修飾的生物素結(jié)合蛋白及其融合蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了能夠在細(xì)菌中以可溶形式高產(chǎn)量地表達的修飾的生物素結(jié)合蛋白。還提供了包含所述修飾的生物素結(jié)合蛋白和抗原的融合蛋白。本公開進一步提供了金黃色葡萄球菌來源的α-溶血素的非溶血性變體、以及包含α-溶血素的非溶血性變體和生物素結(jié)合域的融合蛋白。本發(fā)明還公開了包含所述蛋白的免疫原性組合物，并且還公開了該免疫原性組合物用于誘發(fā)免疫應(yīng)答或用于對受試者進行接種的用途。
【專利說明】修飾的生物素結(jié)合蛋白及其融合蛋白和應(yīng)用
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)，本申請要求2011年5月11日提交的美國臨時申請?zhí)?1/484，934、2012年3月8日提交的美國臨時申請?zhí)?1/608，168以及2012年3月13日提交的美國臨時申請?zhí)?1/609，974的優(yōu)先權(quán)，以引用的方式將其各自的內(nèi)容全部并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及生物素結(jié)合蛋白和包含此類生物素結(jié)合蛋白的融合蛋白/組合物。本文還描述了在細(xì)菌中以高產(chǎn)量和可溶方式表達所述生物素結(jié)合蛋白和/或其融合蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]生物素結(jié)合蛋白及其衍生物可在多種應(yīng)用中廣泛使用。然而，重組生物素結(jié)合蛋白的制備或純化可能非常困難。當(dāng)在大腸桿菌(E.coli)中表達時，大部分生物素結(jié)合蛋白傾向聚集于包涵體(inclusion bodies)中,在活性蛋白的制備中需要進行變性、重折疊及冗長的下游處理。在大腸桿菌中表達由于生產(chǎn)成本低廉、且具有進一步工程化的潛力，因而是優(yōu)選的；能在大腸 桿菌中高效生產(chǎn)的生物素結(jié)合蛋白因此備受追捧。進而，大腸桿菌表達也為產(chǎn)生用于多種應(yīng)用的、含有生物素結(jié)合蛋白的重組融合蛋白提供了可能。
[0005]因此，本領(lǐng)域中對于能在大腸桿菌中以可溶形式高產(chǎn)量地表達的生物素結(jié)合蛋白以及含有生物素結(jié)合蛋白的融合蛋白存在需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的為提供一種能在大腸桿菌中以可溶形式高產(chǎn)量地表達的重組生物素結(jié)合蛋白。因此，本發(fā)明提供了一種生物素結(jié)合蛋白以及含有該生物素結(jié)合蛋白的組合物。在一些實施方式中，所述重組生物素結(jié)合蛋白包含大腸桿菌信號序列，所述信號序列融合至包含野生型Rhizavidin (rhavi)第45-179位氨基酸的氨基酸序列的N端；所述野生型Rhizavidin (rhavi )第45-179位氨基酸為:
[0007](FDASNFKDFSSIASASSS WQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVCWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD, SEQIDINO:1)。
[0008]在一些實施方式中,所述大腸桿菌信號序列為
[0009]MKKIffLALAGLVLAFSASA (SFQ ID No: 2) ο所述信號序列可通過柔性肽接頭與含有野生型rhavi第45-179位氨基酸的序列融合。
[0010]本文還提供了在大腸桿菌中以可溶形式高產(chǎn)量地表達生物素融合蛋白的方法。在一些實施方式中，所述方法包括在大腸桿菌中表達生物素結(jié)合蛋白，其中，以大腸桿菌信號序列對生物素結(jié)合蛋白的天然信號序列進行替換。在一些實施方式中，所述信號序列為
[0011]MKKIffLALAGLVLAFSASA(SEQ ID No:2)。[0012]在又一方面，本發(fā)明提供了包含生物素結(jié)合域以及蛋白質(zhì)或肽的生物素結(jié)合融合蛋白。
[0013]在另一方面，本文提供了脂化(Iipidated)生物素結(jié)合蛋白。本文所使用的術(shù)語“脂化生物素結(jié)合蛋白”是指與脂質(zhì)共價連接的生物素結(jié)合蛋白。脂化生物素結(jié)合蛋白是Toll樣受體2的配體或激動劑。因此，本文還提供了在受試者中誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括向受試者給予包含脂化生物素結(jié)合蛋白的組合物。
[0014]本文還提供了在大腸桿菌中表達脂化生物素結(jié)合蛋白的方法。在一些實施方式中，所述方法包括在大腸桿菌中表達脂化生物素結(jié)合蛋白，其中，以含有脂化基序(motif)的大腸桿菌信號序列對生物素結(jié)合蛋白的天然信號序列進行替換。在一些實施方式中，所述信號系列為
[0015]MKKVAAFVALSLLMAGC(SEQ ID No:3)。
[0016]在又一方面,本文提供了金黃色葡萄球菌(Staphylococcal aureus) α-溶血素(Hla)的非溶血性衍生物。本文所述的Hla衍生物可處于融合蛋白的形式，其中，所述融合蛋白含有Hla衍生物域和生物 素結(jié)合域這兩者。在這一方面的一些實施方式中，所述生物素結(jié)合域為本文所述的生物素結(jié)合蛋白。
[0017]與所述脂化生物素結(jié)合蛋白相類似，本文所述的Hla變體(variants)或其與生物素結(jié)合蛋白的融合蛋白也是Toll樣受體或其它模式識別受體(PRR)的配體或激動劑。因此，本文還提供了在受試者中誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法。在一些實施方式中，所述方法包括向受試者給予含有本文所述的非溶血性Hla變體或其與生物素結(jié)合蛋白的融合蛋白的組合物。
[0018]在又一方面，本文還提供了免疫原性組合物或疫苗組合物，所述免疫原性組合物或疫苗組合物包含生物素結(jié)合蛋白、脂化生物素結(jié)合蛋白、含有生物素結(jié)合域和抗原蛋白或抗原肽的生物素結(jié)合融合蛋白。在這一方面的一些實施方式中，所述抗原蛋白為本文所述的Hla的非溶血性衍生物。
[0019]本文還提供了以本文所公開的免疫原性組合物對受試者(例如哺乳動物，例如人)進行接種(vaccinating)的方法,所述方法包括向所述受試者給予本文公開的疫苗組合物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為根據(jù)本文公開的實施方式的修飾的生物素結(jié)合蛋白的示意圖。
[0021]圖2為純化的本文所述的重組生物素結(jié)合蛋白的SDS-PAGE。
[0022]圖3為含有生物素結(jié)合蛋白和抗原X的融合蛋白的示意圖。
[0023]圖4為純化的rhizavidin融合蛋白的示例性SDS-PAGE。
[0024]圖5為根據(jù)本文公開的實施方式的脂化生物素結(jié)合蛋白的示意圖。
[0025]圖6為本文所述的脂化生物素結(jié)合蛋白的SDS-PAGE。
[0026]圖7為示出了脂化生物素結(jié)合蛋白的劑量依賴性TLR2活性的柱狀圖。
[0027]圖8為本文所述的重組WT或突變型金黃色葡萄球菌α-溶血素(Hla)及其rhizavidin融合蛋白的示意圖。在非溶血性Hla中，進行下列點突變:(i)殘基205處W變?yōu)锳 ;(ii)殘基213處W變?yōu)锳 ;或者(iii)殘基209-211處DRD變?yōu)锳AA。
[0028]圖9為純化的野生型Hla或其非溶血性變體的SDS-PAGE。
[0029]圖10為純化的野生型Hla或其非溶血性變體的生物素結(jié)合融合蛋白的SDS-PAGE。[0030]圖11為示出WT Hla及其非溶血性變體的溶血活性的線形圖。
[0031]圖12為示出野生型Hla、Hla的非溶血性變體、以及野生型Hla及其非溶血性變體的生物素結(jié)合融合蛋白的溶血活性的線形圖。
[0032]圖13為示出以生物素結(jié)合融合蛋白(rhavi_Hla209)刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)了多種促炎性細(xì)胞因子的柱狀圖。
[0033]圖14為示出含有脂化rhizavidin或rhavi_Hla209的多抗原提呈系統(tǒng)(MAPS)復(fù)合物誘發(fā)針對抗原的增強的T細(xì)胞應(yīng)答的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0034]應(yīng)該理解的是，本發(fā)明并不限于本文所述的具體組合物、方法學(xué)、方案和試劑等，此類組合物、方法學(xué)、方案和試劑等可以變化。本文所使用的術(shù)語僅出于描述【具體實施方式】的目的，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求限定。
[0035]不希望被理論所限，本領(lǐng)域中生物素結(jié)合蛋白的低表達可能是由于在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中，生物素結(jié)合蛋白每一單體中的二硫鍵不形成、或形成水平較低，從而折疊較差。目前，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可通過轉(zhuǎn)運至大腸桿菌的周質(zhì)空間(periplasmic space)中來完成正確折疊。因此，可通過將生物素結(jié)合蛋白的全部天然信號序列替換為大腸桿菌分泌信號序列，改善重組生物素結(jié)合蛋白的正確折疊。不希望被理論所限，這樣促進了重組蛋白轉(zhuǎn)位(translocate)至大腸桿菌細(xì)胞的周質(zhì)空間中。重組蛋白轉(zhuǎn)位至大腸桿菌周質(zhì)空間中隨后能夠在生物素結(jié)合蛋白(例如Rhizavidin)中提供具有重要功能的二硫鍵,且所述蛋白能夠以可溶形式高產(chǎn)量地正確折疊。
