缺血性疾病治療藥的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于，提供即使全身給藥也會特異性地僅聚集在病變部位、具有高蛋白質(zhì)表達率、在治愈的同時從病變部位消失的基因轉(zhuǎn)運載體以及使用了其的缺血性疾病的治療方法。通過提供由厭氧性菌形成的基因轉(zhuǎn)運載體、包含該基因轉(zhuǎn)運載體的藥物組合物、以及利用了這些基因轉(zhuǎn)運載體的缺血性疾病的治療方法，從而解決了上述課題，所述厭氧性菌能夠在缺血性疾病部位特異性地生長、且能夠表達至少1種對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)。
【專利說明】缺血性疾病治療藥
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及能夠特異性地治療缺血性疾病部位的基因轉(zhuǎn)運載體、藥物組合物以及使用了這些基因轉(zhuǎn)運載體的缺血性疾病的治療方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，在惡性腫瘤的治療方法中，使用遺傳轉(zhuǎn)化厭氧性菌作為基因轉(zhuǎn)運載體的方法受到矚目，例如，提出了使用進行了遺傳轉(zhuǎn)化的梭狀芽胞桿菌，將硝基還原酶的表達基因轉(zhuǎn)運至腫瘤部位的方法等，所述梭狀芽胞桿菌是將抗腫瘤物質(zhì)的前體藥物轉(zhuǎn)換成抗腫瘤物質(zhì)的酶(參照專利文獻I~3)。
[0003]但是，出于以往這些目的而使用的微生物均是將病原性的菌變異成低毒性而成的，不能否認(rèn)其進行回復(fù)突變而恢復(fù)至原來的病原性菌、從而發(fā)揮有害性的可能性，進而由于運動性、侵襲性，因此不僅在疾病組織中、還會在正常組織中表達作用，從而可能產(chǎn)生全身性的副作用癥狀等，擔(dān)心安全性方面的問題性。
[0004]因而，作為在人腸道內(nèi)存在而形成菌群的非病原性腸道細(xì)菌、且極其安全的專性厭氧性細(xì)菌而已知的雙歧桿菌受到矚目，從而開發(fā)了用于表達胞嘧啶脫氨酶的進行了遺傳轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌，所述胞嘧啶脫氨酶是將抗腫瘤物質(zhì)5-氟尿嘧啶的前體藥物即5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成5-FU的酶(參照專利文獻4、5)。
[0005]該遺傳轉(zhuǎn)化雙歧桿菌具有如下特長:將其靜脈給藥至厭氧性疾病的實體腫瘤動物模型時，該遺傳轉(zhuǎn)化雙歧桿菌會在低氧狀態(tài)的厭氧性疾病組織中特異性地生長、增殖，并在非厭氧環(huán)境下的正常組織中迅速消失(參照非專利文獻1、2)。
[0006]另一方面，在缺血性疾病的治療、尤其是重癥缺血的治療中，嘗試了通過推進血管新生、側(cè)支循環(huán)，從而恢復(fù)血流這樣的血管新生療法。血管新生療法大致分為細(xì)胞移植、蛋白給藥以及基因治療這三種治療方法，但從低侵襲性的觀點出發(fā)，近年來尤其是基因治療受到矚目。在基于基因治療的血管新生中，將用于編碼例如肝細(xì)胞增殖因子(hepatocytegrowthfactor:HGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor:VEGF)等的基因通過肌肉內(nèi)注射、動脈內(nèi)注入而導(dǎo)入患部附近，促進患部附近的血管新生，從而使血流恢復(fù)(例如參照非專利文獻3、4)。
[0007]對于因小動脈程度的損害而無法進行血液循環(huán)再建或效果不充分的患者、因侵襲性的問題而無法進行外科治療的患者等而言，這些血管新生療法作為選擇項之一而受到矚目，尤其是對基于基因治療的血管新生療法，近年來進行了多個臨床試驗。
[現(xiàn)有技術(shù)文獻]
專利文獻
[0008]專利文獻1:美國專利第6416754號說明書 專利文獻2:美國專利第6652849號說明書
專利文獻3:美國專利申請公開2003/0103952號說明書 專利文獻4:日本特開2002-97144號公報專利文獻5:國際公開第2007-136107號 非專利文獻
[0009]非專利文獻1:Yazawaetal., CancerGeneTherapy, Vol.7, N0.2, 2000:pp269-274
非專利文獻 2:Yazawaetal., BreastCancerResearchandTreatment, Vol.66, 2001:p
P165-170
非專利文獻 3:Guptaetal.，Circ.Res.2009 ； 105:724-736
非專利文獻 4:Morishitaetal., ArteriosclerThrombVascBiol.2011 ；31:713-720

【發(fā)明內(nèi)容】

發(fā)明要解決的問題
[0010]本發(fā)明的目的在于，提供由厭氧性菌形成的基因轉(zhuǎn)運載體、包含該基因轉(zhuǎn)運載體的藥物組合物、以及利用了這些基因轉(zhuǎn)運載體的缺血性疾病的治療方法，所述厭氧性菌能夠在缺血性疾病部位特異性地生長、且能夠表達至少I種對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)。
用于解決問題的方案
[0011]如上所述，利用 了基因治療的血管新生療法對缺血性疾病的治療是有用的，但利用了現(xiàn)有基因治療的血管新生療法依然存在幾個問題點。第一，現(xiàn)在使用的基因轉(zhuǎn)運載體沒有病變部位特異性，在全身給藥時會全身播散，因此導(dǎo)入基因的給藥主要使用肌肉內(nèi)注射或動脈內(nèi)注入，但這些給藥方法不能說是對缺血疾病部位特異性給藥且對疾病部位均勻地給藥，進而在缺血部位和非缺血部位混合存在的情況下，由于向非缺血部位大量傳送導(dǎo)入基因、促進非缺血部位的血管新生，因此，結(jié)果可能產(chǎn)生缺血部位的血液循環(huán)進一步惡化之類的、被稱為盜血現(xiàn)象的現(xiàn)象。
[0012]第二，該治療方法的前提是:利用載體進行基因?qū)耄瑥亩鼓繕?biāo)蛋白質(zhì)在疾病部位進行表達，因此可列舉出難以控制基因?qū)胄?、?dǎo)入基因的表達時間。因此，存在如下問題:即使給藥也不會充分地導(dǎo)入從而不發(fā)揮效果、導(dǎo)入基因的表達在疾病緩解前消失、緩解后導(dǎo)入基因也會繼續(xù)表達。
[0013]第三，可以認(rèn)為，對于老年人、糖尿病患者等而言，血管新生療法因其低侵襲性而比其它治療方法具有較大優(yōu)勢，對于這些患者而言，例如糖尿病患者具有糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年人具有惡性腫瘤等會因血管新生而導(dǎo)致癥狀惡化的并發(fā)癥，因此疾病部位特異性低的現(xiàn)有血管新生療法的適用存在限制。
[0014]本發(fā)明人等想到:通過即使全身給藥也會特異性地僅聚集在病變部位、具有高蛋白質(zhì)表達率、在治愈的同時從病變部位消失的載體，可全部解決這些問題，從而重復(fù)進行了深入研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
(I) 一種基因轉(zhuǎn)運載體，其是由能夠在缺血性疾病部位特異性地生長、且能夠表達至少I種對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)的厭氧性菌形成的。
[0015](2)根據(jù)(I)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，厭氧性菌是用遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進行遺傳轉(zhuǎn)化而成的，該質(zhì)粒包含用于編碼對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)的DNA序列。
(3)根據(jù)⑴或(2)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，缺血性疾病為慢性缺血性疾病。(4)根據(jù)(I)~(3)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，厭氧性菌是非病原性的腸道細(xì)菌。
(5)根據(jù)(I)~(4)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，厭氧性菌是雙歧桿菌。
