Nk細(xì)胞的擴(kuò)增方法
【專利摘要】本發(fā)明開發(fā)出一種在試管內(nèi)由采集的血細(xì)胞使NK細(xì)胞擴(kuò)增來制備細(xì)胞療法的最佳數(shù)量的NK細(xì)胞的技術(shù)。本發(fā)明提供一種NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法。本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法包括：制備包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟；從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將T細(xì)胞除去的步驟；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)除去了所述T細(xì)胞后的剩余的細(xì)胞的步驟。有時本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法包括，從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將造血前體細(xì)胞除去的步驟。本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞療法的醫(yī)藥組合物，其包含通過本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法而制備的NK細(xì)胞。有時本發(fā)明的用于細(xì)胞療法的醫(yī)藥組合物用于治療傳染病和/或癌癥。
【專利說明】NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及可以高純度及高擴(kuò)增倍率來擴(kuò)增具有高溶細(xì)胞活性(細(xì)胞傷害活性)的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的方法、和包含通過該方法而得到的NK細(xì)胞的醫(yī)藥組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]NK細(xì)胞并不攻擊表達(dá)MHC類I型分子的正常細(xì)胞，而主要攻擊MHC類I型分子的表達(dá)降低及缺損的細(xì)胞。因此，如果在癌癥及傳染病的細(xì)胞療法使用該種NK細(xì)胞，則具有可以回避GVH (Graft-versus-host,移植物抗宿主)病的副作用的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際上,根據(jù)Miller等人(非專利文獻(xiàn)I)及Rubnitz等人(非專利文獻(xiàn)2)的報告，在將癌癥患者作為受體、并在將NK細(xì)胞濃縮了的基礎(chǔ)上移植其近親的健康者供體的新鮮外周血單核細(xì)胞時，被移植的NK細(xì)胞不會對受體引起副作用，而暫時地存活，并保持溶細(xì)胞活性。但是，尚未有顯示出NK細(xì)胞的移植療法有效性的臨床治療試驗(yàn)的報告。其理由之一在于，可從供體通過淋巴球血液成分單采而回收的細(xì)胞數(shù)量是有限的，因而在直到目標(biāo)細(xì)胞滅絕為止的期間，無法使為使癌細(xì)胞及病原體感染細(xì)胞這樣的目標(biāo)細(xì)胞滅絕所需要的足夠數(shù)量的NK細(xì)胞滯留在受體體內(nèi)。
[0003]由正常成人的外周血的I次血液成分單采可回收約I X 101°個的單核細(xì)胞，如果將外周血單核細(xì)胞中的NK細(xì)胞的構(gòu)成比率設(shè)為約7%，則可以得到7 X IO8個NK細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)3)。另一方面，NK細(xì)胞的移植中，使用I X IO5個/kg至2X IO7個/kg (非專利文獻(xiàn)I)、或者5 X IO5個/kg至8.1 X IO7個/kg (非專利文獻(xiàn)2)的數(shù)量級的NK細(xì)胞。如果將患者的體重設(shè)為60kg，則將需要6 X IO6個至4.8 X IO9個的NK細(xì)胞。這相當(dāng)于由正常成人的外周血的I次血液成分單采而得到的NK細(xì)胞的0.0086倍至6.86倍。但是，例如根據(jù)非專利文獻(xiàn)2，并未發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的存活時間與給予的NK細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)，在2天至189天內(nèi)，存活時間的中間值僅為10天。由 此，在直到目標(biāo)細(xì)胞滅絕為止的期間，為了使為使癌細(xì)胞及病原體感染細(xì)胞這樣的目標(biāo)細(xì)胞滅絕所需要的足夠數(shù)量的NK細(xì)胞滯留在受體體內(nèi)，需要頻繁地重復(fù)NK細(xì)胞的移植，這對患者而言將成為極大的負(fù)擔(dān)。
[0004]因此，正在推進(jìn)使由供體得到的NK細(xì)胞先在試管內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增，來得到為使目標(biāo)細(xì)胞滅絕所需要的足夠的NK細(xì)胞的技術(shù)的開發(fā)。Terunuma, H.等人(專利文獻(xiàn)I)在對人⑶3的激動劑抗體即0KT3、IL-2、抗CD16抗體的存在下，將健康者的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)13天，使NK細(xì)胞擴(kuò)增至純度81.2%、130倍。此外，所述NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(E:T=3:
O為66%。Tanaka, J.等人(專利文獻(xiàn)2)通過使用添加了 IL-2、IL-15、抗CD3抗體、5%的人AB型血清、他克莫司(tacrolimus)及達(dá)肝素鈉(dalteparin)的培養(yǎng)基的方法,將健康者的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)21天，使NK細(xì)胞擴(kuò)增至純度73.4%,6268倍。此外，所述NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(E:T=1:1)約為55%。Carlens, S.等人(非專利文獻(xiàn)4)報告了:在對人CD3的激動劑抗體即0ΚΤ3、IL-2的存在下，將健康者的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)21天，使NK細(xì)胞擴(kuò)增至純度55%、193倍。此外，所述NK細(xì)胞對Κ562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(Ε:Τ=1:1)為45%。Alici1E.等人(非專利文獻(xiàn)5)報告了:在同樣的條件下將骨髓瘤患者的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)20天，使NK細(xì)胞擴(kuò)增至純度65%、1625倍。此外，所述NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(E:T=1:1)約為10%。Fujisaki1H.等人(非專利文獻(xiàn)6)報告了:在使用白血病細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，將健康者的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)21天，使NK細(xì)胞擴(kuò)增至純度96.8%,277倍，其中所述白血病細(xì)胞被進(jìn)行了遺傳性改變以表達(dá)使NK細(xì)胞活性化的因子。此外，所述NK細(xì)胞對Κ562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(Ε:Τ=1:1)的最大值約為90%。
[0005]通過Terunuma, H.等人(專利文獻(xiàn) I)、Tanaka, J.等人(專利文獻(xiàn) 2)、Carlens, S.等人(非專利文獻(xiàn)4)及Alici，E.等人(非專利文獻(xiàn)5)的方法而擴(kuò)增的NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(E:T=1:1)分別為66%、約55%、45%及約10%。因此，在以往技術(shù)中，NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性低，因此治療效果低，NK細(xì)胞的施用數(shù)增大，因而并不優(yōu)選。在Fujisaki，H.等人(非專利文獻(xiàn)6)的方法中，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性約為90% (最大值)。但是，由于使用被遺傳性改變了的腫瘤細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，因此存在該細(xì)胞混入最終產(chǎn)物的風(fēng)險，因而并不優(yōu)選。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:日本特開2007-297291號公報
[0009]專利文獻(xiàn)2:日本特愿2011-140504號申請說明書
[0010]非專利文獻(xiàn)
[0011]非專利文獻(xiàn)1:Miller, J.S.等人，Blood，105:3051 (2005)
[0012]非專利文獻(xiàn)2:Rubnitz, J.Ε.等人，J.Clin.0ncol.，28:955 (2010)
