調(diào)節(jié)表觀遺傳dna甲基化以導(dǎo)致細(xì)胞采取與年輕細(xì)胞相關(guān)的dna甲基化模式的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種外用組合物，其包括：(a)來自稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基；(b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑；以及(c)皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑。當(dāng)本發(fā)明的所述組合物局部用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，能夠?qū)NA的表觀遺傳甲基化發(fā)揮作用，使得甲基化狀態(tài)被調(diào)節(jié)以具有較年輕細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)的較多的特征和模式。
【專利說明】調(diào)節(jié)表觀遺傳DNA甲基化以導(dǎo)致細(xì)胞采取與年輕細(xì)胞相關(guān)
的DNA甲基化模式
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在控制人體皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化方面有效的組合物。更具體地，本發(fā)明涉及外用組合物，該組合物含有來自禾本科植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，以及涉及制造這些組合物的方法和使用這些組合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物是地球上的生物體中唯一能夠從老的植物的單個(gè)細(xì)胞長出新的植物的生物體。培育這樣的植物細(xì)胞的方法被稱為植物組織培養(yǎng)，并自1900年代初期以來就是公知的了。
[0003]植物細(xì)胞培養(yǎng)物已用于局部應(yīng)用。例如:US2008/0299092A1公開了為了影響皮膚干細(xì)胞的健康的目的的、來自于蘋果的分化的植物細(xì)胞在化妝品制備中的用途。同樣，EP1736167A2 公開了富含韋伯思科斯(verboscosides)的歐丁香(Syringa vulgaris)的植物細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基的以提供對(duì)皮膚的抗氧化的影響的局部應(yīng)用。US2007/0015252A1公開了來自含有類苯基丙烷的匍匐筋骨草(Ajuga reptans)的植物培養(yǎng)物的局部應(yīng)用，該類苯基丙烷提供給提取物高含量的抗氧化劑。美國專利N0.6551625公開了來自丹參(Salviamiltiorrhiza)的作為懸浮培養(yǎng)物培育的未分化的植物細(xì)胞可以用在化妝品及局部應(yīng)用中，以幫助防止體臭形成。EP2133323A1公開了培育積雪草(Centella asiatica)作為用于生產(chǎn) 3，5- 二咖啡酰-4-丙二酰奎尼酸(3，5-dicaffeoyl-4-malonylquinic acid)的組織培養(yǎng)物，3，5- 二咖啡酰-4-丙二酰奎尼酸在皮膚化妝品中使用時(shí)，會(huì)有金屬蛋白酶的抑制活性。
[0004]然而，迄今為止，就 申請(qǐng)人:所知，沒有現(xiàn)有技術(shù)披露了由植物細(xì)胞培養(yǎng)物制造的用于影響皮膚細(xì)胞中的表觀遺傳的DNA或染色質(zhì)甲基化的任何局部治療物。
[0005]表觀遺傳學(xué)是研究由與DNA序列變化的機(jī)制不同的機(jī)制導(dǎo)致的基因表達(dá)中的遺傳變化的學(xué)科。改變基因的活性而不改變DNA序列并且還能被傳遞給子細(xì)胞的任何修飾都被視為表觀遺傳修飾。即使DNA序列沒有變化，表觀遺傳變化也能傳遞到子細(xì)胞，并可能持續(xù)多代。表觀遺傳因素和表觀遺傳變化已經(jīng)被證明在細(xì)胞的分化、發(fā)育、衰老和疾病方面發(fā)揮重要作用(Cropley et al., 2006; Weaver et al., 2006; Rakyan et al.，2003)。
[0006]已證明在整體水平和基因特異水平兩方面的DNA甲基化在表觀遺傳記憶方面都發(fā)揮重要的作用；已證明DNA甲基化的變化與年齡有關(guān)(Gopisetty et al., 2006; Ottavianoet al., 1994; Feng et al., 2006; Boks et al., 2009) ? 有關(guān)表觀遺傳變化的 DNA 甲基化發(fā)生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶-5上。甲基基團(tuán)連接到胞嘧啶堿基上，胞嘧啶堿基再連接到鳥嘌呤二核苷酸堿基上。其中P代表與C和G連接在一起的磷酸酯(phosphate)。這有助于從CG堿基對(duì)分化出CpG。DNA甲基化也可以發(fā)生在CpA位點(diǎn)、CpT位點(diǎn)和CpC位點(diǎn)，但目前由于生物和技術(shù)的原因，與胞嘧啶甲基化和基因轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)中的多數(shù)來自CpG數(shù)據(jù)。
[0007]基因的CpG富集啟動(dòng)子區(qū)域(稱為CpG島)的堿基化已被識(shí)別為是在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面的重要機(jī)理(Metivier et al., 2008; Bird, 2002) XpG 島已由 Takai 和 Jones (2002)定義為GC含量大于55%的200個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域。人類啟動(dòng)子中有約70%的CpG島(Saxonovet al., 2006) 0基因啟動(dòng)子區(qū)域是基因的上游的DNA的區(qū)域，在這里RNA聚合酶初始結(jié)合以開始基因的轉(zhuǎn)錄。CpG島除了與啟動(dòng)子相關(guān)聯(lián)外，還與管家基因連接。通常在正常細(xì)胞中CpG島未甲基化，從而使得轉(zhuǎn)錄機(jī)理適用于DNA。在某些疾病中以及在老化情況下，CpG島會(huì)異常地甲基化，不能調(diào)節(jié)通常的基因轉(zhuǎn)錄活性。甲基化在CpG 二核苷酸的兩條鏈上的胞嘧啶殘基上都對(duì)稱地發(fā)生。早在胚胎發(fā)育過程中，在有機(jī)體中就進(jìn)行DNA甲基化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，約70-80%的CpG位點(diǎn)甲基化，但CpG位點(diǎn)和其甲基化程度在基因組中的分布是不均勻的(Bird等，1985)。CpG位點(diǎn)主要在人類基因的約70的啟動(dòng)子中被發(fā)現(xiàn)(Saxonov等，2006)，并且這些位點(diǎn)傾向于不會(huì)被甲基化。當(dāng)啟動(dòng)子中的CpG島甲基化時(shí)，這將導(dǎo)致抑制相鄰基因的轉(zhuǎn)錄。被表達(dá)的基因通常顯示在其啟動(dòng)子區(qū)域有低甲基化，并且在其基因體中有高甲基化(Ball等，2009)。DNA甲基化被推定改變?nèi)旧|(zhì)的密度和DNA對(duì)細(xì)胞機(jī)制的可親性(accessibility),從而影響相關(guān)DNA序列的轉(zhuǎn)錄潛力。[0008]在特定的細(xì)胞中，特定基因的DNA甲基化水平隨著時(shí)間的推移而變化。這正如當(dāng)將不同類型的細(xì)胞(如人類多能干細(xì)胞和體細(xì)胞)進(jìn)行比較時(shí)DNA甲基化水平的變化(Denget al., 2009) 0同卵(相同)雙胞胎具有相同的基因型，因?yàn)樗鼈儊碜酝皇芫?。研究表明，表觀遺傳修飾模式隨著同卵雙胞胎長大而在他們中出現(xiàn)差別，這表明，在通過連續(xù)的細(xì)胞分裂而傳遞表觀遺傳信息方面的小缺陷可能發(fā)生(Fraga et al.，2005)。該過程被稱為“表觀遺傳漂移”，其與年齡相關(guān)。對(duì)雙胞胎的研究估計(jì)，遺傳因素只決定人類壽命變化中的20-30%。變化中的其余70-80%是由于環(huán)境和其他非遺傳因素決定的(Fraga etal., 2005;Mitchell et al., 2001;Herskind et al., 1996;Poulsen et al.，2007)。