[0016](6)根據(jù)(5)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，雙歧桿菌是選自由青春雙歧桿菌、角雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、牛雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、小豬雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、兔雙歧桿菌、寓齒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、高盧雙歧桿菌、雞雙歧桿菌、球雙歧桿菌、蜜蜂雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、殊形雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、Bifidobacterium lactentis、自由雙歧桿菌、長雙歧桿菌、大雙歧桿菌、反會動物雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、Bifidobacteriummongoliens、微小粒雙歧桿菌、假鏈狀雙歧桿菌、偽長雙歧桿菌、嗜冷雙岐桿菌、雛 雙歧桿菌、棲瘤胃雙歧桿菌、反芻雙歧桿菌、世紀(jì)雙歧桿菌、Bifidobacteriumscardov1、細(xì)長雙歧桿菌、豬雙歧桿菌、嗜酸熱雙歧桿菌、以及嗜熱雙歧桿菌組成的組中的I種。
[0017](7)根據(jù)(6)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，雙歧桿菌為長雙歧桿菌。
(8)根據(jù)(I)~(7)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，對缺血性疾病的診斷是有用的蛋白質(zhì)為熒光蛋白質(zhì)。
(9)根據(jù)(I)~(7)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，對缺血性疾病的治療是有用的蛋白質(zhì)為選自由成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)血管生長因子(AGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFii)、血管生成素、肝配蛋白等具有血管新生促進活性的蛋白質(zhì)；前列腺素類等與血管擴張有關(guān)的因子；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等集落刺激因子；神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3等神經(jīng)營養(yǎng)蛋白；胰島素樣生長因子(IGF)組成的組中的一種。
[0018](10)根據(jù)⑵~(9)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為非穿梭質(zhì)粒。
(11)根據(jù)(2)~(10)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒還包含用于編碼分泌信號妝的基因序列。
(12)根據(jù)(2)~(11)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒包含pTB6r印單元。
(13)根據(jù)(2)~(12)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒具有表達盒，所述表達盒包含用于編碼P37啟動子、HU終止子、以及FGF2的基因。
(14)根據(jù)(2)~(13)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒包含用于編碼具有序列號40中記載的序列的多肽的DNA序列。
(15)根據(jù)(2)~(14)的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pFGF12a(序列號38)。
(16)一種缺血性疾病用藥物組合物，其包含(I)~(15)的基因轉(zhuǎn)運載體。
(17)根據(jù)(16)的藥物組合物，其通過全身給藥進行給藥。
(18)—種診斷或處置缺血性疾病的方法，其包括給藥厭氧性菌，所述厭氧性菌能夠在缺血性疾病部位特異性地生長、且能夠表達至少I種對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)。
(19)根據(jù)(18)的方法，其中，給藥為全身給藥。
發(fā)明的效果
[0019]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體是厭氧性菌，因此在處于厭氧環(huán)境下的缺血性疾病部位特異性地生長、增殖，在該疾病組織中，能夠產(chǎn)生、分泌具有缺血性疾病的治療活性的蛋白質(zhì)，作為缺血性疾病治療劑是極其有用的，能夠期待其作為高品質(zhì)的基因轉(zhuǎn)運載體。另外，由于其在缺血性疾病部位特異性地生長，因此即使靜脈注射等全身給藥也會特異性地聚集在缺血性疾病部位，從而發(fā)揮效果。因此，不需要大量給藥、多次給藥，能夠減輕給藥對象的負(fù)擔(dān)。進而，在持續(xù)缺血的期間，缺血性疾病部位的厭氧環(huán)境得以維持，因此會長期生長，一旦缺血得到緩解而不再是厭氧環(huán)境時，就無法生長并迅速消失。
[0020]進而，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體由于基因轉(zhuǎn)運載體本身就能夠表達對治療有用的蛋白質(zhì)，因此不需要像以往那樣考慮向缺血性部位或其附近的細(xì)胞導(dǎo)入基因的效率，能夠一直發(fā)揮高蛋白質(zhì)表達效率。進而，由于其是特異性地向缺血性部位轉(zhuǎn)運的載體，因此并發(fā)癥的危險性也小。因此，能夠?qū)嵤┡c以往相比進一步低侵襲性且副作用也少、安全性高的血管新生治療。進而，通過使本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體同時表達標(biāo)記物，還能夠用于缺血性部位的診斷、處置的監(jiān)控。進而，本發(fā)明的基因載體能夠同時轉(zhuǎn)運多個基因，可以認(rèn)為通過組入給藥多個有效的增殖因子，能夠進行更有效且非侵襲的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是表示a)下肢缺血模型小鼠(ischemicmodel)的基于激光多普勒血流量計的測量圖像和b)血流量比(患肢/健康肢)的變化的圖表。
圖2是在ischemicmodel中對給藥本發(fā)明的B.1ongum菌的組和未給藥本發(fā)明的B.1ongum菌的組的血流量比的變化的圖表。在給藥組與非給藥組中未觀察到血流量變化的明顯差異。
圖3是檢測從ischemicmodel局部給藥組的患肢和健康肢所采取的樣品中存在的本發(fā)明的B.1ongum菌的照片。對患肢給藥后即使經(jīng)過168小時也觀察到大量菌，與此相對，在健康肢中基本上觀察不到菌。
圖4中分別用圖表表示ischemicmodel局部給藥組的給藥后經(jīng)過168小時時的患肢和健康肢的菌數(shù)。
[0022] 圖5中用圖表表示ischemicmodel全身給藥組的健康肢的經(jīng)過規(guī)定時間時的B.1ongum菌的菌數(shù)變化示于圖表。即使在全身給藥組中，經(jīng)過48小時時也基本觀察不到菌，經(jīng)過72小時時未觀察到菌。
圖6中用圖表表示ischemicmodel全身給藥組的患肢的、相對于經(jīng)過時間的血流比變化和菌數(shù)變化。隨著給藥后時間的經(jīng)過，菌數(shù)增加，隨著血流向缺血部位的恢復(fù)，可觀察到菌數(shù)減少的樣子。
圖7是ischemicmodel全身給藥組的、給藥后經(jīng)過4日時的肌肉組織的革蘭氏染色像。健康肢中未觀察到革蘭氏染色菌，與此相對，患肢中觀察到多個革蘭氏染色菌。
圖8是表示下肢缺血模型小鼠(ischemicmodel)和下肢壞死模型小鼠(necroticmodel)的患肢/健康肢血流比的時間變化的圖表。可知:necrotic model的缺血狀態(tài)持續(xù)時間更長、恢復(fù)程度也低。
[0023]圖9中用圖表表示necroticmodel全身給藥組的患肢的、相對于經(jīng)過時間的血流比變化和菌數(shù)變化。隨著給藥后時間的經(jīng)過，菌數(shù)增加，在缺血狀態(tài)持續(xù)的期間，B.1ongum菌生長/增殖，隨著血流向缺血部位的恢復(fù)，可觀察到菌數(shù)減少的樣子。
