低變應(yīng)原的谷物組合物用于誘導(dǎo)特異性口服耐受的用途
【專利摘要】公開了用于在對谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中誘導(dǎo)特異性口服耐受的谷物蛋白的部分水解物，其中所述水解物的水解度介于9-18%之間。
【專利說明】低變應(yīng)原的谷物組合物用于誘導(dǎo)特異性口服耐受的用途
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及低變應(yīng)原的谷物組合物在誘導(dǎo)年幼哺乳動物對谷物、尤其是對小麥或大米的特異性口服耐受中的用途，所述動物對谷物具有IgE介導(dǎo)的過敏癥。
[0002]發(fā)明背景
[0003] 生命中首個發(fā)生的食物過敏是牛奶過敏，其很多情況下是由對食物中蛋白的反應(yīng)引起的。在生命的早期，免疫系統(tǒng)仍處于發(fā)育階段，可能未能建立對食物抗原的耐受性(這也可稱為口服耐受的誘導(dǎo)不足)。其結(jié)果是嬰兒或幼年動物對食物蛋白具有過度的免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生對其的過敏反應(yīng)。食物過敏不僅影響人類，還可影響其他哺乳動物，例如狗和貓。
[0004]通常，當(dāng)易感或有風(fēng)險的嬰兒、兒童或幼年動物首次接觸含有潛在過敏原的新的食物時會發(fā)生食物超敏反應(yīng)。除母乳外，人類嬰兒首個接觸的食物性蛋白至少有牛奶蛋白，如上文所述，牛奶過敏是嬰兒最常見的食物過敏。通常認(rèn)為，具有牛奶過敏的嬰兒發(fā)展成特應(yīng)性疾病和對其他食物蛋白例如蛋和谷物蛋白過敏的風(fēng)險增加，然而，在斷奶時向膳食中引入這些食品后，即使對牛奶蛋白具有口服耐受的那些嬰兒隨后也有可能對其他食物蛋白例如蛋和谷物蛋白過敏。這些過敏在臨床上可能表現(xiàn)為特應(yīng)性疾病，例如特應(yīng)性皮炎、濕疹和哮喘。
[0005]從飲食的觀點看，有兩種方法用于治療已建立的過敏——完全避免含有過敏原的食物，或者食物必須經(jīng)過處理以減少其致敏可能，例如，通過深度水解作用。為了后一目的，制備了含有深度水解的牛奶蛋白(由不超過5個氨基酸組成的肽)的嬰兒配方食品。類似的，在美國專利號6403142中也已提出，制備用于伴侶動物的低變應(yīng)原性寵物食品，其中所述動物疑似發(fā)生了食物過敏。
[0006]如前所述，除母乳外，幼年哺乳動物遭遇的首個食物蛋白通常是來自其他動物的乳蛋白，例如對于人類嬰兒來說為牛奶。通常，下一個遭遇的食物蛋白是谷物蛋白，其在斷奶初期被引入，對于人類嬰兒來說通常為嬰兒谷物形式。當(dāng)首次引入幼年哺乳動物的飲食中時，谷物蛋白也可能引起過敏反應(yīng)，即使之前已成功引入過乳蛋白。具體而言，小麥中的蛋白質(zhì):白蛋白、球蛋白、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白與人類嬰兒的過敏發(fā)展有關(guān)。谷物蛋白的特定變應(yīng)原性特征與這些蛋白的特殊性質(zhì)有關(guān)，由此需要開發(fā)能避免變應(yīng)原性的特異性方法和廣品。
[0007]對建立谷物蛋白過敏反應(yīng)的一級預(yù)防已經(jīng)引起了一些關(guān)注，例如W02009/077457中公開的那些，即在第一地點就減少發(fā)生過敏的風(fēng)險。US5，039，532A涉及低變應(yīng)原的乳清蛋白水解物。EP1236405A1涉及低變應(yīng)原的大豆蛋白，其被設(shè)計以避免“有風(fēng)險的”動物的
致敏作用。
[0008]如前所述,一旦過敏條件建立,含有過敏原的食物必須完全避免,或者食物應(yīng)當(dāng)進行處理以減少其過敏可能性。例如通過深度水解。某些情況下，可能通過誘導(dǎo)對過敏原的特異性口服耐受來緩和或降低過敏反應(yīng)。
[0009]因此，本發(fā)明的一個目的是提供液態(tài)形式或易于在水或奶中重構(gòu)的干燥產(chǎn)物形式的低變應(yīng)原的谷物制劑，用于對所述的食物過敏反應(yīng)脫敏，或誘導(dǎo)對所述變應(yīng)原性蛋白例如谷物蛋白的口服耐受。換句話說，本發(fā)明的一個目的是在年輕個體中重建對變應(yīng)原性蛋白、例如谷物蛋白的口服耐受，所述個體已顯示出對所述蛋白的過敏反應(yīng)。這不同于基于個體的醫(yī)療記錄或基于個體父母的醫(yī)療記錄而提供設(shè)計用于避免有發(fā)生過敏反應(yīng)的高風(fēng)險個體的過敏反應(yīng)的低變應(yīng)原的產(chǎn)品。
[0010]發(fā)明概述
[0011]因此，在第一方面，本發(fā)明提供了谷物蛋白的部分水解物，其用于誘導(dǎo)對所述谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中的特異性口服耐受，其中所述水解物的水解度介于9-18%之間。
[0012]第二方面，本發(fā)明提供了谷物粉，其用于誘導(dǎo)對所述谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中的特異性口服耐受，其中所述蛋白被部分水解，并且水解度介于9-18%之間。
