調(diào)節(jié)皮膚黑素細胞中色素沉著過程的方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了調(diào)節(jié)黑素細胞中的黑素體成熟過程的方法。另外，描述了可逆地改變?nèi)吮砥てつw中的色素沉著過程的方法。所述方法以黑素體成熟和黑素體向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移為目標，這是色素沉著中涉及的關(guān)鍵過程，因為其潛在用于可預(yù)測地和受控地調(diào)節(jié)人皮膚中的色素沉著。
【專利說明】調(diào)節(jié)皮膚黑素細胞中色素沉著過程的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)可見的皮膚色素沉著(pigmentation)。本發(fā)明涉及IFN-Y在使階段I和II的黑素體(melanosome)的成熟停止而導(dǎo)致色素減退(hypopigmentation)并在除去IFN-Y后恢復(fù)該過程中的作用。整個色素沉著過程由在早期階段I和II中黑素體形成、黑素合成、黑素體成熟以及隨后黑素體向角質(zhì)形成細胞(keratinocyte)轉(zhuǎn)移組成。通過控制IFN-Y的濃度，能夠以可預(yù)測的方式調(diào)節(jié)黑素體成熟的過程。本發(fā)明涉及IFN-Y及其激動劑和拮抗劑調(diào)節(jié)人的色素沉著用于臨床或藥物化妝品(cosmaceutical)目的的用途。 【背景技術(shù)】
[0002]色素沉著是涉及來自人表皮的兩種細胞黑素細胞和角質(zhì)形成細胞的獨特過程。黑素細胞通過一系列清楚界定的程序化協(xié)調(diào)步驟在細胞器黑素體中產(chǎn)生黑素聚合物，然后具有色素的黑素體轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細胞中(Hu等，2007)。皮膚中觀察到的色素是由于角質(zhì)形成細胞中黑素體的存在。色素沉著的完整過程可以大致分成四個不同的生物過程:1)黑素體形成的開始，2)涉及數(shù)種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的黑素體成熟階段1、I1、III和IV，3)在黑素體成熟的階段III和IV中的黑素生物合成，4)階段III和IV黑素體向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移。破壞這些步驟中的任何步驟都可以導(dǎo)致皮膚色素沉著水平的改變。細胞器的成熟是人體中細胞程序的非常重要的組成部分。在本發(fā)明中，我們表明，干擾素-Y (IFN-y)直接調(diào)節(jié)黑素體成熟和從黑素細胞轉(zhuǎn)移的過程，從而影響皮膚色素沉著的完整過程。色素減退和色素沉著過度(hyperpigmentation)是多種病理性病癥的臨床表現(xiàn),并且還具有化妝品價值。色素沉著的誘導(dǎo)被認為是黑素細胞受調(diào)節(jié)的分化程序。過去的研究已經(jīng)鑒別了數(shù)種參與該過程的基因。許多這些觀察來源于小鼠基因，并且目前已知接近120個基因座參與調(diào)節(jié)色素沉著(Bennett和Lamoreux, 2003)。在這些中，酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TYRP1 / TRP-1)和多巴色素異構(gòu)酶(dopachrome tautomerase, DCT / TYRP2)是催化黑素合成的酶。已知關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子MITF通過這三種核心酶協(xié)調(diào)黑素生成期間的事件。引起細胞開始和維持黑素合成的一些誘因也是眾所周知的。促黑素因子(meIanotropicfactor)如HGF、SCF, ET由鄰近的角質(zhì)形成細胞和纖維母細胞分泌(Yamaguchi等，2007 ；Yamaguchi and Hearing, 2009)。這些因子調(diào)節(jié)細胞增殖和黑素生成?；趶幕虻絼游锬Ｐ脱芯康亩鄺l證據(jù)線，a-MSH信號傳導(dǎo)似乎是核心。最近，逐漸為人所知的是，ρ53介導(dǎo)角質(zhì)形成細胞分泌α-MSH，因此以旁分泌的方式控制色素沉著(Cui等，2007)。正向調(diào)節(jié)黑素生成的信號傳導(dǎo)通路之間的相互聯(lián)系很復(fù)雜并且剛剛開始被理解。深入研究的色素沉著過度病癥是皮膚暴露于UV射線，其引起一系列短期和長期的作用，導(dǎo)致色素沉著增加(Choi等，2010)。該響應(yīng)包括促黑素因子的分泌和在預(yù)期的黑素體轉(zhuǎn)移中黑素細胞樹突形成(melanocyte dendricity)的增加(Scott等,2006)。令人驚奇的是已知許多的途徑和效應(yīng)器增加色素沉著，但是已知關(guān)于主動逆轉(zhuǎn)該過程的極少。