圖10是對necroticmodel全身給藥組的患肢的、B.1ongum菌數(shù)相對于患肢/健康肢血流比進行標(biāo)繪的圖。表示隨著血流比的增加、菌數(shù)減少的樣子。
圖11是表示ischemicmodel全身給藥組的患肢、肺、腎臟、肝臟、脾臟以及心臟中的B.1ongum菌檢測試驗的結(jié)果的照片。上部左上為缺血肢、上部中間為肺、上部右側(cè)為腎臟、下部左為肝臟、下部中間為脾臟、下部右為心臟的檢測結(jié)果。即使是全身給藥，在除了缺血性疾病部位即患肢以外的臟器中也未觀察到所給藥的B.1ongum菌。
圖12是表示necroticmodel全身給藥組的患肢、血液、腎臟、肝臟、脾臟以及心臟中的、各經(jīng)過時間的B.1ongum菌數(shù)的圖表?？芍獎偨o藥后觀測到少量菌，但其后迅速消失。從血液中未檢測出菌。
[0024]圖13是表示心肌梗塞模型的結(jié)扎部位和菌的給藥部位的模式圖。
圖14是表示心肌梗塞模型小型豬的心臟的染色像的圖。a)為TTC染色像，梗塞部位(圖中箭頭所示的部分)未被染色，表示為梗塞部位。b)、c)分別表示正常心肌部位和梗塞部位的MT染色像、HE染色像。各染色像均可觀察到梗塞部位中的心肌細(xì)胞的脫落和纖維化的推進。
圖15是表示心肌梗塞模型中的B.1ongum菌給藥后經(jīng)過4日和7日時的、梗塞部位和健康部位的B.1ongum 菌數(shù)的圖表。經(jīng)過4日時，即使在健康部位也觀察到微量菌，但經(jīng)過7日時，僅在梗塞部位觀察到菌。
[0025]圖16是表示對本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體進行遺傳轉(zhuǎn)化的遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的一個方式即pFGF12a構(gòu)筑的方案的圖。
圖17表示使用了用pFGF12a進行遺傳轉(zhuǎn)化的長雙歧桿菌105A的培養(yǎng)上清的Western印跡的結(jié)果。作為陰性對照而使用了用pBEshuttle進行遺傳轉(zhuǎn)化的長雙歧桿菌105A,作為陽性對照而使用了 hFGF2。在20kDa附近確認(rèn)到帶，可以認(rèn)為這是hFGF2。
圖18表示使用了用pFGF12a進行遺傳轉(zhuǎn)化的短雙歧桿菌JCM1192的培養(yǎng)上清的Western印跡的結(jié)果。作為陰性對照而使用了用pBEshuttle進行遺傳轉(zhuǎn)化的短雙歧桿菌JCM1192，作為陽性對照而使用了 hFGF2。果然在20kDa附近確認(rèn)到帶，可以認(rèn)為這是hFGF2。
[0026]圖19是向下肢缺血模型的小鼠靜脈注射包含本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體即長雙歧桿菌105A/pFGF12a的藥物組合物，并觀察下肢缺血部位的血流變化的圖表。在第3日血流恢復(fù)已經(jīng)產(chǎn)生微小差異，在第6日以后，給藥了本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體的組的血流明顯恢復(fù)。
圖20是向下肢缺血模型的小鼠靜脈注射包含本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體即短雙歧桿菌JCM1192/pFGF12a的藥物組合物，并觀察下肢缺血部位的血流變化的圖表。在第4日血流恢復(fù)已經(jīng)產(chǎn)生微小差異，在第8日以后，給藥了本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體的組的血流明顯恢復(fù)。
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明涉及一種基因轉(zhuǎn)運載體，其是由能夠在缺血性疾病部位特異性地生長、且能夠表達至少I種對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)的厭氧性菌形成的。
[0028]在本發(fā)明中，“缺血”是指由于血管的狹窄、阻塞，供給至組織的動脈血量減少從而導(dǎo)致組織缺乏氧/營養(yǎng)的狀態(tài)，持續(xù)的缺血會產(chǎn)生組織的萎縮、變性、壞死等。
本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體主要在血管新生治療、臟器的保護等用于改善由缺血引起的不優(yōu)選狀態(tài)的處置方法中使用。因此，在本說明書中，“缺血性疾病”是指無論有無自覺癥狀，由于動脈的狹窄、阻塞而導(dǎo)致的組織持續(xù)缺血的狀態(tài)或者由所述缺血引起的不優(yōu)選狀態(tài)。作為缺血性疾病，不限定于此，例如可列舉出心絞痛、心肌梗塞等缺血性心疾??；腦梗塞等腦缺血；煙霧病等慢性腦缺血；脊髄缺血、缺血性大腸炎、腸系膜動脈阻塞癥等缺血性腸疾病；阻塞性動脈硬化癥等下肢缺血；糖尿病視網(wǎng)膜癥等視網(wǎng)膜缺血等。
[0029]在本說明書中，“缺血性部位”是指因缺血而導(dǎo)致動脈血量、營養(yǎng)以及氧減少的狀態(tài)的部位，“缺血性疾病部位”或”缺血性疾病組織”可互換使用。
在本說明書中，“厭氧性菌”是指具有厭氧性質(zhì)的細(xì)菌，“厭氧性質(zhì)”是指能夠在氧少或無氧條件下生長的性質(zhì)。一 般來說，厭氧性菌可分類為:即使在氧存在下也能夠生長的兼性厭氧性菌、以及在氧存在下無法生長的專性厭氧性菌，在本發(fā)明中，優(yōu)選為專性厭氧性菌。本發(fā)明的厭氧性菌所具有的厭氧性質(zhì)可以是細(xì)菌生來具有的性質(zhì)，也可以是通過遺傳轉(zhuǎn)化得到的性質(zhì)。
[0030]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體由厭氧性菌形成，因此能夠在處于厭氧條件下的缺血性疾病部位特異性地生長、增殖。于是，基因轉(zhuǎn)運載體本身具有基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯功能，因此在生長于缺血性疾病組織的時刻能夠表達對診斷或治療有用的蛋白質(zhì)，并供給于該疾病組織。因此，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體包含用于編碼對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0031]在本發(fā)明的一個方式中，基因轉(zhuǎn)運載體用遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進行了遺傳轉(zhuǎn)化。作為遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，只要在基因轉(zhuǎn)運載體的菌中發(fā)揮作用、且無損該菌的厭氧性質(zhì)，則可以使用任意的質(zhì)粒。
如上所述，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體即厭氧性菌所具有的厭氧性質(zhì)可以是通過遺傳轉(zhuǎn)化而得到的，因此，在本發(fā)明的一個方式中，厭氧性菌以成為專性厭氧性菌的方式進行了遺傳轉(zhuǎn)化。
[0032]在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，基因轉(zhuǎn)運載體通過具有用于編碼對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)的DNA序列的質(zhì)粒而進行了遺傳轉(zhuǎn)化。通過遺傳轉(zhuǎn)化來賦予表達對缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)的能力，從而根據(jù)質(zhì)粒的設(shè)計可表達任意的蛋白質(zhì)。
[0033]在本發(fā)明中，缺血性疾病包括:由于因缺血導(dǎo)致的氧濃度的急劇降低，對組織造成損傷的急性缺血性疾?。灰约坝捎陂L時間持續(xù)的氧濃度降低，從而引起組織變性、壞死等的慢性缺血性疾病。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體在給藥后會選擇性地轉(zhuǎn)運至疾病部位并生長，停留在轉(zhuǎn)運部位而發(fā)揮效果，因此優(yōu)選用于改善慢性的缺血狀態(tài)。在本說明書中，“慢性的缺血狀態(tài)”可與“慢性缺血性疾病”互換使用，但不限定于此，例如可列舉出心絞痛、心肌梗塞等缺血性心疾??；煙霧病等慢性腦缺血；阻塞性動脈硬化癥等下肢缺血等。作為慢性缺血性疾病的改善處置，不限定于此，例如可列舉出血管新生療法等。
