素。
58.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述方法能夠治療所述疾病。
【文檔編號(hào)】A61K39/02GK103687611SQ201280022705
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月11日
【發(fā)明者】J·羅思曼 申請(qǐng)人:阿德瓦希斯公司