[0009]影響DNA甲基化的方法是已知的。例如，美國專利N0.7，790，746中公開了使用不同的喹啉衍生物抑制DNA甲基化的方法。然而，該專利沒有公開使用植物中提取的活性成分作為手段影響DNA甲基化，特別是基因的啟動(dòng)子的DNA甲基化。
[0010]目前在化妝品界所需要的是通過影響與哺乳動(dòng)物(尤其是人類)的皮膚細(xì)胞的老化相關(guān)聯(lián)的各種關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化而改善老化皮膚的特征的成分。本發(fā)明為該需求提供了答案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于控制人類皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化的外用組合物，其包括:(a)來自稻屬(genus oryza)植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(即植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)，(b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑；以及(C)皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑。
[0012]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種組合物濃縮物，其包含:(a)來自稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(即植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)，和(b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑，其中按重量計(jì)，組分(a)以所述組合物濃縮物的介于0.0000001 %至99%之間的量存在，優(yōu)選以介于90%到99%之間、更優(yōu)選以介于97%至99%之間的量存在；并且按重量計(jì)，組分(b)以所述組合物濃縮物的介于
0.01%至10%之間的量存在，更優(yōu)選以介于0.1%至5%之間、并且最優(yōu)選以介于0.4%至2%之間的量存在。
[0013]在又一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于制備上述外用組合物的方法。該方法包括以下步驟:(i)提供來自于稻屬植物的全能性的、未分化的植物細(xì)胞；(ii)使所述植物細(xì)胞在存在或不存在化學(xué)的、氣體的、或能量的應(yīng)激的情況下，在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn)生含有水溶性組分和水不溶性組分的混合物，所述應(yīng)激用于得到次級(jí)植物細(xì)胞代謝物的表達(dá)；
(iii)除去所述水不溶性組分，以產(chǎn)生所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(即植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物);以及(iv)使所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(即植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)與防腐劑以及皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑混合，從而制造出所述外用組合物。
[0014]在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于控制在人類皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化的方法。該方法包括使皮膚與本發(fā)明所述的外用組合物接觸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是臭氧應(yīng)激型分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)的HPLC色譜。
[0016]圖2是非臭氧應(yīng)激型稻米(rice)分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)的HPLC色譜圖。
[0017]圖3是示出本發(fā)明的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)對(duì)在體外生長的成纖維細(xì)胞的基因啟動(dòng)子的全基因組范圍的甲基化水平的影響的曲線圖。
[0018]圖4是示出本發(fā)明的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)對(duì)在體外生長的成纖維細(xì)胞的膠原蛋白IAl基因啟動(dòng)子的甲基化水平的影響的曲線圖。
[0019]圖5是示出本發(fā)明的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)對(duì)在體外生長的成纖維細(xì)胞的膠原蛋白1A2基因啟動(dòng)子的甲基化水平的影響的曲線圖。
[0020]圖6是示出本發(fā)明的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)對(duì)在體外生長的成纖維細(xì)胞的膠原蛋白IA的蛋白水平的影響的曲線圖。
[0021]圖7是示出本發(fā)明的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)對(duì)在體外生長的成纖維細(xì)胞的皮連蛋白(dermatopontin)表達(dá)的影響的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)局部應(yīng)用于人體皮膚細(xì)胞時(shí)，植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)，特別是那些來自于禾本科(poaceae)，優(yōu)選稻屬(Oryza),更優(yōu)選為水稻種(species sativa)的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基,諸如,例如成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞等可以調(diào)節(jié)在年輕的哺乳動(dòng)物皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化并且更具體地在內(nèi)在地和外在地老化的哺乳動(dòng)物皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化，尤其是在基因的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化。經(jīng)處理的細(xì)胞顯示DNA甲基化模式有在年輕的、未老化的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的那些特征。含有這些植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基的外用組合物對(duì)于在人和獸醫(yī)治療中使用以及用于營養(yǎng)和美容的目的是特別有利的。
[0023]因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于控制人體皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化的外用組合物，該組合物包括:(a)來自稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)，(b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑，以及(C)皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑。