[0013]第三方面，本發(fā)明提供了谷物產(chǎn)品，其用于誘導(dǎo)對所述谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中的特異性口服耐受，所述谷物產(chǎn)品包括(按干物質(zhì)的重量百分比)1-100%、優(yōu)選.15-100%的如上文所定義的谷物粉，其中所述蛋白是部分水解的，并且水解度介于9-18%之間；0-40%糖；0-30%淀粉以及0-30%脂肪和1-85%的水。所述產(chǎn)品可以是流體，或者具有半流質(zhì)的粘度和質(zhì)地。在一個實施方案中，所述產(chǎn)品是干的或基本上干的粉末形式。
[0014]在第四方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)對所述谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中的對谷物蛋白的特異性口服耐受的方法，包括對所述幼年哺乳動物喂食治療量的谷物蛋白的部分水解物，其水解度介于9-18%之間。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的第一、第二、第三和第四方面，谷物蛋白的部分水解物的水解度優(yōu)選介于10-16%，更優(yōu)選介于11-13%。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第一、第二、第三和第四方面，優(yōu)選地，所述過敏是IgE-介導(dǎo)的過敏。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的第一、第二、第三和第四方面，優(yōu)選地，所述谷物是小麥、大米、或小麥和大米的混合物。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的第一、第二、第三和第四方面，優(yōu)選地，所述幼年哺乳動物是人類嬰兒。
[0019]附圖簡述
[0020]圖1顯示了完整和水解的大米蛋白的SDS-PAGE分析。
[0021]圖2顯示了完整和水解的小麥蛋白的SDS-PAGE分析。
[0022]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的水解的大米蛋白殘留的變應(yīng)原性。
[0023]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的水解的小麥蛋白殘留的變應(yīng)原性。
[0024]發(fā)明詳述
[0025]在該說明書里，下列術(shù)語具有以下含義:
[0026]“谷物蛋白”表示在谷物中，例如大米、小麥、燕麥、玉米、大麥、黑麥及其混合物中發(fā)現(xiàn)具有食用價值的任何和所有的蛋白；
[0027]蛋白質(zhì)的“水解度”或“DH”表示完 整蛋白在水解過程中解離的肽鍵數(shù)目除以完整蛋白中肽鍵總數(shù)的百分比；
[0028]“低變應(yīng)原的(HA)谷物蛋白”表示部分水解的谷物蛋白，其變應(yīng)原性至少比完整的谷物蛋白低100倍(類似于歐盟指導(dǎo)原則96/4/EC關(guān)于乳蛋白的規(guī)定)；
[0029]“口服耐受”表示對經(jīng)口服途徑遞送的抗原的免疫學(xué)低反應(yīng)性的活性狀態(tài)；
[0030]“特異性口服耐受誘導(dǎo)”表示對具有對谷物蛋白過敏、優(yōu)選IgE介導(dǎo)的過敏的幼年哺乳動物的部分或完全的口服脫敏作用或重建對所述抗原的耐受。
[0031]“具有IgE-介導(dǎo)的過敏”表示基于一種或多種下列測試推定或診斷為IgE介導(dǎo)的過敏:
[0032]-對過敏原，優(yōu)選谷物蛋白的陽性皮膚刺傷測試(SPT)，
[0033]-對過敏原，優(yōu)選谷物蛋白的陽性特異性IgE，
[0034]-對過敏原，優(yōu)選谷物蛋白的快速陽性反應(yīng)(IgE)，如激發(fā)(口服激發(fā))試驗所示。
[0035]“谷物蛋白過敏反應(yīng)的一級預(yù)防”表示預(yù)防所述過敏反應(yīng)發(fā)生，包括降低所述過敏反應(yīng)的風(fēng)險；
[0036]“純化的蛋白酶”表示未被其他能水解碳水化合物的酶例如阿法淀粉酶污染的蛋白酶；[0037]“糖”表示在谷物產(chǎn)品中使用的碳水化合物，用于提供甜味，其包括但不限于蔗糖、葡萄糖和果糖；
[0038]除非另外說明，所有引用的百分比表示重量百分比。本發(fā)明的產(chǎn)品中特定成分的“干重百分比”表示該成分占產(chǎn)品中總干物質(zhì)的百分比的量。
[0039]本發(fā)明使用的谷物蛋白部分水解物的DH介于9-18%之間，優(yōu)選介于10_16%之間。所述谷物可以是任何食用的谷物，包括大米、小麥、燕麥、玉米、大麥、黑麥或其混合物。優(yōu)選地，所述谷物是小麥、大米、或小麥和大米的混合物。
[0040]經(jīng)Fritsch6 等人描述的技術(shù)(Int.Arch.Al Ier and AppIImm., 93, 289-293，1990)測定，谷物蛋白的部分水解物可具有比完整谷物蛋白降低至少100倍的變應(yīng)原性。這些部分水解的谷物蛋白和含有它們的產(chǎn)品因此可描述為低變應(yīng)原的。
[0041]谷物蛋白的部分水解物可由本領(lǐng)域任何適當(dāng)?shù)囊阎椒óa(chǎn)生。適當(dāng)?shù)脑鲜枪任锓?，例如小麥粉或大米粉。粉的粒度測量不是關(guān)鍵的，顆粒大小例如可介于200-500微米之間變化。