[0003]多條證據(jù)線表明，在生理和病理生理條件下，存在色素減少的黑素細胞。在發(fā)育上，黑素細胞開始于作為無色素的前體細胞的神經(jīng)嵴(neural crest) 0這些細胞遷移到皮膚并成為具有色素的黑素細胞。觀察到了無黑素病灶形式的惡性黑素瘤的稀有現(xiàn)象，并且通常與預(yù)后不良相關(guān)。當在限定的條件下體外培養(yǎng)黑素細胞時，類似地檢測到具有較少量黑素的細胞，并且這些細胞被稱為成黑素細胞(melanoblast)。另外，已知皮膚中臨時失去黑素的臨床病癥，例如炎癥后的色素減退。在這些病癥中積極抑制色素沉著的途徑尚待研究。也不清楚黑素合成是否是調(diào)節(jié)色素沉著的唯一步驟，數(shù)個研究表明，可以在以下水平對色素沉著進行調(diào)節(jié):1)黑素體成熟，2)黑素體在細胞中分散(Richardson等，2008)，3)黑素體從黑素細胞向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移(Seiberg等，2000)，4)從細胞中降解/除去黑素。
[0004]從藥物化妝品的角度來說，黑素含量的降低很重要。盡管如此，可以抑制或逆轉(zhuǎn)著色狀態(tài)的藥劑是有限的。不清楚單獨通過MITF關(guān)閉黑素生成是否足以逆轉(zhuǎn)缺陷的著色狀態(tài)。或者，可能存在不依賴MITF的積極抑制黑素生成程序的途徑。使用合適的模型系統(tǒng)并利用由色素細胞的生物學可得的大量信息，目前能夠重現(xiàn)細胞變化并使用整體方法理解這些變化。已知存在許多干擾色素沉著過程的化合物。在它們之中，主要的一類分子屬于黑素生成抑制劑類別。這些化合物可逆地抑制TYR酶并導(dǎo)致黑素含量降低。分子(如曲酸(kojicacid))屬于這一類。其他種類的化合物可以分類為自殺底物(suicide substrate),抑制劑實際上是TYR的底物但是不進一步參與黑素合成，或者是不可逆的抑制劑。代表這一類抑制劑的分子(如氫醌及其衍生物)被廣泛地使用，但是它們具有不期望的副作用，因為它們還干擾其他細胞過程。另一類化合物通過靶向TYR蛋白水平而起作用。這些化合物造成蛋白質(zhì)錯誤折疊，從而降低其活性。已知許多其他的小分子抑制劑降低黑素生成，并且它們的一些功能已經(jīng)被很好地表征。抑制黑素生成的一個主要的副作用是泄露導(dǎo)致細胞毒性的中間物，這可能觸發(fā)自身免疫。因此，化妝品工業(yè)在努力尋找控制黑素合成的更生物學的方式。
[0005]已知的能夠使產(chǎn)生黑素之細胞的色素沉著水平降低的途徑非常少。在本發(fā)明中，我們公開了如何通過 使用干擾素途徑使細胞保持色素減退狀態(tài)。微陣列表明許多參與色素沉著的基因(例如TYRPU TYRP2 / DCT、cappuccino (CNO)、HPS4、G蛋白偶聯(lián)受體143(GPR143)、0CA2、SLC7A11 和粘脂蛋白 3 (mucolipin3, MC0LN3))被 IFN-y 下調(diào)，并誘導(dǎo)了 IFN- Y 的下游效應(yīng)子，例如 IFNGRl、IFNGR2、STAT-1、JAKl、JAK2、IRF-U IRF-3、IRF-7、IRF-9、PSMB8和PSMB9。細胞生物學研究表明色素減退細胞具有較少的成熟黑素體。黑素體蛋白質(zhì)的分析表明TYR和DCT / TYRP2水平降低。IFN-Y還改變成熟黑素體從黑素細胞向角質(zhì)形成細胞的轉(zhuǎn)移。因此，靶向IFN-Y中介物，藥理上使用小分子抑制劑或者細胞因子本身將導(dǎo)致受控的色素沉著響應(yīng)。該方法的主要優(yōu)點是使用介導(dǎo)色素減退的現(xiàn)有生物途徑而不改變MITF水平。IFN-Y的功能如變阻器一樣校正皮膚色素沉著。因此系統(tǒng)將被調(diào)節(jié)以適應(yīng)該改變。我們已經(jīng)通過使黑素體成熟的過程停止使所有的下游功能受到影響而導(dǎo)致色素減退來證明了這一途徑。因此，靶向這一途徑將導(dǎo)致黑素體受協(xié)調(diào)而降低并以更自然的方式實現(xiàn)色素減退。