[0024]與本發(fā)明的上述外用組合物相關(guān)聯(lián)，按重量計(jì)，組分(a)以所述組合物的介于0.0000001%至99%之間的量存在，優(yōu)選以介于0.0001%至50%之間、更優(yōu)選以介于
0.001%至25%之間、并且最優(yōu)選以介于0.01%至10%之間的量存在；按重量計(jì)，組分(b)以所述組合物的介于0.0I %至10 %之間的量存在，更優(yōu)選以介于0.1 %至5 %之間、并且最優(yōu)選以介于0.4%至2%之間的量存在；且按重量計(jì)，組分(c)以所述組合物的介于1%至98 %之間的量存在，并且最優(yōu)選以介于80 %至90 %之間的量存在。
[0025]組分(a)，一種適合用于本發(fā)明的外用組合物中的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)，其來自稻屬植物，優(yōu)選來自植物水稻。
[0026]植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)可以通過包含下述步驟的方法制備:(i)使來自于稻屬植物的分生組織在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn)生含有水溶性組分和水不溶性組分的混合物，以及(ii)除去所述水不溶性成分，由此產(chǎn)生所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)。
[0027]產(chǎn)生植物分生組織培養(yǎng)基的方法在本領(lǐng)域中是已知的。通常情況下，先將植物滅菌，然后將分生組織從植物上切下，并放置在固態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基上，以便從分生組織形成未分化的愈傷組織。
[0028]固態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基通常對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。在一種實(shí)施方式中，它們包含諸如Murashige & Skoog培養(yǎng)基、鹿糖、Gamborg維生素、生長激素(例如IAA)、激動(dòng)素和瓊脂等成分。
[0029]就本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選將由分生組織形成的愈傷組織作為未分化的細(xì)胞保持。在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，相對(duì)于激動(dòng)素，較高水平的植物生長素有利于生根，反之則可導(dǎo)致芽的形成，并且中等水平的植物生長素則導(dǎo)致愈傷組織的增殖。因此，應(yīng)保持在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長素和激動(dòng)素的水平，以便只產(chǎn)生未分化的細(xì)胞。
[0030]分生組織在固體培養(yǎng)基中生長一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，通過將其分割和轉(zhuǎn)移到新的固體培養(yǎng)基上，傳代培養(yǎng)愈傷組織。優(yōu)選地，該處理至少重復(fù)幾次，以獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。如本文所使用的，穩(wěn)定的細(xì)胞系是指具有恒定的性狀、產(chǎn)生可繁殖量的活性成分、以恒定的速率生長、并且在多代之后看起來相同的細(xì)胞。通常情況下，穩(wěn)定的培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中隨著時(shí)間的推移不會(huì)有什么變化，并且繁殖物將不會(huì)有什么變化。
[0031]如本領(lǐng)域技術(shù) 人員所知道的，組織培養(yǎng)可以產(chǎn)生克隆變種。在愈傷組織或植物組織內(nèi)，細(xì)胞中有自然變異。這種體細(xì)胞無性系變異取決于細(xì)胞群的預(yù)先存在的或經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)的變異。這種變異可能是遺傳的或表觀遺傳的。愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物中的這些變化對(duì)于從懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)次級(jí)代謝活性物有顯著的益處。因此，基于本發(fā)明的目的，選擇生長速度快、有穩(wěn)定的性狀(如顏色和大小)、生長速率恒定及有其他相關(guān)品質(zhì)的傳代培養(yǎng)細(xì)胞系。
[0032]被確定為穩(wěn)定的細(xì)胞系后，來自固體培養(yǎng)基上的細(xì)胞，即，全能性的、未分化的植物細(xì)胞，被接種到液態(tài)營養(yǎng)基中。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，該液態(tài)營養(yǎng)基是公知的。其包含諸如Murashige & Skoog培養(yǎng)基、鹿糖、Gamborg維生素、如IAA之類的生長素、以及激動(dòng)素等要素成分。
[0033]在一種實(shí)施方式中，在存在用于引出次生植物細(xì)胞代謝物的表達(dá)的化學(xué)的、氣體的、或能量應(yīng)激的情況下，能讓細(xì)胞在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。
[0034]雖然可使用各種化學(xué)或能量應(yīng)激來誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，但臭氧是優(yōu)選的應(yīng)激原，因?yàn)橥ㄟ^用于將細(xì)胞保持在反應(yīng)器中的氧氣環(huán)境中的氧氣進(jìn)給源，很容易將臭氧引入細(xì)胞培養(yǎng)物中。
[0035]暴露于臭氧有助于促進(jìn)細(xì)胞合成更多的次級(jí)代謝產(chǎn)物。本發(fā)明的次級(jí)代謝產(chǎn)物包括但不限于:植物生長調(diào)節(jié)劑、植物細(xì)胞因子、黃酮類、類胡蘿卜素、植物留醇、皂甙、芥子油苷、蛋白酶抑制劑、植物雌激素、硫化物、肌醇六酸、生物堿、萜類化合物、甙類、酚類、吩嗪、多酮類化合物、多肽、多酚等。
[0036]在一定的閾值下，來自臭氧的適度應(yīng)激可通過植物補(bǔ)償，導(dǎo)致產(chǎn)生出更多的活性成分。然而，在較高的水平下，重度應(yīng)激的不利影響可能會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。此外，應(yīng)激容限閾值不僅取決于臭氧條件下的應(yīng)激原類型和曝光時(shí)間，而且取決于特定物種植物的應(yīng)激應(yīng)對(duì)能力。優(yōu)化施加到稻米懸浮培養(yǎng)物的臭氧量以獲得特定的應(yīng)激相關(guān)的結(jié)果，這是可能的。可用于本發(fā)明的典型的臭氧水平可以是在0.0001到50mM之間的范圍內(nèi)。更優(yōu)選的臭氧水平是在0.01mM至5mM之間的范圍內(nèi)。最優(yōu)選的臭氧水平是在0.1mM至0.5mM之間的范圍內(nèi)。可以根據(jù)植物的種類、臭氧濃度、曝氣量、溫度等將植物細(xì)胞暴露在臭氧中持續(xù)若干分鐘至若干天。
[0037]另一種監(jiān)測(cè)植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵過程中的氧化應(yīng)激的方法是應(yīng)用臭氧，直到一定數(shù)量的植物 細(xì)胞已經(jīng)死亡。測(cè)量植物細(xì)胞活力的方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是公知的，并且可以包括，例如，MTT法，這是一種比色分析法，其證明有活性的線粒體功能，從而證明是活的細(xì)胞而不是死的細(xì)胞。一種在應(yīng)用臭氧應(yīng)激后優(yōu)選的細(xì)胞存活率計(jì)數(shù)將是50%、更優(yōu)選的水平是75%，最優(yōu)選的水平是80%的植物細(xì)胞存活率。
