含有多個(gè)乙烯砜的分子的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明描述了含有多個(gè)乙烯砜的分子?？赏ㄟ^(guò)以下步驟形成所述含有多個(gè)乙烯砜的分子：將含有羥基的水溶性聚合物溶解于水溶液中以形成聚合物溶液；將含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子添加到所述聚合物溶液中；通過(guò)控制添加到所述聚合物上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量而形成修飾聚合物。本發(fā)明還描述了可包括所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和含有多個(gè)巰基的分子的水凝膠。所述水凝膠可由包括所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和所述含有多個(gè)巰基的分子的水溶液在輸送至人體的位點(diǎn)后發(fā)生凝膠化而形成。還描述了采用所述水凝膠的藥物輸送系統(tǒng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】含有多個(gè)乙烯砜的分子
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求名稱(chēng)為“在含有羥基的水溶性聚合物上產(chǎn)生乙烯砜基團(tuán)的方法”、申請(qǐng)日為2011年6月13日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/457，836的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)還要求名稱(chēng)為“用于治療眼后段疾病的原位水凝膠輸送系統(tǒng)”、申請(qǐng)日為2011年6月13日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/457，837的優(yōu)先權(quán)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明大致上涉及多乙烯砜分子的產(chǎn)生以及含有多個(gè)乙烯砜的分子的用途。
【背景技術(shù)】
[0004]生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用的許多聚合物是含有羥基的水溶性聚合物。含有羥基的水溶性聚合物的例子包括:透明質(zhì)酸(HA)、聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚乙烯醇、藻酸鹽、環(huán)式糊精等等。含有羥基的水溶性聚合物一般是無(wú)毒的，羥基基團(tuán)使得這些聚合物通?？扇芙庥谒喹h(huán)境中。但是，含有羥基的水溶性聚合物單獨(dú)使用時(shí)通常對(duì)動(dòng)物細(xì)胞或組織不具有功能性，必須用活性劑對(duì)其進(jìn)行修飾才能使其對(duì)動(dòng)物細(xì)胞或組織具有功能性。
[0005]例如，可將含有羥基的水溶性聚合物與疏水抗癌藥物連接，以提高該抗癌藥物的溶解度和靶向性?？蓪⒑辛u基的水溶性聚合物與蛋白質(zhì)或其他不穩(wěn)定生物分子連接，以延長(zhǎng)藥物在血液循環(huán)中的半衰期。其他例子包括制備納米顆粒和顯像劑。也可對(duì)含有羥基的水溶性聚合物進(jìn)行修飾以用作水凝膠。例如，用已修飾的含有羥基的水溶性聚合物制備的水凝膠可用于(例如)組織工程支架、藥物輸送儲(chǔ)存庫(kù)(depot)、聚合物-藥物綴合物中的藥物載體、以及其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。對(duì)含有羥基的水溶性聚合物進(jìn)行修飾以用于水凝膠中通常涉及復(fù)雜的化學(xué)和苛刻的條件，其價(jià)格可十分昂貴，不適合于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
[0006]上述背景僅為提供關(guān)于含有羥基的水溶性聚合物的背景信息，而并不是詳盡無(wú)遺的。在閱讀以下詳細(xì)說(shuō)明中的各種非限制性實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)后，其他內(nèi)容將變得顯而易見(jiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]以下提供本說(shuō)明書(shū)的簡(jiǎn)要概述，以便對(duì)本說(shuō)明書(shū)的某些方面有基本的理解。該概述并不是本發(fā)明的全面概述。其并不是為了確定本說(shuō)明書(shū)中的任何關(guān)鍵元素，也不是為了描述本說(shuō)明書(shū)的具體實(shí)施例的任何范圍或權(quán)利要求的任何范圍。其唯一目的是以簡(jiǎn)要的形式表述本說(shuō)明書(shū)中的某些概念并為隨后提供的更詳細(xì)的描述作鋪墊。
[0008]根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例以及相應(yīng)的內(nèi)容，描述了與用兩個(gè)或更多的乙烯砜基團(tuán)修飾的含有羥基的水溶性聚合物相關(guān)的多個(gè)非限制性的方面。在PH為約7.4、壓力為約I大氣壓、或溫度為約37攝氏度的溫和生理?xiàng)l件下，修飾聚合物在水介質(zhì)中可與活性劑結(jié)合，和/或在聚合物之間形成交聯(lián)。
[0009]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，描述了形成修飾聚合物的方法。將含有羥基的水溶性聚合物溶解于水溶液中以形成聚合物溶液。將含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子加入到所述聚合物溶液中。通過(guò)控制接枝到聚合物上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量來(lái)形成修飾聚合物。所述乙烯砜基團(tuán)具有化學(xué)反應(yīng)性。
[0010]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，描述了可由所述修飾聚合物制備的水凝膠。所述水凝膠包括所述修飾聚合物(含有多個(gè)乙烯砜的分子)和含有多個(gè)巰基的分子。在將水凝膠輸送到生物組織的位點(diǎn)后，在所述位點(diǎn)形成所述水凝膠。由包括所述修飾聚合物和所述含有多個(gè)巰基的分子的水溶液，通過(guò)所述修飾聚合物和所述含有多個(gè)巰基的分子之間的共價(jià)鍵，形成所述水凝膠。
[0011]在另一個(gè)實(shí)施例中，描述了一種藥物輸送系統(tǒng)。所述藥物輸送系統(tǒng)包括所述修飾聚合物(含有多個(gè)乙烯砜的分子)、含有多個(gè)巰基的分子和治療性分子。所述藥物輸送系統(tǒng)溶解于水中以形成水溶液，所述水溶液在施用到人體的位點(diǎn)后發(fā)生凝膠化。
[0012]以下描述及【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】本說(shuō)明書(shū)的某些示例性的方面。但是，這些方面僅表示實(shí)施本說(shuō)明書(shū)中的各種實(shí)施例的各種方式中的一些方式。當(dāng)結(jié)合附圖考慮時(shí)，本說(shuō)明書(shū)的其它方面可以從以下詳細(xì)描述中明顯地看出。
[0013]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0014]以下與附圖結(jié)合的 詳細(xì)描述中列舉了許多方面和實(shí)施例，其中相同的參考標(biāo)號(hào)在全文中表示相同的部件，而且其中:
[0015]圖1是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于在含有羥基的分子上產(chǎn)生功能性乙烯砜基團(tuán)的方法的示例性非限制性工藝流程圖；
[0016]圖2是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于控制接枝在含有羥基的聚合物上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量的方法的示例性非限制性工藝流程圖；
[0017]圖3是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的親核試劑-麥克爾加成過(guò)程的示例性非限制性工藝流程圖；