[0034]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體以體內(nèi)給藥作為前提，因此所使用的厭氧性菌需要不具有毒性或者毒性低。因此，在本發(fā)明的一個方式中，基因轉(zhuǎn)運載體可以是將病原性的菌變異成低毒性而成的。然而，變異成低毒性的細(xì)菌有可能進行回復(fù)突變而恢復(fù)至原本的病原性菌，從而發(fā)揮有害性，因此優(yōu)選為天生的非病原性細(xì)菌。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，厭氧性菌使用非病原性的腸道細(xì)菌。
[0035]作為本發(fā)明中能夠使用的非病原性腸道細(xì)菌，可優(yōu)選列舉出雙歧桿菌屬菌(雙歧桿菌)。作為雙歧桿菌屬細(xì)菌，例如可列舉出青春雙歧桿菌、角雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、牛雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、小豬雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、兔雙歧桿菌、寓齒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、高盧雙歧桿菌、雞雙歧桿菌、球雙歧桿菌、蜜蜂雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、殊形雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、Bifidobacteriumlactentis、自由雙歧桿菌、長雙歧桿菌、大雙歧桿菌、反會動物雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、Bifidobacteriummongoliens、微小粒雙歧桿菌、假鏈狀雙歧桿菌、偽長雙歧桿菌、嗜冷雙岐桿菌、雛雙歧桿菌、棲瘤胃雙歧桿菌、反芻雙歧桿菌、世紀(jì)雙歧桿菌、Bifidobacteriumscardov1、細(xì)長雙歧桿菌、豬雙歧桿菌、嗜酸熱雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等，最優(yōu)選為長雙歧桿菌。
[0036]這些菌均已經(jīng)市售或者能夠容易地從保藏機構(gòu)獲取。例如，長雙歧桿菌ATCC-15707、兩歧雙歧桿菌ATCC-11863、嬰兒雙歧桿菌ATCC-15697等可容易地從ATCC (TheAmericanTypeCultureCollection,美國典型培養(yǎng)物保藏中心)獲取。
[0037]另外，關(guān)于各菌的株也沒有特別限定，例如，關(guān)于長雙歧桿菌的株，可列舉出長雙歧桿菌105-A株、長雙歧桿菌aE-194b株、長雙歧桿菌bs-601株、長雙歧桿菌M101-2株，其中，優(yōu)選為長雙歧桿菌105-A株。
[0038]關(guān)于短雙歧桿菌的株，例如可列舉出短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(JCM1192)、短雙歧桿菌aS-Ι株、短雙歧桿菌1-53-8W株，其中，優(yōu)選為短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、短雙歧桿菌aS_l株。
[0039]關(guān)于嬰兒雙歧桿菌的株，例如可列舉出嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(JCM1222)、嬰兒雙歧桿菌1-10-5株，其中，優(yōu)選為嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、嬰兒雙歧桿菌1-10-5株。
另外，關(guān)于 Bifidobacteriumlactentis 的株，例如可列舉出 Bifidobacteriumlactentis 標(biāo)準(zhǔn)株(JCM1220)。
[0040]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體在缺血性疾病部位特異性地生長，因此通過檢測該基因轉(zhuǎn)運載體的存在，能夠診斷缺血性疾病部位?；蜣D(zhuǎn)運載體的檢測例如可以通過標(biāo)記基因轉(zhuǎn)運載體來簡便地進行。從用于疾病診斷這一觀點出發(fā)，檢測優(yōu)選侵襲性小，優(yōu)選標(biāo)記對轉(zhuǎn)運對象的不良影響小。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，基因轉(zhuǎn)運載體表達熒光蛋白質(zhì)來作為對診斷有用的蛋白質(zhì)。作為熒光蛋白質(zhì)，可列舉出各種綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、紅色熒光蛋白質(zhì)(RFP)等。作為其它優(yōu)選方式:
[0041]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體在缺血性疾病部位特異性地生長，因此在生長部位表達出的蛋白質(zhì)必然被特異性地轉(zhuǎn)運至缺血性疾病部位。因此，通過使本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體表達用于治療缺血性疾病的蛋白質(zhì)，能夠有效地處置缺血性疾病。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，基因轉(zhuǎn)運載體表達對缺血性疾病的治療有用的蛋白質(zhì)。
[0042]作為對缺血性疾病的治療是有用的蛋白質(zhì)，不限定于此，例如可列舉出具有血管新生促進活性的蛋白質(zhì)、與血管擴張有關(guān)的蛋白質(zhì)等。作為具有血管新生促進活性的蛋白質(zhì)，不限定于此，例如可列舉出成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血管生長因子(AGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFi3)、血管生成素、肝配蛋白等，作為與血管擴張有關(guān)的因子，可列舉出前列腺素類等。作為其它對治療有用的蛋白質(zhì)，可列舉出粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等集落刺激因子；神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3等神經(jīng)營養(yǎng)蛋白；胰島素樣生長因子(IGF)等。
[0043] 如上所述，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體的遺傳轉(zhuǎn)化中能夠使用的質(zhì)粒只要在基因轉(zhuǎn)運載體的菌中發(fā)揮作用、且無損該菌的厭氧性質(zhì)，則可以是任意質(zhì)粒。然而，在轉(zhuǎn)運對象的體內(nèi)，遺傳轉(zhuǎn)化中使用的質(zhì)粒可能向例如大腸桿菌等體內(nèi)的其它細(xì)菌中水平轉(zhuǎn)運，此時，質(zhì)粒在水平轉(zhuǎn)運的其它細(xì)菌中被復(fù)制，其結(jié)果，無法否認(rèn)質(zhì)粒所編碼的蛋白質(zhì)在不期望的部位進行表達的危險性。因此，在優(yōu)選方式中，遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為非穿梭質(zhì)粒。
[0044]在本說明書中，“穿梭質(zhì)?！笔侵改軌蛟趦煞N以上不同的宿主中復(fù)制的質(zhì)粒，可與“穿梭載體質(zhì)?！被Q使用。因此，”非穿梭質(zhì)?！笔侵竷H能夠在一種宿主中復(fù)制的質(zhì)粒。
[0045]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體在菌體中產(chǎn)生利用遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒所編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在菌體外釋放而首次起到治療效果，因此，為了使用通常不會分泌到菌體外的蛋白質(zhì)來發(fā)揮治療效果，需要將菌殺滅破壞。為了解決該問題，在優(yōu)選方式中，遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒還包含用于編碼分泌信號肽的基因序列。