[0036]在一方面，本文提供了能夠在大腸桿菌中以可溶形式高產(chǎn)量地表達的生物素結(jié)合蛋白。本文所使用的術(shù)語“生物`素結(jié)合蛋白”是指非共價結(jié)合至生物素或其類似物或衍生物的蛋白質(zhì)。高產(chǎn)量是指蛋白能夠以可溶形式在大腸桿菌中以約10mg/L、llmg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L以上的量表達。
[0037]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合蛋白可為重組蛋白。為避免由于原始來源的基因中存在稀有密碼子而造成在大腸桿菌中表達困難，可使用大腸桿菌表達密碼子對生物素結(jié)合蛋白的編碼序列進行優(yōu)化。
[0038]通常，生物素結(jié)合蛋白包含生物素結(jié)合域。本文所使用的術(shù)語“生物素結(jié)合域”是指結(jié)合至生物素的多肽序列。盡管可將完整的生物素結(jié)合蛋白用作生物素結(jié)合域；然而也可僅使用蛋白上與生物素結(jié)合的部分。在一些實施方式中，生物素結(jié)合域來源于Rhizavidin。
[0039]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合域由對應(yīng)于野生型Rhizavidin第45-179位氨基酸的氨基酸序列組成，或基本由上述序列組成。野生型Rhizavidin的氨基酸序列為:
[0040]MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALAFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD(SEQ ID NO:4)
[0041]換言之，生物素結(jié)合域并不包含(即缺少)野生型Rhizavidin第1_44位的氨基酸(MIITSLYATFGTIADGRRTSGGLTMIRTNAVAALVFAVATSALA, SEQ ID NO:5)。[0042]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合域含有氨基酸序列
[0043]FDAANFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYRGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD(SEQ IDNO:1).[0044]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合域包含與SEQ ID NO:1具有至少50% —致性、至少55% —致性、至少60% —致性、至少65% —致性、至少70% —致性、至少75% —致性、至少80% —致性、優(yōu)選至少85% —致性、至少90% —致性、至少95% —致性、至少96% —致性、至少97% —致性、至少98% —致性、或至少99% —致性、或更優(yōu)選至少99.3% 一致性的氨基酸序列。
[0045]盡管Helppolainen 等(Biochem J., 2007,405:397-405)描述了僅去除全長Rhizavidin的前24個殘基；然而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，全長Rhizavidin的前44個殘基對Rhizavidin的核心結(jié)構(gòu)和功能來說都不是必須的。此外，出乎預(yù)料地，全長Rhizavidin第25-44位的氨基酸(MIRTNAVAALVFAVATSALA，SEQ ID N0:6)降低在大腸桿菌中表達的Rhizavidin的溶解性和分泌；而將全長Rhizavidin的前44個殘基替換為大腸桿菌信號肽則會導(dǎo)致本文所述的生物素蛋白在大腸桿菌中的溶解性和分泌增高。
[0046]在本文所述的生物素結(jié)合蛋白中，生物素結(jié)合域可在N端或C端延伸一個或多個氨基酸，但所述生物素結(jié)合域的N端必須不包含對應(yīng)于野生型Rhizavidin第1_44位的氨基酸序列的氨基酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將野生型Rhizavidin N端的前44個氨基酸截除能夠顯著增加大腸桿菌中可溶形式的生物素結(jié)合蛋白的表達。因此，本文所述的生物素結(jié)合蛋白可含有序列X1-X2-X3,其中X2是具有對應(yīng)于野生型Rhizavidin第45-179位氨基酸的氨基酸序列的肽，而X1和X3獨立地空缺(absent)或為具有I至約100個氨基酸的肽，但X1的N端必須不包含對應(yīng)于野生型Rhizavidin N端第1_44位的氨基酸的氨基酸序列。
[0047]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合蛋白可包含綴合至生物素結(jié)合蛋白N端的信號肽，即Xl可包含信號肽。信號肽也稱為N端前導(dǎo)肽，其可在跨膜轉(zhuǎn)位后被切除或不被切除。分泌/信號肽在下文詳述。在一些實施方式中，信號序列是MKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQID No:2)；
[0048]MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA(SEQ ID NO:7)；
[0049]MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID No: 3)，或其衍生物或功能片段。
[0050]可將信號肽直接(如通過鍵合)或間接(如通過接頭)地連接至生物素結(jié)合域的N端。在一些實施方式中，可通過肽接頭將信號肽連接至生物素結(jié)合域的N端。肽接頭序列可為任何長度。例如，肽接頭序列的長度可以是I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個以上氨基酸。在一些實施方式中，肽接頭的長度為4個氨基酸。
[0051]肽接頭序列可包含任何氨基酸序列。例如，肽接頭可包含能夠被信號肽酶切割的氨基酸序列。在一些實施方式中，肽接頭包含氨基酸序列
[0052]AQDP(SEQ ID NO:8)或 VSDP (SEQ ID NO:9)。
[0053]在生物素結(jié)合蛋白中，生物素結(jié)合域可在其C端綴合1-100個氨基酸的肽。可將此類位于C端的肽用作純化標(biāo)簽(tag)、與其它域的接頭等。
[0054]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合蛋白在其N端或C端包含一個或多個(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個以上)純化標(biāo)簽。純化標(biāo)簽的示例包括但不限于:組氨酸標(biāo)簽、c-my標(biāo)簽、Halo標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽等。在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合蛋白在其C端包含組氨酸標(biāo)簽，例如，(His)6 (SEQ ID N0.10)。
[0055]為增加標(biāo)簽暴露在外側(cè)的概率，可通過肽接頭將純化標(biāo)簽綴合至生物素結(jié)合蛋白。所述接頭的長度可為至少一個(例如I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個)氨基酸。接頭肽可不受限制地包含任意氨基酸序列。在一些實施方式中，所述接頭肽包含氨基酸序列VDKLAAALE(SEQ ID N0:11)或GGGGSSSVDKLAAALE(SEQ ID NO:12)。
[0056]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合蛋白在其C端包含氨基酸序列VDKLAAALEHHHHH(SEQ ID NO:13)或 GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:14)。
[0057]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合蛋白包含氨基酸序列:
[0058]MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEYVTSWNTAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH(SEQ ID NO:15).[0059]與已知的形成四聚體的生物素結(jié)合蛋白相比，本文所述的生物素結(jié)合蛋白形成二聚體。不希望被理論所限，形成二聚體可進一步提高本文所述的生物素結(jié)合蛋白在大腸桿菌中作為可溶蛋白的表達。
[0060]雖然生物素結(jié)合蛋白為本領(lǐng)域所知，然而本文所述的生物素結(jié)合蛋白與本領(lǐng)域目前已知的親和素(avidin)和親和素樣蛋白相比具有顯著差別。首先，目前已知的親和素在大腸桿菌中極難作為可溶蛋白表達。然而，如發(fā)明人所證明的，本文所述的生物素結(jié)合蛋白可在大腸桿菌中作為可溶蛋白高產(chǎn)量地表達。
[0061]可通過在大腸桿菌中`表達，以可溶形式高產(chǎn)量地(例如超過30mg每升培養(yǎng)液)獲得本文所述的生物素結(jié)合蛋白。由此，本文所述的生物素結(jié)合蛋白比本領(lǐng)域所描述的生物素結(jié)合蛋白具有更強的溶解性，表現(xiàn)出顯著差別。不希望被理論所限，溶解性的差別可歸結(jié)于本文所述的生物素結(jié)合蛋白和本領(lǐng)域已知的其它生物素結(jié)合蛋白之間顯著的物理差別和/或化學(xué)差別和/或結(jié)構(gòu)差別。
[0062]第二，本文所述的生物素結(jié)合蛋白含有由野生型Rhizavidin第45-179位氨基酸組成的生物素結(jié)合域。盡管野生型Rhizavidin及其局部截短的部分是本領(lǐng)域已知的，然而對于包含野生型Rhizavidin第45-179位氨基酸的氨基酸序列、且具有大腸桿菌信號序列的生物素結(jié)合蛋白能夠得到可在大腸桿菌中以高產(chǎn)量獲得的可溶蛋白，本領(lǐng)域并無教導(dǎo)或暗不。根據(jù) Helppolainen 等(Biochem J.，2007,405:397-405),野生型 Rhizavidin 第25-44位的氨基酸包含推定(putative)信號序列。然而,如本文所討論的,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并證明，將所述推定信號序列替換為大腸桿菌信號序列導(dǎo)致在大腸桿菌中的可溶形式生物素結(jié)合蛋白表達提聞。