[0042]根據(jù)本發(fā)明，制備所用的部分谷物水解物的過程的實例如下:谷物粉與水混合，混合物加熱至60-65°C持續(xù)10分鐘，隨后冷卻至55°C。加入蛋白酶，例如細(xì)菌的絲氨酸內(nèi)切
蛋白酶枯草桿菌蛋白酶(市售，例如商標(biāo)為Alcalase?)，將混合物維持在55°C持續(xù)2小
時。隨后升溫至70-75°C，保持10分鐘。將混合物再次冷卻至55°C，加入不同的蛋白酶，例如來自解淀粉芽胞桿菌和蘚樣芽胞桿菌的細(xì)菌蛋白酶的混合物(可從丹麥的Novozymes
A/S Bagsvaerd獲得，商標(biāo)名為Protamex?)。將混合物繼續(xù)維持在55°C 2小時，隨后升
溫至85-95°C，保持30分鐘以失活酶，終止水解。由此獲得的部分水解的谷物蛋白為液態(tài)形式，可以該狀態(tài)使用或通過任何本領(lǐng)域已知的適當(dāng)技術(shù)、例如滾筒干燥、噴霧干燥或擠壓進行干燥。
[0043]由此制備的部分谷物水解物或產(chǎn)品可進一步通過擠壓步驟處理?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的擠壓方法和設(shè)備。然而，優(yōu)選的擠壓步驟使用雙螺桿擠壓機進行，速度為200-260rpm，溫度介于130°C _150°C，產(chǎn)品流速介于6_8kg/h，水流速為7-llml/min，壓力介于50-150巴。擠壓步驟能使產(chǎn)品獲得特定的質(zhì)地，具有獨特的物理性質(zhì)，例如溶解時間、重構(gòu)的粘度等。
[0044]根據(jù)本發(fā)明，一種特別優(yōu)選的用于制備谷物蛋白部分水解物的方法包括混合谷物粉和水和緩沖劑(PH優(yōu)選介于7-8)，進行初步(第一次)熱處理(然而是任選的)，加入純化的蛋白酶，使混合物的溫度維持在40-80°C或40°C -70°C (第二次熱處理)，保持30分鐘至240分鐘，獲得部分水解物，其水解度介于9-18%。
[0045]在一個實施方案中，初步(第一次)熱處理在40°C -90°C進行，優(yōu)選60°C -80°C,保持1-8小時，優(yōu)選2-3小時。
[0046]在一個實施方案中，上述第二次熱處理用漸進的熱處理替代:溫度在2-5小時內(nèi)，優(yōu)選在3-4小時內(nèi)從室溫緩慢升至70°C或80°C。溫度增加的速率可介于0.050C /min至
0.40°C /min,優(yōu)選介于 0.08-0.3°C /min,最優(yōu)選介于 0.10°C /min 至 0.15°C /min。任選地，在熱處理的最終溫度下可將水解物維持一段平臺期(1、2、3或5小時)。
[0047]用于熱處理的最佳溫度高度依賴于谷物蛋白和所用的酶的性質(zhì)。高于70°C時注意酶活性可能降低。
[0048]純化的蛋白酶可以是細(xì)菌蛋白酶，其未被阿法淀粉酶污染，例如以商標(biāo)名Alcalase AF? (Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)市售的酶,或動物來源的蛋白酶,例如膜蛋白酶。
[0049]本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，初步熱處理的目的是促進蛋白分子的解折疊，使其更容易被隨后的酶水解。初步熱處理可包含例如在50-130°C下，在熱交換器中加熱15秒-10分鐘，或通過蒸氣直接注入加熱。
[0050]優(yōu)選地，所述水解在50-80°C進行30-180分鐘，優(yōu)選進行60-120分鐘。然而，也可使用更長時間，例如4或5小時。某些情況下，很短的時間(10或15分鐘)可能是有益的。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的谷物蛋白的部分水解物可代替完整的谷物蛋白，用于幼年哺乳動物例如人類嬰幼兒以及幼年伴侶動物例如狗和貓的食品中。
[0052]本發(fā)明使用的產(chǎn)品包括(按干物質(zhì)的重量百分比算):1-100%的谷物粉，優(yōu)選15%-100%，其中所述蛋白是部分水解的，水解度為9-18% ；0-40%的糖，以及0-30%的脂肪和1-85%的水。
[0053]所述產(chǎn)品可以包含天然或水解的淀粉，水解的淀粉可隨著水解蛋白谷物的量增加而增加。
[0054]所述產(chǎn)品可以是流體(液體)形式。其可以以直接食用(不需要進一步稀釋)的形式銷售。
[0055]所述產(chǎn)品可以是脫水粉末的形式，其可通過用水或奶重構(gòu)而制備食用。
[0056]所述產(chǎn)品可以是擠壓的零食產(chǎn)品形式，尤其是用于幼兒消費的產(chǎn)品。
[0057]當(dāng)產(chǎn)品為用液體(水或奶)重構(gòu)的脫水臨時粉末形式或液體谷物產(chǎn)品形式時，本發(fā)明所覆蓋的粘度范圍為OmPa.s到4000mPa.s，優(yōu)選介于1000_3500mPa.S。優(yōu)選地，對于斷奶食品而言，粘度為2000-3000mPa*s。粘度測量可通過任何已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行。上述數(shù)值在60°C、50rpm、IOmin下，使用用水稀釋的15.6%固體的產(chǎn)品測定。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的脫水谷物粉末優(yōu)選含有70-80%的谷物粉末，10-30%糖(優(yōu)選15%-20%)，2-10%的脂肪和1-3%的水(優(yōu)選2%-3%)。所述產(chǎn)品還可包含高達(dá)20%的淀粉。它們以脫水形式銷售，通過與液態(tài)奶(或者奶粉和水的混合物)混合而再次水合，以形成便于食用的半流質(zhì)。