[0046]在本說明書中，“分泌信號肽”是指具有使在菌體內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分泌到菌體外的功能、且存在于蛋白質(zhì)末端的肽序列。作為能夠使用的分泌信號肽，不限定于此，例如可列舉出青春雙歧桿菌的amyB ;短雙歧桿菌的Seel、Sec2、Sec3 ;通過序列號I~22中記載的DNA序列所編碼的肽等。
[0047]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體例如可以如下操作來制作。
例如，按照通常的方法，通過在具有對遺傳轉(zhuǎn)化菌和遺傳轉(zhuǎn)化菌以外的菌、例如雙歧桿菌和大腸桿菌分別起作用的復(fù)制起始位點的穿梭質(zhì)粒中插入至少I種用于編碼對期望的缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)的基因，能夠制作穿梭質(zhì)粒。
[0048]而且，可以根據(jù)期望通過從該穿梭質(zhì)粒中去除遺傳轉(zhuǎn)化菌以外的菌的復(fù)制起始位點，從而制作非穿梭質(zhì)粒。
進而，根據(jù)期望，將啟動子基因用至少對雙歧桿菌起作用的分泌信號及其啟動子基因代替，將終止子基因用對前述雙歧桿菌起作用的分泌信號肽的終止子基因代替，從而能夠制作還包含用于編碼分泌信號肽的基因序列的質(zhì)粒。
[0049]需要說明的是，上述各工序中的操作可以基于基因工學(xué)領(lǐng)域的公知方法來進行。 而且，使用上述遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，按照基因工學(xué)領(lǐng)域的公知方法對要進行遺傳轉(zhuǎn)化的
任意厭氧性菌進行遺傳轉(zhuǎn)化，從而制作。
[0050]本發(fā)明還涉及包含上述基因轉(zhuǎn)運載體的缺血性疾病用藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物在含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體的范圍內(nèi)，就沒有特別限定。關(guān)于本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體，可以包含至少I種，也可以包含2種以上。進而，本發(fā)明的藥物組合物可以與包含本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體以外的顯示缺血性疾病治療效果的化合物的藥物組合物、缺血性疾病治療劑組合使用。
[0051 ] 另外，本發(fā)明的藥物組合物在不妨礙本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，除了本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體之外，還可以含有任意的成分。作為這樣的任意成分，例如可列舉出藥理學(xué)上可允許的載體、賦形劑、稀釋劑等。
本發(fā)明的藥物組合物的劑型沒有特別限定，例如可列舉出含有本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體的 液體制劑或固體制劑。液體制劑可以如下制造:將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體的厭氧性菌的培養(yǎng)液提純，根據(jù)需要向其中添加適當(dāng)?shù)纳睇}水或輔助液或醫(yī)藥添加物，并填充到安剖或小瓶等中，從而制造。另外，固體制劑可以如下制造:向液體制劑中添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑，在填充到安剖或小瓶等中后，進行冷凍干燥或L干燥，或者向液劑中添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑再進行冷凍干燥或L干燥，然后將其填充到安剖或小瓶等中，從而制造。
[0052]作為本發(fā)明的藥物組合物的給藥方法，口服給藥、非口服給藥均可，優(yōu)選為非口服給藥，例如可以進行靜脈注射、皮下注射、局部注入、腦室內(nèi)給藥等，最優(yōu)選為靜脈注射、即全身給藥。
本發(fā)明的藥物組合物的基因轉(zhuǎn)運載體的給藥量只要是能夠在疾病部位生長、且對于表達有效治療量的活性蛋白質(zhì)而言充分的量，就沒有特別限定，從經(jīng)濟方面的觀點和盡可能避免副作用的觀點出發(fā)，優(yōu)選的是，在能夠獲得所需的治療效果的范圍內(nèi)盡可能少。
[0053]本發(fā)明的藥物組合物中的基因轉(zhuǎn)運載體的給藥量根據(jù)疾病程度、患者的體重、年齡、性別進行適當(dāng)選擇，可以按照改善程度進行適當(dāng)增減。
例如，在使用本 發(fā)明的藥物組合物時，根據(jù)要使用的厭氧性菌的菌自身所顯示的疾病治療活性、要使用的厭氧性菌所產(chǎn)生的具有疾病治療活性的蛋白質(zhì)等的種類、以及要使用的厭氧性菌的該活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量等進行適當(dāng)設(shè)定。
[0054]具體而言，在例如靜脈內(nèi)給藥的情況下，尤其是要求降低由菌塊導(dǎo)致的塞栓等風(fēng)險，因此，優(yōu)選的是，盡可能將低濃度的注射用制劑分多次進行分注，或者用適當(dāng)?shù)妮o助液稀釋后持續(xù)注入。例如，在成人的情況下，將本發(fā)明的厭氧性菌的菌體以平均Ikg體重為IO6~IO12Cfu的量、I日I次~分多次連續(xù)或隔開適當(dāng)間隔地給藥I日~多日。更具體而言，將包含IO4~101(lCfu/mL本發(fā)明的雙歧桿菌菌體的制劑以每I個成人為I~1000mL的量直接或用適當(dāng)輔助液稀釋后、I日I次~分多次連續(xù)給藥I日~數(shù)日。
[0055]另外，在直接向疾病組織給藥的局部給藥的情況下，由于要求菌盡可能在疾病組織整體生長、增殖，因此期望將高濃度的注射劑給藥至疾病組織的多個場所。例如，在成人的情況下，將本發(fā)明的雙歧桿菌的菌體以平均Ikg體重為IO6~IO12Cfu的量、I日I次~多次根據(jù)需要連續(xù)或隔開適當(dāng)間隔地給藥I日~多日。更具體而言，將包含IO4~101(lCfU/mL本發(fā)明的雙歧桿菌菌體的制劑以每I個成人為I~1000mL的量、I日多次根據(jù)需要直接連續(xù)給藥I日~多日。
[0056]在治療期間中確認(rèn)到疾病組織中的菌已經(jīng)消失的情況下，暫時中斷治療，與上述同樣操作來給藥菌。
需要說明的是，本發(fā)明中的“X與Y組合而成”包括以下任意情況:x與Y為不同形態(tài)、X與Y為相同形態(tài)(例如含有X和Y的形態(tài))。另外，在X與Y為不同形態(tài)的情況下，還包括X、Y均含有其它成分的情況。
[0057]本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體在缺血性疾病部位特異性地生長、增殖，在非厭氧環(huán)境下的正常組織中不會增殖。因此，即使不是瞄準(zhǔn)缺血性疾病部位的局部給藥，也會向疾病部位特異性地轉(zhuǎn)運基因。因此，從給藥的簡便性、侵襲性低等觀點出發(fā)，優(yōu)選將本發(fā)明的藥物組合物進行全身給藥。
[0058]本發(fā)明的一個側(cè)面包含使用上述由厭氧性菌形成的基因轉(zhuǎn)運載體來診斷或處置缺血性疾病的方法。通過使用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體，能夠進行高效且高安全性的診斷或治療。
在本發(fā)明的方法中，向具有缺血性疾病的對象給藥本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體。作為給藥方法，口服給藥、非口服給藥均可，優(yōu)選為非口服給藥，例如可以進行靜脈注射、皮下注射、局部注入、腦室內(nèi)給藥等，最優(yōu)選為靜脈注射、即全身給藥。[0059]因此，在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選方式中，全身給藥本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體能夠?qū)⒒蛱禺愋缘剞D(zhuǎn)運至缺血性疾病部位，因此即使在不使用導(dǎo)管、肌肉內(nèi)注射等而進行靜脈注射等全身給藥的情況下，也能夠在缺血性疾病部位生長、增殖而發(fā)揮效果。因此，與現(xiàn)有的治療方法相比能夠進行侵襲性非常低的治療。