[0006]已知造成色素減退的其他途徑包括TGF-β途徑(Martinez-Esparza等,2001)。證明通過使用TGF-β，使培養(yǎng)的Β16細胞有效地色素減退。這與細胞中成熟黑素體含量的減少相關(guān)。最近利用小鼠實驗跟進了該研究(Nishimura等，2010)。但是，這些研究證實這種降低是由于關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子MITF水平降低并導(dǎo)致干細胞的維持。在掌跖(palmoplantor)皮膚中觀察了位點特異的色素減退的機理，其中真皮來源的DKKl抑制WNT信號傳導(dǎo)，改變MITF水平和黑素細胞生長(Yamaguchi等，2009)。另一方面，我們的研究表明IFN-Y改變色素沉著而不改變MITF水平，表明IFN-Y介導(dǎo)色素減退的機理與TGF-β和DKKl不同。因此使用干擾素途徑將會以遠遠更加可預(yù)測和高效的方式實現(xiàn)對色素沉著的改變。
[0007]支持我們的主張的早期報告包括產(chǎn)生以下小鼠的轉(zhuǎn)基因系，其中所述小鼠在表皮中過表達IFN-Y。除具有其他可辨別的表型之外，這些小鼠在毛發(fā)中明顯地色素減退(Carroll等，1997)。作者在該研究中沒有調(diào)查這一機理，并且因為小鼠不具有表皮色素沉著，所以在之前不知道這一途徑在皮膚表皮黑素細胞中的作用。大部分關(guān)于IFN-Y之作用的早期研究在轉(zhuǎn)化的黑素瘤細胞上進行，所述黑素瘤細胞已被證明具有與正常的人表皮黑素細胞不同的性質(zhì)(Nihal等，2005)。提出IFN-Y在改變黑素瘤相關(guān)的抗原呈遞中的作用為改變炎癥應(yīng)答和妨礙黑素瘤細胞的有效識別(Le Poole等，2002)。關(guān)于人惡性黑素瘤細胞的早期研究從統(tǒng)計學上表明在這些轉(zhuǎn)化細胞中IFN-Y對黑素合成的減少沒有顯著影響(Garbe等，1990)。雖然黑素合成是參與色素沉著的一個過程，但是可見的皮膚顏色是涉及不同生物事件級聯(lián)的復(fù)雜現(xiàn)象。我們的研究表明IFN-Y在通過使培養(yǎng)的人黑素細胞中的關(guān)鍵黑素細胞細胞器黑素體的成熟停止來調(diào)節(jié)色素沉著中的重要作用。在一個完全不同的系統(tǒng)中，IFN-Y是培養(yǎng)的人生長期毛囊中退化期樣變化(catagen-like change)的強力誘導(dǎo)物(ItO等，2005)。最近，使用斑馬魚模型系統(tǒng)，toll樣受體途徑被認為導(dǎo)致黑素細胞的色素減退(Jin和Kang，2010)。雖然觀察有限，但是確實突出了信號傳導(dǎo)途徑對色素沉著的調(diào)節(jié)。已知干擾素本身通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子家族的干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)來發(fā)揮其作用。在最近的研究中，發(fā)現(xiàn)在歐洲群體中IRF-4與色素沉著相關(guān)(Sturm，2009)。這些觀察進一步鞏固了我們的主張:干擾素途徑組分的參與對降低皮膚色素沉著有作用。因此，我們提出專利:通過靶向?qū)儆?IFNG、IFNGR1、IFNGR2、STAT-1、JAKl、JAK2、IRF-U IRF-3、IRF-7、IRF-9、PSMB8和PSMB9的組分來實現(xiàn)對皮膚及衍生之黑素細胞的色素沉著進行改變的方法。在本發(fā)明中，我們開發(fā)了通過IFN-Y肽及其下游蛋白質(zhì)或通過使用IFN-Y途徑的多種激動劑或拮抗劑來實現(xiàn)受控之色素 沉著的方法。
[0008]發(fā)明目的
[0009]本發(fā)明的主要目的是開發(fā)調(diào)節(jié)可見的皮膚色素沉著的可逆方法。
[0010]本發(fā)明的另一目的是開發(fā)調(diào)節(jié)黑素細胞中的黑素體成熟的可逆方法。
[0011]本發(fā)明的另一目的是開發(fā)調(diào)節(jié)黑素體向角質(zhì)形成細胞之轉(zhuǎn)移的方法。
[0012]本發(fā)明的另一目的是開發(fā)通過識別影響黑素體成熟之試劑的下游靶標來調(diào)節(jié)表皮皮膚黑素細胞中黑素體成熟的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]因此，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)可見的皮膚色素沉著的可逆方法。證明以下內(nèi)容的研究導(dǎo)致了本發(fā)明JiIFN-Y能夠抑制黑素體成熟以及從黑素細胞中的轉(zhuǎn)移，從而降低色素沉著水平。