[0018]圖4是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于形成水凝膠的方法的示例性非限制性工藝流程圖；
[0019]圖5是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于施用藥物輸送系統(tǒng)的方法的示例性非限制性工藝流程圖；
[0020]圖6是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于在人體的位點(diǎn)形成包裹有治療性材料的水凝膠的方法的示例性非限制性工藝流程圖；
[0021]圖7是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的證實(shí)已在透明質(zhì)酸上修飾乙烯砜的示例性非限制性1HNMR結(jié)果圖；
[0022]圖8是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的證實(shí)已在右旋糖酐上修飾乙烯砜的示例性非限制性1HNMR結(jié)果圖；
[0023]圖9是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的證實(shí)已在聚乙酸乙烯酯上修飾乙烯砜的示例性非限制性1H NMR結(jié)果圖；
[0024]圖10是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的證實(shí)已在藻酸鹽上修飾乙烯砜的示例性非限制性1HNMR結(jié)果圖；
[0025]圖11是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的證實(shí)已在聚乙二醇上修飾乙烯砜的示例性非限制性1HNMR結(jié)果圖；
[0026]圖12是列出根據(jù)一個(gè)實(shí)施例采用不同合成方法在透明質(zhì)酸上修[0027]飾乙烯砜的程度的示例性非限制性表格；
[0028]圖13是表示根據(jù)一個(gè)實(shí)施例在右旋糖酐上修飾乙烯砜的程度的示例性非限制性曲線圖；
[0029]圖14示出根據(jù)一個(gè)實(shí) 施例的試驗(yàn)的示例性非限制性結(jié)果，該結(jié)果顯示，乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸在各種濃度下(0.1%至1%)以及經(jīng)過(guò)不同培養(yǎng)時(shí)間(5小時(shí)及20小時(shí))后均不具有細(xì)胞毒性。
[0030]圖15示出根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的示例性非限制性凝膠化動(dòng)力學(xué)以及實(shí)際凝膠的照片。
[0031]圖16是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的證實(shí)綴合成功的示例性非限制性1H NMR結(jié)果圖；
[0032]圖17是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的兔周邊視網(wǎng)膜在玻璃體內(nèi)注射10%透明質(zhì)酸后的示例性非限制性雙目間接顯微鏡圖像。
[0033]圖18是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的顯示抗體在體外從透明質(zhì)酸水凝膠釋放的示例性非限制性曲線圖；
[0034]圖19是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的顯示抗體在體外從透明質(zhì)酸水凝膠釋放的示例性非限制性曲線圖；
[0035]圖20是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的兔周邊視網(wǎng)膜的示例性非限制性雙目間接顯微鏡圖像，這些圖像中未見(jiàn)出血、視網(wǎng)膜脫落、水腫、新血管形成、或其他損傷的跡象。
[0036]圖21示例性非限制性地示出根據(jù)一個(gè)實(shí)施例通過(guò)眼球筋膜下向兔眼中注射聚合物。
[0037]圖22是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例在玻璃體內(nèi)注射包裹有NR-1gR的水凝膠一星期后的示例性非限制性照片，箭頭顯示水凝膠的位置。
[0038]圖23是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的已治療眼及對(duì)照眼的鞏膜和玻璃體中的熒光的示例性非限制性對(duì)照?qǐng)D。
【具體實(shí)施方式】
[0039]參照附圖描述了本發(fā)明公開(kāi)的各個(gè)方面或特征，其中相同的附圖標(biāo)記在全文中用于指代相同的元件。本說(shuō)明書(shū)中包含了大量具體細(xì)節(jié)，以便對(duì)本說(shuō)明書(shū)提供透徹的理解。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本說(shuō)明書(shū)中的某些方面可以在不需要這些細(xì)節(jié)的情況下實(shí)現(xiàn)，或應(yīng)用其它方法、成分、分子等等來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其他實(shí)例中，眾所周知的結(jié)構(gòu)和器件用框圖的形式示出，以便于各實(shí)施例的描述和說(shuō)明。
[0040]根據(jù)本說(shuō)明書(shū)中描述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例，本文描述了多乙烯砜分子:修飾有兩個(gè)或以上的乙烯砜基團(tuán)的含有多個(gè)羥基的水溶性分子。含有多個(gè)乙烯砜的分子可通過(guò)以下步驟形成:將含有羥基的水溶性分子溶解在水溶液中形成溶液；將含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子添加到所述溶液中；以及通過(guò)控制添加到所述分子中的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量來(lái)形成修飾分子。還描述了含有多個(gè)乙烯砜的分子的應(yīng)用，包括水凝膠和采用所述水凝膠的藥物輸送系統(tǒng)。所述水凝膠包括所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和含有多個(gè)巰基的分子，并可由包含所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和所述含有多個(gè)巰基的分子的水溶液形成，所述水溶液在被輸送到人體的位點(diǎn)后發(fā)生凝膠化。所述含有多個(gè)乙烯砜的分子在溫和水性條件下對(duì)所述含有多個(gè)巰基的分子具有活性。[0041]以下參見(jiàn)附圖，首先參見(jiàn)圖1，所示為根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于在含有羥基的分子上產(chǎn)生功能性乙烯砜基團(tuán)的方法100的示例性非限制性工藝流程圖。方法100使得可以簡(jiǎn)單、高效并可控地在含有羥基的分子上修飾功能性乙烯砜基團(tuán)。
[0042]方法100在水性環(huán)境(“水溶液”)中進(jìn)行，以獲得最大的產(chǎn)率和/或盡可能減小在生物系統(tǒng)中使用修飾分子時(shí)的潛在危險(xiǎn)。在步驟102中，將含有羥基的水溶性分子溶解在水溶液中以形成溶液。在一個(gè)實(shí)施例中，所述水溶液是堿性水溶液。所述堿性水溶液的pH高于7。在一個(gè)實(shí)施例中，所述堿性水溶液的pH為約8至約15。根據(jù)另一實(shí)施例，將含有羥基的水溶性分子溶解在PH約為7的水溶液中，并在含有羥基的水溶性分子溶解之后，將溶液的PH調(diào)節(jié)成堿性。
[0043]所述水溶液可包括鹽、水性溶劑、其他任何能調(diào)節(jié)溶液的pH的分子、其他任何有助于修飾的分子、或者其他任何能最大程度地減小在生物系統(tǒng)中使用修飾分子時(shí)的潛在危險(xiǎn)的分子。
[0044]根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述含有羥基的水溶性分子是含有羥基的水溶性聚合物。含有羥基的水溶性聚合物(或含羥基水溶性聚合物)的例子包括:透明質(zhì)酸(HA)、聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚乙烯醇(PVA)、藻酸鹽、環(huán)式糊精等等。