[0038]市售的用于植物細(xì)胞的臭氧處理的臭氧產(chǎn)生器可以在例如Erwin SanderElektroapparatebau GmbH, Uetze-Eltze (德國)找到。在大多數(shù)情況下，除了臭氧發(fā)生器還使用臭氧檢測(cè)器。合適的臭氧檢測(cè)器能從Dasibi，Glandlae，加利福尼亞得到。
[0039]雖然臭氧在這里被描述作為優(yōu)選的應(yīng)激原，但也可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的其他應(yīng)激原，以誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物。這些應(yīng)激原包括，但不限于，植物生長調(diào)節(jié)劑、植物病原體蛋白質(zhì)、和如幾丁質(zhì)之類的聚合物以及各種形式的外部能量，包括但不限于熱和紫外線輻射。
[0040]允許這些細(xì)胞生長一定長的時(shí)間，直到獲得足夠量的生物量。如果有必要，可以加入新鮮的液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基。在一種實(shí)施方式中，允許細(xì)胞生長到100-400的光密度，在這之后，收獲生物量以及進(jìn)行提取以提供植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基。提取過程對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，例如，可以過濾掉不溶性成分并且所得到的可溶成分為植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)。
[0041]不被任何理論所束縛，據(jù)說通過植物細(xì)胞生長，這些細(xì)胞能通過代謝營養(yǎng)培養(yǎng)基中的化合物并將這些代謝物以及其他各種植物細(xì)胞產(chǎn)生的化合物一起排泄到些該營養(yǎng)培養(yǎng)基中，從而調(diào)整該營養(yǎng)培養(yǎng)基。由于植物組織的最初來源是植物的分生組織，因此，就本專利申請(qǐng)的目的而言，條件培養(yǎng)基被稱為“植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基”。
[0042]如有必要，這樣獲得的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)一步處理，以改善顏色或氣味，或濃縮或甚至完全干燥該產(chǎn)品。
[0043]可以通過將植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)包括在諸如，例如，脂質(zhì)體、尼亞質(zhì)體(niasomes)、聚合質(zhì)體(polymerisomes)、枝狀質(zhì)體(dendrimerosomes)等運(yùn)輸系統(tǒng)中，或通過諸如例如離子電滲療法等滲透增強(qiáng)機(jī)制,而進(jìn)一步提高該培養(yǎng)基的療效。[0044]也可通過在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，諸如例如冷凍式干燥法、噴射式干燥法、帶式干燥法之類的任何方法，去除提取溶劑，而使植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)包括在無水體系中。對(duì)于無水的形式，培養(yǎng)基可以被包括在無水凝膠(諸如，例如，硅酮凝膠)中或在無水粉末(諸如，例如，底粉和粉餅)中。
[0045]植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)適合用于本發(fā)明的外用組合物中。此外，通過額外的植物或微生物發(fā)酵，該條件培養(yǎng)基還可以是用于進(jìn)一步的修飾物的基礎(chǔ)物，其中植物分生組織營養(yǎng)培養(yǎng)基作為二次發(fā)酵營養(yǎng)源加入到正在進(jìn)行的發(fā)酵工藝中。
[0046]本發(fā)明的外用組合物的組分(b)是以相對(duì)于組分(a)(植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑。
[0047]防腐劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，并且可以包括例如以下成分:如有機(jī)酸，諸如，例如，水楊酸或山梨酸；有機(jī)醇，諸如，例如，苯氧乙醇、芐醇、乙二醇和乙醇；四元成分(quaternary ingredients),諸如，例如，季銨-15 ;酶，諸如，例如，組合有底物的葡萄糖氧化酶和乳過氧化物酶，該底物如由Arch Personal Care (南平原鎮(zhèn),新澤西)以Biovert市售的葡萄糖等；或這些防腐劑的組合。
[0048]優(yōu)選的防腐劑選自由水楊酸、山梨酸、苯氧乙醇、芐醇、乙醇、季銨鹽-15、組合有底物的葡萄糖氧化酶和乳過氧化物酶、以及它們的組合組成的群組中。
[0049]應(yīng)以足以作為實(shí)質(zhì)上對(duì)植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)進(jìn)行滅菌的抗生素或作為使植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基保持在使得該培養(yǎng)基中的活體微生物不會(huì)繁殖的狀態(tài)的生物穩(wěn)定劑的濃度向植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基添加防腐劑。確定防腐系統(tǒng)的功效的方法對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員而言是公知的。最常用的防腐效力測(cè)試的方法被稱為挑戰(zhàn)(chalIenge)測(cè)試。在這種測(cè)試方法中，微生物以受控方式被導(dǎo)入液態(tài)植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并被允許在培養(yǎng)基上試驗(yàn)和生長。如果微生物水平在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)減少或保持不變，則認(rèn)為該培養(yǎng)基受到充分保護(hù)，不受微生物污染。
[0050]特別優(yōu)選的防腐劑是苯氧乙醇。
[0051]防腐劑，特別是苯氧乙醇，優(yōu)選以占組合物的至少0.5% (重量)、更優(yōu)選為1.0%(重量)、最優(yōu)選1.2% (重量)的量使用。
[0052]如果所述產(chǎn)品被分離作為固體，則還可能會(huì)要求防腐劑將所述產(chǎn)品保持足夠長久，以便對(duì)所述產(chǎn)品進(jìn)行干燥，并且在干燥過程后防腐劑將保持在粉末狀的該產(chǎn)品中。干燥的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，并且可以包括，例如，噴射式干燥、冷凍式干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥、薄膜式干燥等。特別優(yōu)選的干燥方法是噴射式干燥方法，其例如在US2003/0198682A1 中被公開。
[0053]上面已經(jīng)描述了組分(a)及(b)。本發(fā)明的組合物中的組分(C)是一種皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑。如本文所用的短語“皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑”意指適于外用于皮膚、具有良好的美學(xué)特性、與本發(fā)明的活性成分和任何其他組分兼容、并且不會(huì)造成任何難以處理的安全性或毒性問題的賦形劑。
[0054]賦形劑可以是各種各樣的形式。例如，可用于本發(fā)明的乳狀液的載體，其包括但并不限于，水包油型乳狀液、油包水型乳狀液、水包油包水型乳狀液、以及有機(jī)硅包水包油型乳狀液。這些乳狀液可以涵蓋廣范圍的粘度，例如，從約100厘泊至約200,000厘泊。也可以使用常規(guī)的推進(jìn)劑、利用機(jī)械泵容器或加壓的噴霧器容器以噴霧的形式輸送這些乳狀液。這些載體也可以摩絲的形式輸送。其它適宜的外用載體包括:無水液體溶劑,例如油、醇、有機(jī)娃(例如，礦物油、乙醇、異丙醇、聚二甲基硅氧烷、環(huán)聚二甲基硅氧烷等)；/Κ基單相液體溶劑(例如，水-醇溶劑系統(tǒng))；這些無水和水基單相溶劑的增粘型(例如，其中，溶劑的粘度增大到通過加入適當(dāng)?shù)臉淠z、樹脂、蠟、聚合物、鹽等以形成固體物或半固體物)?？墒褂迷诒景l(fā)明的載體系統(tǒng)中的實(shí)施例在以下四個(gè)參考文獻(xiàn)中有描述:“Sun ProductsFormulary^Cosmetics & Toiletries, 105卷，122 - 139頁(1990年 12月)；“Sun ProductsFormulary，，，Cosmetics & Toiletries, 102 卷，117 - 136 頁(1987 年 3 月)；Figueroa 等的美國專利N0.4，960，764 ;以及Fukuda等的美國專利N0.4，254，105。