[0063]第三，本文所述的生物素結(jié)合蛋白含有氨基酸序列為
[0064]GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO: 14)的肽。在 C 端的這一肽提供了用于純化的組氨酸標(biāo)簽以及用于在生物素蛋白中插入其它域(如抗原域)的位置。此外，雖然Helppolainen 等(Biochem J., 2007,405:397-405)描述了 Rhizavidin 在大腸桿菌中的表達，然而Helppolainen等中并未對在Rhizavidin的生物素結(jié)合域的C端綴合一段額外的肽給出教導(dǎo)或暗示。
[0065]第四，與其它親和素樣蛋白相比，Rhizavidin與卵親和素具有較低的序列同源性(22.4%的序列一致性和35.0%的序列相似度)。因此，本文所述的生物素結(jié)合蛋白不同于親和素和其它親和素樣蛋白。
[0066]第五，與親和素和其它親和素樣分子相比，本文所述的生物素結(jié)合蛋白具有低等電點(pi)。野生型 Rhizavidin 的等電點為 4.0(Helppolainen 等，Biochem J., 2007,405:397-405)。其它已知的生物素結(jié)合蛋白的等電點通常大于6.1(見Helppolainen等,BiochemJ.，2007，405:397-405)。相比之下，本文所述的生物素結(jié)合蛋白的pi為5.4。本文所述的結(jié)合蛋白酸性的Pl能夠減少非特異性結(jié)合。使用目前已知的親和素和親和素樣肽的問題是其非特異性結(jié)合。目前已知的親和素和親和素樣肽不僅與細(xì)胞結(jié)合，而且與DNA、蛋白和生物材料(如膜)均能非特異性結(jié)合。例如，在使用親和素-生物素結(jié)合對物質(zhì)進行檢測時，親和素非特異性結(jié)合至除待檢測的目標(biāo)材料以外的材料，從而導(dǎo)致背景升高。親和素的高非特異性結(jié)合的原因之一包括了其高等電點。親和素為強堿性蛋白，具有10以上的超高等電點，且總體而言為正電性。因此，可以認(rèn)定親和素易結(jié)合至許多情況下為負(fù)電性的生物材料。因此，本文所述的生物素結(jié)合蛋白的低Pl優(yōu)于目前已知的親和素和親和素樣肽。
[0067]第六，本文所述的生物素結(jié)合蛋白的大小相對小于目前已知的親和素和親和素樣蛋白。所述生物素結(jié)合蛋白小于28kDa (二聚體大小)。然而，目前已知的親和素和親和素樣蛋白大部分具有大于60kDa的大小(四聚體大小)。據(jù)記載野生型Rhizavidin的大小約為29kDa (二聚體大小)。較小的生物素結(jié)合蛋白可用于提高與感興趣的分子的結(jié)合性綴合的負(fù)載量。例如，可用生物素結(jié)合蛋白將感興趣的第一分子綴合至感興趣的第二分子。其中一個感興趣的分子可連接至一個或多個生物素或生物素樣分子，而第二分子可連接、綴合或融合至生物素結(jié)合蛋白。相對于若第二分子是較大的目前已知的親和素或親和素樣分子的情況，由于本文所述的生物素蛋白的大小較小，生物素或生物素樣分子間隔較近，因此允許結(jié)合更多。
[0068]第七，本文所述的生物素結(jié)合蛋白是二聚體。形成二聚體可進一步增加本文所述的生物素結(jié)合蛋白在大腸桿菌中作為可溶蛋白的表達。此外，由于生物素結(jié)合蛋白形成二聚體，而非如所有其它已知的親和素樣蛋白形成四聚體，I)降低了融合抗原的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性；2)還降低了表達重組生物素結(jié)合蛋白融合蛋白的難度；3)使得生物素結(jié)合蛋白融合操作的空間位阻降至最小，這有利于與例如但不限于生物素、生物素模擬物或生物素衍生物進行進一步操作；以及4)生物素結(jié)合蛋白融合物的溶解性顯著增加。因此，證明了本文所述的生物素結(jié)合蛋白與本領(lǐng)域已知的生物素結(jié)合蛋白之間的顯著區(qū)別。
[0069]第八，本文所述的生物素結(jié)合蛋白降低了包含該生物素結(jié)合蛋白的免疫原性組合物在受試者中誘發(fā)卵相關(guān)過敏反應(yīng)的風(fēng)險。此外，針對本文所述的生物素結(jié)合域的抗體與卵親和素不具有明顯的交叉反應(yīng)性，反之亦然。
[0070]此外，本文所述的生物素結(jié)合蛋白具有改善的性質(zhì)，例如減少了非特異性結(jié)合或進一步改善了與生物素的結(jié)合，同時保留了野生型Rhizavidin的性質(zhì)。將本文所述的生物素結(jié)合蛋白用于例如免疫分析或核酸雜交分析中的檢測、用于利用親和素-生物素結(jié)合的分析物測定中，可減少背景、增加靈敏度、并在極端(severe )條件下保持與生物素的結(jié)合性質(zhì)。[0071]本研究清楚地表明了本文所述的生物素結(jié)合蛋白相比于親和素和其它親和素樣蛋白的優(yōu)勢和區(qū)別。因此，在利用親和素-生物素技術(shù)的廣泛應(yīng)用中，本文所述的生物素結(jié)合蛋白具有作為強大且通用的工具的潛力。
[0072]不受限制地，可將生物素結(jié)合蛋白用于任何需要使用親和素-生物素系統(tǒng)的方法學(xué)、組合物或系統(tǒng)。作為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，親和素-生物素系統(tǒng)可用于多種實驗室方法，例如:生物綴合；目標(biāo)分子檢測；或從樣品中對目標(biāo)分子進行分離、純化或富集；蛋白檢測；核酸檢測；蛋白分離、純化或富集；核酸分離、純化或富集；ELISA ;流式細(xì)胞術(shù)等。
[0073]因此，本文所述的重組生物素結(jié)合蛋白的示例性用途包括但不限于:生物綴合；目標(biāo)分子檢測；從樣品中對目標(biāo)分子進行分離、純化或富集；蛋白檢測；核酸檢測；蛋白分離、純化或富集；核酸分離、純化或富集；ELISA ;流式細(xì)胞術(shù)等。
[0074]在一些實施方式中，在如美國臨時申請?zhí)?1/48,934 (申請日為2012年5月11日)、61/608，168 (申請日為2012年3月8日)、61/609，974 (申請日為2012年3月13日)和PCT申請?zhí)朠CT/US12/37412 (申請日為2012年5月11日)中所述的多抗原提呈系統(tǒng)(MAPS)中，可將本文所述的生物素結(jié)合蛋白用作親合對的一部分，以引用的方式上述全部文獻的內(nèi)容并入本文。本文也將在下文中對MAPS進行詳述。不希望被理論所限，使用本文所述的生物素結(jié)合蛋白減少了 MAPS在受試者中引起卵相關(guān)過敏反應(yīng)的風(fēng)險。此外，針對重組修飾Rhizavidin的抗體對卵親和素不具有明顯的交叉反應(yīng)性,反之亦然。
[0075]脂化生物素結(jié)合蛋白
[0076]本文另一方面提供了脂化生物素結(jié)合蛋白。本文所使用的術(shù)語“脂化生物素結(jié)合蛋白”是指與脂質(zhì)共價綴合的生物素結(jié)合蛋白。所述脂質(zhì)部分可以是二?；|(zhì)或三酰基脂質(zhì)。
[0077]可使用脂化序列制備所述脂化生物素結(jié)合蛋白。本文所用的術(shù)語“脂化序列”是指在細(xì)菌(如大腸桿菌)中促進攜帶該脂化序列的多肽發(fā)生脂化的氨基酸序列。脂化序列可存在于蛋白的N端或C端處?？蓪⒅蛄羞B接至重組生物素結(jié)合蛋白以形成融合蛋白，該融合蛋白在通過常規(guī)重組技術(shù)在大腸桿菌中表達時處于脂化形式。在一些實施方式中，脂化序列位于生物素結(jié)合蛋白的N端。
[0078]可使用任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的脂化序列。在一些實施方式中，脂化序列是MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID No: 3)或其衍生物或功能部分。其它示例性脂化序列包括但不限于
[0079]MNSKKLCCICVLFSLLAGCAS(SEQ ID NO:16)，MRYSKLTMLIPCALLLSAC(SEQ ID NO:17)，MFVTSKKMTAAVLAITLAMSLSAC(SEQ ID NO: 18) ,MIKRVLVVSMVGLSLVGC(SEQ ID NO: 19)，及它們的衍生物或功能部分。
[0080]在一些實施方式中，可通過肽接頭將脂化序列融合至生物素結(jié)合蛋白，其中所述肽接頭將所述脂化序列連接至所述生物素結(jié)合蛋白。
[0081]在一些實施方式中，所述肽接頭包含氨基酸序列L’ SVIi (SLQID' \§0:9)ο
[0082]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合脂蛋白包含氨基酸序列
[0083]MKKVAAFVALSLLMAGCVSDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD(SEQ ID NO:20).[0084]所述脂化生物素結(jié)合蛋白為Toll樣受體(TLR)的配體。就這一點而言，可將本文所述的脂化生物素結(jié)合蛋白用作TLR配體。例如，可將所述脂化生物素結(jié)合蛋白用于組合物中，以誘導(dǎo)TLR2刺激。這可用于誘導(dǎo)針對其它抗原/病原體的免疫原性。因此，可將所述生物素結(jié)合脂蛋白作為抗原的共刺激因子或佐劑用于免疫原性組合物中。
[0085]本文所用的術(shù)語“Toll樣受體”通常是指任何生物物種的任何Toll樣受體。TLR可來自于任何哺乳動物物種。TLR已在多種哺乳動物物種(包括但不限于:例如人、豚鼠和小鼠)中得以確認(rèn)。特定的TLR可進一步通過引述原始來源的物種(例如人、鼠等)、具體的受體(例如TLR2、TLR3、TLR9等)或兩者兼有來確定。在一些實施方式中，所述脂化生物素結(jié)合蛋白為TLR2配體。