[0013]非專利文獻(xiàn)3:Cho, D.及 Campana, D.，Korean J.Lab.Med.，29:89 (2009)`[0014]非專利文獻(xiàn)4:Carlens, S.等人，Hum.Tmmunol.,62:1092 (2001)
[0015]非專利文獻(xiàn)5:Alici，E.等人，Blood、111:3155 (2008)
[0016]非專利文獻(xiàn)6:Fujisaki, H.等人，Cancer Res.,69:4010 (2009)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]發(fā)明所要解決的課題
[0018]因此，需要開發(fā)在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，由臍帶血、或外周血都可以高純度地?cái)U(kuò)增具有高溶細(xì)胞活性的NK細(xì)胞的技術(shù)。
[0019]用于解決課題的方法
[0020]本發(fā)明提供一種NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法。本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法包括:制備包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟；從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將T細(xì)胞除去的步驟；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)除去了所述T細(xì)胞后的剩余的細(xì)胞的步驟。
[0021]在本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法中，有時從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將所述T細(xì)胞除去的步驟是通過將CD3陽性細(xì)胞除去的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
[0022]有時本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法包括從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將造血前體細(xì)胞除去的步驟。
[0023]在本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法中，有時從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將所述造血前體細(xì)胞除去的步驟是通過將CD34陽性細(xì)胞除去的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
[0024]在本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法中，有時所述培養(yǎng)基包含自體血清、AB型血清和/或血清白蛋白。
[0025]在本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法中，有時制備所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟是通過從采集自受試者的血細(xì)胞中將單核細(xì)胞分離的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
[0026]在本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法中，有時所述血細(xì)胞采集自外周血、臍帶血、骨髓和/或淋巴結(jié)。
[0027]在本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法中，有時通過血液成分單采術(shù)從外周血采集所述血細(xì)胞。
[0028]在本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法中，有時所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群由選自源于干細(xì)胞的造血干細(xì)胞、源于臍帶血的造血干細(xì)胞、源于外周血的造血干細(xì)胞、源于骨髓血的造血干細(xì)胞、臍帶血單核細(xì)胞、和外周血單核細(xì)胞中的至少I種細(xì)胞來制備，其中所述干細(xì)胞為選自胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞及人工多能干(iPS)細(xì)胞中的任意一種。有時所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的供體源于:作為受體的患者自身、該患者的近親、或者與患者無血緣關(guān)系的人。所述NK細(xì)胞有時源于受體的主要組織相容性抗原(MHC)、和殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer Immunoglobulin-like Receptor:KIR)不一致的供體。
[0029]本發(fā)明提供包含通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法而制備的NK細(xì)胞的、用于細(xì)胞療法的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物除了擴(kuò)增后的NK細(xì)胞之外，有時還包含NK細(xì)胞前體、T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、造血前體細(xì)胞等。
[0030]有時本發(fā)明的醫(yī)藥組 合物用于治療傳染病和/或癌癥。
[0031]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物有時被施用于具有與通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法而制備的NK細(xì)胞不同的HLA基因型的患者。
[0032]本發(fā)明提供一種細(xì)胞療法，該細(xì)胞療法包括:制備包含所述NK細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟；從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將T細(xì)胞除去的步驟；在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)除去了所述T細(xì)胞后的剩余的細(xì)胞的步驟；將由所述剩余的細(xì)胞擴(kuò)增后的NK細(xì)胞移植給患者的步驟。有時所述細(xì)胞療法包含:從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將造血前體細(xì)胞除去的步驟。在將所述NK細(xì)胞移植給患者的步驟中，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞有時與NK細(xì)胞前體、T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、造血前體細(xì)胞等一起被移植。有時本發(fā)明的細(xì)胞療法被用于治療和/或預(yù)防傳染病和/或癌癥。有時本發(fā)明的細(xì)胞療法包含:移植給具有與通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法而制備的NK細(xì)胞不同的HLA基因型的患者的步驟。在本發(fā)明的細(xì)胞療法中，有時將所述NK細(xì)胞移植給患者的步驟通過將本發(fā)明的醫(yī)藥組合物施用于患者的步驟來實(shí)現(xiàn)。
[0033]在本發(fā)明的細(xì)胞療法中，有時所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群由選自源于干細(xì)胞的造血干細(xì)胞、源于臍帶血的造血干細(xì)胞、源于外周血的造血干細(xì)胞、源于骨髓血的造血干細(xì)胞、臍帶血單核細(xì)胞、和外周血單核細(xì)胞中的至少I種細(xì)胞來制備，其中所述干細(xì)胞為選自胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞及人工多能干(iPS)細(xì)胞中的任意一種。有時所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的供體源于:作為受體的患者自身、該患者的近親、或者與患者無血緣關(guān)系的人。有時所述NK細(xì)胞源自受體的主要組織相容性抗原(MHC)、和殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer Immunoglobulin-1 ike Receptor:KIR)不一致的供體。
[0034]在本說明書中，“NK細(xì)胞”表示⑶3陰性⑶56陽性的單核細(xì)胞，尤其是對MHC類I型分子的表達(dá)少、或者該表達(dá)消失了的細(xì)胞具有溶細(xì)胞活性。[0035]在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中，所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種步驟來制備。例如，可以在由臍帶血及外周血這樣的血液回收單核細(xì)胞時，使用密度梯度離心法。此外，NK細(xì)胞可以使用免疫磁珠來采集。而且，就所述NK細(xì)胞而言，可以使用對細(xì)胞表面標(biāo)記特異性的抗體進(jìn)行免疫突光染色，使用FACS (Fluorescence activatedcell sorter，熒光激活細(xì)胞分選儀)或流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離、鑒定。此外，所述NK細(xì)胞也可以如下制備:使用包括但不限于由Invitrogen公司市售的Dynal公司制的Dynabeads (商標(biāo))、Miltenyi Biotec公司的CliniMACS (商標(biāo))的免疫磁珠，將表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD3和/或CD34的細(xì)胞分離除去來制備。此外，有時利用對T細(xì)胞和/或造血前體細(xì)胞的特異性結(jié)合配偶體，使T細(xì)胞和/或造血前體細(xì)胞選擇性地受傷或滅絕。需要說明的是,將所述T細(xì)胞從所述單核細(xì)胞除去的步驟也可以是將其他的細(xì)胞類型、例如造血前體細(xì)胞、B細(xì)胞和/或NKT細(xì)胞與T細(xì)胞一起除去的步驟。將造血前體細(xì)胞從所述單核細(xì)胞除去的步驟也可以是將其他的細(xì)胞類型、例如T細(xì)胞、B細(xì)胞和/或NKT細(xì)胞與造血前體細(xì)胞一起除去的步驟。