[0055]在授權(quán)給Blank等的美國專利N0.5, 605, 894和在授權(quán)給Bissett的美國專利N0.5，681，852中發(fā)現(xiàn)有對(duì)合適的賦形劑的更詳細(xì)的討論。賦形劑也可以是粉末型的外用組合物，諸如，例如，粉末狀粉底。
[0056]此外，本發(fā)明的外用組合物可以可選地包含其他功能性成分，例如，水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)理劑、潤膚劑、蠟、油、聚合物、增粘劑、固定劑、著色劑、濕潤劑、保濕劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、溶劑、香料等，以及活性成分，諸如，例如植物性物質(zhì)(botanicals)、營養(yǎng)素(neutraceuticals)、藥妝品、治療劑、藥劑、抗真菌劑、抗微生物、留體類激素、去頭屑劑、抗粉刺組分、防曬劑、防腐劑等等。
[0057]本發(fā)明的外用組合物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何形式，例如，霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠、乳清劑、皂劑、粘劑、粉末或類似物。組合物可以應(yīng)用于作為免洗型產(chǎn)品或作為擬在應(yīng)用后立即從皮膚清洗掉的產(chǎn)品(這樣的產(chǎn)品包括沐浴液，洗發(fā)液等之類的東西)。
[0058]已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用本發(fā)明的外用組合物可以影響與年齡有關(guān)的遺傳學(xué)改變及延遲和減輕皮膚的老化的某些方面。通過局部應(yīng)用含有植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)組合物，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以以使老化細(xì)胞經(jīng)歷轉(zhuǎn)型并重新獲得他們的更年輕的未老化細(xì)胞所具有的DNA CpG甲基化模式這樣的方式來調(diào)節(jié)DNA甲基化。在基因組水平以及在特定的基因的DNA甲基化模式可以通過應(yīng)用植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)節(jié)?；蚪M和單個(gè)基因的識(shí)別具有可逆的甲基化狀態(tài)，并且植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基可以影響皮膚細(xì)胞的甲基化狀態(tài)，產(chǎn)生新的局部治療機(jī)會(huì)。
[0059]雖然基因組在兩個(gè)個(gè)體中可能是完全一樣的，但是通過表觀遺傳修飾進(jìn)行的調(diào)控基因表達(dá)可以在有機(jī)體或組織的壽命和健康之間的巨大差異性方面發(fā)揮作用。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的DNA甲基化模式，可以獲得潛在地治療脫發(fā)、皮膚炎癥狀態(tài)、色素沉著與老年斑、皺紋、與老化有關(guān)的皮膚干燥、失去彈性和皮膚紋理以及其它疾病的機(jī)會(huì)。
[0060]表觀遺傳的模式化和維護(hù)對(duì)于正常細(xì)胞運(yùn)行是非常重要的。通過分析年輕的和老化的皮膚組織的CpG甲基化，可以注意到老化和UVB照射在甲基化變化方面的特征。由于老化和甲基化之間的最強(qiáng)的正相關(guān)性發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的CpG島內(nèi)的位置，因此關(guān)于植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基的功效的研究集中在這些重要位點(diǎn)的甲基化。
[0061]在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及一種組合物濃縮物，該濃縮物包括:(a)來自水稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)，(b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑，其中按重量計(jì)，組分(a)以所述組合物的介于0.0000001%至99%之間的量存在，優(yōu)選以介于90%至99%之間、并且更優(yōu)選以介于97%至99%之間的量存在；并且按重量計(jì)，組分(b)以所述組合物的介于
0.01%至10%之間的量存在，更優(yōu)選以介于0.1%至5%之間、并且最優(yōu)選以介于0.4%至2%之間的量存在。
[0062]在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物濃縮物的組分(a)是來自于水稻植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)。
[0063]本發(fā)明的組合物濃縮物可適合通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法并入如上所述的外用組合物中。
[0064]然而，本發(fā)明的另一實(shí)施方式是用于制備本發(fā)明的組合物的工藝，所述方法包含以下步驟:
(i)提供來自于稻屬植物的全能性的、未分化的植物細(xì)胞；
(ii)使所述植物細(xì)胞在存在或不存在化學(xué)的、氣體的、或能量的應(yīng)激的情況下，在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn)生含有水溶性組分和水不溶性組分的混合物，所述應(yīng)激用于得到次級(jí)植物細(xì)胞代謝物的表達(dá)，
(iii)除去所述水不溶性組分，以產(chǎn)生所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，以及
(iv)將所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基與防腐劑以及皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑混合，從而制造出本發(fā)明的組合物。
[0065]在該工藝的優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(i)的植物細(xì)胞來自于水稻植物。
[0066]在該工藝的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，在步驟(ii)，植物細(xì)胞在存在臭氧的情況下生長。
[0067]在該工藝的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(i)的植物細(xì)胞通過包括以下步驟的方法制備:
(1)使來自于所述稻屬植物的植物分生組織在固態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長；以及
(2)選擇穩(wěn)定的培養(yǎng)物，從而產(chǎn)生所述植物細(xì)胞。
[0068]然而，本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種用于控制人類皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化的方法，該方法包括使皮膚與包含下述組分的局部用組合物接觸:
(a)來自稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，