[實施例]
[0060]以下，通過參考例和實施例來更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限定于這些例示。 [0061]例1:小鼠下肢缺血 模型實驗
為了驗證本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體向缺血性疾病部位的特異性轉(zhuǎn)運，制作下肢缺血的小鼠模型，給藥本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體并進行了研究。
(I)模型制作
實驗動物使用8-9周齡、雄性C57BL/6小鼠(從CharlesRiverLaboratoriesJapan, Inc.獲取)，按照以下步驟制作下肢缺血模型(ischemicmodel)小鼠。麻醉是向腹腔內(nèi)注射3.6%水合氯醒(從NacalaiTesque, Inc.獲取)0.3ml。從腹部去除下腿的毛后，將總股動脈至國動脈用7-0丙綸絲進行結(jié)扎，切除股動脈。創(chuàng)口內(nèi)用生理鹽水清洗后，將創(chuàng)口用5-0尼龍線進行縫合。
[0062](2)基于激光多普勒血流量計的血流測定
將小鼠麻醉后，使用激光多普勒血流量計(MoorInstruments制)，在(3)的下肢肌肉摘出前進行血流測定。在兩側(cè)對下腿部至指間的血流進行定量，用患側(cè)/健康側(cè)比進行表示。血流測定在模型剛制作前、剛制作后、1、2、3、4、5、7、10、14、21、28日后進行。
[0063]將結(jié)果示于圖1和2。在所述下肢缺血模型中，患肢的血流量為術(shù)后健康肢的2成以下，但術(shù)后I周時恢復(fù)至4成左右，在術(shù)后4周時恢復(fù)至6成左右(圖1)。在(3)中，對給藥B.1ongum菌的組和未給藥B.1ongum菌的組比較血流變化。已知:在給藥組和非給藥組中，未觀測到術(shù)后的血流變化的舉動存在顯著差異(圖2)，B.1ongum菌的存在不影響缺血狀態(tài)。
[0064](3) B.1ongum菌的給藥和檢測
將用pBLESlOO質(zhì)粒進行遺傳轉(zhuǎn)化而制成大觀霉素耐性菌的B.1ongum菌用MRS培養(yǎng)基(從關(guān)東化學(xué)株式會社獲取)繼代培養(yǎng)2次。使用生理鹽水將繼代培養(yǎng)2次的培養(yǎng)液離心清洗，用生理鹽水進行懸濁并使用。作為局部給藥模型，在下肢缺血模型剛制作后向缺血肢和健康肢分別以I X 109cfu/ml X0.1ml X 2處的方式肌肉內(nèi)注射給藥上述B.Longum菌。作為全身給藥模型，向尾靜脈以lX109cfu/ml的濃度給藥0.2mlB.1ongum菌。在給藥了菌開始1、2、3、4、5、7、10、14日后，分別摘出各給藥模型的左右下肢肌肉(各n = 5)。對各組織進行均質(zhì)化后，涂布在BL板上，在37°C、厭氧條件下培養(yǎng)3日。培養(yǎng)后測定各板的菌落數(shù)，求出缺血肢和健康肢的菌數(shù)。
[0065]將結(jié)果示于圖3~圖6。在局部給藥的情況下，在術(shù)后經(jīng)過24小時的時刻，確認(rèn)到與健康肢相比患肢中聚集更多的菌。健康肢中，隨著之后的時間經(jīng)過，可觀察到菌數(shù)的減少，在術(shù)后經(jīng)過168小時的時刻，基本上未觀察到菌。與此相對，患肢中，即使在術(shù)后經(jīng)過168小時的蝕刻也觀察到大量菌。關(guān)于術(shù)后經(jīng)過168小時的時刻的平均Ig肌肉組織的菌數(shù)，健康肢為4.8 X IO2個，與此相對，患肢為4.1 X IO6個，可觀察到顯著差異(P = 0.039、n=3)(圖 3 和 4)。
[0066]同樣的結(jié)果在全身給藥的情況下可觀察到。即，健康肢中，在術(shù)后經(jīng)過24小時的時刻觀察到約0.6 X IO3個的菌，但在術(shù)后經(jīng)過48小時的時刻變成約0.1 X IO3個，在術(shù)后經(jīng)過72小時的時刻未觀察到菌。與此相對，患肢中，在術(shù)后24小時觀察到約3.5 X IO5個的菌，隨著時間的經(jīng)過，該數(shù)量增加，在術(shù)后經(jīng)過4日的時刻最大、觀察到約2.7X IO6個的菌。其后，隨著血流的恢復(fù)，菌數(shù)減少，在術(shù)后10日的時刻未觀察到菌(圖5和6)。與局部給藥的情況相比，可知全身給藥時菌的生長花費若干時間，但即使向靜脈給藥，也會在缺血性疾病部位特異性地生長。菌數(shù)在血流比達到最低的第4日顯示最高值，其后隨著血流比的改善，菌數(shù)降低，因此暗示了 B.1ongum菌可能根據(jù)缺血的程度而生長。
[0067](4)組織學(xué)的分析
與⑶同樣地向小鼠給藥B.1ongum菌后,在96小時后摘出下肢肌肉。將下肢肌肉浸潰在20%中性緩沖福爾馬林中48小時，將組織固定。其后，用石蠟包埋，制成蠟塊。將蠟塊切成3μm的厚度，承載于載玻片，以44°C風(fēng)干24小時，制成石蠟組織切片載玻片。在脫石蠟后進行革蘭氏染色。革蘭氏染色使用了革蘭氏染色液neo-B&MWako (和光純藥工業(yè)株式會社)。染色后，用光學(xué)顯微鏡進行了觀察。
[0068]將結(jié)果示于圖6。在健康肢中未檢出被革蘭氏染色的菌，而在患肢中觀察到被革蘭氏染色的細(xì)菌，可確認(rèn)所給藥的B.1ongum菌已經(jīng)生長。
[0069]例2:小鼠下肢壞死模型實驗 (I)模型制作
例I中暗示了隨著血流的恢復(fù)，B.1ongum菌的生長數(shù)量減少,但為了對其進行確認(rèn),制作了更重度的缺血狀態(tài)的模型即下肢壞死模型(necrotic model)小鼠。實驗動物使用6_7周齡、雄性 BALB/c 小鼠(從 CharlesRiver LaboratoriesJapan, Inc.獲取)。麻醉是向腹腔內(nèi)注射3.6%水合氯醒(Nacalai Tesque, Inc.)0.3ml。從腹部去除下腿的毛后,將總股動脈至淺股動脈用7-0丙綸絲進行結(jié)扎，切除股動脈。創(chuàng)口內(nèi)用生理鹽水清洗后，將創(chuàng)口用5-0尼龍線進行縫合。
[0070](2)基于激光多普勒血流量計的血流測定
與例I同樣地測定血流。將結(jié)果示于圖8。necroticmodel與ischemicmodel相比,可知:血流恢復(fù)的時刻慢，最終血流量與健康肢相比也為約30%左右，與血流恢復(fù)至約60%左右的ischemicmodel相比，恢復(fù)的程度也低至一半左右。
[0071 ] (3) B.1ongum菌的給藥和檢測
與例I同樣地全身給藥B.1ongum菌,檢查健康肢和患肢肌肉組織。將結(jié)果示于圖9和10?？芍猲ecroticmodel中，與ischemicmodel相比B.1ongum菌在患肢中存在更長時間。而且，與ischemicmodel同樣地隨著血流的恢復(fù),菌數(shù)減少,在血流恢復(fù)至某種程度的時刻，無法觀察到菌。由以上結(jié)果可知，無論在何種程度的期間內(nèi)，B.1ongum菌均在缺血狀態(tài)持續(xù)時在患肢中生長、增殖，隨著血流的恢復(fù)(即從缺血狀態(tài)恢復(fù))，菌數(shù)開始減少。因此，B.1ongum菌具有如下性質(zhì):其被特異性地轉(zhuǎn)運至處于缺血狀態(tài)的組織，表達所導(dǎo)入的基因，隨著缺血狀態(tài)的恢復(fù)而消失，可期待其在缺血性疾病的診斷和治療中發(fā)揮優(yōu)異的效果O
[0072]例3:安全件試齡對上述的下肢缺血模型(ischemicmodel)小鼠和下肢壞死模型(necrotic model)小鼠兩者進行安全性試驗。在給藥了菌開始2、3、4、6、7日后，摘出各給藥模型的腎臟、肝臟、脾臟、心臟(各η = 3)。另外，除了這些臟器之外，還摘除ischemicmodel的肺、necroticmode I的血液。對各組織進行均質(zhì)化后,涂布在BL板上,在37°C、厭氧條件下培養(yǎng)3日。培養(yǎng)后測定各板的菌落數(shù)，求出各組織的菌數(shù)。
[0073]將結(jié)果示于圖11和12。ischemicmodel中，在全身給藥168小時后，在除了患肢以外的任意臟器中均未觀察到B.1ongum菌。即使在necroticmodel中，截止至全身給藥3日后在全身的各臟器中還會觀察到B.1ongum菌，在6日后在除了脾臟以外的臟器未觀察到菌。另外，將給藥組與非給藥組進行比較，未發(fā)現(xiàn)下肢潰瘍形成率和膿腫形成率存在顯著差異，也未從膿腫中明顯地分離出B.1ongum菌。由以上的結(jié)果可知,B.1ongum菌在健康的臟器中迅速消失，另外也沒有缺血狀態(tài)本身或并發(fā)癥的惡化等對疾病造成不良影響。