[0045]修飾是簡(jiǎn)單而高效的過(guò)程。在步驟104中，將含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子加入到溶液中。含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子的例子是二乙烯砜(DVS)。在步驟106中，通過(guò)控制添加到所述分子上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量來(lái)形成修飾分子。通過(guò)使用水作為溶劑的一步過(guò)程來(lái)形成所述修飾分子。在高PH下(堿性，pH高于約7)，溶解的含有羥基的分子對(duì)含有至少兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子具有反應(yīng)性。當(dāng)溶解的分子與摩爾過(guò)量的含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子反應(yīng)時(shí)，乙烯砜基團(tuán)被添加到所述分子上。在一個(gè)實(shí)施例中，所述修飾分子是生物相容的。
[0046]接枝在所述修飾分子上的乙烯砜基團(tuán)具有活性，并可與配對(duì)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述配對(duì)物是含`有親核試劑的分子。乙烯砜基團(tuán)能與親核試劑形成共價(jià)鍵。親核試劑的例子包括巰基和胺。
[0047]參見(jiàn)圖2，所示為根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于控制接枝在含有羥基的聚合物上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量的方法200的示例性非限制性工藝流程圖。在步驟202中，將含有羥基的水溶性聚合物溶解在水溶液中以形成聚合物溶液。所述含有羥基的水溶性聚合物可為任何水溶性并含有一個(gè)或多個(gè)羥基的聚合物。含有羥基的水溶性聚合物的例子包括:透明質(zhì)酸(HA)、聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚乙烯醇(PVA)、藻酸鹽、環(huán)式糊精等等。
[0048]在步驟204中，將含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子加入到聚合物溶液中。含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子的例子是二乙烯砜。所述水溶液和/或聚合物溶液是堿性的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述堿性溶液的PH高于約7。在另一實(shí)施例中，所述堿性溶液的pH為約8至約15。根據(jù)另一實(shí)施例，所述堿性溶液的PH為約11.5至約16。在另一實(shí)施例中，所述堿性溶液的pH為約11.5至約14.5。
[0049]在步驟206中，改變反應(yīng)條件以控制接枝到所述聚合物上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量或所述聚合物的修飾程度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，可在大范圍內(nèi)控制所述修飾程度。用于控制添加到所述分子上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量的不同機(jī)制包括:改變反應(yīng)時(shí)間、改變反應(yīng)pH、改變含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子的量、改變乙烯砜基團(tuán)與羥基之間的摩爾比、改變水溶液的堿性等等。在步驟208中，形成修飾聚合物。[0050]在一個(gè)實(shí)施例中，所述含有羥基的水溶性分子是透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸是一種每個(gè)雙糖單元含有四個(gè)羥基的聚合物。在高pH下，透明質(zhì)酸對(duì)二乙烯砜具有反應(yīng)性。例如，在高于約11.5的pH下，透明質(zhì)酸對(duì)二乙烯砜具有反應(yīng)性。在一個(gè)實(shí)施例中，透明質(zhì)酸在約12至約14.5的pH下對(duì)二乙烯砜具有反應(yīng)性。在另一實(shí)施例中，透明質(zhì)酸在約13.3的pH下對(duì)二乙烯砜具有反應(yīng)性。
[0051]糖中的羥基的pKa為約12至約13。因此，在高pH (高于約11.5)環(huán)境中，大部分的羥基被去質(zhì)子化并變成醇鹽離子(R0—)。由于醇鹽例子是具有活性的親核試劑，其能夠通過(guò)I，4-親核共軛加成(麥克爾式加成)與乙烯砜的親電雙鍵形成共價(jià)鍵。
[0052]此前麥克爾式加成反應(yīng)已被用于使透明質(zhì)酸與二乙烯砜交聯(lián)。在交聯(lián)反應(yīng)中，二乙烯砜與羥基的摩爾比很低(例如1:4)，以使每個(gè)二乙烯砜的兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)都與透明質(zhì)酸的羥基反應(yīng)，從而使透明質(zhì)酸的鏈交聯(lián)。如果二乙烯砜的乙烯砜基團(tuán)多于透明質(zhì)酸的羥基(提高二乙烯砜與羥基的摩爾比)，可以避免發(fā)生交聯(lián)?？赏ㄟ^(guò)優(yōu)化包括例如pH和時(shí)間等反應(yīng)參數(shù)來(lái)進(jìn)一步控制所述反應(yīng)。結(jié)果是二乙烯砜不是用作交聯(lián)劑，而是用作通過(guò)簡(jiǎn)單的“點(diǎn)擊”反應(yīng)來(lái)修飾聚合物的試劑。
[0053]按化學(xué)計(jì)量比，每個(gè)二乙烯砜分子只有一個(gè)乙烯砜基團(tuán)會(huì)與透明質(zhì)酸的OH基團(tuán)反應(yīng)。另一個(gè)乙烯砜基團(tuán)會(huì)保持未反應(yīng)狀態(tài)。未反應(yīng)的乙烯砜基團(tuán)可在隨后的“點(diǎn)擊”反應(yīng)中用作例如原位交聯(lián)點(diǎn)或蛋白質(zhì)結(jié)合點(diǎn)。
[0054]“點(diǎn)擊”反應(yīng)是一種通過(guò)將小(模塊化)單元連接在一起以快速及可靠地產(chǎn)生產(chǎn)物的反應(yīng)?！包c(diǎn)擊”反應(yīng)是模塊化的、范圍廣泛、化學(xué)產(chǎn)率高、副產(chǎn)品無(wú)害、立體定向、生理學(xué)穩(wěn)定、具有有利于單一反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)的強(qiáng)熱力學(xué)力(大于約84kJ/mol)、并具有高的原子經(jīng)濟(jì)性。優(yōu)選地，“點(diǎn)擊”反應(yīng)的反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、使用易于取得的起始材料和試劑、不需溶劑或使用溫和或易于清除的溶劑(水)、并可通過(guò)非色譜方法容易地分離產(chǎn)物。
[0055]此外，用于合成修 飾聚合物的方法是簡(jiǎn)單的“點(diǎn)擊”方法。這種簡(jiǎn)單的“點(diǎn)擊”方法使得所述修飾聚合物隨后在生理?xiàng)l件下變得“可點(diǎn)擊”。修飾聚合物產(chǎn)生適合于廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的“可點(diǎn)擊”的前體，而不是形成預(yù)先交聯(lián)的水凝膠。生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的例子包括藥物輸送和組織工程。
[0056]參見(jiàn)圖3，所示為根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的親核試劑-麥克爾加成過(guò)程300的示例性非限制性工藝流程圖。在步驟302中，形成含有多個(gè)乙烯砜的分子。在步驟304中，所述含有多個(gè)乙烯砜的分子與含有親核試劑的分子在溫和的生理?xiàng)l件下形成共價(jià)鍵。在一個(gè)實(shí)施例中，溫和的生理?xiàng)l件指PH為約5至約9、溫度為約10至40攝氏度、或者含水量為至少約90%。在另一實(shí)施例中，溫和的生理?xiàng)l件指pH為約7.4、壓力為約I個(gè)大氣壓、溫度為約37攝氏度、或者含水量為至少約99%。親核試劑的例子有胺和巰基。