[0059]優(yōu)選地，所述半流質(zhì)使用前述的本發(fā)明的谷物產(chǎn)品、水和粉末化的低變應(yīng)原的嬰兒配方食品(即含有部分水解的乳蛋白混合物并符合指導(dǎo)原則96/4/EC要求的嬰兒配方食品)制備?；蛘?，如果可行的話，即時食用的液態(tài)HA嬰兒配方食品可用于重構(gòu)該谷物產(chǎn)品。其優(yōu)點是提供基于谷物的斷奶食品，其具有顯著降低的變應(yīng)原性，因為食物中所有的蛋白都經(jīng)過了部分的水解。
[0060]所述半流質(zhì)也可通過混合本發(fā)明的谷物產(chǎn)品和其他含蛋白的低變應(yīng)原的制劑而制備。
[0061]在一個實施方案中，本發(fā)明的部分水解物或部分水解的谷物蛋白與低變應(yīng)原的卵制劑一起提供。
[0062]在另一個實施方案中，另一種低變應(yīng)原制劑可包含低變應(yīng)原的奶或低變應(yīng)原的嬰兒配方食品。
[0063]在另一個實施方案中，本發(fā)明的部分水解物或部分水解的谷物蛋白包含低變應(yīng)原的卵制劑和低變應(yīng)原的奶或嬰兒配方食品二者。
[0064]低變應(yīng)原的蛋制劑可參見專利出版物EP1867237A1和W02007/144397A1所述。
[0065]低變應(yīng)原的嬰兒配方食品可以是含有部分水解的乳蛋白的嬰兒配方食品，其符合指導(dǎo)原則96/4/EC的要求。其優(yōu)點在于提供基于谷物-蛋的斷奶食品，其具有顯著降低的變應(yīng)原性，因為食物中所有的蛋白都經(jīng)過了部分的水解。
[0066]在另一個實施方案中，所述谷物產(chǎn)品還包括乳固體。所述產(chǎn)品可通過簡單與水混合制備以供食用。同樣，如果存在乳固體的話，其優(yōu)選通過低變應(yīng)原的嬰兒配方食品提供。
[0067]根據(jù)本發(fā)明使用的液體谷物產(chǎn)品優(yōu)選包含5-10%的谷物粉，2-7%的乳固體，最高15%的脂肪，最高30%的糖，最高5%的淀粉和75-90%的水。所述產(chǎn)品可設(shè)定為谷物乳飲料，通常以單次食用的紙盒或瓶裝售賣以供消費。所述乳固體優(yōu)選通過低變應(yīng)原的嬰兒配方食品提供。
[0068]谷物產(chǎn)品可包含淀粉。如果存在淀粉，其可以是天然淀粉或通過本領(lǐng)域已知方法部分水解的淀粉，例如美國專利4，374，860的方法。淀粉的水解度可以是DE5-55或DE20-45，最終介于DE25-35。淀粉的水解度被優(yōu)化以獲得本發(fā)明最終應(yīng)用的正確的感官和物理化學(xué)性質(zhì)。如果需要含有部分水解的淀粉和部分水解的蛋白的產(chǎn)品，用作原料的谷物粉可能需要進行兩步水解，一步針對淀粉，另一步針對蛋白。這些水解可同時或先后進行。
[0069]除上述的谷物產(chǎn)品以外，谷物蛋白的部分水解物可作為例如谷物粉形式(其中蛋白部分水解，其水解度介于9-18%)的成分用在任何通常含有谷物粉的食品中，例如生面團、面包和餅干等。
[0070]如前所述，谷物蛋白的脫敏依賴于對所述蛋白的口服耐受的成功誘導(dǎo)。發(fā)明人相信該目的可以通過平衡所述部分水解的蛋白殘留的抗原性和其誘導(dǎo)口服耐受的能力而實現(xiàn)。通常，所述水解蛋白殘留的抗原性應(yīng)當(dāng)比完整蛋白至少低100倍。
[0071]蛋白質(zhì)之間的不同不僅僅在于分子量，尤其還在于其序列、疏水-親水程度、三維結(jié)構(gòu)、PKa和許多其他性質(zhì)。因此，盡管不是不可能的，但預(yù)測口服耐受誘導(dǎo)也是有難度的。此外，蛋白質(zhì)家族之間變應(yīng)原性的性質(zhì)/潛能差異巨大。同樣，不同蛋白質(zhì)之間的蛋白/宿主相互作用以及免疫系統(tǒng)的反應(yīng)都有很大區(qū)別。因此，關(guān)于奶或大豆蛋白的知識不能直接用于谷物蛋白。
[0072]本發(fā)明將通過下述實施例進一步說明。
[0073]部分谷物水解物的制備
[0074]實施例1
[0075]將IOKg的大米粉(按照美國專利4，374，860預(yù)處理以部分水解碳水化合物成分)和23kg的水混合，在55°C加熱。制備緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)，加入混合物進行 pH 調(diào)節(jié)。加入 5% 的Protamex? 酶(批號 PW2A1006, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在55°C 2小時。該第一步水解結(jié)束后，將混合物在90°C加熱10分鐘。冷卻所述混合物至55°c，加入5%的Flavourzyme? 1000L酶(批號400904，Novozymes
A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在55°C 2小時。該第二步水解后，將混合物在90°C加熱30分鐘，隨后噴霧干燥獲得含有部分水解的大米蛋白的粉末，DH為14.2%，將其放置在鋁包中。
[0076]實施例2