[0074]例4:小型豬心肌梗寒模型試驗
作為其它代表性的缺血性疾病，可列舉出心肌梗塞等缺血性心疾病，近年來針對缺血性心疾病也嘗試了血管新生治療、尤其是基于基因?qū)氲难苄律委?。然而，缺血性心疾病的治療中也可列舉出與其它缺血性疾病中的問題點相同的問題點。尤其是在缺血性心疾病中，作為局部給藥法，使用了冠動脈導(dǎo)管的動脈注射、使用了冠動脈導(dǎo)管的局部注射、開胸下心肌內(nèi)注射等侵襲性非常高的方法是必須的，盡管可以認(rèn)為血管新生療法特別適合于無法適用經(jīng)皮冠動脈介 入治療(PCI)、冠動脈旁路移植術(shù)(CABG)等其它治療方法的對象，但在現(xiàn)在，主要還是與其它治療方法并用。
[0075]因而，為了確認(rèn)本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體在心肌梗塞中也有效地發(fā)揮作用，進行以下的實驗。
(I)模型制作
實驗動物使用雄性哥廷根系小型豬(15kg)(從中外醫(yī)科學(xué)研究所獲取)。肌肉注射Ketaral (從三共株式會社獲取)15mg/kg和硫酸阿托品(從田邊制藥株式會社獲取)(25mg)后，通過吸入麻醉即FL0-THENE(從武田藥品工業(yè)株式會社獲取)(2%~5% )維持麻醉狀態(tài)。開胸后，將左冠狀動脈前降枝用3-0絲線進行結(jié)扎。手術(shù)中給藥2%利多卡因(從AstraZeneca公司獲取)(Iml~2ml)。閉胸前用Lactec (從大冢制藥株式會社獲取UOOml清洗心包內(nèi)。
[0076](2)組織學(xué)的分析
為了確認(rèn)心肌梗塞，進行了三苯基四唑化氯(TTC)染色、蘇木精/伊紅(HE)染色以及三色膠原(MT)染色。關(guān)于TTC染色，將在制作心肌梗塞模型7日后摘出的心臟切成5mm的厚度，在I % TTC液(從SIGMA公司獲取)中以37°C孵育5分鐘。其后，用肉眼觀察。
關(guān)于蘇木精/伊紅(HE)染色，在脫石蠟后，用蘇木精染色30秒~I分鐘，用流水清洗10分鐘,然后用0.5%曙紅溶液染色30秒。染色后,進行脫水、清除(clearing)以及封入，用光學(xué)顯微鏡進行觀察。
[0077]關(guān)于三色膠原(MT)染色，在將各切片進行布安固定后，進行10分鐘的流水水洗。水洗后，在10%重鉻酸鉀10%三氯乙酸等量混合液中浸潰10分鐘，然后在鐵蘇木精染色液中浸潰5分鐘，進行5分鐘的流水水洗。水洗后，在麗春紅酸性品紅偶氮焰紅液中浸潰I分鐘后，在2.5%磷鎢酸溶液中浸潰10分鐘。將切片在2%橙黃G液中浸潰5分鐘后，用1%乙酸水溶液進行清洗，用Light Greensolution染色3分鐘后,用I %乙酸水溶液進行清洗。脫水、清除、封入用與HE染色同樣的過程進行。
[0078]將結(jié)果示于圖14。在TTC染色中，在左室前壁和心室中隔的前壁發(fā)現(xiàn)穿壁性的梗塞部位。另外，用MT和HE染色發(fā)現(xiàn)同部位的心肌細(xì)胞的脫落和膠原纖維的增生，確認(rèn)到心肌梗塞已完成。
[0079](3) B.1ongum菌的給藥和檢測
與例I同樣地制備B.1ongum菌,在心肌梗塞模型剛制作后以lX109cfu/ml的濃度每隔Icm地等間隔向健康部位和梗塞部位心肌內(nèi)給藥0.1mlB.1ongum菌(參照圖13)。在給藥了菌開始4日和7日后(各η = 2)，摘出心臟，分為梗塞部位和健康部位，進行均質(zhì)化后，涂布在BL板上，在37°C、厭氧條件下培養(yǎng)3日。培養(yǎng)后測定各板的菌落數(shù)，求出梗塞部位和健康部位的菌數(shù)。
[0080]與例I同樣地制備B.1ongum菌，在心肌梗塞模型剛制作后以IX 109cfu/ml的濃度每隔Icm地等間隔向健康部位和梗塞部位心肌內(nèi)給藥0.1mlB.1ongum菌(參照圖13)。在給藥了菌開始4日和7日后(各η = 2)，摘出心臟，分為梗塞部位和健康部位，進行均質(zhì)化后，涂布在BL板上，在37°C、厭氧條件下培養(yǎng)3日。培養(yǎng)后測定各板的菌落數(shù)，求出梗塞部位和健康部位的菌數(shù)。
[0081]例 5:hFGF2 分泌 Bifidobacterium 的構(gòu)筑
(I)表達質(zhì)粒載體P37的構(gòu)筑
以質(zhì)粒pCDshuttle (國際申請第2009/128272號)作為模型，使用CDvecF3引物(序列號23)和pUCoriR5引物(序列號24)進行PCR，將PCR產(chǎn)物作為載體。將Bifidobacteriumlonguml05A的基因組DNA作為模型,將用Pins37F引物(序列號25)和Pins37R引物(序列號26)進行增幅而成的PCR產(chǎn)物作為插入物。PCR按照常規(guī)方法實施。
[0082]使用In-FusionHDCloningKit 和 CloningEnhancer(TAKARABIC), Inc.)連接上述載體和插入物(以下記為in-fusion反應(yīng))，使用反應(yīng)液的一部分,對大腸桿菌TOPlOchemicallycompetentcell (LifeTechnologiesJapanLtd.)進行遺傳轉(zhuǎn)化。詳細(xì)按照制品說明書進行。將遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌涂布在LB (含有75 μ g/mL大觀霉素)瓊脂培養(yǎng)基上，以37 °C靜置培養(yǎng)一晚。
拾取在上述板上充分分離的菌落，用LB (含有75 μ g/mL大觀霉素)液體培養(yǎng)基以37°C振蕩培養(yǎng)一晚后，使用QIApr印SpinMinipr印Kit (QIAGEN公司)從其中提取質(zhì)粒DNA。針對該質(zhì)粒DNA的全長進行序列分析，確認(rèn)了序列。將完成的質(zhì)粒名記作p37(序列號39)。
[0083](2)hFGF2表達質(zhì)粒(非分泌型)的構(gòu)筑
人FGF2表達(非分泌型)質(zhì)粒pFGF-P37的構(gòu)筑概要示于圖16。如下所示地制備載體。即，將質(zhì)粒P37作為模型，使用FGFl引物(序列號27)和FGF7引物(序列號28)進行PCR，對包含P37啟動子(序列號29)、Hu終止子、pTB6復(fù)制子(雙歧桿菌中的質(zhì)粒復(fù)制子)、AAD9cassette (大觀霉素耐性基因表達單元)、pUCori部分(大腸桿菌中的質(zhì)粒復(fù)制起點)的約3.Skbp的DNA進行增幅，將其作為載體。對引物進行設(shè)計，以使載體的末端15bp與以下示出的插入物末端15bp成為相同序列。DNA的增幅使用PrimeSTARHS (Premix)(TAKARABIO, Inc.)，PCR條件基于該酶的制品說明書。
[0084] 如下那樣地制備插入物。即，基于hFGF2 (從GenBankAccessionN0.#NM_002006的AUG開始翻譯的約18kDa的蛋白質(zhì))的氨基酸序列，對密碼子最適合雙歧桿菌用的DNA進行人工合成(委托GenScript公司)。此時，對DNA進行設(shè)計，以使hFGF2編碼蛋白質(zhì)的C末端融合組氨酸標(biāo)簽(序列號30)。將該合成DNA作為模型，用FGF3引物(序列號31)和FGF4引物(序列號32)與上述同樣地進行PCR增幅，將約0.5kbp的DNA增幅產(chǎn)物作為插入物。
[0085]通過In-fusion反應(yīng)連接上述載體和插入物。詳細(xì)按照制品說明書進行。將In-fusion反應(yīng)液用0.1 X TE適當(dāng) 稀釋，使用其中的2 μ L,對大腸桿菌TOPlOchemicalIycompetentcell (LifeTechnologiesJapanLtd.)進行遺傳轉(zhuǎn)化。詳細(xì)按照制品說明書進行。將遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌涂布在LB (含有75 μ g/mL大觀霉素)瓊脂培養(yǎng)基上，以37 °C靜置培養(yǎng)一晚。
[0086]拾取在上述板上充分分離的菌落，用LB (含有75 μ g/mL大觀霉素)液體培養(yǎng)基以37°C振蕩培養(yǎng)一晚后，使用QIApr印SpinMinipr印Kit (QIAGEN公司)從其中提取質(zhì)粒DNA。使用質(zhì)粒DNA的一部分來確認(rèn)hFGF2表達單元的DNA序列。序列反應(yīng)使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit (Life TechnologiesJapanLtd.),詳細(xì)按照制品說明書進行。序列反應(yīng)液的電泳委托信州大學(xué)人環(huán)境科學(xué)研究支援中心器械分析部門。數(shù)據(jù)分析使用了Genetyx Ver.10。將完成的質(zhì)粒名記作pFGF_P37 (序列號33)。