[0057]在一個(gè)實(shí)施例中，所述含有多個(gè)乙烯砜的分子是由多個(gè)乙烯砜功能化的聚合物，所述親核試劑是巰基。所述由多個(gè)乙烯砜功能化的聚合物能夠參與隨后的與巰基配對(duì)物的巰基-麥克爾加成反應(yīng)。所述巰基-麥克爾加成反應(yīng)在親電雙鍵和巰基之間發(fā)生。在生理PH下，巰基被部分去質(zhì)子化變成巰基陰離子(S-，麥克爾受體)，所述巰基陰離子能容易地與某些缺電子雙鍵反應(yīng)，例如乙烯砜基團(tuán)(麥克爾受體)中的雙鍵。乙烯砜基團(tuán)與巰基之間的反應(yīng)是與蛋白質(zhì)、細(xì)胞、以及其他生物結(jié)構(gòu)相容的。
[0058]乙烯砜基團(tuán)與巰基之間的點(diǎn)擊反應(yīng)有助于形成水凝膠。所述水凝膠包含含有多個(gè)乙烯砜的分子和含有多個(gè)巰基的分子。參見(jiàn)圖4，所示為根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于合成水凝膠的方法400的非限制性工藝流程圖。在步驟402中，將含有多個(gè)乙烯砜的分子和含有多個(gè)巰基的分子的水溶液注入人體的位點(diǎn)。所述含有多個(gè)乙烯砜的分子可以是根據(jù)方法100或200修飾有乙烯砜功能性基團(tuán)的含有羥基的水溶性聚合物，所述含有多個(gè)巰基的分子含有巰基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述含有多個(gè)巰基的分子是含有至少兩個(gè)巰基的聚合物。在另一實(shí)施例中，所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和/或所述含有多個(gè)巰基的分子是多糖衍生物。
[0059]在步驟404中，由水溶液在所述位點(diǎn)通過(guò)共價(jià)鍵合所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和所述含有多個(gè)巰基的分子來(lái)形成水凝膠。所述水溶液也可包括能與治療性材料或生物組織相互作用的游離乙烯砜基團(tuán)和/或巰基。所述游離乙烯砜基團(tuán)和/或巰基可由調(diào)節(jié)分子調(diào)節(jié)。在另一實(shí)施例中，所述水溶液也可包括鹽、有機(jī)溶劑、治療性試劑或調(diào)節(jié)分子。
[0060] 水凝膠可用于許多應(yīng)用中，包括藥物輸送系統(tǒng)。圖5是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于施用藥物輸送系統(tǒng)的方法500的示例性非限制性工藝流程圖。方法500中的藥物輸送系統(tǒng)采用能夠在注入人體后發(fā)生原位凝膠化的聚合物。能夠在注入人體后發(fā)生原位凝膠化的聚合物的例子有含有多個(gè)乙烯砜的分子和含有多個(gè)巰基的分子。所述含有多個(gè)乙烯砜的分子可根據(jù)方法100-300由含有羥基的水溶性材料獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和/或所述含有多個(gè)巰基的分子是聚合物。所述聚合物可以是多糖衍生物。
[0061]所述藥物輸送系統(tǒng)還包括治療性分子(“藥物”)。治療性分子的例子包括:生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、肽、核酸、適體等)、顆粒小分子藥物、或者包裹有顆粒小分子藥物的顆粒。在一個(gè)實(shí)施例中，所述治療性分子可以是任何可用于治療眼后段疾病的治療性分子，所述眼后段疾病包括老年性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變。
[0062]根據(jù)方法500，在步驟502中，將包括含有多個(gè)乙烯砜的分子、含有多個(gè)巰基的分子和治療性分子的藥物輸送系統(tǒng)溶解在水性緩沖液中以形成水溶液。在一個(gè)實(shí)施例中，所述水性緩沖液是水。在步驟504中，所述水溶液在施用至人體的位點(diǎn)后發(fā)生凝膠化。在一個(gè)實(shí)施例中，所述人體的位點(diǎn)是人體的表面或人體的內(nèi)部。在另一實(shí)施例中，所述位點(diǎn)是眼后段。
[0063]在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)注射將所述水溶液施用至所述位點(diǎn)。所述水溶液可容易地注射至所述位點(diǎn)，甚至可使用小針，因此可將治療性材料置于靶向位點(diǎn)，而盡可能減小對(duì)周?chē)M織的影響。所述注射可以是注射至人體的表面或人體的內(nèi)部。注射類(lèi)型的例子包括:玻璃體內(nèi)注射、球周注射、眼球筋膜下注射等等。當(dāng)所述位點(diǎn)是眼時(shí)，用于注射的針可以是(例如)31號(hào)針(31gauged)，以便將治療性材料置于靶向位點(diǎn)，而盡可能減小對(duì)周?chē)劢M織的影響。
[0064]當(dāng)含有多個(gè)乙烯砜的分子與含有多個(gè)巰基的分子形成共價(jià)鍵時(shí)，所述水溶液可發(fā)生凝膠化。根據(jù)方法400，共價(jià)鍵合的含有多個(gè)巰基的分子和含有多個(gè)乙烯砜的分子可形成水凝膠。
[0065]在注入親水鏈中之后，含有多個(gè)乙烯砜的分子和含有多個(gè)巰基的分子發(fā)生交聯(lián)。交聯(lián)的親水鏈將治療性分子包裹起來(lái)。所述治療性分子被包裹在由所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和所述含有多個(gè)巰基的分子形成的網(wǎng)絡(luò)中。所述交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)保護(hù)所述治療性分子以免被酶消化，并避免所述治療性分子與組織接觸。此外，根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，可將不同類(lèi)型的治療性材料(例如，生物大分子和包裹有小分子的顆粒)包裹到同一個(gè)原位水凝膠中，以實(shí)現(xiàn)可控的聯(lián)合治療。
[0066]水凝膠內(nèi)部具有水性環(huán)境。對(duì)不穩(wěn)定生物分子來(lái)說(shuō)，相對(duì)于傳統(tǒng)聚合物植入物內(nèi)部的疏水環(huán)境，水凝膠內(nèi)部的水性環(huán)境使得不穩(wěn)定生物分子能夠保持正確的三維結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)不穩(wěn)定生物分子的穩(wěn)定性，并有助于保持不穩(wěn)定生物分子的治療效能。同樣地，包裹有藥物的顆粒在被包裹到水凝膠中之后便不會(huì)接觸血液/淋巴系統(tǒng)，從而減小了被排出的可能性。在眼中，這種包裹還降低了由于接觸眼組織而引起的諸如無(wú)菌眼內(nèi)炎等不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0067]水凝膠的形成和治療性分子的包裹在溫和的生理?xiàng)l件下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，溫和的生理?xiàng)l件指PH為約5至約9、溫度為約10至約40攝氏度、或者含水量為至少約90%。在另一實(shí)施例中，溫和的生理?xiàng)l件指PH為約7.4、壓力為約I個(gè)大氣壓、溫度為約37攝氏度、或者含水量為至少約99%。
[0068]水凝膠藥物輸送系統(tǒng)有助于向所述位點(diǎn)進(jìn)行可控藥物輸送。水凝膠藥物輸送系統(tǒng)可用于向所述位點(diǎn)持續(xù)輸送治療性物質(zhì)?？梢栽跀?shù)日、數(shù)月、或數(shù)年內(nèi)持續(xù)向所述位點(diǎn)輸送治療性物質(zhì)。由于水凝膠的原位凝膠化特性，治療性分子的釋放速率是可控的，例如，可通過(guò)控制交聯(lián)密度來(lái)控制。此外，可通過(guò)為不同藥物的釋放選擇不同的聚合物來(lái)進(jìn)一步控制釋放速率。例如，當(dāng)需要長(zhǎng)期釋放時(shí)，最好將諸如安維汀(Avastin)等帶正電荷的藥物包裹在諸如多乙烯砜透明質(zhì)酸等帶負(fù)電荷的聚合物中。