[0036]在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中，有時由臍帶血及外周血分離的單核細(xì)胞被冷凍保存，并根據(jù)向患者的移植時間來解凍，供于NK細(xì)胞的擴(kuò)增?；蛘撸袝r所述單核細(xì)胞在通過本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法擴(kuò)增的途中、或在擴(kuò)增結(jié)束后被冷凍，并根據(jù)向患者的移植時間來解凍，供于向患者的移植。血細(xì)胞的冷凍及解凍可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。有時在所述細(xì)胞的冷凍中，可以使用任意一種市售的細(xì)胞冷凍保存液。
[0037]在本發(fā)明的細(xì)胞療法中，就用于使活著的NK細(xì)胞懸浮的溶液而言，例如，通常有生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水(PBS)、培養(yǎng)基、血清等。有時所述溶液包含作為醫(yī)藥品及準(zhǔn)醫(yī)藥品的藥學(xué)上允許的載體。本發(fā)明的NK細(xì)胞療法可以適用于NK細(xì)胞敏感的各種疾病的治療和/或預(yù)防。所述疾病包括但不限于例如口腔癌、膽囊癌、膽管癌、肺癌、肝癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌、白血病、或者由病毒、細(xì)菌等引起的傳染病。有時本發(fā)明的細(xì)胞療法可以通過單獨(dú)或組合外科療法、化學(xué)療法、放射療法等來實(shí)施。在本發(fā)明的細(xì)胞療法中，有時NK細(xì)胞例如通過向靜脈、動脈、皮下、腹腔內(nèi)等施用來移植。
[0038]用于制備本發(fā)明的NK細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基包括但并不限于KBM501培養(yǎng)基(Kohjin Bio株式會社)、CellGro SCGM培養(yǎng)基(CellGenix，巖井化學(xué)藥品株式會社)、X-VIV015 培養(yǎng)基(Lonza，Takara Bio 株式會社)、MDM、MEM、DMEM、RPM1-1640 等。
[0039]所述培養(yǎng)基中，有時以能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的的濃度來添加白介素-2(IL_2)。有時所述IL-2的濃度為2500IU/mL至2813IU/mL。所述IL-2優(yōu)選具有人的氨基酸序列，從安全上考慮，優(yōu)選通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。
[0040]本說明書中，IL-2的濃度有時以日本標(biāo)準(zhǔn)單位(JRU)及國際單位(IU)來表示。由于 IIU 為約 0.622JRU,因此 1750JRU/mL 為約 2813IU/mL。
[0041]所述培養(yǎng)基中，有時添加有受試者的自體血清、能夠從BioWhittaker公司等獲得的人AB型血清、能夠從日本紅十字會獲得的獻(xiàn)血人血清白蛋白。所述自體血清及所述人AB型血清優(yōu)選以I至10%的濃度添加，所述獻(xiàn)血人血清白蛋白優(yōu)選以I至10%的濃度添加。有時所述受試者為健康者、和患有所述疾病的患者。
[0042]所述培養(yǎng)基中，以不損害NK細(xì)胞的擴(kuò)增效果為條件，有時含有適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)、細(xì)胞因子、抗體、化合物等成分。所述細(xì)胞因子有時為白介素3(IL-3)、白介素7(IL-7)、白介素12 (IL-12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-21 (IL-21)、干細(xì)胞因子(SCF)、和/或FMS樣酪氨酸激酶 3 配體(Flt3L)。所述 IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、SCF 及 Flt3L 優(yōu)選具有人的氨基酸序列，從安全上考慮，優(yōu)選通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。對于所述培養(yǎng)基的更換，以能夠得到所期望的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為條件，從培養(yǎng)開始后任意時刻進(jìn)行均可，優(yōu)選為每3-5日進(jìn)行更換。
[0043]在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中，培養(yǎng)容器包括但不限于商業(yè)上可獲得的皿、燒瓶、板、多孔板。作為培養(yǎng)條件，只要不損害NK細(xì)胞的擴(kuò)增效果，則沒有特別限制，通常為37°C、5%C02及飽和水蒸氣環(huán)境下的培養(yǎng)條件。由于本發(fā)明的目的為大量制備NK細(xì)胞，因此在所述培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的時間越長，則越能夠得到更多的NK細(xì)胞，因此是有利的。就培養(yǎng)時間而言，只要是能夠?qū)K細(xì)胞擴(kuò)增至所期望的細(xì)胞數(shù)的條件，則沒有特別限制。
[0044]在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中，有時所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群除NK細(xì)胞外，還包含NK細(xì)胞前體、T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、造血前體細(xì)胞等。有時所期望的NK細(xì)胞在擴(kuò)增后，通過使用例如密度梯度離心法、免疫磁珠、FACS、流式細(xì)胞法等來進(jìn)行選擇。例如，有時所述NK細(xì)胞通過使用抗⑶3抗體、抗⑶16抗體、抗⑶34抗體、抗⑶56抗體、抗⑶69抗體、抗⑶94抗體、抗CD107a抗體、抗KIR3DL1抗體、抗KIR3DL2抗體、抗KIR2DL3抗體、抗KIR2DL1抗體、抗KIR2DS1抗體、抗KIR2DL5抗體、抗NKp46抗體、抗NKp30抗體、抗NKG2D抗體等，從所述細(xì)胞群選擇性分離。有時所述抗體為單克隆抗體、多克隆抗體等。有時NK細(xì)胞的選擇通過選擇性除去T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、造血前體細(xì)胞等細(xì)胞來進(jìn)行。
[0045]本發(fā)明的方法及醫(yī)藥組合物的制造優(yōu)選在適合于醫(yī)藥品及準(zhǔn)醫(yī)藥品的制造管理及品質(zhì)管理規(guī)則的條件(good manufacturing practice、GMP)下來實(shí)施。
[0046]擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來評價。所述溶細(xì)胞活性一般通過如下方法進(jìn)行定量:孵育所述NK細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)、和使用放射性物質(zhì)、熒光色素等標(biāo)記后的目標(biāo)細(xì)胞后，對放射量或熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。有時所述目標(biāo)細(xì)胞為K562細(xì)胞、急性骨髓性白血病 細(xì)胞、慢性骨髓性白血病細(xì)胞，但并不限定于此。有時擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的性質(zhì)使用RT-PCR法、固相雜交形成法、ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉降法、免疫比濁法、FACS、流式細(xì)胞法等來進(jìn)行調(diào)查。
[0047]在本發(fā)明中，臍帶血及外周血的全血的采集、自體血清的制備、來自所述全血的單核細(xì)胞的制備、該單核細(xì)胞的培養(yǎng)前后的細(xì)胞數(shù)的測定、培養(yǎng)前后的所述單核細(xì)胞中的NK細(xì)胞、T細(xì)胞、造血前體細(xì)胞等細(xì)胞類型的構(gòu)成比率的測定、NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍率的計(jì)算、和關(guān)于測定誤差和顯著性的統(tǒng)計(jì)分析可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意方法來實(shí)施。