作為重組肽供應(yīng)的IFN-Y的較高水平降低了 TYR、TYRPl和TYRP2 / DCT以及數(shù)種其他黑素體蛋白(CN0、HPS4、GPR143、0CA2、SLC7A11和MC0LN3)的水平，從而改變了黑素體成熟的過程。在體外向正常黑素細胞應(yīng)用IFN-Y，導(dǎo)致在這些細胞中黑素體成熟的顯著降低和導(dǎo)致的色素減退。因此，本發(fā)明涉及改變導(dǎo)致色素沉著改變之黑素體成熟過程的方法。本方法可用于由于例如陽光暴露、炎癥或傷疤或者由于具有先天性或獲得性黑素細胞增殖之疾病的色素沉著過度的臨床狀況。在某些情況下，IFN- Y在表皮中產(chǎn)生，因此其可以表面地應(yīng)用于表皮以及全身施用。具有升高或異常的皮膚色素沉著的問題常見且廣泛。即使位于小面積的皮膚，尤其是當異常色素沉著涉及臉和/或手時，這樣的改變也仍可能造成巨大的痛苦。本文中，我們公開了通過使用肽IFN-Y及其下游靶蛋白(如IFNGR1、IFNGR2、STAT-1、JAK1、JAK2、IRF-1、IRF-3、IRF-7、IRF_9、PSMB8 和 PSMB9 等)來引起色素減退的方法。另外，我們公開了該因素足以重復(fù)抑制這些細胞中的色素沉著響應(yīng)。顯微評價表明，當用IFN-Y處理細胞時，存在未成熟的黑素體。因此，通過對參與色素沉著之關(guān)鍵靶標的協(xié)調(diào)作用，IFN-y通過積極抑制黑素體成熟來誘導(dǎo)色素減退狀態(tài)。
[0014]附圖簡述
[0015]圖1說明
[0016]使用透射電子顯微鏡觀察的用100U / ml IFN-y處理原代正常人黑素細胞的電子顯微圖。(a)對照(未處理的)黑素細胞，(b)用100U / ml IFN-y處理的。將黑素細胞固定、透化并使用HMB45抗體探測黑素體的黑素體基質(zhì)(綠色)和黑素(紅色)(c)對照(d)100U / ml IFN-y處理的黑素細胞。(e)HMB45和(f)黑素染色的黑素細胞之熒光強度的歸一化量化圖。
[0017]圖2說明
[0018](a)用100U / ml IFN-y處理原代人黑素細胞，接著對表示為熱圖(heat_map)的調(diào)芐基因進行微陣列分析。一些顯著下調(diào)的基因包括DCT、Mlan A和Trpl。明顯地，許多參與免疫功能的基因被該處理上調(diào)。(b)在兩種不同IFN-Y濃度(100U / ml和200U / ml)下調(diào)芐基因的實時PCR分析。(c)來自對照、MSH(6nM)或IFN-Y (100U / ml)處理之黑素細胞的DCT、磷酸化的STAT-1、磷酸化的GSK-3 β的western印跡分析。
[0019]發(fā)明詳述
[0020]IFN-Y通過改變參與黑素體形成和成熟之關(guān)鍵蛋白(如TYR、TYRPl和DCT /TYRP2、CN0, HPS4、GPR143、0CA2、SLC7A11和MC0LN3)的水平來使黑素體的成熟停止，從而減少正常人黑素細胞中的色素沉著。IFN-Y對色素沉著蛋白水平的調(diào)節(jié)可用于獲得色素減退狀態(tài)。
[0021]皮膚色素沉著的另一決定因素是成熟(階段III和IV)黑素體從黑素細胞向角質(zhì)形成細胞的轉(zhuǎn)移。我們使用黑素細胞-角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)模型的體外研究表明，IFN-Y降低了該轉(zhuǎn)移過程，改變了角質(zhì)形成細胞中黑素體的數(shù)目，導(dǎo)致降低外觀上的色素沉著。
[0022]如在隨后的實施例5中詳細描述的，這種IFN- Y介導(dǎo)色素減退的機理在皮膚的數(shù)種色素減退型病癥中可以是明顯的，所述色素減退型病癥例如結(jié)核樣型麻風(tuberculoidleprosy)，其中IFN-Y的表面濃度可以抑制病灶皮膚的黑素細胞中黑素體的成熟和轉(zhuǎn)移。因此，靶向這一途徑對于治療色素減退病癥將具有治療重要性。或者，模擬該途徑將通過靶向黑素細胞中黑素體的成熟和黑素體向角質(zhì)形成細胞的轉(zhuǎn)移來促進受控的皮膚色素沉著。
[0023]可以使用多種生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑來將IFN- Y配制成組合物。所述組合物可以是例如用于表面使用的霜劑(cream)、凝膠劑(gel)或洗劑，或者可以作為液體存在。所述組合物還可以以需要時通過皮下輸注的劑量單位形式存在。
[0024]由于之前已經(jīng)表明TGF-β抑制B16黑素瘤細胞和人原代黑素細胞中的黑素合成(Martinez-Esparza 等,2001 ；Nishimura 等；Nishimura 等,2010)，因此，重要的是確定IFN- Y是否通過涉及TGF- β的機理起作用。報道TGF- β通過降低MITF轉(zhuǎn)錄因子的水平導(dǎo)致色素沉著降低。但是，IFN-Y及其下游效應(yīng)子蛋白質(zhì)實現(xiàn)色素減退而不改變MITF的水平。這些發(fā)現(xiàn)表明IFN-Y介導(dǎo)色素減退的過程與TGF-β引起的不同。