(b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑；以及 (C)皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑。
[0069]用于控制在人體皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化的上述方法優(yōu)選是非治療性的方法，例如，化妝的方法。[0070]本發(fā)明進(jìn)一步在下面給出的實(shí)施例中描述。以下實(shí)施例用來說明本發(fā)明的范圍而不以任何方式限制本發(fā)明的權(quán)利要求。除另有說明，否則此處給出的所有百分?jǐn)?shù)都是基于所述組合物的總重量計(jì)算的重量百分?jǐn)?shù)。
[0071]實(shí)施例1:
[0072]從水稻(稻米(rice))生產(chǎn)植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基
[0073]讓稻米分生組織培養(yǎng)物在固態(tài)培養(yǎng)基(Murashigie & Skoog與GamborglX維生素，30克/升蔗糖，I毫克/升激動(dòng)素，0.2毫克/升IAAjP 1%瓊脂，pH為5.6)上生長，并傳代培養(yǎng)至少三個(gè)月。將來自相同培養(yǎng)物系的愈傷組織接種到多個(gè)含有約60毫升無瓊脂的上述培養(yǎng)基的250mL燒瓶中。兩周后，將培養(yǎng)物移到含有約130毫升的液態(tài)營養(yǎng)基的500mL燒瓶中，該液態(tài)營養(yǎng)基包含:Murashige & Skoog培養(yǎng)基，GamborglX維生素,30克/升蔗糖，I毫克/升激動(dòng)素，0.2毫克/升IAA，pH為5.6。兩周后，將培養(yǎng)物移到含有約300mL的液態(tài)營養(yǎng)基的I升燒瓶中。培養(yǎng)發(fā)酵14天之后，將600mL的培養(yǎng)物移到具有2.3升工作容積的3升的生物反應(yīng)器中。發(fā)酵三周后，將5升的培養(yǎng)物移入具有22升的工作容積的30升的生物反應(yīng)器中。在發(fā)酵三周后，將40升的培養(yǎng)物移到具有200升的工作容積的250升的生物反應(yīng)器中。發(fā)酵四周后，將200升培養(yǎng)基移到具有總計(jì)400升的液態(tài)營養(yǎng)基的1000升的生物反應(yīng)器中。經(jīng)過2周的發(fā)酵后，加入350升的新鮮培養(yǎng)基以使總體積達(dá)到750升。讓培養(yǎng)物生長2周，然后將0.5ppm的臭氧加入到空氣管線中。讓培養(yǎng)物再額外生長一周以產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，然后，使用Niix)均質(zhì)機(jī)將培養(yǎng)物均質(zhì)化并過濾，以除去固體物質(zhì)。所得到的物質(zhì)被稱為稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基(植物分生組織細(xì)胞懸浮液提取物)或簡稱為稻米培養(yǎng)物。
[0074]實(shí)施例 2:
[0075]實(shí)施例1的臭氧施加應(yīng)激的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基的HPLC色譜圖
[0076]對(duì)實(shí)施例1的分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基提取物進(jìn)行HPLC分析。多個(gè)峰被觀察到，但只有一個(gè)峰是來自生物素，這表明臭氧會(huì)導(dǎo)致稻米培養(yǎng)物產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物。使用Phenomenex Kinetex2.6微米，100X4.6毫米柱進(jìn)行分析。溶劑A為甲醇。溶劑B為50mM的磷酸鈉(PH4.5)。等度洗脫地(isocratically)使用10%的溶劑A和使用90%的溶劑B。流率為1.0毫升每分鐘，柱溫為30°C。在200nm波長進(jìn)行檢測(cè)。HPLC分析結(jié)果示于圖1中。
[0077]實(shí)施例3:
[0078]無臭氧施加應(yīng)激的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基的HPLC色譜圖
[0079]根據(jù)實(shí)施例1的步驟制備稻米分生組織提取物，但不添加臭氧。在實(shí)施例1中所描述的條件下進(jìn)行HPLC分析。其結(jié)果示于圖2中。如該圖2所示，觀察到很少的次級(jí)代謝物峰。
[0080]實(shí)施例4:
[0081]應(yīng)用實(shí)施例1的經(jīng)臭氧處理的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基,在體外(in vitro)生長的成纖維細(xì)胞中，在所有基因啟動(dòng)子基因組范圍處的平均CpG甲基化下降。
[0082]如上所述，年輕細(xì)胞的一個(gè)重要特點(diǎn)是與較老的細(xì)胞相比，它們具有低的甲基化水平。這個(gè)實(shí)施例表明，施加實(shí)施例1的2%的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基到體外生長的成纖維細(xì)胞的應(yīng)用，與未處理的對(duì)照樣本相比，造成基因啟動(dòng)子基因組范圍處的甲基化水平下降。
[0083]測(cè)試方法概要
[0084]在這項(xiàng)研究中，人類皮膚成纖維細(xì)胞或者經(jīng)過一段組合的內(nèi)在和外在的老化(順序細(xì)胞傳代和反復(fù)的UVB照射)期間獲得，或者不是老化的。對(duì)于內(nèi)在老化過程而言，成纖維細(xì)胞是通過8個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)傳代(培養(yǎng)3周)得到的。細(xì)胞生長在12孔培養(yǎng)板中，并生長直至匯合(每48至72小時(shí))，收獲并按50%的原始細(xì)胞密度重新接種，使每個(gè)傳代大致代表一個(gè)群體倍增。對(duì)于外在老化方面，每周用UVB對(duì)細(xì)胞照射三次。雖然這項(xiàng)研究的初衷也是使該組通過8個(gè)傳代，但這是不可能的。到了第三傳代，細(xì)胞復(fù)制的速度已經(jīng)放慢到不再能夠使細(xì)胞傳代的地步。該組保持在培養(yǎng)物中持續(xù)3周并進(jìn)行9次UVB照射。
[0085]除了老化處理外，還用在整個(gè)老化過程中存在的測(cè)試材料對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理。處理組列表如下:
1.非老化細(xì)胞(培養(yǎng)幾天后收獲)
2.內(nèi)在老化+外在老化
3.內(nèi)在老化+外在老化+2%的實(shí)施例1的稻米培養(yǎng)物
[0086]培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基并分析其變化。
[0087]方法
[0088]成纖維細(xì)胞的 制備及處理
[0089]將成纖維細(xì)胞接種到在I毫升的Fibroblast Growth Medium(FGM)中的12孔板的單個(gè)的孔中，并且在37 ± 2°C，5 ± I %的CO2下培養(yǎng)，培養(yǎng)基每48至72小時(shí)進(jìn)行更換。達(dá)到匯合后，收獲細(xì)胞，然后按50%的原始密度重新接種。對(duì)于在內(nèi)在加外在老化組中的UVB照射，細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基用磷酸鹽緩沖鹽水代替，并將細(xì)胞曝光于5-7mJ/cm2的UVB。該照射每周進(jìn)行三次，照射之間的時(shí)間至少為24小時(shí)。
[0090]如上文所述，將細(xì)胞培養(yǎng)3周。在這段時(shí)間，內(nèi)在老化加外在老化組經(jīng)歷了 3個(gè)群體倍增和9次UVB曝光。在三周的期間結(jié)束時(shí)，在最后的培養(yǎng)基改變后48小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基和細(xì)胞。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗，以除去任何殘余的測(cè)試材料，然后將200微升的裂解緩沖液(在磷酸鹽緩沖生理鹽水中制備的ImM EDTA，0.5%的Triton X-100，IOmM的氟化鈉，150mM的氯化鈉，20mM的β -磷酸甘油，ImM的DTT，10微克/毫升亮肽素，10微克/毫升胃蛋白酶抑制素，3微克/毫升抑肽酶)加入至每孔。將細(xì)胞在冰上孵育約15分鐘以使其完全裂解。然后收集溶胞產(chǎn)物，并貯存于_75°C直至分析。