[0086]Toll樣受體(TLR)是促進固有免疫系統(tǒng)活化和病原體識別的生殖細(xì)胞系編碼的跨膜蛋白家族。Toll樣受體(TLR)為模式識別受體(PRR)，由固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞表達，所述細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和NK細(xì)胞。已知的TLR配體的實例包括革蘭氏陽性細(xì)菌(TLR-2)、細(xì)菌內(nèi)毒素(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)、細(xì)菌DNA (TLR-9)、雙鏈RNA和聚肌胞苷酸(poly 1:C) (TLR-3)和酵母(TLR-2)。其它結(jié)合內(nèi)吞(endocytic)模式識別受體、清道夫受體或甘露糖結(jié)合受體的配體也可由本發(fā)明得以預(yù)期。TLR作用于保守病原體衍生的配體，隨后激活TLR/IL-1R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)多種效應(yīng)基因。Toll樣受體(TLR)代表了PRR的重要類群，這一類群能夠感知病原體相關(guān)分子模式或微生物相關(guān)分子模式。它們由多種類型的細(xì)胞(特別是樹突細(xì)胞(DC)，還有巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)在血液、脾、肺、肌肉和腸道中得以廣泛表達。
[0087]某些定位于細(xì)胞表面的TLR特異性針對微生物的脂質(zhì)和蛋白，另一些與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體區(qū)室(endosomal compartments)相關(guān)的TLR則特異性針對核酸。通過TLR的特定配體將TLR連接引起受體構(gòu)象變化、并引起下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要涉及MyD88依賴性和TRIF依賴性通路。除了 TLR3以外，其它TLR均能夠通過MyD88通路傳導(dǎo)信號，以誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子(參與激活包含I`B激酶(IKK)-NF-B在內(nèi)的胞內(nèi)蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng))、以及胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。獨立于MyD88的TRIF通路被TLR3和TLR4兩者使用，并介導(dǎo)I型干擾素的誘導(dǎo)。
[0088]本文所述的重組生物素結(jié)合脂蛋白具有增強的免疫原性。不希望被理論所限，位于脂蛋白或脂肽N端的脂質(zhì)部分提供了佐劑活性。因此，另外的實施方式提供了用于引起免疫應(yīng)答的免疫原性組合物或疫苗組合物，所述組合物包含分離的生物素結(jié)合脂蛋白，或用于所述生物素結(jié)合脂蛋白體內(nèi)表達的適合載體(vector)，或二者兼有；以及合適的載體(carrier);以及提供了引發(fā)免疫應(yīng)答或保護性應(yīng)答的方法，所述方法包括以足以引發(fā)所述應(yīng)答的量向宿主給予所述分離的重組生物素結(jié)合脂蛋白、表達所述重組生物素結(jié)合脂蛋白的載體、或含有所述重組脂蛋白或載體的組合物。
[0089]包含所述生物素結(jié)合脂蛋白的免疫組合物或免疫原性組合物引發(fā)局部或系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。該應(yīng)答可以為保護性的，但并非必需。需要指出的是，本文所用的術(shù)語“免疫組合物”和“免疫原性組合物”包括“疫苗組合物”(前二者可為保護性組合物)。不受限制地，本文所述的脂化生物素結(jié)合蛋白可作為抗原、佐劑或共刺激劑用于免疫組合物、免疫原性組合物或疫苗組合物中。此外，由于所述脂化生物素結(jié)合蛋白包含生物素結(jié)合域，因此可將該脂化蛋白組裝至MAPS的聚合物骨架。因此，本文還提供了在哺乳動物宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括向宿主給予包含本文所述的脂化生物素結(jié)合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的免疫原性組合物、免疫組合物或疫苗組合物。
[0090]在一些實施方式中，所述脂化生物素結(jié)合蛋白是包含脂化生物素結(jié)合蛋白以及蛋白或肽的融合蛋白。
[0091]非溶血性Hla
[0092]溶血素是細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素(exotoxins)，引起紅細(xì)胞裂解。盡管溶血素具有強免疫原性，然而由于會引起紅細(xì)胞裂解，因而其在疫苗中的用途有限。因此，本文另一方面提供了金黃色葡萄球菌α-溶血素(Hla)的變體，其與生物素結(jié)合蛋白的融合構(gòu)建體及其應(yīng)用。這些變體在本文中稱為“mHla”，基本上為非溶血性，即基本上具有低溶血活性。本文所用的短語“基本上為非溶血性”意味著在與野生型Hla等同的效價(titer)下不能裂解紅細(xì)胞。術(shù)語“野生型Hla”與這類短語慣用的定義一致，即由具有能力的細(xì)菌來源天然分泌而來的Hla。定義的“野生型Hla”不包括例如，通過重組DNA技術(shù)衍生而得的Hla融合產(chǎn)物。在一些實施方式中，mHla的溶血活性比等同效價的野生型Hla低了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少20%、至少30%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%。在一些實施方式中，檢測不到mHla的溶血活性。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，可通過將mHla與生物素結(jié)合蛋白連接，從而進一步降低mHla的溶血活性。因此,本公開還描述了包含mHla蛋白和生物素結(jié)合蛋白的融合蛋白。
[0093]如本文所提供的，可生成非溶血性Hla，其中，野生型Hla中的W205或W213殘基被丙氨酸(A)替代、或DRD209-211三肽被三個丙氨酸的肽(AAA)替代。突變型Hla蛋白可由大腸桿菌表達系統(tǒng)表達和純化?？墒褂肣uick Change誘變進行點突變得到突變體。例如，可改變編碼野生型Hla的核酸的`核苷酸序列，將野生型Hla中給定的氨基酸替換為另一氨基酸。
[0094]在一些實施方式中，mHla為包含mHla和生物素結(jié)合蛋白的融合蛋白。在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合mHla融合蛋白含有氨基酸序列MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNTAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTEBKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGGTDIGSNTTVKTCDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSTEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTCDDTGKIGGLIGANVSIGHTLXYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN(SEQ ID NO:21).[0095]本文所述的Hla變體為Toll樣受體(TLR)的配體。就這一點而言，本文所述的Hla變體可用作TLR配體。例如，可將Hla變體用于組合物中誘導(dǎo)TLR2刺激。這對于誘導(dǎo)針對其它抗原/病原體的免疫原性是有用的。因此，可將本文所述的Hla變體作為抗原的共刺激因子或佐劑用于免疫原性組合物中。此外，當(dāng)mHla與生物素結(jié)合蛋白融合時，可將所述融合蛋白綴合至MAPS的聚合物骨架。
[0096]在一些實施方式中，可將mHla作為共刺激因子用于免疫原性組合物或疫苗組合物中。[0097]此外，由于mHla在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因此可將mHla用于免疫原性組合物或疫苗組合物中，以對受試者進行針對金黃色葡萄球菌的接種。
[0098]本文所述的mHla具有增強的免疫原性。因此，附加實施方式提供了用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫原性組合物或疫苗組合物，所述組合物包含mHla,或用于所述mHla體內(nèi)表達的適合載體(vector)，或二者兼有；以及合適的載體(carrier);以及提供了引發(fā)免疫應(yīng)答或保護性應(yīng)答的方法，所述方法包括以足以引發(fā)所述應(yīng)答的量向宿主給予分離的mHla、表達mHla的載體、或含有mHla或載體的組合物。
[0099]包含mH la的免疫組合物或免疫原性組合物能夠引發(fā)局部或系統(tǒng)性免疫應(yīng)答。所述應(yīng)答可以為保護性的,但并非必需。因此,本文所述的非溶血性Hla突變體可以作為免疫組合物、免疫原性組合物或疫苗組合物中的抗原、佐劑或共刺激物。
[0100]此外，本文還提供了在哺乳動物宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。所述方法包括向宿主給予包含本文所述的非溶血性Hla突變體及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的免疫原性組合物、免疫組合物或疫苗組合物。
[0101]另一方面，本文還提供了包含本文所述的生物素結(jié)合蛋白(連接至抗原蛋白或抗原肽)的融合蛋白。本文中這些融合蛋白也稱為生物素結(jié)合融合蛋白或抗原融合蛋白。所述生物素結(jié)合蛋白與所述抗原蛋白或抗原肽可以任何構(gòu)象相連，例如，生物素結(jié)合蛋白可在融合蛋白的N端、而抗原肽在融合蛋白的C端，或與此相反。