[0025]通過其對正常人黑素細胞中涉及的整個色素沉著過程的抑制作用，證明了 IFN-Y色素減退功能的普遍性。IFN-Y在數(shù)種病癥中在表皮中表面產(chǎn)生(Sarra等，2011)。其他人在之前已經(jīng)證明，角質(zhì)形成細胞衍生因子(其也是表面產(chǎn)生)影響黑素細胞行為，例如黑素細胞增殖、樹突形成和黑素產(chǎn)生量(Gordon等，1989)。因此一并考慮，本文提供的數(shù)據(jù)表明IFN-Y的表面施用可用于可預(yù)測地改變?nèi)吮砥ぜ毎械纳爻林?br> [0026]本公開內(nèi)容提供了 IFN- Y如何可用于可逆地調(diào)節(jié)表皮黑素細胞中階段I和II發(fā)生的黑素體成熟的細節(jié)。通過本公開內(nèi)容明顯的是，IFN-Y的衍生物、模擬物或拮抗劑也可用于可逆地調(diào)節(jié)表皮黑素細胞中階段I和II發(fā)生的黑素體成熟。因此，本說明書不使本發(fā)明的范圍局限于IFN-Y，而是旨在將范圍延伸至IFN-Y的衍生物、模擬物和拮抗劑。
[0027]因此，本發(fā)明涉及通過以受控方式使IFN-Y及其衍生物、其模擬物、拮抗劑與黑素細胞接觸或撤回IFN-Y及其衍生物、其模擬物、拮抗劑來可逆地改變對象表皮黑素細胞中階段I和II發(fā)生之黑素體成熟的方法，并且其中IFN-Y及其衍生物、模擬物、拮抗劑調(diào)節(jié)IFN-Y途徑組分的表達，所述IFN-Y途徑組分選自包含IFNGRl、JAKl和STATl的組。
[0028]在本發(fā)明的另一個方面，IFN- Y或其衍生物、或其模擬物、或拮抗劑、或IFN- Y途徑的組分以100-500U / ml的范圍與黑素細胞接觸I至10天。
[0029]在本發(fā)明的另一個方面，IFN- Y或其衍生`、或者IFN- Y的模擬物或拮抗劑可逆地改變 TYR 和 TYRP2 / DCT、CNO, HPS4、GPR143、0CA2、SLC7A11 和 MC0LN3 的水平。
[0030]在本發(fā)明的另一個方面，通過靶向IFN-Y途徑組分來改變黑素體向角質(zhì)形成細胞的轉(zhuǎn)移，所述IFN- Y途徑組分選自包含IFNG、IFNGRl、JAKl和STATl的組。
[0031]在本發(fā)明的另一個方面，IFN-Y及其組分、其激動劑和拮抗劑調(diào)節(jié)人的色素沉著用于臨床或藥物化妝品目的的用途。
[0032]在本發(fā)明的另一個方面，通過向?qū)ο笫┯肐FN-Y或其衍生物或者IFN-Y的模擬物或拮抗劑來治療皮膚色素沉著的方法。
[0033]在本發(fā)明的另一個方面,通過表面遞送(topical delivery)或皮下遞送向?qū)ο笫┯肐FN-Y或其衍生物或者IFN-Y的模擬物或拮抗劑。
[0034]在本發(fā)明的另一個方面，以選自包含以下之組的劑型進行表面遞送或皮下遞送:散劑(powder)、溶液劑(solution)、乳劑(emulsion)、流體乳劑(fluid emulsion)、混懸劑(suspension)、流體混懸劑(fluid suspension)、半固體劑(sem1-solid)、軟膏劑(ointment)、糊劑(paste)、霜劑(cream)、凝膠劑、膠凍劑(jelly)、泡沫劑(foam)、植入劑(implant)、注射劑(injection)、貼劑(patch)和噴霧劑(spray)。
[0035]在本發(fā)明的另一個方面，可用于治療選自包含以下之組的皮膚疾病:色素沉著過度(hyperpigmentation)、色素減退、色素沉著不均(uneven pigmentation)、炎癥后色素沉著、皮膚曬傷(sun-damaged skin)、色素胎記(pigmented birthmark)、黑棘皮癥(acanthosis nigricans)和日光斑(solar lentiges)、年齡相關(guān)的色素沉著變化、未定型麻風(indeterminate leprosy)、結(jié)核樣型麻風、界線型麻風(borderline leprosy)、結(jié)節(jié)型麻風(leprematous leprosy)。
[0036]通過舉例說明本發(fā)明給出了以下實施例，并且因此不應(yīng)當解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0037]實施例1