[0069]參見(jiàn)圖6，所示為根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的用于在人體的位點(diǎn)形成包裹有治療性材料的水凝膠的方法的示例性非限制性工藝流程圖。方法600表示一種原位形成水凝膠以向人體中的位點(diǎn)可控地輸送治療性物質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，所述治療性物質(zhì)是大分子和/或小分子治療性物質(zhì)，所述人體的位點(diǎn)是眼。
[0070]在步驟602中，將各成分溶解并混合在水溶液中。所述成分包括根據(jù)方法100-300形成的每個(gè)分子具有多個(gè)乙烯砜基團(tuán)的聚合物、每個(gè)分子具有多個(gè)巰基的分子、以及治療性分子和/或包裹有治療性分子的顆粒。
[0071]在步驟604中，將含有混合成分的水溶液注入人體的位點(diǎn)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述人體的位點(diǎn)是眼。注射后，在溫和的生理?xiàng)l件下，根據(jù)方法100-300形成的所述每個(gè)分子具有多個(gè)乙烯砜基團(tuán)的聚合物和所述每個(gè)分子具有多個(gè)巰基的分子交聯(lián)，而所述治療性材料被包裹在交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中。在步驟606中，在可控的凝膠化時(shí)間后形成包裹有所述治療性材料的水凝膠。所述形成和包裹過(guò)程都在原位發(fā)生。凝膠化時(shí)間是高度可控的，因此在注射后不久就完全形成所述水凝膠，而又不會(huì)太快，以便處理治療性材料。在一個(gè)實(shí)施例中，凝膠化時(shí)間足以完全包裹治療性材料，但比通過(guò)血液或淋巴循環(huán)排出游離治療性材料的時(shí)間短。
[0072]實(shí)驗(yàn)
[0073]以下實(shí)施例用于說(shuō)明用乙烯砜基團(tuán)修飾透明質(zhì)酸、右旋糖酐、聚乙烯醇、藻酸鹽和聚乙二醇。但是，應(yīng)注意，方法100-600并不限于上述聚合物；相反，方法100-600可用于所有含有羥基的水溶性聚合物?？梢愿淖冎T如聚合物的濃度、pH、乙烯砜與羥基的比等反應(yīng)變量的值和/或諸如純化過(guò)程、聚合物的選擇、含有巰基的聚合物的選擇、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)緩沖液等所述方法的步驟，以控制乙烯砜基團(tuán)在修飾聚合物的形成過(guò)程中添加到所述聚合物上。所述修飾聚合物上的乙烯砜基團(tuán)可參與隨后與巰基配對(duì)物之間的巰基-麥克爾“點(diǎn)擊”反應(yīng)。[0074]以下實(shí)施例是示例性的，其用于說(shuō)明以上描述的原理的應(yīng)用。應(yīng)注意，以下提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并不限制實(shí)施例的范圍。相反，以下數(shù)據(jù)僅用于根據(jù)本發(fā)明說(shuō)明組合物實(shí)施例的制備，以及展示以上描述的特性，以說(shuō)明所述組合物在藥物輸送中的用途。
[0075]修飾分子的合成
[0076]乙烯砜修飾透明質(zhì)酸的合成
[0077]將透明質(zhì)酸以2%w/v溶解于0.1M氫氧化鈉中(相當(dāng)于每毫升約200微摩爾羥基)。將摩爾比為透明質(zhì)酸的羥基的1.25倍的過(guò)量二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的透明質(zhì)酸溶液中。反應(yīng)進(jìn)行10分鐘，然后用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在調(diào)節(jié)pH之后，通過(guò)透析純化溶液并將其凍干。
[0078]如圖7所示，通過(guò)1H NMR證實(shí)結(jié)合成功。圖7 (A)涉及未修飾的透明質(zhì)酸，圖7(B)涉及用乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸。結(jié)構(gòu)式702表示未修飾的透明質(zhì)酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)式704表示用乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。曲線706是未修飾的透明質(zhì)酸的1H NMR譜，曲線708是用乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸的1H NMR譜。
[0079]游離乙烯砜雙鍵的NMR信號(hào)是圖7 (B)中的曲線708上的δ =6.3 (f ’)，6.4(e’)及6.9(d’)。修飾程度定義為乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量除以雙糖重復(fù)單元的數(shù)量，其可通過(guò)比較δ =6.9和δ =2 (雙糖的乙酰基)處的信號(hào)的積分而由1H NMR譜計(jì)算得到。
[0080]乙烯砜修飾右旋糖酐的合成
[0081]將右旋糖酐以2%w/v溶解于0.1M氫氧化鈉中。將1.5倍(與聚合物的羥基之間的摩爾比)過(guò)量二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的聚合物溶液中。用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在調(diào)節(jié)pH之后，通過(guò)透析純化溶液并將其凍干。圖8、信號(hào)802和804證實(shí)綴合成功。
[0082]乙烯砜修飾聚乙烯醇的合成
[0083]將聚乙烯醇以2%w/v溶解于0.1M氫氧化鈉中。將1.5倍(與聚合物的羥基之間的摩爾比)過(guò)量二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的聚合物溶液中。用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在調(diào)節(jié)pH之后，通過(guò)滲濾純化溶液并將其凍干。圖9、信號(hào)902和904證實(shí)綴合成功。
[0084]乙烯砜修飾藻酸鹽的合成
[0085]將藻酸鹽以2%w/v溶解于0.1M氫氧化鈉中。立即將1.5倍(與聚合物的羥基之間的摩爾比)過(guò)量二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的聚合物溶液中。用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在調(diào)節(jié)pH之后，通過(guò)滲濾純化溶液并將其凍干。圖10、信號(hào)1002和1004證實(shí)綴合成功。
[0086]乙烯砜修飾聚乙二醇的合成
[0087]將聚乙二醇以6%w/v溶解于0.1M氫氧化鈉中。將10倍(與聚合物的羥基之間的摩爾比)過(guò)量二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的聚合物溶液中。用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在調(diào)節(jié)pH之后，通過(guò)滲濾純化溶液并將其凍干。圖11、信號(hào)1102和1104證實(shí)綴合成功。
[0088]控制修飾稈度
[0089]可通過(guò)至少三種因素來(lái)控制某種含有羥基的水溶性聚合物的修飾程度:反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間以及二乙烯砜和羥基之間的摩爾比。[0090]以下實(shí)施例用于說(shuō)明如何控制透明質(zhì)酸和右旋糖酐的修飾程度；但是，應(yīng)注意，控制原理也適用于其他含有羥基的水溶性聚合物。
[0091 ] 控制乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸的修飾程度
[0092]將透明質(zhì)酸溶液溶解于nanopure water?并通過(guò)逐滴加入6M氫氧化鈉調(diào)節(jié)至不同PH值(在9至10的范圍內(nèi))。將摩爾比為透明質(zhì)酸的羥基的1.25倍的過(guò)量二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的透明質(zhì)酸溶液中。反應(yīng)進(jìn)行12小時(shí)，然后用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在時(shí)間控制實(shí)驗(yàn)中，將透明質(zhì)酸以2%w/v溶解于0.01M或0.1M氫氧化鈉中。將摩爾比為透明質(zhì)酸的羥基的1.25倍的過(guò)量二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的透明質(zhì)酸溶液中。在預(yù)先確定的時(shí)間點(diǎn)用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。