[0102]在一些實施方式中，所述生物素結(jié)合蛋白與所述抗原蛋白或抗原肽通過肽接頭彼此相連。非限定地，所述肽接頭可含有任何氨基酸序列并可為任何長度。例如，所述肽接頭序列的長度可以是I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個以上氨基酸。在一些實施方式中，將抗原域與生物素結(jié)合域相連的肽接頭的長度是8個氨基酸。
[0103]在一些實施方式中，將抗原域連接至生物素結(jié)合域的肽接頭具有氨基酸序列GGGGSSS(SEQ ID NO:22)。
[0104]在一些實施方式中，所述抗原蛋白為本文所述的非溶血性Hla。
[0105]在一些實施方式中，所述非溶血性Hla蛋白為包含本文所述的生物素結(jié)合蛋白和非溶血性Hla的融合蛋白。
[0106]在一些實施方式中，所述非溶血性Hla蛋白為包含本文所述的脂化生物素結(jié)合蛋白和非溶血性Hla的融合蛋白。
[0107]免疫原性組合物
[0108]本文另一方面提供了含有本文所述的抗原融合蛋白、脂化生物素結(jié)合蛋白或非溶血性Hla變體的免疫原性組合物。此外,本文還提供了包含免疫原性復(fù)合物的免疫原性組合物和疫苗組合物，該免疫原性復(fù)合物包含連接至聚合物支架的至少一種抗原融合蛋白或多種抗原融合蛋白；該組合物用于在給予受試者時引發(fā)針對連接至所述聚合物的每一種抗原的免疫應(yīng)答，以及任選地對所述聚合物本身的免疫應(yīng)答。不希望被理論所限，本文所述的免疫原性組合物刺激體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答:它可使用單個MAPS免疫原性構(gòu)建體產(chǎn)生針對多種蛋白抗原的抗體和Thl/Thl7應(yīng)答。賦予生物體的聯(lián)合的B細(xì)胞免疫力和T細(xì)胞免疫力代表了針對多種疾病(包含肺炎球菌疾病相關(guān)的侵襲性感染和鼻咽攜帶(carriage))的最佳疫苗策略。在一些實施方式中，所述免疫原性組合物為疫苗或包含在疫苗中。
[0109]因此，本文的實施方式提供了對引發(fā)受試者中的免疫應(yīng)答有用的免疫原性組合物和方法，所述免疫原性組合物和方法可使用其自身或與基本上任意已存在的疫苗方法結(jié)合或混合使用。
[0110]在一些實施方式中，本文公開的免疫原性組合物包含至少2種抗原、或至少3種抗原、或至少5種抗原、或2-10種之間的抗原、或10-15種之間的抗原、或15-20種之間的抗原、或20-50種之間的抗原、或50-100種之間的抗原或超過100種抗原，包括端值。在一些實施方式中，當(dāng)本文所公開的免疫原性組合物包含至少2種抗原時，所述抗原可為相同的抗原或至少2種不同的抗原。在一些實施方式中，所述抗原可以來自相同病原體或不同病原體，或者可為相同抗原蛋白的不同表位或不同部分，或者可為對相同病原體的不同血清型或季節(jié)性變型(如流感病毒A、B和C)具有特異性的相同抗原。
[0111]在一些實施方式中，本文公開的免疫原性組合物包含來自病原性生物體或異常組織的抗原。在一些實施方式中，所述抗原為腫瘤抗原。在一些實施方式中，抗原可為選自于寄生蟲或病原體抗原的至少一種抗原，例如如下抗原:肺炎鏈球菌抗原、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原或破傷風(fēng)分枝桿菌(M.tetanus)抗原、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)抗原、HIV抗原、季節(jié)性或流行性流感抗原(如HlNl或H5N1)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)抗原或淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)抗原、HPV抗原、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)抗原、HSV抗原或其它皰疫病毒抗原、或痕原蟲(Plasmodia) sp抗原。這些抗原可包括肽、蛋白、糖蛋白或多糖。在一些實施方式中，所述抗原為類毒素或毒素的一部分。
[0112]在一些實施 方式中，本文公開的免疫原性組合物包含抗原多糖，例如，如Vi抗原(傷寒沙門氏菌莢膜多糖)、肺炎球菌莢膜多糖、肺炎球菌細(xì)胞壁多糖、Hib (B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type B))莢膜多糖、腦膜炎球菌(meningococcal)莢膜多糖、炭疽桿菌的多糖(炭疽的病原體(causative agent))、以及其它細(xì)菌莢膜多糖或細(xì)胞壁多糖，或上述多糖的任意組合。所述多糖可具有蛋白組分，例如，如來源于病毒的糖蛋白。
[0113]在一些實施方式中，本文公開的免疫原性組合物進一步包含至少一種與所述聚合物或多糖締合(associated with)的共刺激因子,其中，所述共刺激因子可直接或間接締合。例如，在一些實施方式中，共刺激因子可共價連接至所述聚合物。例如，在一些實施方式中，共刺激因子可共價連接至所述第一親和分子，然后將其交聯(lián)至所述聚合物。例如，在一些實施方式中，共刺激因子可連接至互補親和分子，所述互補親和分子與第一親和分子締合，從而將所述共刺激因子連接至所述聚合物。在一些實施方式中，共刺激因子為佐劑(adjuvant)。在替代的實施方式中，共刺激因子可為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何共刺激因子，并包括任意組合，例如但不限于，Toll樣受體激動劑(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9等的激動劑)、NOD激動劑或炎性小體(inflammasome)激動劑。
[0114]在一些實施方式中，所述共刺激因子可以是本文所述的脂化生物素結(jié)合蛋白、或α -溶血素的非溶血性變體、或mHla與生物素結(jié)合蛋白形成的融合蛋白。
[0115]本發(fā)明的另一方面涉及將本文所公開的免疫原性組合物給予受試者以在所述受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的用途。在一些實施方式中，所述免疫應(yīng)答為抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答、⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答(包括Thl、Th2和Thl7細(xì)胞)和/或⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實施方式中，將至少一種佐劑與所述免疫原性組合物聯(lián)合給藥。
[0116]本發(fā)明的另一方面涉及用于在受試者中誘導(dǎo)針對至少一種抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者給予本文所公開的免疫原性組合物。
[0117]本發(fā)明的另一方面涉及針對至少一種抗原對動物(例如鳥類、哺乳動物或人)進行接種的方法，所述方法包括給予含有本文所公開的免疫原性組合物的疫苗組合物。
[0118]在本文公開的所有方面中，動物或受試者可為人。在一些實施方式中，所述受試者可為農(nóng)業(yè)動物或非馴養(yǎng)動物(non-domestic animal)、或馴養(yǎng)動物。在一些實施方式中,含有本文所公開的免疫原性組合物的疫苗組合物可經(jīng)由以下方式給藥:皮下、鼻內(nèi)、口腔、舌下、陰道、直腸、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)或肌內(nèi)注射。
[0119]在本文公開的所有方面中，免疫應(yīng)答是針對蛋白/肽抗原的抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答、⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答(包括Thl、Th2和Thl7應(yīng)答)或⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實施方式中，免疫應(yīng)答是針對所述聚合物(例如，肺炎球菌多糖)的抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答。在一些實施方式中，將至少一種佐劑與所述免疫原性組合物聯(lián)合給藥。
[0120]本發(fā)明的另一方面涉及本文所公開的免疫原性組合物在對暴露于病原體或免疫原性劑進行診斷中的用途。
[0121]多抗原提呈系統(tǒng)
[0122]本文還提 供了免疫原性多抗原提呈系統(tǒng)(MAPS)，該免疫原性多抗原提呈系統(tǒng)對免疫原性組合物(例如，在疫苗中有用的組合物)的生產(chǎn)有用。特別地，本發(fā)明涉及含有免疫原性復(fù)合物(immunogenic complex)的組合物,所述免疫原性復(fù)合物含有至少一種類型的聚合物(例如多糖)，所述聚合物可任選為抗原性的；至少一種抗原蛋白或抗原肽；以及至少一種互補親和分子對，所述互補親和分子對含有(i)與所述聚合物締合(associate with)的第一親和分子，以及(ii)與所述蛋白或肽締合的互補親和分子，以使得所述第一親和分子和互補親和分子作為所述聚合物與所述抗原蛋白或抗原肽之間的間接連接。因此，所述聚合物可連接至少I種、或至少2種、或多種相同或不同的蛋白抗原或肽抗原。在一些實施方式中，所述聚合物為抗原性的，例如，所述聚合物為肺炎球菌莢膜多糖。在一些實施方式中，所述蛋白抗原或肽抗原為重組蛋白抗原或肽抗原。
[0123]本文所公開的免疫原性組合物可同時引發(fā)針對一種或多種抗原的體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答這兩種應(yīng)答。所述免疫原性組合物提供了長期記憶應(yīng)答，潛在地保護受試者免于以后的感染。這允許單個免疫原性組合物產(chǎn)生高效價(titer)的功能性抗多糖抗體，并使其誘發(fā)的抗體水平類似于或高于由傳統(tǒng)綴合疫苗誘發(fā)的抗體水平。此外，對具體的載體蛋白沒有限制，并且多種抗原蛋白可用于MAPS構(gòu)建體中來生成穩(wěn)健的抗多糖抗體應(yīng)答。