[0077]將IOKg的大米粉(按照美國專利4，374，860預(yù)處理以部分水解碳水化合物成分)和23kg的水混合，在55°C加熱。制備緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)，加入混合物進行pH調(diào)節(jié)(至ρΗ7.8)。加入10%的Alcalase?2.4L酶(批號500357， Novozymes A/
S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在55°C 2小時。該第一步水解結(jié)束后，將混合物在90°C加熱10分鐘。冷卻所述混合物至55°C，加入10%的Alcalase酶，將混合物維持在55°C 2小時。該第二步水解后， 將混合物在90°C加熱30分鐘，隨后噴霧干燥獲得含有部分水解的大米蛋白的粉末，DH為15.9%，將其放置在鋁包中。
[0078]實施例3
[0079]將IOKg大米粉(按照美國專利4，374，860預(yù)處理以部分水解碳水化合物成分)和23kg的水混合，在55°C加熱。制備緩沖劑溶液(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)，加入混合物進行 pH 調(diào)節(jié)(至 ρΗ7.8)。加入 5% 的 Alcalase?2.4L 酶(批號 500357，Novozymes A/SBagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在55°C 2小時。該第一步水解結(jié)束后，將混合物在90°C加熱10分鐘。冷卻所述混合物至55°C，加入5%的Protamex?酶(批號PW2A1006，NovozymesA/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在55°C 2小時。該第二步水解后，將混合物在90°C加熱30分鐘，隨后噴霧干燥獲得含有部分水解的大米蛋白的粉末，DH為11.2%，將其放置在鋁包中。
[0080]實施例4
[0081]將15Kg小麥粉(按照美國專利4，374，860預(yù)處理以部分水解碳水化合物成分)和70kg的水混合，在55°C加熱。制備緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)，加入混合物進行 pH 調(diào)節(jié)。加入 5% 的 Protamex?l酶(批號 PW2A1006, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在55°C 2小時。該第一步水解結(jié)束后，將混合物在90°C加熱10分鐘。冷卻所述混合物至55°c,加入5%的Flavourzyme? 1000L酶(批號400904，NovozymesA/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在55°C 2小時。該第二步水解后，將混合物在90°C加熱30分鐘，隨后噴霧干燥獲得含有部分水解的小麥蛋白的粉末，DH為12.7%，將其放置在鋁包中。
[0082]實施例5 (非本發(fā)明的部分)
[0083]將15Kg小麥粉(按照美國專利4，374，860預(yù)處理以部分水解碳水化合物成分)和70kg的水混合，在55°C加熱。制備緩沖劑溶液(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)，加入混合物進行 pH調(diào)節(jié)。加入 10% 的 Alcalase?2.4L 酶(批號 500357，Novozymes A/S Bagsvaerd,
丹麥)，將混合物維持在55‘C 2小時。該第一步水解結(jié)束后，將混合物在90°C加熱10分鐘。冷卻所述混合物至55°C，加入10%的Alcalase酶，將混合物維持在55°C 2小時。該第二步水解后，將混合物在90°C加熱30分鐘，隨后使用4kDa的膜進行超濾,噴霧干燥獲得含有深度水解的小麥蛋白的粉末，DH為20.0%，將其放置在鋁包中。
[0084]實施例6
[0085]將15Kg大米粉、70kg水和用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)混合，通過蒸氣注射加熱數(shù)秒鐘，加入5%的Alcalase?2.4L AF酶(批號RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在60°C I小時。該水解步驟后，混合物再次用蒸氣注射加熱數(shù)秒。隨后滾筒干燥混合物，獲得含有部分水解的大米蛋白的粉末，DH為13.2%，將其放置在鋁包中。
[0086]實施例7
[0087]將15Kg小麥粉、70kg水和用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)混合，通過蒸氣注射加熱數(shù)秒鐘，加入5%的Alcalase?2.4L AF酶(批號RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在60°C 2小時。該水解步驟后，混合物再次用蒸氣注射加熱數(shù)秒。隨后滾筒干燥混合物，獲得含有部分水解的小麥蛋白的粉末，DH為11%，將其放置在鋁包中。
[0088]實施例8
[0089]將15Kg谷物粉混合物(大米，小麥)、70kg水和用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)混合，通過蒸氣注射加熱數(shù)秒鐘，加入5%的Alcalase?2.4L AF 酶(批號 RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物在