[0048]本說明書中提到的全部文獻(xiàn)通過引用其整體而包含在本說明書中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1A為在除去⑶3陽性細(xì)胞之前，使用對⑶3及⑶56的抗體進(jìn)行雙重染色并通過流式細(xì)胞法進(jìn)行測定的結(jié)果圖。
[0050]圖1B為在除去⑶3陽性細(xì)胞之后，使用對⑶3及⑶56的抗體進(jìn)行雙重染色并通過流式細(xì)胞法進(jìn)行測定的結(jié)果圖。
[0051]圖2A為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的各自的增殖曲線。[0052]圖2B為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的平均增殖曲線。
[0053]圖3A為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的擴(kuò)增倍率的各自的增殖曲線。
[0054]圖3B為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的擴(kuò)增倍率的平均增殖曲線。
[0055]圖4A為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)的擴(kuò)增倍率的各自的增殖曲線。
[0056]圖4B為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)的擴(kuò)增倍率的平均增殖曲線。
[0057]圖5A為通過流式細(xì)胞法對從5名健康人分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的經(jīng)時變化進(jìn)行測定的結(jié)果圖。
[0058]圖5B為通過流式細(xì)胞法對從5名健康人分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的經(jīng)時變化進(jìn)行測定、并平均化的結(jié)果圖。
[0059]圖6A為通過流式細(xì)胞法對從3名晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者分離出的NK細(xì)胞(CD3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的經(jīng)時變化進(jìn)行測定的結(jié)果圖。
[0060]圖6B為從3名晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/CD56陽性)的擴(kuò)增倍率的平均增殖曲線。
[0061]圖7為對⑶69的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行比較的圖表。
[0062]圖8為對CD69的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行比較的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的測定值的圖表。
[0063]圖9為對CD16的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行比較的圖表。
[0064]圖10為對CD16的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行比較的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的測定值的圖表。
[0065]圖11為對各種細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行比較的圖表。
[0066]圖12為在KBM培養(yǎng)基、和CellGro培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍率的增殖曲線。
[0067]圖13為表示對通過本發(fā)明的方法擴(kuò)增后的源于外周血的NK細(xì)胞對K562的溶細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)查的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表。
[0068]圖14為通過流式細(xì)胞法對從健康人分離出的CD107a陽性細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的經(jīng)時變化進(jìn)行測定的結(jié)果圖。
[0069]圖15為表示除去I次及2次⑶3陽性細(xì)胞后的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的柱狀圖。
[0070]圖16A為表示擴(kuò)增前的⑶3陰性細(xì)胞、和⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中的⑶34陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率的柱狀圖。
[0071]圖16B為表示擴(kuò)增前的⑶3陰性細(xì)胞、和⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中的⑶3陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率的柱狀圖。
[0072]圖17為表示擴(kuò)增后的⑶3陰性細(xì)胞、和⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中的NK細(xì)胞(⑶3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0073]就以下說明的本發(fā)明的實(shí)施例而言，其目的僅為例示，而并非對本發(fā)明的技術(shù)范圍進(jìn)行限定。本發(fā)明的技術(shù)范圍僅受權(quán)利要求的記載的限定。在不脫離本發(fā)明的主旨的條件下，可以進(jìn)行本發(fā)明的變更、例如進(jìn)行本發(fā)明的構(gòu)成要件的追加、刪除及置換。
[0074]實(shí)施例1
[0075]NK細(xì)胞的擴(kuò)增(I)
[0076]1.材料及方法
[0077](I)自外周血的采血
[0078]外周血采集自健康人、和晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者。本實(shí)驗(yàn)獲得了九州大學(xué)醫(yī)系地區(qū)部局臨床研究倫理審查委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號22-176，批準(zhǔn)日:平成23年3月31日)而實(shí)施。自所述健康人及所述患者獲得書面同意。采血、冷凍保存、及解凍通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來進(jìn)行。
[0079](2)自外周血分離單核細(xì)胞
[0080]將所得的血液用保存于常溫的稀釋液(添加有ImM EDTA及2%胎牛血清的PBS)稀釋2倍，在各離心管中，20~35mL稀釋血由10~15mL的Ficoll Paque (比重1.077)覆蓋。離心在500Xg、室溫下進(jìn)行20分鐘，不經(jīng)制動地停止離心。以剩余數(shù)mL的方式除去離心上清(血漿部分)，回收中間層。將回收自I~2根離心管的所述中間層收集到I根新的離心管中，用所述稀釋液調(diào)節(jié)體積至50mL。第二次離心在500Xg、室溫、5分鐘或15分鐘的條件下進(jìn)行。除去上清，使團(tuán)粒懸浮于30mL的所述稀釋液中。第三次離心在280Xg、室溫、10分鐘的條件下進(jìn)行。除去上清，以`使細(xì)胞濃度為I X IO7個/mL的方式使沉淀物懸浮于添加有2mM EDTA和0.1%BSA的PBS中(以下稱為“單核細(xì)胞懸浮液”)。
[0081](3)⑶3陽性細(xì)胞的除去
[0082]抗CD3抗體被固定化后的磁珠(Dynabeads CD3)用添加有0.1%BSA的PBS洗滌I次后，以每IO7個細(xì)胞添加50 μ L的方式被添加到所述單核細(xì)胞懸浮液中。在4°C下使用旋轉(zhuǎn)器將所述包含磁珠的單核細(xì)胞懸浮液攪拌30分鐘。之后，通過磁鐵將所述磁珠從所述懸浮液中分離，除去在細(xì)胞表面表達(dá)CD3的細(xì)胞(CD3陽性細(xì)胞)。
[0083](4)除去⑶3陽性細(xì)胞后的細(xì)胞群的培養(yǎng)
[0084]所述懸浮液中的剩余細(xì)胞(以下，稱為“⑶3陰性細(xì)胞”。)使用添加有5%自體血清的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(KBM501，16025015,Kohjin Bio株式會社；含有1750JRU/mL的IL-2)(以下，稱為“KBM培養(yǎng)基”。)進(jìn)行稀釋以達(dá)到5 X IO5個/mL，并接種于6孔培養(yǎng)板(140675，nunc, Thermo Fisher Scientif ic株式會社)。在37°C、5%C02及飽和水蒸氣環(huán)境下進(jìn)行21天細(xì)胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)第5天、第9天、第13天及第17天進(jìn)行培養(yǎng)基更換。所述細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0085](5)細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞表面標(biāo)記的分析