[0124]此外，強烈的抗體應(yīng)答和Th 17/Th I應(yīng)答對經(jīng)由所述MAPS組合物提呈的多種蛋白抗原具有特異性。這呈現(xiàn)出作為用一種構(gòu)建體引發(fā)兩種形式的免疫的手段的主要優(yōu)點。除了針對綴合至蛋白載體的抗原多糖的更傳統(tǒng)的免疫應(yīng)答之外，本發(fā)明提供了針對全身性注射的蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答以及，更具體地說，為Thl7和Thl應(yīng)答。此外，本免疫原性組合物可將配體并入到所述聚合物骨架上。這提供了如下潛能:通過改變蛋白/聚合物比例、復(fù)合物大小，或通過將特定共刺激因子(如TLR2/4配體等)并入所述組合物中，來增強特異性B細(xì)胞應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答。[0125]與典型的綴合技術(shù)(涉及對蛋白的嚴(yán)苛處理)相比，本方法避免了肽抗原的其它修飾的變性風(fēng)險。這提供了如下很大的優(yōu)勢:保持所包含的蛋白的抗原性，并增加蛋白本身將作為抗原(而不只是載體)的可能性。同樣地，本方法避免了對多糖骨架不必要的修飾/損壞，因為沒有重度化學(xué)交聯(lián):可精確地控制生物素化以使其與多糖的特定官能團進行反應(yīng)，并且可容易地對生物素化水平進行調(diào)節(jié)。這有利于避免綴合的典型過程，所述綴合的典型過程導(dǎo)致關(guān)鍵側(cè)鏈或表位的損壞，這可能會導(dǎo)致降低的免疫原性和保護。
[0126]本發(fā)明的基于親和的組裝(assembly)提供了簡單且高度靈活的免疫原性組合物的制備。它高度特異和穩(wěn)定；它可以在寒冷中保存數(shù)月并保持其效力。組裝過程足夠簡單以確保了高重現(xiàn)性；僅需要幾個步驟，這降低了批次間存在偏差的風(fēng)險，并具有巨大的工業(yè)優(yōu)勢。即使在低濃度的蛋白和多糖(如0.lmg/ml)中，MAPS組裝也是高效的(超過95%);這是主要優(yōu)點，因為綴合制造的低效率(效率通常在< 50%的范圍內(nèi))是主要障礙和疫苗高成本的原因。就制劑(formulation)而言:其易于調(diào)整終產(chǎn)物的組成和物理性質(zhì)。在復(fù)合物中蛋白:聚合物的比例是可調(diào)節(jié)的；就聚合物適度的生物素化而言，蛋白:聚合物可為10:1(w/w)以上；相反，如果這就是基于免疫目標(biāo)的興趣，所述比例可為1:10以下。此外，免疫原性MAPS組合物的大小可通過對聚合物大小的選擇來進行調(diào)節(jié)。制備MAPS的方法在將聚合物與蛋白聯(lián)合而幾乎無需修飾這方面提供了方便。通過在單一的免疫原性構(gòu)建體中裝載來自相同或不同病原體(例如，肺炎球菌和肺結(jié)核)的多種蛋白抗原而得到的終產(chǎn)物的可能的多價性提供了如下組合物:所述組合物可用于減少針對超過一種疾病對受試者進行免疫時所需的疫苗的數(shù)量。此外，MAPS組合物高度穩(wěn)定；只有在煮沸時才會解離(dissociated)，并且在4°C甚至許多個月后仍保持免疫原性。MAPS復(fù)合物的免疫原性可能會受到抗原蛋白或抗原肽組分的穩(wěn)定性的限制，所述抗原蛋白或抗原肽的穩(wěn)定性可通過包含于MAPS復(fù)合物中而被延長。本文所用的特定抗原在室溫下以及在至少一個冷凍-解凍循環(huán)后具有穩(wěn)定性。這提供了相比于當(dāng)前疫苗的重要優(yōu)點，如果沒有仔細(xì)維持“冷鏈”的話，當(dāng)前疫苗會受到損害。
[0127]因此，本發(fā)明一方面涉及免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含聚合物、至少一種蛋白抗原或肽抗原、以及至`少一種互補親和分子對，其中，所述互補親和分子對包含與所述聚合物締合的第一親和分子以及與所述蛋白抗原或肽抗原締合的互補親和分子，以使得當(dāng)所述第一親和分子與所述互補親和分子締合時，間接地將所述抗原連接至所述聚合物。
[0128]在一些實施方式中，用交聯(lián)劑將所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物，例如，交聯(lián)劑選自于=CDAP (1-氰基-4- 二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽)、EDC (1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)、氰基硼氫化鈉；溴化氰；或碳酸氫銨/碘乙酸。在一些實施方式中，所述第一親和分子交聯(lián)至所述聚合物的羧基、羥基、氨基、苯氧基、半縮醛以及巰基官能團。在一些實施方式中，所述第一親和分子共價鍵合至所述聚合物。
[0129]在一些實施方式中，所述第一親和分子為生物素或其衍生物、或具有與生物素類似的結(jié)構(gòu)或物理性質(zhì)的分子，例如，胺-PEG3-生物素((+)-生物素酰_3，6，9-三氧代十一燒二胺(trixaundecanediamine))或其衍生物。
[0130]在一些實施方式中，所述免疫原性組合物的蛋白抗原或肽抗原為融合蛋白，所述融合蛋白含有融合至互補親和結(jié)合分子的抗原蛋白或抗原肽。所述融合可為遺傳構(gòu)建體，即重組融合肽或重組融合蛋白。在一些實施方式中，抗原可作為融合蛋白共價連接至所述互補親和分子。在替代的實施方式中，所述抗原非共價連接至所述互補親和分子。
[0131]在一些實施方式中，所述互補親和分子為生物素結(jié)合蛋白或其衍生物或功能部分。在一些實施方式中，互補親和分子為親和素樣蛋白或其衍生物或功能部分，例如但不限于，rhizavidin或其衍生物。在一些實施方式中，互補親和分子為親和素或鏈霉親和素或它們的衍生物或功能部分。
[0132]在一些實施方式中，分泌信號肽位于所述親和素樣蛋白的N端。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何信號序列均可使用；在一些實施方式中，所述信號序列為MKKIffLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO:2)或其衍生物或功能部分。在一些實施方式中，所述抗原可經(jīng)由柔性接頭肽融合至互補親和分子，其中，所述柔性接頭肽將所述抗原連接至所述互補親和分子。
[0133]在一些實施方式中，免疫原的聚合物組分包含來自活生物體(living organism)的聚合物，例如多糖。在一些實施方式中，聚合物可從天然來源中純化和分離得到，或者可將所述聚合物合成為具有天然組成/結(jié)構(gòu)，或者所述聚合物可為合成(例如，具有人造組成/結(jié)構(gòu))聚合物。在一些實施方式中，聚合物來源于選自于由以下生物體所組成的組中的生物體:細(xì)菌、古生菌、或真核細(xì)胞例如真菌、昆蟲、植物，或上述生物體的嵌合體。在一些實施方式中，所述聚合物為來源于病原性細(xì)菌的多糖。在【具體實施方式】中，所述多糖為肺炎球菌莢膜多糖、肺炎球菌細(xì)胞壁多糖或傷寒沙門氏菌Vi多糖。
[0134]在一些實施方式中，本文所公開的免疫原性組合物的聚合物為支鏈聚合物，例如分支多糖；或者，可為直鏈聚合物，例如單鏈聚合物，例如多糖。在一些實施方式中，所述聚合物為多糖，例如，葡聚糖或其衍生物。在一些實施方式中，聚合物(例如葡聚糖多糖)的平均分子量可為425kD-500kDa (包括端值)；或者，在一些實施方式中，為大于500kDa。在一些實施方式中，聚合物 (例如葡聚糖多糖)的平均分子量可為60kD-90kDa (包括端值)；或者，在一些實施方式中，為小于70kDa。所述葡聚糖聚合物可來源于細(xì)菌，如腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
[0135]在一些實施方式中，本文公開的免疫原性組合物包含至少2種抗原、或至少3種抗原、或至少5種抗原、或2-10種之間的抗原、或10-15種之間的抗原、或15-20種之間的抗原、或20-50種之間的抗原、或50-100種之間的抗原或超過100種抗原，包括端值。在一些實施方式中，當(dāng)本文所公開的免疫原性組合物包含至少2種抗原時，所述抗原可為相同的抗原或至少2種不同的抗原。在一些實施方式中，所述抗原可以來自相同病原體或不同病原體，或者可為相同抗原蛋白的不同表位或不同部分，或者可為對相同病原體的不同血清型或季節(jié)性變型(如流感病毒A、B和C)具有特異性的相同抗原。
[0136]在一些實施方式中，本文公開的免疫原性組合物包含來自病原性生物體或異常組織的抗原。在一些實施方式中，所述抗原為腫瘤抗原。在一些實施方式中，抗原可為選自于寄生蟲或病原體抗原的至少一種抗原，例如如下抗原:肺炎鏈球菌抗原、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原或破傷風(fēng)分枝桿菌(M.tetanus)抗原、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)抗原、HIV抗原、季節(jié)性或流行性流感抗原(如HlNl或H5N1)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)抗原或淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)抗原、HPV抗原、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)抗原、HSV抗原或其它皰疫病毒抗原、或痕原蟲(Plasmodia) sp抗原。這些抗原可包括肽、蛋白、糖蛋白或多糖。在一些實施方式中，所述抗原為類毒素或毒素 的一部分。
[0137]在一些實施方式中，本文公開的免疫原性組合物包含抗原多糖，例如，如Vi抗原(傷寒沙門氏菌莢膜多糖)、肺炎球菌莢膜多糖、肺炎球菌細(xì)胞壁多糖、Hib (B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type B))莢膜多糖、腦膜炎球菌(meningococcal)莢膜多糖、炭疽桿菌的多糖(炭疽的病原體(causative agent))、以及其它細(xì)菌莢膜多糖或細(xì)胞壁多糖，或上述多糖的任意組合。所述多糖可具有蛋白組分，例如，如來源于病毒的糖蛋白。