[0038]在37 °C、5 % CO2 下，將正常人表皮黑素細胞(normal human epidermalmelanocyte, NHEM)(由Lonza生產(chǎn)，或者由表皮建立)的培養(yǎng)物保存在含無PMA增補物的M254培養(yǎng)基(Jnvitrogen)中。為了研究IFN-y對黑素細胞的作用，在存在或不存在1OOU / ml劑量的重組人IFN-Y (Peprotech)下培養(yǎng)黑素細胞的早期培養(yǎng)物，并且在處理后觀察細胞8天。在用IFN-Y處理的細胞沉淀中可以觀察到色素沉著減少，證明存在誘導(dǎo)色素減退的機理(圖1)。為了理解黑素細胞中人IFN- Y (以下簡稱IFN- Y )的分子靶標和細胞色素減退的機理，進行進一步的研究。 [0039]細胞中黑素體成熟的狀態(tài)與可見的色素沉著緊密聯(lián)系。在黑素體成熟的后期階段黑素合成的過程消失，并且需要合適的多蛋白靶標以啟動黑素體的早期階段。因此，黑素體對于合成黑素的接受性狀態(tài)和每一黑素體中黑素的含量可以認為是色素沉著程序的細胞終點。由于黑素是高電子密度物質(zhì)，經(jīng)典地使用電子顯微鏡使黑素體可視化。該技術(shù)允許基于細胞器結(jié)構(gòu)和黑素含量來鑒別黑素體I至IV的不同階段。使用HMB45和黑素抗體對IFN-Y處理細胞(如上所述)進行電子顯微鏡觀察和共聚焦成像。關(guān)于對照和IFN-Y處理細胞進行電子顯微鏡評估。顯微照片的分析表明在IFN-Y處理細胞中較少檢測到階段III和IV的黑素體，而在對照細胞中能夠明顯地識別出數(shù)個。對于黑素體狀態(tài)的更精細的和定量的分析，采用免疫細胞化學方法。將對照和IFN-Y處理的原代黑素細胞用獲自(Dako Cytomation)的 Human melanoma Black45 (HMB45)和抗黑素抗體(針對合成黑素培養(yǎng)的兔多克隆，在實驗室中培養(yǎng))染色。細胞核用DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)(Invitrogen)對比染色，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞。反復(fù)觀察表明，從IFN-Y處理的細胞中觀察到較少熒光信號。為了定量比較，將對照和IFN-Y處理細胞在相同的條件下進行處理和成像。用于成像的設(shè)置(如背景校正、信噪比等)是任意的并保持恒定。從來自每一細胞的HMB45或黑素信號中減去DAPI平均熒光強度以歸一化。如通過HMB45抗體檢測的，歸一化強度的比較表明IFN-Y處理的細胞具有顯著較少的黑素和黑素體基質(zhì)。
[0040]實施例2
[0041]為了理解IFN-Y在黑素細胞上誘導(dǎo)的分子變化，對兩個獨立的原代黑素細胞培養(yǎng)物進行基于微陣列的研究。將細胞用IOOU / ml IFN-Y處理8天(如實施例1所述)，分離全部RNA并進行微陣列。使用Illumina全基因組芯片HumanWG_6進行微陣列。使用Illumina total prep RNA標記試劑盒(Ambion)進行RNA標記。隨后按照制造商的說明進行雜交和清洗步驟。將數(shù)據(jù)平均歸一化，減去背景并使用Bead-studio軟件(Illumina)進行分析。典型的免疫細胞因子IFN-Y引起提示黑素細胞中免疫應(yīng)答的基因表達譜。但是，基因表達的圖案還包括抑制某些色素沉著基因(圖2)。這確認IFN-Y的色素減退作用是由于通過影響黑素體成熟來抑制色素沉著基因。通過實時PCR來確認所選基因的調(diào)節(jié)。在原代人黑素細胞中觀察到了多個IFN-Y下游基因的調(diào)節(jié)并且在表1中列出。 [0042]表1.基于微陣列在原代人黑素細胞中被IFN- Y調(diào)節(jié)在原代黑素細胞中被顯著調(diào)節(jié)之基因的列表[0043]DCT, TSPAN10, TSPAN9, SERPINFI, KIF1B, S0X10, MY018A，MLANA, CREBI, MC1R,DCTNI，CNO, TYRPl，HPS4, GPR143, ID2, JARID2, 0CA2CHMP2A, JARID1B, SLC7A11, MC0LN3,IFT2, IFTMl，IRFl，IRF3, IRF4, IRF7, IRF9, OASl，PSMB8, PSMB9, STATl，STAT6, TNFRSF19,TNFSFl2, IFNGRl，IFNGR2, MAPKAPI, L0C402221, PDK4, C190RF28, FARSA, TSPAN4, TYSNDl，DEAFl，PKNl，WHSC1L1, ACPI, RASSFl, FAM76B, XL, PGAM4, WDR26, PIK3CD，F(xiàn)ENl，HS.31532，NR1H2, DNAJB12, FEZI, PWWP2B, TNFAIPI, SH3BGRL3, TCIRGl， PCMTD2, L0C643357, MY01B,HS.374257，L0C648249, BINl，HS.12876，PRMTI, JAKl，JAK2, HS.231861，BRD8, L0C347544,BANFl，GYPC, AGXT2L2, M0RF4L1, MRRF, ACTB, 