[0086]所述外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)通過在培養(yǎng)開始時至第21天為止的期間使用血球計(jì)對活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)量來確定。使用抗⑶3抗體(317308, BioLegend Japan株式會社)、抗 CD16 抗體(556618, BD Pharmingen,日本 Becton Dickinson 株式會社)、抗 CD56 抗體(304607, 318321, BioLegend Japan 株式會社)、抗 CD69 抗體(310905BioLegend Japan 株式會社)、抗 KIR3DL1/KIR3DL2 抗體(130-095-205，Miltenyi Biotec 株式會社)、抗 KIR2DL3抗體(FAB2014P，R & D SYSTEMS 公司，COSMO BIO 株式會社)、抗 KIR2DL1/KIR2DS1 抗體(339505, BioLegend Japan 株式會社)、抗 KIR2DL5 抗體(341303, BioLegend Japan 株式會社)、抗NKp46抗體(331907,BioLegend Japan株式會社)、抗NKp30抗體(325207,BioLegendJapan株式會社)、及抗NKG2D抗體(320805, BioLegend Japan株式會社)通過流式細(xì)胞法來分析所述細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記。
[0087]2.結(jié)果
[0088]( I)健康人的NK細(xì)胞的擴(kuò)增
[0089]圖1A為在除去⑶3陽性細(xì)胞之前，使用對⑶3及⑶56的抗體進(jìn)行雙重染色，并通過流式細(xì)胞法進(jìn)行測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1B為在除去CD3陽性細(xì)胞之后，使用對CD3及CD56的抗體進(jìn)行雙重染色并通過流式細(xì)胞法進(jìn)行測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。就“CD3陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率”而言，通過流式細(xì)胞法計(jì)量出的、各實(shí)驗(yàn)組的全部培養(yǎng)細(xì)胞中的CD3陽性細(xì)胞的比例以百分率表示。CD3陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率(％)在除去CD3陽性細(xì)胞前為69.37%，在除去CD3陽性細(xì)胞后為0.68%。由上述結(jié)果可知:CD3陽性細(xì)胞從單核細(xì)胞懸浮液中被顯著地除去。
[0090]圖2A為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的各自的增殖曲線。圖2B為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的平均增殖曲線。在培養(yǎng)開始時、培養(yǎng)5天后、培養(yǎng)9天后、培養(yǎng)13天后、培養(yǎng)17天后及培養(yǎng)21天后，對從 5名健康人采集到的每ImL外周血的CD3陰性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測定。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)5次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。CD3陰性細(xì)胞從培養(yǎng)開始時起到第21天后為止持續(xù)增加。增加速度到第13天為止持續(xù)上升，在第13天后降低。⑶3陰性細(xì)胞從培養(yǎng)開始時的約5X IO5個增加至培養(yǎng)21天后的約700X IO5個。
[0091]圖3A為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的擴(kuò)增倍率的各自的增殖曲線。圖3B為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的CD3陰性細(xì)胞的擴(kuò)增倍率的平均增殖曲線。所述擴(kuò)增倍率以用培養(yǎng)5天后、培養(yǎng)9天后、培養(yǎng)13天后、培養(yǎng)17天后及培養(yǎng)21天后的CD3陰性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)除以培養(yǎng)開始時的CD3陰性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)所得的商的形式算出。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)5次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。CD3陰性細(xì)胞的擴(kuò)增倍率從培養(yǎng)開始時起到第21天為止持續(xù)增大。所述擴(kuò)增倍率到第13天為止顯著持續(xù)增大,在培養(yǎng)21天后增大至約150倍。
[0092]圖4A為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)的擴(kuò)增倍率的各自的增殖曲線。圖4B為從5名健康人的外周血中的單核細(xì)胞分離出的NK細(xì)胞(CD3陰性/CD56陽性)的擴(kuò)增倍率的平均增殖曲線。在圖4A及圖4B中，使用對CD3及CD56的抗體進(jìn)行雙重染色并通過流式細(xì)胞法對CD3陰性細(xì)胞進(jìn)行分析。所述擴(kuò)增倍率以用培養(yǎng)7天后、培養(yǎng)14天后及培養(yǎng)21天后的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)除以培養(yǎng)開始時的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)所得的商的形式算出。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)5次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍率從培養(yǎng)開始時起到第21天為止持續(xù)增大。所述擴(kuò)增倍率到第14天為止顯著持續(xù)增大，在培養(yǎng)21天后增大至約400倍。
[0093]圖5A為通過流式細(xì)胞法對從5名健康人分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的經(jīng)時變化進(jìn)行測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5B為通過流式細(xì)胞法對從5名健康人分離出的NK細(xì)胞(CD3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的平均值的經(jīng)時變化進(jìn)行測定、并平均化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在圖5A及圖5B中，使用對CD3及CD56的抗體進(jìn)行雙重染色并通過流式細(xì)胞法對CD3陰性細(xì)胞進(jìn)行分析。就“NK細(xì)胞的構(gòu)成比率”而言，通過流式細(xì)胞法進(jìn)行計(jì)量的、各實(shí)驗(yàn)組的全部培養(yǎng)細(xì)胞中的NK細(xì)胞的比例以百分率表示。圖表的縱軸為NK細(xì)胞(CD3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(%)，橫軸為培養(yǎng)天數(shù)。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)5次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。NK細(xì)胞的構(gòu)成比率從培養(yǎng)開始時起到第21天為止持續(xù)增大。所述NK細(xì)胞的構(gòu)成比率到第14天為止顯著持續(xù)增大，在培養(yǎng)14天后增大至約90。本發(fā)明示出可選擇性地且經(jīng)時地使NK細(xì)胞擴(kuò)增。
[0094]( 2 )患者的NK細(xì)胞的擴(kuò)增
[0095]圖6A為通過流式細(xì)胞法對從3名晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者分離出的NK細(xì)胞(CD3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的經(jīng)時變化進(jìn)行測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6B為從3名晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者分離出的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)的擴(kuò)增倍率的平均增殖曲線。就“NK細(xì)胞的構(gòu)成比率”而言，通過流式細(xì)胞法計(jì)量的、各實(shí)驗(yàn)組的全部培養(yǎng)細(xì)胞中的NK細(xì)胞的比例以百分率表示。在圖6A的圖表中，縱軸為NK細(xì)胞(CD3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(％)，橫軸為培養(yǎng)天數(shù)。就“N K細(xì)胞的擴(kuò)增倍率”而言，其表示為用擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)除以擴(kuò)增前外周血單核細(xì)胞中所存在的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)而得的結(jié)果。在圖6B的圖表中，縱軸為NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍率，橫軸為培養(yǎng)天數(shù)。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。如圖6A所示，NK細(xì)胞的構(gòu)成比率從培養(yǎng)開始時起到第14天為止顯著持續(xù)增加，在培養(yǎng)14天后增大至約85%。此外，如圖6B所示，NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍率從培養(yǎng)開始時起到第14天為止顯著持續(xù)增加，在培養(yǎng)14天后增大至約140倍。在培養(yǎng)21天后，CD3陽性細(xì)胞發(fā)生了增殖，因此NK細(xì)胞的構(gòu)成比率降低。但是，所述CD3陽性細(xì)胞的增殖幾乎沒有給NK細(xì)胞的擴(kuò)增帶來影響。由以上的結(jié)果顯示出:從晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者分離出的NK細(xì)胞可經(jīng)時擴(kuò)增。此外，本發(fā)明顯示出:可以使從患有癌癥、傳染病等的患者分離出的NK細(xì)胞經(jīng)時擴(kuò)增。