[0138]在一些實施方式中，本文公開的免疫原性組合物進一步包含至少一種與所述聚合物或多糖締合的共刺激因子，其中，所述共刺激因子可直接或間接締合。例如，在一些實施方式中，共刺激因子可共價連接至所述聚合物。例如，在一些實施方式中，共刺激因子可共價連接至所述第一親和分子，然后將其交聯(lián)至所述聚合物。例如，在一些實施方式中，共刺激因子可連接至互補親和分子，所述互補親和分子與第一親和分子締合，從而將所述共刺激因子連接至所述聚合物。在一些實施方式中，共刺激因子為佐劑(adjuvant)。在替代的實施方式中，共刺激因子可為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何共刺激因子，并包括任意組合，例如但不限于，Toll樣受體激動劑^!^、!！!^、!！!^、!！!^、!！!^、!！!^和TLR9等的激動劑)、N0D激動劑或炎性小體(inflammasome)激動劑。
[0139]本發(fā)明的另一方面涉及將本文所公開的免疫原性組合物給予受試者以在所述受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的用途。在一些實施方式中，所述免疫應(yīng)答為抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答、⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答(包括Thl、Th2和Thl7細(xì)胞)和/或⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實施方式中，將至少一種佐劑與所述免疫原性組合物聯(lián)合給藥。
[0140]本發(fā)明的另一方面涉及用于在受試者中誘導(dǎo)針對至少一種抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者給予本文所公開的免疫原性組合物。
[0141]本發(fā)明的另一方面涉及針對至少一種抗原對動物(例如鳥類、哺乳動物或人)進行接種的方法，所述方法包括給予含有本文所公開的免疫原性組合物的疫苗組合物。
[0142]在本文公開的所有方面中，動物或受試者可為人。在一些實施方式中，所述受試者可為農(nóng)業(yè)動物或非馴養(yǎng)動物(non-domestic animal)、或馴養(yǎng)動物。在一些實施方式中,含有本文所公開的免疫原性組合物的疫苗組合物可經(jīng)由以下方式給藥:皮下、鼻內(nèi)、口腔、舌下、陰道、直腸、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)注射，或經(jīng)由皮膚貼劑來經(jīng)皮免疫。
[0143]在本文公開的所有方面中，免疫應(yīng)答是針對蛋白/肽抗原的抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答、⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答(包括Thl、Th2和Th 17應(yīng)答)或⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一些實施方式中，免疫應(yīng)答是針對所述聚合物(例如，肺炎球菌多糖)的抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答。在一些實施方式中，將至少一種佐劑與所述免疫原性組合物聯(lián)合給藥。
[0144]本發(fā)明的另一方面涉及本文所公開的免疫原性組合物在對暴露于病原體或免疫原性劑進行診斷中的用途。
[0145]本文還提供了以本文所公開的免疫原性組合物對受試者(例如哺乳動物，如人)進行接種的方法，所述方法包括向所述受試者給予本文所公開的疫苗組合物。
[0146]通常而言，所述含有免疫原性復(fù)合物的組合物和免疫原性組合物可包含至少一種抗原或多種抗原，所述至少一種抗原或多種抗原連接至聚合物支架以在給予受試者時用于引發(fā)針對連接至所述聚合物的各抗原的免疫應(yīng)答，以及任選的針對所述聚合物本身的免疫應(yīng)答。該多抗原提呈系統(tǒng)(MAPS)刺激體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答:它可使用單個MAPS免疫原性構(gòu)建體來產(chǎn)生針對多種蛋白抗原的抗多糖抗體和B細(xì)胞/Thl/Thl7應(yīng)答。賦予生物體的聯(lián)合的B細(xì)胞免疫力和T細(xì)胞免疫力可能代表了針對多種疾病的最佳疫苗策略，所述疾病包括肺炎球菌疾病相關(guān)的侵襲性感染和鼻咽攜帶(carriage)。在一些實施方式中，所述免疫原性組合物為疫苗或包含于疫苗中。
[0147]因此，本發(fā)明一方面涉及免疫原性組合物(多抗原提呈系統(tǒng)，或MAPS)，所述免疫原性組合物包含至少一種聚合物(例如，一種多糖)、至少一種蛋白抗原或肽抗原及至少一種互補親和分子對，所述互補親和分子對包含(i )與所述聚合物締合的第一親和分子以及(ii)與所述抗原締合的互補親和分子，所述互補親和分子對用于間接地將所述抗原連接至所述聚合物(例如，所述第一親和分子與所述互補親和分子締合，以將所述抗原連接至所述聚合物)。因此，可將所述聚合物用作支架以連接至少I種、或至少2種或更多種(例如，多種)相同或不同的抗原。本文所公開的免疫原性組合物可用于同時引發(fā)針對多種抗原的體液免疫力和細(xì)胞免疫力這兩種免疫力。
[0148]因此，本文的實施方式提供了對引發(fā)受試者中的免疫應(yīng)答有用的免疫原性組合物和方法，所述免疫原性組合物和方法可使用其自身或與基本上任意已存在的疫苗方法結(jié)合或混合使用。
[0149]所述MAPS是靈活且通用的組合物，其可被設(shè)計并制造用于引發(fā)特定、廣譜、或多種抗原性靶標(biāo)。表1提供了用于設(shè)想MAPS實施方式的靈活性的簡單示例指南:
[0150]表1.MAPS平臺的通用性
[0151]
【權(quán)利要求】
1.包含氨基酸序列SEQID NO:1及其任意功能衍生物的可溶性生物素結(jié)合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合蛋白在大腸桿菌中以至少10mg/L培養(yǎng)基的水平以可溶形式生產(chǎn)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合蛋白為二聚體。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合蛋白在N端包含細(xì)菌信號序列。
5.如權(quán)利要求4所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述細(xì)菌信號序列為SEQID N0:2。
6.如權(quán)利要求4或5所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，通過肽接頭將所述信號序列連接至所述生物素蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列SEQIDN0:8 或 VSDP (SEQ ID N0:9)。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合蛋白在C端包含純化標(biāo)簽。
9.如權(quán)利要求8所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述純化標(biāo)簽選自于由下列純化標(biāo)簽所組成的組: 組氨酸標(biāo)簽、c-my標(biāo)簽、Halo標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽，以及以上標(biāo)簽的任意組合。
10.如權(quán)利要求9所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述組氨酸標(biāo)簽包含氨基酸序列SEQID NO:10。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，通過肽接頭將所述純化標(biāo)簽連接至所述生物素結(jié)合蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列VDKLAAALE (SEQ ID NO:1I)或 GGGGSSSVDKLAAALE (SEQ ID NO:12)。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的生物素結(jié)合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15。
14.包含如權(quán)利要求1-13中任一項所述的生物素結(jié)合蛋白的組合物。
15.包含生物素結(jié)合蛋白以及蛋白質(zhì)或肽的融合蛋白。
16.如權(quán)利要求15所述的融合蛋白，其中，通過肽接頭將所述蛋白質(zhì)或肽融合至所述生物素結(jié)合蛋白。
17.如權(quán)利要求15所述的融合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列SEQID N0:22。
18.如權(quán)利要求15-17中任一項所述的融合蛋白，其中，所述蛋白質(zhì)或肽為選自于由下列抗原所組成的組中的抗原: 肺炎球菌抗原、結(jié)核抗原、炭疽抗原、HIV抗原、季節(jié)性流感抗原或流行性流感抗原、流感抗原、百日咳抗原、金黃色葡萄球菌抗原、腦膜炎球菌抗原、嗜血桿菌抗原、HPV抗原，或以上抗原的組合。
19.如權(quán)利要求15-18中任一項所述的融合蛋白，其中，所述抗原為金黃色葡萄球菌α-溶血素的非溶血性變體。`
20.如權(quán)利要求19所述的融合蛋白，其中，所述金黃色葡萄球菌α-溶血素的非溶血性變體包含位于野生型金黃色葡萄球菌α -溶血素第205位、213位或209-211位氨基酸殘基處的突變。