0AS3, H1FX, UBE2G1, FAM10A4, C220RF29, HLA,DRB4, TMEM69, C80RF33, RCEI, HLAH, ARL6IP6, L0C402251, CYBA, HLAB, AHSAl，ERP29，ADAT3,PPT2, SCANDl，TNC, RPL32, IFIT3, GRN, CTTN, L0C648210, ARPC4, TBCC, CTH, HLAF，RIPK5,TAP2, GMPR, APRT, ACLY, TMED10, TUBA1A, AGPATI, L0C407835, KIAA0460, PDIA6, PHF20L1,MRPLl2, VAMP5, UBB, ARMCXl, BEX4, L0C441775, FAM152B，NAT5, 0BFC2B, RAB4A, L0C440589,PHF5A, LRPlI, TNPOl, STEAPI, L0C649150, CX0RF40B, PTTG1IP, L0C284821, HP1BP3, CAPNSI,RNHl，HCG4,HS.406790，EEFlAl，HLA.DPAl，POLRMT,L0C388654, CPEB2, IFI27，GAA，ARfGEFl，RAB7L1
[0044]實施例3
[0045]為了驗證介導(dǎo)IFN-Y之色素減退效果的途徑并闡明途徑的組分，我們采用基于siRNA的蛋白質(zhì)功能測試。如上所述(實施例1中)將原代人黑素細胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，使用基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑(獲自Invitrogen的Cellfectin II)用祀向目標組分mRNA的IOOnM siRNA (獲自Dharmacon的4種靶向siRNA的混合物)進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之后，將細胞用胰蛋白酶處理并平板接 種在孔中，用IFN-Y處理或者放置不經(jīng)處理而作為對照。處理48小時之后，使細胞溶解并由細胞制備全部RNA，通過實時PCR來測量靶向基因轉(zhuǎn)錄物和DCT的水平。靶向JAK-1、STAT-1和IFNGR-1的SiRNA大幅降低了同源基因的mRNA水平，并同時消除了 IFN-Y介導(dǎo)的DCT轉(zhuǎn)錄的抑制。這一系列實驗進一步證實，所述途徑的組分是用于實現(xiàn)改變色素沉著的潛在極好靶標。
[0046]實施例4
[0047]已知IFN-Y以物種特異的方式起作用。為了驗證在黑素細胞中觀察到的色素減退是否是由IFN- Y特異性引起的，將黑素細胞用小鼠IFN- Y (100U / ml)和人IFN- Y (100U / ml)處理8天。小鼠IFN-Y沒有使人黑素細胞色素減退,證實效果是特異的并且不是肽添加的一般效果。當人IFN-Y處理的色素減退型黑素細胞在無IFN-Y的情況下僅在M254中培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)細胞在5天后恢復(fù)了其色素沉著水平，表明了 IFN-Y介導(dǎo)的黑素細胞中的色素減退的可逆性。這支持了 IFN-Y是介導(dǎo)生理可逆的色素沉著變化的重要組分。
[0048]實施例5
[0049]為了探尋在皮膚色素減退癥狀中IFN-Y之作用的原因，從患有結(jié)節(jié)型麻風之對象的色素減退病灶表皮和非病灶表皮分離RNA。合成cDNA并進行實時PCR分析以比較色素沉著(TYR、TYRPU TYRP2、MITF)基因和已知不被IFN-Y上調(diào)的基因(PSMB8、PSMB9、HLA-DRBl、HLA-A, HLA-B, HLA-C, IFNGRl、IRFl)之間基因表達的變化。發(fā)現(xiàn)在麻風病對象的病灶皮膚中含DCT的色素沉著基因(除MITF外)的表達水平較低，與可見的色素減退相符合。還觀察到了 IFN-Y基因特征信號(signature)的相應(yīng)提高。相對于病灶皮膚的非病灶皮膚的電鏡分析也表明，與非病灶皮膚相比病灶皮膚中成熟(階段III和IV)黑素體的數(shù)目減少。這些結(jié)果與我們對IFN-Y使黑素體停止在成熟的早期階段從而導(dǎo)致可見的色素減退的體外觀察一致。該研究證明，在患病狀態(tài)該途徑對于導(dǎo)致人皮膚色素沉著的可見變化可能是可行的。