[0096](3) NK細(xì)胞的分化標(biāo)記的表達(dá)
[0097]圖7、9及11中示出了對各細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行比較的圖表。此外，圖8及10中示出了對CD69及CD16的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果進(jìn)行比較的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的測定值的圖表。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。由圖7至圖11可知:與擴(kuò)增前的細(xì)胞相比較，通過本發(fā)明的方法擴(kuò)增的細(xì)胞強(qiáng)勢地表達(dá)出 CD69、KIR2DL3、KIR2DL1/KIR2DS1、KIR2DL5、NKp30、及 NKG2D。尤其是，在所述擴(kuò)增后的細(xì)胞中，CD69的表達(dá)約為100%。這些圖顯示出:通過本發(fā)明的方法制備出的細(xì)胞可對作為NK細(xì)胞的分化標(biāo)記進(jìn)行表達(dá)。此外示出，所述NK細(xì)胞具備高溶細(xì)胞活性。
[0098]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出:將CD3陽性細(xì)胞、即T細(xì)胞除去后，在所述KBM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，由此基本可以僅使NK細(xì)胞選擇性地且有效地進(jìn)行擴(kuò)增。顯示出:不僅可以由健康人、而且可以由患有癌癥、傳染病等的患者制備大量的NK細(xì)胞。此外顯示出:本發(fā)明的方法不僅可以使源于外周血的NK細(xì)胞顯著地?cái)U(kuò)增，而且可以使源于其他的組織、器官的細(xì)胞、特別是源于臍帶血的NK細(xì)胞顯著地?cái)U(kuò)增。
[0099]實(shí)施例2
[0100]NK細(xì)胞的擴(kuò)增(2)
[0101]1.材料及方法
[0102]NK細(xì)胞根據(jù)實(shí)施例1中說明的方法由健康人制備。制備添加了 2500IU/mL的IL_2(AF-200-02-2, PeproTech，東洋紡織株式會社)、和 5% 自體血清的 CellGro SCGM (2001，CellGenix,巖井化學(xué)藥品株式會社)(以下,稱為“CellGro培養(yǎng)基”。)作為細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。所述NK細(xì)胞按照實(shí)施例1中說明的方法在所述KBM培養(yǎng)基及所述CellGro培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。
[0103]2.結(jié)果
[0104]圖12為在KBM培養(yǎng)基、和CellGro培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍率的增殖曲線。所述擴(kuò)增倍率以用培養(yǎng)7天后、培養(yǎng)14天后及培養(yǎng)21天后的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)除以培養(yǎng)開始時的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)所得的商的形式算出。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)2次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍率在KBM培養(yǎng)基及CellGro培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)開始時起到第21天為止持續(xù)增大。在培養(yǎng)21天后，所述擴(kuò)增倍率在KBM培養(yǎng)基中為約670倍，在CellGro培養(yǎng)基約為140倍。
[0105]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出:NK細(xì)胞在所述KBM培養(yǎng)基、和所述CellGro培養(yǎng)基中充分地進(jìn)行擴(kuò)增。因此，顯示出:NK細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的類型無關(guān)，可以在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。
[0106]實(shí)施例3`[0107]擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性
[0108]1.材料及方法
[0109](I)溶細(xì)胞活性的定量
[0110]NK細(xì)胞按照實(shí)施例1中說明的方法來制備，并作為效應(yīng)細(xì)胞來使用。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備K562細(xì)胞(慢性骨髓性白血病細(xì)胞)，并作為目標(biāo)細(xì)胞來使用。擴(kuò)增后的NK細(xì)胞、和未擴(kuò)增的NK細(xì)胞(以下，稱為“非擴(kuò)增NK細(xì)胞”。)的溶細(xì)胞活性通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來定量。簡單而言，所述目標(biāo)細(xì)胞在添加了 3，3’ - 二(十八烷基)氧雜擬花青(3，3，-dioctadecyloxacarbocyanine) (D4292, Sigma-Aldrich Japan 株式會社)(終濃度:0.01mM)的RPM1-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)10分鐘，由此進(jìn)行標(biāo)識。所述目標(biāo)細(xì)胞在標(biāo)識后使用PBS(-)及無血清MDM培養(yǎng)基洗滌3次。所述效應(yīng)細(xì)胞和所述目標(biāo)細(xì)胞被接種于圓底的96孔的培養(yǎng)板中，在無血清IMDM培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2小時。就效應(yīng)細(xì)胞和目標(biāo)細(xì)胞之比(Ε:T比)而言，以3:1、2:1、1:1、1:5、及1:10的方式來制備。使用抗MHC類I抗體(311409, BioLegend Japan 株式會社)及 7-氨基-放線菌素 D (A9400, Sigma-AldrichJapan株式會社)通過流式細(xì)胞法對溶細(xì)胞活性(％)進(jìn)行定量。
[0111](2) NK細(xì)胞的分化標(biāo)記的表達(dá)
[0112]NK細(xì)胞按照實(shí)施例1中說明的方法進(jìn)行擴(kuò)增。在培養(yǎng)開始時、培養(yǎng)3天后、培養(yǎng)7天后、培養(yǎng)14天后及培養(yǎng)21天后，以2:1的E:T比將所述NK細(xì)胞和所述Κ562細(xì)胞共培養(yǎng)2小時。之后，所述NK細(xì)胞中的⑶107a陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率使用抗⑶107a抗體(328606，BioLegend Japan株式會社)通過流式細(xì)胞法來分析。[0113]2.結(jié)果
[0114](I)溶細(xì)胞活性的定量
[0115]圖13為表示對通過本發(fā)明的方法擴(kuò)增后的源于外周血的NK細(xì)胞對K562的溶細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)查的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表?？v軸為溶細(xì)胞活性(單位:％)。白色柱表示非擴(kuò)增NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性，黑色柱表示擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性。橫軸為擴(kuò)增后的NK細(xì)胞或非擴(kuò)增NK細(xì)胞、與K562細(xì)胞的E:T比。當(dāng)E:Τ比為3:1時，就所述溶細(xì)胞活性而言，非擴(kuò)增NK細(xì)胞約為30%，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞約為110%。當(dāng)E:Τ比為2:1時，就所述溶細(xì)胞活性而言，非擴(kuò)增NK細(xì)胞約為20%，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞約為107%。當(dāng)E:Τ比為1:1時，就所述溶細(xì)胞活性而言，非擴(kuò)增NK細(xì)胞約為10%，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞約為100%。當(dāng)E:Τ比為1:5及