21.如權(quán)利要求19所述的融合蛋白，其中，所述金黃色葡萄球菌α-溶血素的非溶血性變體包含野生型金黃色葡萄球菌α-溶血素中的下列突變中的一種: (i)第205位殘基由W變?yōu)锳 ; (ii)第213位殘基由W變?yōu)锳 ;或者(iii)第209-211位殘基由DRD變?yōu)锳AA。
22.如權(quán)利要求19所述的融合蛋白，其中，所述金黃色葡萄球菌α-溶血素的非溶血性變體包含選自于由下列氨基酸序列所組成的組中的氨基酸序列:
SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25，以及上述氨基酸序列的功能變體、部分和衍生物。
23.如權(quán)利要求15-22中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在N端包含細(xì)菌信號序列。
24.如權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其中，所述細(xì)菌信號序列為SEQID ΝΟ:2。
25.如權(quán)利要求23或24所述的融合蛋白，其中，通過肽接頭將所述信號序列連接至所述生物素蛋白。
26.如權(quán)利要求25所述的融合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列SEQID ΝΟ:8或SEQ ID NO:9。
27.如權(quán)利要求15-26中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在C端包含純化標(biāo)簽。
28.如權(quán)利要求27所述的融合蛋白，其中，所述純化標(biāo)簽選自于由下列純化標(biāo)簽所組成的組: 組氨酸標(biāo)簽、c-my標(biāo)簽、Halo標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽，以及以上標(biāo)簽的任意組合。
29.如權(quán)利要求27所述的融合蛋白，其中，所述組氨酸標(biāo)簽包含氨基酸序列SEQIDNO:10。
30.如權(quán)利要求27-29中任一項所述的融合蛋白，其中，通過肽接頭將所述純化標(biāo)簽連接至所述生物素結(jié)合蛋白。
31.如權(quán)利要求30所述的融合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列SEQID NO: 11。
32.如權(quán)利要求15-31中任一項所述的融合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合蛋白為如權(quán)利要求1-13中任一項所述的生物素結(jié)合蛋白。
33.如權(quán)利要求15-32中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含選自于由下列氨基酸序列所組成的組中的氨基酸序列:
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28。
34.包含如權(quán)利要求15-33中任一項所述的融合蛋白的組合物。
35.一種突變型α-溶血素(mHla)蛋白，所述蛋白包含位于野生型金黃色葡萄球菌α -溶血素第205位、213位或209-211位氨基酸殘基處的突變，其中，與等同效價的野生型α -溶血素(Hla)相比，所述突變型α -溶血素具有較低的溶血活性。
36.如權(quán)利要求35所述的突變型α-溶血素，其中，所述突變型α-溶血素的溶血活性比等同效價的野生型Hla低至少25%。
37.如權(quán)利要求35或36所述的突變型α-溶血素，其中，所述突變型α-溶血素包含野生型金黃色葡萄球菌α-溶血素中的下列突變中的一種: (i)第205位殘基由W變?yōu)锳 ; (ii)第213位殘基由W變?yōu)锳 ;或者(iii)第209-211位殘基由DRD變?yōu)锳AA。
38.如權(quán)利要求13-15中任一項所述的突變型α-溶血素，其中，所述突變型α -溶血素包含選自于由下列氨基酸序列所組成的組中的氨基酸序列: SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25，以及上述氨基酸序列的功能變體、部分和衍生物。
39.包含如權(quán)利要求35-38中任一項所述的突變型α-溶血素的組合物。
40.一種包含α-溶血素和生物素結(jié)合域的融合蛋白，其中，與等同效價的野生型α -溶血素(Hla)相比,所述融合蛋白具有較低的溶血活性。
41.如權(quán)利要求18所述的融合蛋白，其中，所述α-溶血素為如權(quán)利要求35-38中任一項所述的突變型溶血素；或者所述α-溶血素由金黃色葡萄球菌野生型α-溶血素第27-319位氨基酸的氨基酸序列組成。
42.如權(quán)利要求19所述的融合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合域由氨基酸序列SEQIDNO:1組成。
43.如權(quán)利要求40-42中任一項所述的融合蛋白，其中，通過肽接頭連接所述生物素結(jié)合域與所述突變型α-溶血素。
44.如權(quán)利要求43所述的融合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列SEQID ΝΟ:22。
45.如權(quán)利要求40-44中`任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在N端包含細(xì)菌信號序列。
46.如權(quán)利要求45所述的融合蛋白，其中，所述細(xì)菌信號序列為SEQID ΝΟ:2。
47.如權(quán)利要求45或46所述的融合蛋白，其中，通過肽接頭將所述信號序列連接至所述生物素蛋白。
48.如權(quán)利要求47所述的融合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列SEQID ΝΟ:8或SEQ ID ΝΟ:9。
49.如權(quán)利要求40-48中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白在C端包含純化標(biāo)簽。
50.如權(quán)利要求49所述的融合蛋白，其中，所述純化標(biāo)簽選自于由下列純化標(biāo)簽所組成的組: 組氨酸標(biāo)簽、c-my標(biāo)簽、Halo標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽，以及以上標(biāo)簽的任意組合。
51.如權(quán)利要求50所述的融合蛋白，其中，所述組氨酸標(biāo)簽包含氨基酸序列SEQIDNO:10。
52.如權(quán)利要求49-51中任一項所述的融合蛋白，其中，通過肽接頭將所述純化標(biāo)簽連接至所述生物素結(jié)合蛋白。
53.如權(quán)利要求52所述的融合蛋白，其中，所述肽接頭包含氨基酸序列SEQID NO: 11。
54.如權(quán)利要求40-53中任一項所述的融合蛋白，其中，所述生物素結(jié)合域為如權(quán)利要求1-13中任一項所述的生物素結(jié)合蛋白。
55.如權(quán)利要求40-54中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含選自于由下列氨基酸序列所組成的組中的氨基酸序列:
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28。
56.如權(quán)利要求40-55中任一項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的溶血活性比等同效價的野生型Hla低至少25%。
57.包含如權(quán)利要求40-56中任一項所述的融合蛋白的組合物。
58.一種在受試者中誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者給予如權(quán)利要求14、34、39或57所述的組合物。
59.一種針對至少一種攜帶抗原的病原體對哺乳動物進行接種的方法，所述方法包括給予如權(quán)利要求14、34、39或57所述的組合物。
60.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，所述受試者為人。
61.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，所述受試者為農(nóng)業(yè)動物或非馴養(yǎng)動物。
62.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，所述受試者為馴養(yǎng)動物。
63.如權(quán)利要求58或59所述的方法，其中，通過皮下注射、鼻內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或肌內(nèi)注射給藥。
64.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答為抗體應(yīng)答/B細(xì)胞應(yīng)答。
65.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答為CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，所述CD4+T細(xì)胞應(yīng)答包括Thl應(yīng)答、Th2應(yīng)答或Th 17應(yīng)答。
66.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述免疫應(yīng)答為CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
67.如權(quán)利要求14、34、39或57中任一項所述的組合物在對暴露于病原體或免疫威脅進行診斷中的用途。
【文檔編號】A61K31/00GK103732222SQ201280034719
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月11日
【發(fā)明者】理查德·馬利, 陸英杰, 張帆 申請人:兒童醫(yī)療中心有限公司