60°C通過連續(xù)的管道泵出，維持I小時。該水解步驟后，混合物再次用蒸氣注射加熱數(shù)秒。隨后噴霧干燥混合物，獲得含有部分水解的大米和谷物蛋白的粉末，DH為9.2%，將其放置在鋁包中。
[0090]實施例9
[0091]將25Kg小麥粉和70kg水混合，在130°C加熱。加入5% Alca丨ase?2.4L AF酶(批號RBN00013批號500357，Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物溫度從60升至800C 3小時(~0.1rC /min)。該水解步驟后，混合物在90°C加熱15分鐘。隨后混合物冷卻至60°C用于制劑步驟，接著滾筒干燥獲得含有部分水解的小麥蛋白的粉末，將其放置在鋁包中。
[0092]實施例10
[0093]將15Kg谷物粉(大米，小麥)和乳蛋白、70kg水和用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)混合，通過蒸氣注射加熱數(shù)秒鐘，加入5%的Alcalase?2.4L AF 酶(批號 RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在60°C I小時。該水解步驟后，混合物再次用蒸氣注射加熱數(shù)秒。隨后滾筒干燥混合物，獲得水解的谷物粉末，將其放置在鋁包中。
[0094]實施例11
[0095]將20Kg小麥粉(按照美國專利4，374，860預(yù)處理以部分水解碳水化合物成分)和30kg的水和用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑溶液(Na (OH) 2或K (OH) 2或Ca (OH) 2)混合，加入5%的Alca 丨 ase?2.4L 酶(批號 RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在
600C 2小時。該第一步水解結(jié)束后，將混合物在90°C加熱15分鐘。向混合物中加入蔗糖、淀粉和脂肪；最終混合物通過蒸氣注射加熱數(shù)秒鐘，滾筒干燥、研磨獲得水解的谷物粉末，將其放置在鋁包中。
[0096]實施例12[0097]將20Kg小麥粉(按照美國專利4，374，860預(yù)處理以部分水解碳水化合物成分)、30kg的水和用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑溶液(Na(OH)2或K(OH)2或Ca(OH)2)與4kg未處理的小麥粉混合，通過蒸氣注射加熱數(shù)秒鐘，加入5%的Alcalase?2.4L酶(批號RBN00013, Novozymes A/S Bagsvaerd,丹麥)，將混合物維持在60°C 2小時。該第一步水解結(jié)束后，將混合物在90 C加熱15分鐘。向混合物中加入庶糖、淀粉和脂肪；最終混合物通過蒸氣注射加熱數(shù)秒鐘，滾筒干燥、研磨獲得水解的谷物粉末，將其放置在鋁包中。
[0098]含有谷物蛋白的部分水解物的谷物產(chǎn)物
[0099]說明書和實施例中提到的谷物產(chǎn)物可用于在對谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中誘導(dǎo)對該谷物蛋白的特異性口服耐受中。所述方法包括向該幼年哺乳動物提供治療量的谷物蛋白的部分水解物，其水解度介于9-18%。優(yōu)選地，所述幼年哺乳動物是人類嬰兒，年齡介于I到12歲。
[0100]通常，特異性的口服耐受誘導(dǎo)包括下列步驟:
[0101]-鑒定幼年哺乳動物的“維持劑量”，即不產(chǎn)生過敏反應(yīng)的谷物蛋白部分水解物的最大劑量。為鑒定維持劑量，從很低的劑量(例如0.2g谷物產(chǎn)品)開始向幼年哺乳動物施用增加量的谷物蛋白部分水解物，直到等于口服的通常每日攝入量為止。該步驟應(yīng)當(dāng)在醫(yī)學(xué)監(jiān)督下進行。
[0102]-使用維持劑量喂養(yǎng)幼年哺乳動物一至數(shù)月，例如2到10個月，通常約4-6個月。優(yōu)選地，所述維持劑量應(yīng)當(dāng)每天給予一次。
[0103]所述谷物產(chǎn)品可溶于水或奶后喂養(yǎng)，其也可以與食物例如蘋果醬、酸奶、果汁或湯混合。
[0104]所述谷物產(chǎn)品可含有7-10g蛋白/100g谷物產(chǎn)品，優(yōu)選8-9.5g蛋白/100g谷物產(chǎn)
品O
[0105]為了檢查是否獲得了特異性口服耐受誘導(dǎo)，可在醫(yī)學(xué)監(jiān)督的條件下用低劑量的天然谷物蛋白激發(fā)幼年哺乳動物。
[0106]實施例13
[0107]谷物產(chǎn)品組成的一個實例如下(除水以外的成分重量基于干物質(zhì)):
[0108]含部分水解的蛋白成分的大米粉(實施例6) 60%
蔗糖 12%
天然土豆淀粉15%
脂肪混合物 10%
維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.5%
水2.5%
[0109]實施例14
[0110]另一個谷物產(chǎn)品組成的實例如下(除水以外的成分重量基于干物質(zhì)):
[0111]
含部分水解的蛋白成分的大米粉(實施例6) 75%
蔗糖 15%
脂肪混合物 7%
維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.5%
水2.5%