I:10時，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的所述溶細(xì)胞活性分別為約25%及約15%。
[0116](2) NK細(xì)胞的分化標(biāo)記的表達(dá)
[0117]圖14為通過流式細(xì)胞法對從健康人分離出的CD107a陽性細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的經(jīng)時變化進(jìn)行測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。各實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)偏差由在同一條件下重復(fù)5次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值算出。就“CD107a陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率”而言，通過流式細(xì)胞法計(jì)量的、各實(shí)驗(yàn)組的全部培養(yǎng)細(xì)胞中的CD107a陽性細(xì)胞的比例以百分率表示。在圖14的圖表中，縱軸為CD107a陽性細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(％)，橫軸為培養(yǎng)天數(shù)。⑶107a陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率從培養(yǎng)開始時起到第3天為止增大至約35%，所述構(gòu)成比率在第21天仍得以維持。
[0118]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出:通過本發(fā)明擴(kuò)增后的NK細(xì)胞具有高溶細(xì)胞活性。因此，就本發(fā)明而言，其顯示出:不使用飼養(yǎng)細(xì)胞、將外來分子轉(zhuǎn)染后的NK細(xì)胞等，也可選擇性地且有效地?cái)U(kuò)增溶細(xì)胞活性高的NK細(xì)胞。此外，就NK細(xì)胞而言，其不僅在由源于外周血的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，即使在由源 于其他的組織、器官的細(xì)胞、特別是源于臍帶血的細(xì)胞來進(jìn)行擴(kuò)增時，也顯示出高溶細(xì)胞活性。
[0119]實(shí)施例4
[0120]NK細(xì)胞的擴(kuò)增(3)(⑶3陽性細(xì)胞的重復(fù)除去)
[0121]在實(shí)施例1至3的實(shí)驗(yàn)后，在進(jìn)一步重復(fù)NK細(xì)胞的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)如下情況:CD3陽性細(xì)胞非選擇性地增大，CD3陽性細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率如本實(shí)施例的結(jié)果所示而有時超過30%。在利用通過血液成分單采術(shù)從晚期癌癥患者采集的外周血單核細(xì)胞來擴(kuò)增NK細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，該CD3陽性細(xì)胞的非選擇性地增大的頻率約為30% (未示出數(shù)據(jù)。)。因此，為了選擇性地?cái)U(kuò)增NK細(xì)胞，而嘗試重復(fù)除去CD3陽性細(xì)胞的步驟。
[0122]1.材料及方法
[0123]按照實(shí)施例1中說明的方法，擴(kuò)增NK細(xì)胞，對細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行分析。單核細(xì)胞懸浮液由晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者制備。實(shí)施I次或2次CD3陽性細(xì)胞的除去。CD3陰性細(xì)胞在所述KBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天。
[0124]2.結(jié)果
[0125]圖15為表示除去I次及2次⑶3陽性細(xì)胞后的NK細(xì)胞(⑶3陰性/⑶56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的柱狀圖。各實(shí)驗(yàn)條件的誤差柱表示在同一條件下重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。就NK細(xì)胞、CD3陽性細(xì)胞及其他細(xì)胞的構(gòu)成比率而言，通過流式細(xì)胞法計(jì)量的、各實(shí)驗(yàn)組的全部培養(yǎng)細(xì)胞中的NK細(xì)胞、CD3陽性細(xì)胞及其他細(xì)胞的比例分別以百分率表示。圖表的縱軸為NK細(xì)胞、CD3陽性細(xì)胞及其他細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(％)，橫軸為CD3陽性細(xì)胞的除去次數(shù)。就NK細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(％)而言，在⑶3陽性細(xì)胞的I次除去的情況下約為50%，在⑶3陽性細(xì)胞的2次除去的情況下約為65%。
[0126]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出:CD3陽性細(xì)胞的重復(fù)除去使⑶3陽性細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率降低，可以增大NK細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率。但是，對于使NK細(xì)胞選擇性地?cái)U(kuò)增而言，所述CD3陽性細(xì)胞的重復(fù)除去的作用并不充分。因此，嘗試并用所述CD3陽性細(xì)胞的重復(fù)除去以外的其他處理。
[0127]實(shí)施例5
[0128]NK細(xì)胞的擴(kuò)增(4)(⑶3陽性細(xì)胞及⑶34陽性細(xì)胞的除去)
[0129]1.材料及方法
[0130]按照實(shí)施例1中說明的方法，擴(kuò)增NK細(xì)胞，對細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行分析。單核細(xì)胞懸浮液由晚期癌癥(口腔癌、膽嚢癌及膽管癌)的患者制備。在除去CD3陽性細(xì)胞后，除去造血前體細(xì)胞。使用生物素化抗⑶34抗體(343523, BioLegend Japan株式會社)、和磁珠(Dynabeads biotin binder, 110-47, Life Technologies Japan 株式會社)，除去使⑶34在細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞(⑶34陽性細(xì)胞)，由此進(jìn)行所述造血前體細(xì)胞的除去。簡單而言，使所述CD34陽性細(xì)胞、與所述生物素化抗CD34抗體反應(yīng)。之后，進(jìn)行離心分離，除去上清，制備出結(jié)合有所述抗體的細(xì)胞的懸浮液。所述磁珠使用添加有0.1%BSA的PBS洗滌I次后，以每IO7個細(xì)胞添加50 μ L的方式被添加到所述懸浮液中。在4°C下使用旋轉(zhuǎn)器將包含所述磁珠的懸浮液攪拌30分鐘。通過磁鐵將所述磁珠從所述懸浮液中分離，除去CD34陽性細(xì)胞。所述懸浮液中 的剩余細(xì)胞(以下，稱為“CD3及CD34陰性細(xì)胞”。)在所述KBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天。在利用流式細(xì)胞法的計(jì)量中，追加使用抗⑶34抗體(343505，BioLegendJapan株式會社)。
[0131]2.結(jié)果
[0132]圖16A為表示擴(kuò)增前的⑶3陰性細(xì)胞、和⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中的⑶34陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率的柱狀圖。圖16B為表示擴(kuò)增前的CD3陰性細(xì)胞、和CD3及CD34陰性細(xì)胞中的CD3陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率的柱狀圖。各實(shí)驗(yàn)條件的誤差柱表示在同一條件下重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。就CD34陽性細(xì)胞及CD3陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率而言，通過流式細(xì)胞法計(jì)量的、各實(shí)驗(yàn)組的全部細(xì)胞中的CD34陽性細(xì)胞及CD3陽性細(xì)胞的比例以百分率來表示。圖表的縱軸為擴(kuò)增前的CD34陽性細(xì)胞及CD3陽性細(xì)胞相對于細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(%)。圖表的橫軸表示擴(kuò)增用的各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞類型。就擴(kuò)增前的CD34陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率(％)而言，在⑶3陰性細(xì)胞中約為0.15%，其在⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中約為0.02%。就擴(kuò)增前的⑶3陽性細(xì)胞的構(gòu)成比率(％)而言，其在⑶3陰性細(xì)胞中約為0.15%，在⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中約為0.25%。