[0093]為研究二乙烯砜:羥基摩爾比的變化，將透明質(zhì)酸溶解于0.1M氫氧化鈉中，并立即將摩爾比為透明質(zhì)酸的羥基的1.25倍、2.5倍或10倍的二乙烯砜加入到劇烈振蕩下的透明質(zhì)酸溶液中。在預(yù)先確定的時(shí)間點(diǎn)用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在調(diào)節(jié)pH之后，通過(guò)滲濾純化溶液并將其凍干。
[0094]通過(guò)1H NMR驗(yàn)證綴合成功以及修飾程度。圖12中的表格表示透明質(zhì)酸的修飾的類(lèi)型。所合成的乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸的修飾程度可低于3%或高達(dá)160%。
[0095]控制乙烯砜修飾的右旋糖酐的修飾程度
[0096]將右旋糖酐溶解于0.025M氫氧化鈉溶液中，并將1.2倍的二乙烯砜加入到劇烈攪拌下的右旋糖酐溶液中。在預(yù)先確定的時(shí)間點(diǎn)用5M鹽酸調(diào)節(jié)pH至5以停止反應(yīng)。在調(diào)節(jié)PH之后，通過(guò)透析或滲濾或其他類(lèi)型的方法純化溶液并將其凍干。如圖13所示，通過(guò)1HNMR驗(yàn)證綴合成功以及修飾程度。
[0097]乙烯砜修飾聚合物的細(xì)胞毒性
[0098]為檢驗(yàn)綴合在聚合物上的乙烯砜基團(tuán)對(duì)細(xì)胞是否具有毒性，用Live/Death試驗(yàn)測(cè)試乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸的細(xì)胞`毒性。
[0099]在96孔板上培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，加入濃度為0.1%至1%的乙烯砜修飾透明質(zhì)酸并培育5小時(shí)或20小時(shí)，然后進(jìn)行試驗(yàn)。如圖14所示，未觀察到細(xì)胞毒性效應(yīng)(在該試驗(yàn)中，活細(xì)胞顯示為綠色，死細(xì)胞顯示為紅色；未觀察到紅色)。
[0100]乙烯砜修飾聚合物與巰基的反應(yīng)
[0101]以下實(shí)施例表明，乙烯砜修飾聚合物在溫和水性條件下可與巰基反應(yīng)。由于這些條件與不穩(wěn)定生物分子、細(xì)胞、動(dòng)物及人體相容，因此乙烯砜修飾聚合物是用于制備原位水凝膠、聚合物-藥物綴合物、蛋白質(zhì)包裹、表面修飾等的良好材料。
[0102]乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸與二硫蘇糖醇的反應(yīng)以及原位水凝膠的制備
[0103]將乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸以諸如7%w/v的各種濃度溶解于水性緩沖溶液中，例如0.1Μ、ρΗ為7.4的磷酸鹽緩沖液(PB)。將含有兩個(gè)巰基的小分子二硫蘇糖醇以0.1毫克/微升溶解于相同的緩沖溶液中，并以摩爾比1:1/SH:VS加入到聚合物溶液中。圖15示出凝膠化動(dòng)力學(xué)1504和實(shí)際所得凝膠1502的照片。
[0104]乙烯砜修飾的右旋糖酐與二硫蘇糖醇的反應(yīng)以及原位水凝膠的制備
[0105]將乙烯砜修飾的右旋糖酐以諸如7%w/v等各種濃度溶解于水性緩沖溶液中，例如
0.1Μ、ρΗ為7.4的磷酸鹽緩沖液(PB)。將交聯(lián)劑二硫蘇糖醇以0.1毫克/微升溶解于相同的緩沖溶液中，并以摩爾比1:1/SH:VS加入到聚合物溶液中。圖15示出凝膠化動(dòng)力學(xué)1506和實(shí)際所得凝膠1508的照片。
[0106]在乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸上綴合還原型谷胱甘肽
[0107]將乙烯砜修飾的透明質(zhì)酸以l%w/v溶解于水性緩沖溶液中，例如0.1M、pH為7.4的PB。將兩倍過(guò)量(與乙烯砜基團(tuán)的摩爾比)的谷胱甘肽加入到聚合物溶液中。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)，將產(chǎn)物徹底透析并且凍干。如圖16中的1602所示，通過(guò)1H NMR驗(yàn)證綴合成功。
[0108]在乙烯砜修飾的右旋糖酐上綴合還原型谷胱甘肽
[0109]將乙烯砜修飾的右旋糖酐以l%w/v溶解于水性緩沖溶液中，例如0.1M、pH為7.4的PB。將兩倍過(guò)量(與乙烯砜基團(tuán)的摩爾比)的谷胱甘肽加入到聚合物溶液中。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)，將產(chǎn)物徹底透析并且凍干。如圖16中的1604所示，通過(guò)1H NMR驗(yàn)證綴合成功。
[0110]乙烯砜接枝的聚合物與兔眼的相容性
[0111]為檢驗(yàn)接枝在聚合物上的乙烯砜基團(tuán)是否對(duì)眼有毒，用乙烯砜接枝透明質(zhì)酸作為示例。將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸以10%w/v溶解于PBS并通過(guò)玻璃體內(nèi)注射注入兔眼。使用雙眼間接顯微鏡(BIO)檢驗(yàn)兔視網(wǎng)膜。
[0112]在第7天及一個(gè)月后均未觀察到出血、視網(wǎng)膜脫落、水腫、新血管形成或任何其他損傷。圖17示出了具有代表性的雙眼間接顯微鏡圖像。
[0113]用小分子交聯(lián)劑交聯(lián)乙烯砜接枝的聚合物
[0114]每個(gè)分子具有兩個(gè)`或更多乙烯砜基團(tuán)的聚合物可用具有兩個(gè)或更多巰基的小分子交聯(lián)。在以下實(shí)施例中，在生理PH下用二巰基小分子二硫蘇糖醇交聯(lián)兩種乙烯砜接枝的聚合物:乙烯砜接枝透明質(zhì)酸和乙烯砜接枝的右旋糖酐。
[0115]應(yīng)注意，該方法并不限于這兩種聚合物和我們采用的特定交聯(lián)分子，而所采用的具體方案，例如特定的緩沖液、pH、濃度、純化方法等，也僅作為示例。
[0116]乙烯砜接枝透明質(zhì)酸與二硫蘇糖醇的反應(yīng)以及原位水凝膠的制備
[0117]將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸以各種濃度溶解于水性緩沖溶液中，例如0.1M、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)。
[0118]將含有兩個(gè)巰基的小分子二硫蘇糖醇以0.1毫克/微升溶解于相同的緩沖溶液中，并以摩爾比1:1/SH:VS加入到聚合物溶液中。
[0119]在混合后不久形成水凝膠。
[0120]乙烯砜接枝的右旋糖酐與二硫蘇糖醇的反應(yīng)以及原位水凝膠的制備
[0121]將乙烯砜接枝的右旋糖酐以各種濃度溶解于水性緩沖溶液中，例如PBS。將交聯(lián)劑二硫蘇糖醇以0.1毫克/微升溶解于相同的緩沖溶液中，并以摩爾比1:1/SH:VS加入到聚合物溶液中。在混合后不久形成水凝膠。
[0122]用含有巰基的聚合物交聯(lián)乙烯砜接枝的聚合物
[0123]每個(gè)分子具有兩個(gè)或更多乙烯砜基團(tuán)的聚合物可用其他大分子交聯(lián)，例如用每個(gè)分子具有兩個(gè)或更多巰基的聚合物交聯(lián)。在以下實(shí)施例中，用兩種含有巰基的聚合物:巰基透明質(zhì)酸(HA-SH)和巰基右旋糖酐(右旋糖酐-SH)交聯(lián)兩種VS接枝的聚合物:乙烯砜接枝透明質(zhì)酸和乙烯砜接枝的右旋糖酐。
[0124]應(yīng)注意，該方法并不限于這兩種聚合物，而所采用的具體方案，例如特定的緩沖液、pH、濃度、純化方法等，也僅作為示例。
[0125]HA-SH 的合成
[0126]將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸以1%溶解于pH為7.4的緩沖溶液中，例如0.1Μ、ρΗ為7.4的磷酸鹽緩沖液(PB)并用氮?dú)獯祾?。將等摩爾的二硫蘇糖醇(DTT，與未修飾的HA的羥基的摩爾比)以預(yù)先溶解于緩沖溶液中的等分物加入反應(yīng)。加入DTT后的pH約為7.4。