[0112]實施例13和14的產(chǎn)品可通過混合在實施例6中獲得的產(chǎn)品制備(實施例13)或通過混合實施例3和4中獲得的產(chǎn)品制備(實施例14)，其中略去脂肪和蔗糖的最終干燥步驟。所述混合物進行常規(guī)谷物產(chǎn)品的熱處理、滾筒干燥和研磨。此時可通過干混加入任何熱或濕度敏感的成分，例如維生素或益生菌。也可加入非復(fù)制性益生菌。
[0113]實施例15
[0114]另一個谷物產(chǎn)品組成的實例如下(除水以外的成分重量基于干物質(zhì)):
[0115]
含部分水解的蛋白成分的大米粉(實施例7) 75%
蔗糖 15%
脂肪混合物 7%
維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.5%
水2.5%
[0116]實施例16
[0117]液態(tài)谷物產(chǎn)品組成的一個實例如下(除水以外的成分的重量以干物質(zhì)百分比表示):-
[0118]含部分水解的蛋白成分的大米粉(實施例3) 0.5%
含部分水解的蛋白成分的小麥粉(實施例4) 5%
HA嬰兒配方食品12.5%
天然淀粉 1.5%
維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.5%
水80%
[0119]實施例17
[0120]液態(tài)谷物產(chǎn)品組成的一個實例如下(除水以外的成分的重量以干物質(zhì)百分比表
示):-
[0121]
含部分水解的蛋白成分的大米粉(實施例3) 0.5%
含部分水解的蛋白成分的小麥粉(實施例4) 5%
7K解的乳清蛋白質(zhì) 1.5%
脂肪混合物 3.5%
乳糖 7.5%
天然淀粉 1.5%
維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.5%
水80%
[0122]實施例16和17的產(chǎn)品可通過在水中混合部分水解的大米和小麥粉與水解的乳清
蛋白質(zhì)、乳糖、淀粉以及礦物質(zhì)和維生素預(yù)混合物制備。隨后，產(chǎn)物混合物預(yù)熱至70°C，在
線加入脂肪混合物(僅對于實施例17)，所述產(chǎn)品經(jīng)UHT處理后冷卻。在冷卻期間產(chǎn)物在
250/50巴下勻漿，隨后繼續(xù)冷卻至環(huán)境溫度，在無菌條件下裝入紙盒或類似容器中。
[0123]實施例18
[0124]另一個谷物 產(chǎn)品組成的實例如下(除水以外的成分重量基于干物質(zhì))
[0125]含部分水解的蛋白和淀粉成分的小麥粉(實施例12) 75%
土豆淀粉 19%
脂肪混合物 2%
酶0.5%
維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.4%
緩沖鹽 0.1%
水3%
[0126]實施例19
[0127]另一個谷物產(chǎn)品組 成的實例如下(除水以外的成分重量基于干物質(zhì))
[0128]
含部分水解的蛋白的小麥粉(實施例4) 50 %
含部分水解的蛋白的奶(如專利US5039532所述)20%
具有部分水解蛋白的蛋(如專利W02007/144397A1所述)10% 土豆淀粉 14%
脂肪混合物 2%
酶0.5%
維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.4%
緩沖鹽 0.1%
水3%
[0129]實施例20
[0130]另一個谷物產(chǎn)品組成的實例如下(除水以外的成分重量基于干物質(zhì))
[0131]
含部分水解的蛋白和淀粉成分的小麥粉(實施例12) 65% 蔗糖10%
土豆淀粉 19%
脂肪混合物 2%
酶0.5%
[0132]維生素/礦物質(zhì)預(yù)混合物0.4%
緩沖鹽 0.1%
水3%
[0133]實施例13至20的組合物可用于在對小麥或大米蛋白過敏的幼年哺乳動物中誘導(dǎo)對小麥或大米的特異性口服耐受。
[0134]蛋白質(zhì)/肽的凝膠電泳分析
[0135]大米和小麥粉中蛋白質(zhì)的酶促水解效應(yīng)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析，使用NuPAGE12%Bis-Tris凝膠和銀染。結(jié)果顯示在圖1 (大米)和圖2 (小麥)中。在圖1中，泳道5對應(yīng)于實施例1的水解物，泳道6對應(yīng)于實施例2的水解物，以及泳道4對應(yīng)于實施例3的水解物。在圖2中，泳道3對應(yīng)于實施例4的水解物，泳道4對應(yīng)于實施例5的水解物。這些圖顯示，與全大米粉或小麥粉相比，在所有的水解情況下，部分水解的產(chǎn)品都大幅減少了蛋白條帶。
[0136]解產(chǎn)物中的總氮量通過Kjeldahl法測定。水解度根據(jù)Adler-Nissen的(J.Agric.Food.Chem.27:1256-1262，1979) TNBS 方法測定。
[0137]谷物水解物殘留的變應(yīng)原性
[0138]在部分水解前后，使用致敏的大鼠肥大細(xì)胞中氚標(biāo)記的5-羥色胺釋放的體外功能測試確定來自大米和小麥的潛在過敏原分子導(dǎo)致的IgE依賴的變應(yīng)原性。大米使用了總蛋白組分，小麥的研究則集中于麥醇溶蛋白，其是一種已知涉及發(fā)生小麥過敏的小麥蛋白。