[0091]甲基化陣列報(bào)告
[0092]DNA CpG甲基化陣列芯片產(chǎn)自安捷倫(Agilent)，并且覆蓋27，627個(gè)CpG島。對(duì)于該陣列，總基因組DNA(5微克)從體外成纖維細(xì)胞分離出，然后剪切成片段(約400至800個(gè)堿基長度)。這5微克的剪切基因組DNA的樣品中，I微克的總基因組DNA被擱置，而余下的4微克被用來隔離甲基化DNA。甲基化DNA使用具有專用于甲基化DNA的抗體的免疫-沉淀物分離。所述I微克的總基因組DNA和甲基化DNA然后進(jìn)行熒光標(biāo)記，并應(yīng)用到DNA甲基化陣列。雜交后，然后掃描該陣列，然后確定在陣列上的特征的熒光強(qiáng)度。將在所有的基因啟動(dòng)子的所有的CpG位點(diǎn)的值進(jìn)行平均，以確定平均值。結(jié)果列于圖3中。
[0093]圖3中的數(shù)據(jù)表明，相比未經(jīng)處理的類似細(xì)胞，2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基的局部應(yīng)用顯示內(nèi)在地和外在地老化的成纖維細(xì)胞中的啟動(dòng)子區(qū)域中的總的CpG甲基化下降。
[0094]實(shí)施例5:
[0095]使用實(shí)施例1的經(jīng)臭氧處理的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，在體外生長的成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白IAl啟動(dòng)子的平均CpG甲基化水平下降。
[0096]在老化過程中已增加啟動(dòng)子甲基化水平的基因之一是膠原蛋白IAl (Takatsu等，1999)。這個(gè)實(shí)施例說明，向體外生長的成纖維細(xì)胞應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基造成該細(xì)胞與未經(jīng)處理的類似細(xì)胞相比，其膠原蛋白IAl基因啟動(dòng)子的甲基化水平下降。檢測(cè)如上所述進(jìn)行。對(duì)膠原蛋白IAl啟動(dòng)子中的所有CpG位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行平均，得到平均值。結(jié)果列于圖4中。
[0097]圖4中的數(shù)據(jù)表明，與未經(jīng)處理的相似細(xì)胞相比，局部應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基顯示在已內(nèi)在和外在老化的細(xì)胞中，膠原蛋白IAl基因啟動(dòng)子的DNA CpG甲基化水平下降。
[0098]實(shí)施例6:[0099]使用實(shí)施例1的經(jīng)臭氧處理的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，在體外生長的成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白1A2啟動(dòng)子的平均CpG甲基化水平下降。
[0100]這個(gè)實(shí)施例說明，向體外生長的成纖維細(xì)胞應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基造成該細(xì)胞其膠原蛋白1A2基因啟動(dòng)子的甲基化水平下降。檢測(cè)如上所述進(jìn)行。對(duì)膠原蛋白1A2啟動(dòng)子中的所有CpG位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行平均，得到平均值。結(jié)果列于圖5中。
[0101]圖5中的數(shù)據(jù)表明，與未經(jīng)處理的相似細(xì)胞相比，局部應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基顯示在已內(nèi)在和外在老化的細(xì)胞中，膠原蛋白1A2基因啟動(dòng)子的DNA CpG甲基化水平下降。
[0102]實(shí)施例7:
[0103]使用實(shí)施例1的經(jīng)臭氧處理的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，在體外生長的成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白水平提高。
[0104]這個(gè)實(shí)施例說明，向體外成纖維細(xì)胞應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基造成該細(xì)胞其膠原蛋白的產(chǎn)量增加。如上所述，讓細(xì)胞生長并對(duì)其處理。對(duì)在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)基樣品和在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)基兩者的膠原蛋白進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于該檢測(cè)，制備范圍從O毫微克/毫升到640毫微克/毫升的一系列型I C-肽的標(biāo)準(zhǔn)值。接著，通過從板框架去除任何不需要的條帶，制備ELISA微孔板，然后對(duì)在試驗(yàn)中所使用的每一個(gè)孔添加100微升的過氧化物酶標(biāo)記的抗型前膠原蛋白1-C肽抗體。然后，將二十(20)微升的樣品(收集的組織培養(yǎng)液培養(yǎng)基)或標(biāo)準(zhǔn)物加入適當(dāng)?shù)目字?，并覆蓋微孔板，在37°C下將其孵育3±0.25小時(shí)。在孵育后，對(duì)孔進(jìn)行抽取并用400微升的洗滌緩沖液將其洗滌三次。將最后的洗滌物去除后，向每個(gè)孔中添加100微升的過氧化物酶底物溶液(過氧化氫+四甲基聯(lián)苯胺作為色原體)，并在室溫下將板孵育15±5分鐘。孵育后，將100微升的停止溶液(IN硫酸)加入到各孔中，并用酶標(biāo)儀在450nm處讀取板。結(jié)果列于圖6中。
[0105]圖6中的數(shù)據(jù)表明:相比于未經(jīng)處理的類似生長的細(xì)胞，局部應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基顯示已內(nèi)在地和外在地老化的細(xì)胞中的IA型膠原蛋白增加了。
[0106]實(shí)施例8:
[0107]應(yīng)用實(shí)施例1的經(jīng)臭氧處理的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，在體外生長的成纖維細(xì)胞中的皮連蛋白(Dermatopontin)的蛋白水平增加。
[0108]這個(gè)實(shí)施例說明，應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基到體外生長的成纖維細(xì)胞中導(dǎo)致該細(xì)胞增加其皮連蛋白的產(chǎn)量。細(xì)胞生長并如上處理。使用免疫印跡法檢測(cè)皮連蛋白的蛋白水平。
[0109]細(xì)胞裂解液的微濾滲透和免疫檢測(cè)
[0110]膜在Tris緩沖液(TBS:20mM Tris, pH7.5，150mM NaCl)中平衡，并裝配到Bio-Dot微濾裝置中。裝配后，將200微升的TBS溶液加入到在Bio-Dot中使用的各孔并施加真空以確保有充足的流量通過所有孔。接著，各細(xì)胞裂解物樣品(約5微克)被分配在該裝置的孔中以及應(yīng)用于合適的孔中。在低真空下對(duì)樣品進(jìn)行過濾。將TBS溶液加入未分配到樣品的孔中，以確保膜在操作過程中不干燥。在滲透過程結(jié)束時(shí)，另外的200微升TBS被施加，并過濾通過各孔。然后將膜從Bio-Dot裝置去除，在TBS中洗滌5-10分鐘，然后放入封閉溶液(Tris緩沖鹽溶液[20mM Tris, pH7.5，150mM NaCl, 1%的非脂奶粉])，并讓其在擺動(dòng)平臺(tái)上在室溫下孵育至少I小時(shí)。
[0111]抗體孵育和檢測(cè)