[0127]反應(yīng)進(jìn)行30分鐘,用IM鹽酸重新調(diào)節(jié)pH至4.5以停止反應(yīng),通過(guò)滲濾純化溶液并將其凍干。利用1H NMR譜和Ellman試驗(yàn)通過(guò)乙烯砜雙鍵的消失來(lái)驗(yàn)證修飾成功。
[0128]右旋糖酐-SH的合成
[0129]將乙烯砜接枝的右旋糖酐(右旋糖酐-VS)以1%溶解于pH為7.4的緩沖溶液中，例如0.1Μ、ρΗ為7.4的磷酸緩沖液(PB)并用氮?dú)獯祾?。將等摩爾的二硫蘇糖醇(DTT，與未修飾的HA的羥基的摩爾比)以預(yù)先溶解于緩沖溶液中的等分物加入反應(yīng)。加入DTT后的PH約為7.4。反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，用IM鹽酸重新調(diào)節(jié)pH至4.5以停止反應(yīng)，通過(guò)滲濾純化溶液并將其凍干。利用1H NMR譜和Ellman試驗(yàn)通過(guò)乙烯砜雙鍵的消失來(lái)驗(yàn)證修飾成功。
[0130]乙烯砜接枝透明質(zhì)酸與HA-SH的反應(yīng)以及原位水凝膠的制備
[0131]以諸如10%w/v等各種濃度將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸和HA-SH分別溶解于諸如PBS等水性緩沖溶液中?；旌虾蟛痪眯纬伤z。
[0132]乙烯砜接枝的右旋糖酐與右旋糖酐-SH的反應(yīng)以及原位水凝膠的制備
[0133]以諸如10%w/v等各種濃度將乙烯砜接枝的右旋糖酐和右旋糖酐-SH分別溶解于諸如PBS等水性緩沖溶液中?；旌虾蟛痪眯纬伤z。
[0134]乙烯砜接枝的右旋糖酐與HA-SH的反應(yīng)以及原位水凝膠的制備
[0135]以諸如10%w/v等各種濃度將乙烯砜接枝的右旋糖酐和HA-SH分別溶解于諸如PBS等水性緩沖溶液中。混合后不久形成水凝膠。
[0136]將大分子包裹在原位水凝膠中及其體外釋放
[0137]以下實(shí)施例展示大分子在體外從水凝膠中可控地釋放。使用由小分子交聯(lián)劑二硫蘇糖醇或聚合物交聯(lián)劑HA-SH交聯(lián)的乙烯砜接枝透明質(zhì)酸形成的透明質(zhì)酸基水凝膠、以及三種模型蛋白:牛血清白蛋白(BSA)、近紅外標(biāo)記IgG(NIR-1gG)和安維汀作為模式聚合物和大分子。
[0138]應(yīng)注意，聚合物的選擇很大程度上取決于所用的藥物。例如，安維汀是一種廣泛用于治療包括老年性黃斑變性的各種眼科疾病的全長(zhǎng)抗體藥物。安維汀的分子量為150kDa，在中性pH下帶正電。
[0139]因此，如果需要，可用帶負(fù)電的聚合物透明質(zhì)酸來(lái)延緩藥物的釋放。
[0140]必要時(shí)，可將帶不同電荷的聚合物混合以提供合適的釋放動(dòng)力學(xué)。
[0141]用二硫蘇糖醇交聯(lián)的乙烯砜接枝透明質(zhì)酸制備的水凝膠以及BSA的釋放
[0142]以0.1%至10%w/v的各種濃度將BSA溶解于pH為7.4的緩沖溶液中。將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸溶解于該蛋白質(zhì)溶液中。以0.1毫克/微升將交聯(lián)劑二硫蘇糖醇溶解于相同的緩沖溶液中，并以摩爾比1:1/SH: VS加入到乙烯砜接枝透明質(zhì)酸/BSA溶液中。
[0143]混合后形成凝膠，蛋白質(zhì)被包裹在凝膠中。然后加入PBS以作為蛋白質(zhì)釋放的漏槽。圖18示出了超過(guò)兩個(gè)月的蛋白質(zhì)(BSA)釋放數(shù)據(jù)。少于30%的蛋白質(zhì)被釋放。
[0144]用HA-SH交聯(lián)的乙烯砜接枝透明質(zhì)酸制備的水凝膠以及NIR-1gG和安維汀的釋放[0145]將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸和HA-SH分別溶解于PBS。將抗體加入聚合物，然后立即混合兩種聚合物。在混合之后，將聚合物和藥物的混合物培養(yǎng)過(guò)夜以確保凝膠化完成。然后加入PBS以作為蛋白質(zhì)釋放的漏槽。
[0146]圖19示出了超過(guò)一個(gè)月的蛋白質(zhì)釋放數(shù)據(jù)。超過(guò)95%的抗體仍然留在該凝膠中，顯示該凝膠具有良好的可控釋放性質(zhì)。
[0147]將包裹藥物的顆粒包裹在水凝膠中
[0148]以下實(shí)施例說(shuō)明如何將包裹藥物的顆粒包裹在原位水凝膠中。使用的模式藥物分子是去炎松，一種廣泛用于治療各種眼科炎癥的類(lèi)固醇藥物。
[0149]應(yīng)注意，該方法并不限于這種特定的藥物、特定的顆粒以及特定的乙烯砜修飾聚合物和交聯(lián)劑，而所采用的具體方案，例如特定的緩沖液、pH、濃度、純化方法等，也僅作為示例。
[0150]可將模型藥物去炎松包裹在由FTAEA和F-moc苯基丙氨酸形成的直徑約為100納米的雙組分納米顆粒中。將所述納米顆粒溶解于pH為7.4的緩沖溶液中。
[0151]將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸溶解于pH為7.4的緩沖溶液中并于納米顆粒溶液混合。將HA-SH溶解于與乙烯砜接枝透明質(zhì)酸相同的緩沖溶液中并加入到乙烯砜接枝透明質(zhì)酸/納米顆?；旌衔镏小Ｔ诨旌虾蠛芸炀托纬赡z。
[0152]水凝膠的眼相容性
[0153]以下實(shí)施例說(shuō)明水凝膠在體內(nèi)的生物相容性。使用透明質(zhì)酸基的水凝膠作為示例。但是，應(yīng)注意，聚合物的 選擇以及所采用的具體方案，例如特定的緩沖液、pH、濃度、純化方法等，僅作為示例。
[0154]將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸和HA-SH分別溶解于PBS。在混合之后，通過(guò)玻璃體內(nèi)注射將50微升聚合物混合物注入兔眼。定期用雙眼間接顯微鏡檢驗(yàn)被注入眼。所有檢驗(yàn)中均未觀察到出血、視網(wǎng)膜脫落、水腫、新血管形成或任何其他損傷。圖20示出了具有代表性的雙眼間接顯微鏡圖像。
[0155]將包裹蛋白質(zhì)的原位水凝膠注入兔眼
[0156]以下實(shí)施例展示將水凝膠注入兔眼以及藥物在體內(nèi)從水凝膠中可控地釋放。使用透明質(zhì)酸基的水凝膠和NIR-1gG作為模型聚合物和藥物分子，NIR-1gG在結(jié)構(gòu)上與廣泛用于治療眼疾的抗VEGF抗體安維汀相似。但是，應(yīng)注意，聚合物的選擇很大程度上取決于使用的藥物，而所采用的具體方案，例如特定的緩沖液、pH、濃度、純化方法等，僅作為示例。
[0157]眼球筋膜下注射包裹蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸原位水凝膠
[0158]將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸和HA-SH分別溶解于PBS。加入NIR-1gG并立即混合兩種聚合物。在混合之后，通過(guò)眼球筋膜下注射將600微升聚合物/藥物混合物注入兔眼(如圖21 (A)所示)。
[0159]一周后，摘除兔眼，并從眼球筋膜下空間清除凝膠。用NIR熒光成像儀檢驗(yàn)鞏膜中是否存在NIR-1gG。如圖21 (B)所示，被處理的兔眼鞏膜中的熒光說(shuō)明藥物在體內(nèi)釋放。
[0160]玻璃體內(nèi)注射包裹蛋白質(zhì)的透明質(zhì)酸原位水凝膠
[0161]將乙烯砜接枝透明質(zhì)酸和HA-SH分別溶解于PBS。將抗體加入到聚合物中并立即混合兩種聚合物。
[0162]在混合之后，通過(guò)玻璃體內(nèi)注射將50微升聚合物/藥物混合物注入兔眼。一周后，處死兔并摘除兔眼。將兔眼對(duì)切，用NIR熒光成像儀檢驗(yàn)兔眼中是否存在NIR-1gG。
[0163]圖22是對(duì)切的兔眼球的照片?？汕宄乜吹?，玻璃體包圍著透明的水凝膠。
[0164]圖23顯示被處理兔眼和對(duì)照兔眼的玻璃體的比較。被處理兔眼的玻璃體中的熒光說(shuō)明藥物在體內(nèi)釋放。
[0165]以上所描述的包含了本發(fā)明主題的實(shí)施例示例。當(dāng)然，不可能將要求保護(hù)的主題中所有方法、元素的所有可能組合均描述出來(lái)，但應(yīng)理解，不同實(shí)施例之間可有更多進(jìn)一步的組合和排列。因此，本發(fā)明的主題意在包羅所有在所附的權(quán)利要求的思想和范圍內(nèi)的所有改動(dòng)、修改和變型。雖然本說(shuō)明書(shū)中以闡述為目的而描述了特定的實(shí)施例和示例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可有各種修改而不會(huì)超出這些實(shí)施例和示例的范圍。