[0133]圖17為表示擴(kuò)增后的⑶3陰性細(xì)胞、和⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中的NK細(xì)胞(⑶3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率的柱狀圖。各實(shí)驗(yàn)條件的誤差柱表示在同一條件下重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。就NK細(xì)胞、CD3陽性細(xì)胞及其他細(xì)胞的構(gòu)成比率而言，通過流式細(xì)胞法計(jì)量的、各實(shí)驗(yàn)組的全部培養(yǎng)細(xì)胞中的NK細(xì)胞、CD3陽性細(xì)胞及其他細(xì)胞的比例分別以百分率表示。圖表的縱軸為NK細(xì)胞、CD3陽性細(xì)胞及其他細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(％)。圖表的橫軸表示擴(kuò)增所使用的各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞類型。就擴(kuò)增后的NK細(xì)胞相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率(％)而言，其在CD3陰性細(xì)胞中約為60%，其在⑶3及⑶34陰性細(xì)胞中約為90%。
[0134]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出:NK細(xì)胞(CD3陰性/CD56陽性)相對于培養(yǎng)細(xì)胞總體的構(gòu)成比率，因除去⑶3陽性細(xì)胞及⑶34陽性細(xì)胞而顯著地增大。此外，即使在利用通過血液成分單采術(shù)采集的外周血單核細(xì)胞來擴(kuò)增NK細(xì)胞時，也顯示出通過將CD3陽性細(xì)胞及CD34陽性細(xì)胞除去，能夠以高純度擴(kuò)增NK細(xì)胞。
[0135]結(jié)論 [0136]由以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，通過從源于外周血的單核細(xì)胞除去⑶3陽性細(xì)胞(T細(xì)胞)，能夠大量制備NK細(xì)胞。而且，由本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，通過本發(fā)明的方法擴(kuò)增后的細(xì)胞具有非常高的溶細(xì)胞活性。而且，通過從源于外周血的單核細(xì)胞除去CD3陽性細(xì)胞(T細(xì)胞)及⑶34陽性細(xì)胞(造血前體細(xì)胞)，能夠以高純度地制備NK細(xì)胞。
[0137]已知就目前報道的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法而言，NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性低。例如，就源于健康人的外周血的NK細(xì)胞而言，Terunuma, H.等人的NK細(xì)胞的擴(kuò)增成績?yōu)?純度為81.2%，擴(kuò)增倍率為130倍，溶細(xì)胞活性為66% (Ε:T=3:1)(專利文獻(xiàn)I)。就源于健康人的外周血單核細(xì)胞而言，Tanaka, J.等人的NK細(xì)胞的擴(kuò)增成績?yōu)?純度為73.4%，擴(kuò)增倍率為6268倍，溶細(xì)胞活性約為55% (Ε:T=1:1)(專利文獻(xiàn)2)。就源于骨髓瘤患者的外周血的NK細(xì)胞而言，Carlens, S.等人的NK細(xì)胞的擴(kuò)增成績?yōu)?純度為55%，擴(kuò)增倍率為193倍，溶細(xì)胞活性為45% (Ε:T=1:1)(非專利文獻(xiàn)4)。就源于骨髓瘤患者的外周血的NK細(xì)胞而言，Alici, Ε.等人的NK細(xì)胞的擴(kuò)增成績?yōu)?純度為65%，擴(kuò)增倍率為1625倍，溶細(xì)胞活性約為10% (Ε:Τ=1:1)(非專利文獻(xiàn)5)。就源于健康人的外周血的NK細(xì)胞而言，F(xiàn)ujisaki，H.等人的NK細(xì)胞的擴(kuò)增成績?yōu)?當(dāng)使用被進(jìn)行了遺傳性改變的腫瘤細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時，純度為96.8%，擴(kuò)增倍率為277倍，溶細(xì)胞活性的最大值約為90% (Ε:T=1:1)(非專利文獻(xiàn)6)。與此相對,就源于健康人的外周血的NK細(xì)胞而言，本發(fā)明的NK細(xì)胞的擴(kuò)增成績?yōu)?純度約為90%，擴(kuò)增倍率為400倍，溶細(xì)胞活性約為100%(Ε:Τ=1:1)。在以往技術(shù)中，就NK細(xì)胞對Κ562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性而言，當(dāng)使用被進(jìn)行了遺傳性改變的腫瘤細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時，最大值約為約90% (Ε:Τ=1:1)，當(dāng)不使用飼養(yǎng)細(xì)胞時，為66% (Ε:Τ=3:1)。但是，本發(fā)明的NK細(xì)胞未使用飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，對Κ562細(xì)胞的溶細(xì)胞活性約為100% (Ε:Τ=1:1)。因此，就本發(fā)明而言，NK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性高、且不存在飼養(yǎng)細(xì)胞混入最終產(chǎn)物的風(fēng)險，因此與現(xiàn)有技術(shù)相比而顯著優(yōu)異。因此，本發(fā)明對于由采集的血細(xì)胞以高純度大量制備具有高溶細(xì)胞活性的NK細(xì)胞而言是有用的。
【權(quán)利要求】
1.一種NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，包括: 制備包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟； 從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將T細(xì)胞除去的步驟；和 在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)除去了所述T細(xì)胞后的剩余的細(xì)胞的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將所述T細(xì)胞除去的步驟是通過將CD3陽性細(xì)胞除去的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，包括從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將造血前體細(xì)胞除去的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，從所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群中將所述造血前體細(xì)胞除去的步驟是通過將CD34陽性細(xì)胞除去的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含自體血清、AB型血清和/或血清白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，制備所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟是通過從采集自受試者的血細(xì)胞中將單核細(xì)胞分離的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，所述血細(xì)胞采集自外周血、臍帶血、骨髓和/或淋巴結(jié)。`
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其特征在于，通過血液成分單采術(shù)從外周血采集所述血細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述包含NK細(xì)胞的細(xì)胞群由選自源于干細(xì)胞的造血干細(xì)胞、源于臍帶血的造血干細(xì)胞、源于外周血的造血干細(xì)胞、源于骨髓血的造血干細(xì)胞、臍帶血單核細(xì)胞、和外周血單核細(xì)胞中的至少I種細(xì)胞來制備，其中所述干細(xì)胞為選自胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞及人工多能干(iPS)細(xì)胞中的任意一種。
10.一種用于細(xì)胞療法的醫(yī)藥組合物，其特征在于，包含通過權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的擴(kuò)增方法而制備的NK細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，用于治療傳染病和/或癌癥。
【文檔編號】A61P37/04GK103620022SQ201280031188
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月24日
【發(fā)明者】米滿吉和, 原田結(jié), 齊藤智, 矢崎雄一郎, 岡本正人, 石田尾武文 申請人:國立大學(xué)法人九州大學(xué), 泰來株式會社