[0112]封閉后，將膜轉(zhuǎn)移到具有適當(dāng)稀釋的檢測(cè)抗體的20毫升的TBST(含0.1%Tween-20的TBS)和0.1 %的脫脂奶粉中，并讓其在擺動(dòng)平臺(tái)上在4°C下孵育過夜。孵育后，在TBST中洗滌膜3次(IX 15分鐘和2X5分鐘)。在室溫下，在15毫升含0.1 %非脂奶粉的TBST中利用該膜孵育次級(jí)抗體(與熒光共軛)，持續(xù)I小時(shí)，然后用TBS洗滌3次(I X 15分鐘，2X5分鐘)。
[0113]最后一次洗滌后，將膜放置到BioRad Molecular Imager FX中，并使用適合于熒光的激發(fā)激光器和發(fā)射過濾器的組合掃描。使用ImageJ圖像分析軟件對(duì)用掃描儀產(chǎn)生的圖像進(jìn)行分析。結(jié)果列于圖7中。
[0114]圖7中的數(shù)據(jù)顯示，與在類似的條件下生長的未處理的細(xì)胞相比，對(duì)老化細(xì)胞局部應(yīng)用實(shí)施例1的2%的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基導(dǎo)致皮連蛋白的表達(dá)的顯著增強(qiáng)。
[0115]實(shí)施例9:
[0116]水包油型乳狀液
[0117]使用下面的配方和工藝將實(shí)施例1 (稻米培養(yǎng)物)的稻米分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基配制成水包油型乳狀液:
【權(quán)利要求】
1.一種用于控制人類皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化的外用組合物，其包括: (a)來自稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基， (b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑；以及 (C)皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中按重量計(jì)，組分(a)以所述組合物的介于0.0000001 %至99%之間的量存在，優(yōu)選以介于0.0001 %至50%之間、更優(yōu)選以介于0.001%至25%之間、并且最優(yōu)選以介于0.01%至10%之間的量存在；按重量計(jì)，組分(b)以所述組合物的介于0.0I %至10 %之間的量存在，更優(yōu)選以介于0.1 %至5 %之間、并且最優(yōu)選以介于0.4%至2%之間的量存在；且按重量計(jì)，組分(c)以所述組合物的介于1%至98 %之間的量存在，并且最優(yōu)選以介于80 %至90 %之間的量存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中組分(a)來自水稻植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基通過下述步驟制備:(i)使來自于所述稻屬植物的分生組織在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn)生含有水溶性組分和水不溶性組分的混合物，以及(ii)除去所述水不溶性組分，從而產(chǎn)生所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述植物分生組織在化學(xué)的、氣體的、或能量的應(yīng)激的存在下，在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，所述應(yīng)激用于得到次級(jí)植物細(xì)胞代謝物的表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述植物分生組織細(xì)胞在臭氧的存在下，在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述防腐劑選自由水楊酸、山梨酸、苯氧乙醇、芐醇、乙醇、季銨鹽-15、組合有底物的葡萄糖氧化酶和乳過氧化物酶、以及它們的組合組成的群組中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述防腐劑為苯氧乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中基于所述組合物的總重量，所述防腐劑以所述組合物的至少0.5wt%的量存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包括至少一種成分，該成分選自:水、表面活性劑、乳化劑、調(diào)理劑、軟化劑、蠟、油、聚合物、增粘劑、固定劑、著色劑、濕潤劑、保濕劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、溶劑、香料、植物性物質(zhì)、營養(yǎng)素、藥妝品、治療劑、藥物、抗真菌劑、抗微生物劑、留體類激素、去頭屑劑、抗痤瘡組分、防曬劑、防腐劑、以及它們的組合。
11.一種組合物濃縮物，其包括: (a)來自稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，和 (b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑；其中按重量計(jì)，組分(a)以所述組合物的介于0.0000001%至99%之間的量存在，優(yōu)選以介于90%到99%之間、更優(yōu)選以介于97%至99%之間的量存在；并且按重量計(jì)，組分(b)以所述組合物的介于0.0I %至10 %之間的量存在，更優(yōu)選以介于0.1 %至5 %之間、并且最優(yōu)選以介于0.4%至2%之間的量存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物濃縮物，其中組分(a)是來自水稻植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基。
13.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物的方法，其包括以下步驟: (i)提供來自于稻屬植物的全能性的、未分化的植物細(xì)胞； (?)使所述植物細(xì)胞在存在或不存在化學(xué)的、氣體的、或能量的應(yīng)激的情況下，在液態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn)生含有水溶性組分和水不溶性組分的混合物，所述應(yīng)激用于得到次級(jí)植物細(xì)胞代謝物的表達(dá)， (iii)除去所述水不溶性組分，以產(chǎn)生所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基，以及 (iv)使所述植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基與防腐劑以及皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑混合，從而制造出根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，步驟(i)中的所述植物細(xì)胞來自于水稻植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中在步驟(ii)中，所述植物細(xì)胞在臭氧的存在下生長。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(i)中的所述植物細(xì)胞通過包括下述步驟的方法制備: (1)使來自于所述稻屬植物的植物分生組織在固態(tài)營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長；以及 (2)選擇穩(wěn)定的培養(yǎng)物，從而生產(chǎn)所述植物細(xì)胞。
17.一種用于控制人類皮膚細(xì)胞中的DNA甲基化的方法，該方法包括使皮膚與包含下述組分的外用組合物 接觸: (a)來自稻屬植物的植物分生組織條件營養(yǎng)培養(yǎng)基， (b)以相對(duì)于組分(a)足以提供滅菌或生物穩(wěn)定療效的量存在的防腐劑；以及 (C)皮膚病學(xué)上可接受的賦形劑。
【文檔編號(hào)】A61K8/97GK103841956SQ201280025287
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月27日
【發(fā)明者】詹姆斯·文森特·格魯伯, 菲利普·雷德特·路德維格 申請(qǐng)人:奧麒化工有限公司