[0166]此外，本文中使用的詞語(yǔ)“示例”或“示例性的”意為作為例子、示范或說(shuō)明。本文中任何被描述為“示例性的”方面或設(shè)計(jì)相對(duì)于其它方面或設(shè)計(jì)并不一定是優(yōu)選的或有優(yōu)勢(shì)的。相反地，“示例性的”一詞僅用于用具體的方式表達(dá)概念。在此申請(qǐng)中，“或者”一詞的意思是包容性的而非排他性的。也就是說(shuō)，除非另有說(shuō)明或可從上下文得知，“X采用A或B”用于表示任何自然包容性的排列。也就是說(shuō)，若X采用A、X采用B、或X既采用A也采用B這三者中任一者成立，則“X采用A或B”即成立。此外，在本說(shuō)明書(shū)及所附的權(quán)利要求中，詞語(yǔ)“一個(gè)” 一般應(yīng)理解為“一個(gè)或更多”，除非另有說(shuō)明或從上下文可得知其表示單數(shù)。
[0167]此外，雖然發(fā)明中的某方面只在一些實(shí)施例中的一個(gè)中公開(kāi)，但若對(duì)于任何給定或特定的應(yīng)用有利，該特征可以與其他實(shí)施例的一個(gè)或多個(gè)其他特征結(jié)合。此外，在發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明和權(quán)利要求中出現(xiàn)的“包括” “有” “含有”及其變形等類(lèi)似詞語(yǔ)作為連接詞意為包容性的“包括”，即不排除附加或其他元素。
[0168]在本說(shuō)明書(shū)中，諸如溫度、濃度、時(shí)`間、比率等的數(shù)值數(shù)據(jù)以范圍的方式表示。這種范圍的方式只是為了方便和簡(jiǎn)潔的目的。這種范圍的方式應(yīng)靈活地理解為不僅包括作為范圍的限制而明確敘述的數(shù)值，也包括所述范圍內(nèi)的所有各個(gè)數(shù)值或子范圍，就如同所述范圍內(nèi)的所有各個(gè)數(shù)值或子范圍也明確敘述了一樣。本說(shuō)明書(shū)中記載的任何數(shù)值都應(yīng)理解為隱含“大約”的意思。由測(cè)量時(shí)可能產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差而得出的值應(yīng)理解為包含在所述數(shù)值中。
【權(quán)利要求】
1.一種藥物輸送系統(tǒng)，包括: 含有多個(gè)乙烯砜的分子； 含有多個(gè)巰基的分子；以及 治療性分子， 其中: 所述藥物輸送系統(tǒng)溶解于水中以形成水溶液，以及 所述水溶液在施用至人體的位點(diǎn)后發(fā)生凝膠化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物輸送系統(tǒng)，其中當(dāng)所述含有多個(gè)乙烯砜的分子與所述含有多個(gè)巰基的分子形成共價(jià)鍵時(shí)，所述水溶液發(fā)生所述凝膠化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物輸送系統(tǒng)，其中所述治療性分子被包裹在由所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和所述含有多個(gè)巰基的分子形成的網(wǎng)絡(luò)中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物輸送系統(tǒng)，其中所述治療劑是生物大分子或包裹藥物分子的顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物輸送系統(tǒng)，其中所述藥物輸送系統(tǒng)通過(guò)注射施用至所述人體的表面或所述人體的內(nèi)部。
6.根 據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物輸送系統(tǒng),其中所述藥物輸送系統(tǒng)通過(guò)玻璃體內(nèi)注射、球周注射、或眼球筋膜下注射施用至所述人體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物輸送系統(tǒng)，其中所述含有多個(gè)乙烯砜的分子是聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物輸送系統(tǒng)，其中所述聚合物衍生自含有羥基的聚合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物輸送系統(tǒng),其中 所述水溶液發(fā)生所述凝膠化而形成水凝膠，以及 所述治療性分子通過(guò)治療劑從所述水凝膠的擴(kuò)散或通過(guò)所述水凝膠的降解而被從所述水凝膠釋放。
10.一種方法，包括: 將含有羥基的水溶性聚合物溶解在水溶液中以形成聚合物溶液； 將含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子添加到所述聚合物溶液中；以及通過(guò)控制接枝到所述聚合物上的乙烯砜基團(tuán)的數(shù)量來(lái)形成修飾聚合物，其中接枝到所述聚合物上的所述乙烯砜基團(tuán)具有化學(xué)反應(yīng)性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述溶解進(jìn)一步包括將所述水溶性聚合物溶解在含有鹽或有機(jī)溶劑的所述水溶液中。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述溶解進(jìn)一步包括將所述水溶性聚合物溶解在堿性水溶液中。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述控制進(jìn)一步包括改變反應(yīng)時(shí)間、含有兩個(gè)乙烯砜基團(tuán)的分子的量、或所述水溶液的堿性。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，進(jìn)一步包括共價(jià)鍵合所述修飾聚合物和含有親核試劑的分子。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述親核試劑是巰基或胺。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述共價(jià)鍵合進(jìn)一步包括在pH為約5到約9、溫度為約10到約40攝氏度、或含水量為至少約90%的水性條件下共價(jià)鍵合所述修飾聚合物和所述含有親核試劑的分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述共價(jià)鍵合進(jìn)一步包括在pH為約7.4、溫度為約37攝氏度、并且含水量為至少約99%的生理水性條件下共價(jià)鍵合所述修飾聚合物和所述含有親核試劑的分子。
18.一種水凝膠，包括: 含有多個(gè)乙烯砜的分子，以及 含有多個(gè)巰基的分子，其中 由含有所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和所述含有多個(gè)巰基的分子的水溶液在所述水溶液被輸送到生物組織的位點(diǎn)后，通過(guò)所述含有多個(gè)乙烯砜的分子和所述含有多個(gè)巰基的分子之間的共價(jià)鍵，在所述位點(diǎn)形成所述水凝膠。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的水凝膠，其中所述含有多個(gè)乙烯砜的分子是含有至少一個(gè)乙烯砜基團(tuán)的聚合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的水凝膠，其中所述含有多個(gè)巰基的分子是含有兩個(gè)或更多疏基的聚合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的水凝膠，其中所述含有多個(gè)乙烯砜的分子或所述含有多個(gè)巰基的分子是多糖衍生 物。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的水凝膠，進(jìn)一步包括用于與治療劑或所述生物組織相互作用的游離乙烯砜基團(tuán)或巰基。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的水凝膠，其中所述水溶液含有鹽、有機(jī)溶劑、治療劑或者調(diào)節(jié)所述游離乙烯砜基團(tuán)和巰基的量的分子。
【文檔編號(hào)】A61K47/20GK103687622SQ201280029538
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月16日
【發(fā)明者】周迎, 余渝 申請(qǐng)人:香港科技大學(xué)