[0050]實施例6
[0051]為了理解IFN-Y對于黑素體從黑素細胞向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移的作用，以1:2的比率建立了黑素細胞和正常人表皮角質(zhì)形成細胞(獲自Lonza或由包皮來源的表皮建立)的共培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在1:2M254和KSFM(Invitrogen)中并且分別在存在或不存在IFN_y(100U / ml)下維持8天。在8天結(jié)束時，通過差別胰酶消化(differentialtrypsinization)方法使角質(zhì)形成細胞和黑素細胞分離,并進行電鏡分析。獲得具有黑素體之角質(zhì)形成細胞的多個顯微照片，并分析每張顯微照片中黑素體的數(shù)目。通過圖像分析軟件計算角質(zhì)形成細胞的細胞質(zhì)面積。觀察到在IFN-Y存在下培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞中黑素體數(shù)目/角質(zhì)形成細胞面積減小，表明IFN-Y除了影響黑素體成熟外，還抑制黑素體向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移的過程。
[0052]表2.涉及本申請權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)
[0053]
【權(quán)利要求】
1.可逆地改變對象表皮黑素細胞中階段I和II發(fā)生的黑素體成熟的方法，其通過以受控方式使IFN-Y及其衍生物、模擬物、其拮抗劑與所述黑素細胞接觸或撤回IFN-Y及其衍生物、模擬物、其拮抗劑， 并且其中所述IFN-Y及其衍生物、模擬物、其拮抗劑調(diào)節(jié)IFN-Y途徑組分的表達，所述IFN- Y途徑組分選自包含IFNGRl、JAKl和STATl的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中IFN-Y、或其衍生物、或其模擬物、或拮抗劑、或IFN-Y途徑的組分以100至500U / ml的范圍與黑素細胞接觸I至10天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中IFN-Y或其衍生物、或者IFN-Y的模擬物或拮抗劑可逆地改變 TYR 和 TYRP2 / DCT、CNO, HPS4、GPR143、0CA2、SLC7A11 和 MC0LN3 的水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過靶向IFN-Y途徑組分來改變黑素體向角質(zhì)形成細胞的轉(zhuǎn)移，所述IFN-Y途徑組分選自包含IFNG、IFNGRU JAKl和STATl的組。
5.1FN-Y及其組分、其激動劑和拮抗劑在調(diào)節(jié)人的色素沉著用于臨床或藥物化妝品目的中的用途。
6.治療皮膚色素沉著方法，其通過向?qū)ο笫┯肐FN-Y或其衍生物或者IFN-Y的模擬物或拮抗劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中通過表面遞送或皮下遞送向所述對象施用IFN-Y或其衍生物或者IFN-Y的模擬物或拮抗劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中以選自包含以下之組的劑型進行所述表面遞送或皮下遞送:散劑、溶液劑、乳劑、流體乳劑、混懸劑、流體混懸劑、半固體劑、軟膏劑、糊劑、霜劑、凝膠劑、膠凍劑、泡沫劑、植入劑、注射劑、貼劑和噴霧劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其可用于治療選自包含以下之組的皮膚疾病:色素沉著過度、色素減退、色素沉著不均、炎癥后色素沉著、皮膚曬傷、色素胎記、黑棘皮癥和日光斑、年齡相關(guān)的色素沉著變化、未定型麻風、結(jié)核樣型麻風、界線型麻風、結(jié)節(jié)型麻風。
【文檔編號】A61P17/00GK103619413SQ201280029596
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月16日
【發(fā)明者】拉杰什·素迪爾·戈卡萊, 維韋克·蒂魯內(nèi)爾韋利·納塔拉詹, 帕魯爾·甘朱 申請人:科學與工業(yè)研究會