[0139]簡而言之，該方法如下:將RBL-2H3細(xì)胞在RPMI中在250ml瓶內(nèi)培養(yǎng)。對于脫顆粒實驗，去除培養(yǎng)基，向細(xì)胞層加入4ml胰蛋白酶-EDTA，在37°C溫育10分鐘。輕微振蕩使細(xì)胞脫壁，加入6ml RPMI并混合。將9.5ml分裝于15ml藍(lán)頂Falcon管內(nèi)，在310g離心5分鐘(Sorval 1，轉(zhuǎn)子75006445)。棄去上清，向細(xì)胞沉淀中加入IOml RPMI，混合并在310g離心5分鐘。棄去上清，向細(xì)胞沉淀中加入IOml RPMI，混合，計數(shù)細(xì)胞并再懸浮于RPMI中(4xl05/ml)。將100 μ I該細(xì)胞混懸液分裝在96孔Costar板的孔中，板在37°C溫育過夜。
[0140]從各孔去除50 μ I培養(yǎng)基，替之以50 μ I鼠抗變應(yīng)原(麥醇溶蛋白/大米蛋白)IgE抗血清，其含有1μ 13Η5-羥色胺；在371:溫育2小時。用25(^1 HBSS輕輕洗滌所有的孔2次，完全除去上清，加入150 μ I變應(yīng)原標(biāo)準(zhǔn)品/樣品/HBSS/用HBSS稀釋的TritonX。37°C溫育 45min, 140g (Mistral2000)下離心 8min。將 50 μ I 上清轉(zhuǎn)移到 Optiplate 中，加A 200 μ I Microsint40,混合并計數(shù)放射性(Topcount Packard β -計數(shù)器).[0141]結(jié)果如圖3和4所示，其中可以看到，部分水解的谷物的變應(yīng)原性與相應(yīng)的完整谷物蛋白相比顯著下降:
[0142]8-25 μ g大米蛋白抗原/g蛋白。
[0143]25-175 μ g麥醇溶蛋白/g蛋白。
[0144]結(jié)果表示為每克蛋白能引發(fā)肥大細(xì)胞的大米蛋白/麥醇溶蛋白的量。
[0145]在圖3中，從左到右，第二個柱來自實施例3的水解物，第三個柱來自實施例1的水解物，第四個柱來自實施例2的水解物。在圖4中，從左到右，第二個柱來自實施例4的水解物，第三個柱來自實施例5的水解物。
【權(quán)利要求】
1. 谷物蛋白的部分水解物，其用于誘導(dǎo)對所述谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中的特異性口服耐受，其中所述水解物的水解度介于9-18%之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的水解物，其中所述水解度介于10-16%之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的水解物，其中所述谷物是大米、小麥、黑麥、玉米、大麥、燕麥或其混合物。
4.谷物粉，其用于誘導(dǎo)對所述谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中的特異性口服耐受，其中所述蛋白被部分水解，并且水解度介于9-18%之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的谷物粉，其中所述水解度介于10-16%之間。
6.谷物產(chǎn)品，其用于誘導(dǎo)對所述谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中的特異性口服耐受，所述產(chǎn)品包括按干物質(zhì)的重量百分比計的15-100%的根據(jù)權(quán)利要求4或5的谷物粉，0-40%的糖，0-30%的淀粉和0-30%的脂肪；和1-85%的水。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的谷物產(chǎn)品，其粘度在60°C/50rpm下介于2000-3000mPas。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的谷物產(chǎn)品，其中所述谷物產(chǎn)品包括低變應(yīng)原的卵蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任意一項的谷物產(chǎn)品，包括按干物質(zhì)的重量百分比計的5-10%的根據(jù)權(quán)利要求4或5的谷物粉，2-7%的乳固體，最高15%的脂肪，最高30%的糖和最高5%的淀粉；以及75-90%的水。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的谷物產(chǎn)品，其中所述乳固體通過低變應(yīng)原的嬰兒配方食品提供。
11.根據(jù)權(quán)利要求5-10任一項的谷物產(chǎn)品，其中所述谷物是大米、小麥、黑麥、燕麥、大麥或其混合物。
12.在對谷物蛋白過敏的幼年哺乳動物中誘導(dǎo)對所述谷物蛋白的特異性口服耐受的方法，包括對所述幼年哺乳動物喂食治療量的谷物蛋白的部分水解物，其水解度介于9-18%之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中幼年哺乳動物是人類嬰兒。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13任一項所述的方法，其中水解度介于10-16%之間。
【文檔編號】A61K36/899GK103582488SQ201280027679
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月5日
【發(fā)明者】A·梅賽尼爾, G·奧爾特加 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司