[0087](3)分泌型hFGF2表達質(zhì)粒的構(gòu)筑
人FGF2表達(分泌型)質(zhì)粒pFGF12a的構(gòu)筑概要示于圖16。將上述質(zhì)粒pFGF_P37作為模型，使用FGF35引物(序列號34)和FGF26引物(序列號35)進行PCR，將約4.2kbp的DNA增幅產(chǎn)物作為載體。
另外，將長雙歧桿菌105A株的基因組DNA作為模型，用FGF45引物(序列號36)和FGF17引物(序列號37)進行PCR，將約0.2kbp的DNA增幅產(chǎn)物作為插入物。插入物包含分泌信號，B.breveUCC2003 的 Sec2 (參照 Shkoporov ANet.al., BiotechnolLett (2008) 30:1983-1988)的N末端序列保存良好。載體和插入物的增幅使用PrimeSTARHS(Premix)(TAKARABIO, Inc.)，PCR條件基于該酶的制品說明書。
[0088]如上述的FGF表達質(zhì)粒(非分泌型)的構(gòu)筑時同樣地用In-fusion反應(yīng)連接上述載體和插入物，對大腸桿菌TOPlO進行遺傳轉(zhuǎn)化，確認(rèn)質(zhì)粒的hFGF2表達單元部分的DNA序列，將完成的質(zhì)粒名記作pFGF12a(序列號38)。hFGF2表達單元部分的構(gòu)成如下所示。
?P37啟動子:序列號38的堿基序號14~275、
?hFGF2編碼區(qū)域的構(gòu)成:序列號38的喊基序號276~902 ?信號序列:序列號38的堿基序號276~419
?hFGF2序列:序列號38的喊基序號420~881
?組氨酸標(biāo)簽序列:序列號38的堿基序號882~899 ?結(jié)束密碼子:序列號38的堿基序號900~902
?Hu終止子:序列號38的喊基序號903~1016
[0089]另外，將該單元所編碼的氨基酸序列示作序列號40，進而其構(gòu)成如下所示。
?hFGF2編碼區(qū)域的構(gòu)成:序列號40的氨基酸番號I~208
?信號序列:序列號40的氨基酸番號I~48 (其中,氨基酸番號I~37為推測信號肽區(qū)域，氨基酸番號38~48為推測間隔物區(qū)域，氨基酸番號37與38之間為推定切斷部位)?hFGF2序列:序列號40的氨基酸番號49~202 ?組氨酸標(biāo)簽序列:序列號40的氨基酸番號203~208
[0090](4)重組雙歧桿菌的制作
按照 Rossietal., LettersinAppliedMicrobiology (1997) 24:33-36 中記載的方法制作長雙歧桿菌105A株和短雙歧桿菌JCMl 192株的感受態(tài)細(xì)胞。即，用PBS緩沖液清洗利用MR培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)增殖期初期的上述雙歧桿菌后，用KMR緩沖液進行懸濁，用液態(tài)氮急速冷凍后作為感受態(tài)細(xì)胞。將感受態(tài)細(xì)胞在冰上融解后，混合上述質(zhì)粒pFGF12a或pBEshuttle(國際公開第2011/093465號中記載的mock載體、無FGF表達)，使用GenePulserII (Bio-Rad Laboratories, Inc.)進行電穿孔。電穿孔使用0.2cm裂縫的比色皿，在2kV、25 μ F、200 Ω的條件進行。將遺傳轉(zhuǎn)化后的雙歧桿菌涂布在IMR (含有75 μ g/mL大觀霉素)瓊脂培養(yǎng)基，以37°C進行2日的厭氧培養(yǎng)。拾取在瓊脂培養(yǎng)基上形成并充分分離的菌落，取得重組雙歧桿菌。
[0091](5)蛋白質(zhì)表達分析(Western印跡)
作為雙歧桿菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基，向MRS培養(yǎng)基(oxide) IOmL中添加包含350mg/mL的抗壞血酸和20mg/mL的L-半胱氨酸的維生素C/半胱氨酸溶液200 μ L和75mg/mL大觀霉素溶液10 μ Lo對該制備培養(yǎng)基栽種上述重組雙歧桿菌B.longuml05A/pFGF12a和B.longuml05A/pBEshuttle,以37°C進行24小時的厭氧培養(yǎng)(活化培養(yǎng)液)。將活化培養(yǎng)液栽種于向上述制備培養(yǎng)基中以達到166mM的方式進一步添加磷酸鈉緩沖液而成的培養(yǎng)基，以37°C進行18小時的厭氧培養(yǎng)。
[0092]與上述同樣地還實施了短雙歧桿菌JCMl 192/pFGF12a和短雙歧桿菌JCMl 192/pBEshuttle的培養(yǎng)。其中，未使用MRS培養(yǎng)基，使用了 RCM培養(yǎng)基。未添加維生素C/半胱氨酸溶液。
按照常規(guī)方法對上述重組雙歧桿菌培養(yǎng)液上清進行三氯乙酸(TCA)沉淀，用I XSDS樣品緩沖液進行再溶解。將其以95°C進行3分鐘加熱處理，供于Western分析。
[0093]使用Min1-PROTEANTGXgel (4 ~20 %、Bio-Rad 公司)，用 I X SDS 緩沖液對上述試樣進行電泳。電泳裝置使用了 MiniPROTEANTetraSystem(Bio-Rad公司)。使用iBlotGelTransferDevice將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印到iBlotTransfer Stacks。將轉(zhuǎn)印后的膜用TTBS進行約5分、3次的清洗后，用2%封閉液(Block Ace)進行封閉。作為一次抗體，添加 AntiFGF_2humanrabbitpoly (H-131、SantaCruzBiotechno logy Inc.),以 4 °C振蕩一晚。在一次抗體反應(yīng)后，用TTBS將膜清洗約5分，反復(fù)清洗6次，添加二次抗體Goatant1-rabbitIgGHRP(Santa CruzBiotechnologyInc.),在室溫下振蕩 3.5 小時。用TTBS 將膜清洗約 5 分，反復(fù)清洗 6 次后，用 ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKit (GEHealthcare制)內(nèi)的發(fā)光試劑使其發(fā)光。將其用成像儀(Fluor_SMAX、Bio-Rad公司)進行檢測(圖17和圖18)。
[0094](6)蛋白質(zhì)表達分析(ELISA)
直至TCA沉淀工序之前用與上述相同的方法制備培養(yǎng)上清，用human FGF2ELISA試劑盒(Quantikine (R) ELISAHumanFGFbasicImmunoassay、R&Dsy stems > 目錄編號:DFB50)對hFGF2量進行定量。
關(guān)于培養(yǎng)上清中的hFGF2量，B.longuml05A/pFGF12a為33，058pg/mL、陰性對照的B.longuml05A/pBEshuttle 為 Opg/mL。短雙歧桿菌 JCM1192/pFGF12a 為 11，429pg/mL、陰性對照的短雙歧桿菌JCM1192/pBEshuttle為Opg/mL。
[0095]例6:基于小鼠下肢缺血模型的體內(nèi)治療效果驗證
為了驗證本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體在缺血性疾病部位的治療效果，制作下肢缺血的小鼠模型，給藥了人FGF2分泌雙歧桿菌，進行了研究。
(I)模型制作
實驗動物使用6-8周齡、雄性Balb/c小鼠(從CharlesRiverLaboratoriesJapan, Inc.獲取)，按照以下步驟制作下肢缺血模型(ischemicmodel)小鼠。麻醉是向腹腔內(nèi)注射3.6%水合氯醒(從NacalaiTesque, Inc.獲取)0.3ml。從腹部去除下腿的毛后，將總股動脈、深股動脈、淺股動脈用8-0丙綸絲結(jié)扎，部分切除淺股動脈。創(chuàng)口內(nèi)用生理鹽水清洗后，將創(chuàng)口用5-0尼龍線進行縫合。 [0096](2)基于激光多普勒血流量計的血流測定
將小鼠麻醉后，使用激光多普勒血流量計(MoorInstruments制)，進行血流測定。在兩側(cè)對下腿部至指間的血流進行定量，用患側(cè)/健康側(cè)比進行表示。血流測定在模型剛制作后、3~4、6以及8日后進行。
[0097](3)基因重組B.1ongum菌的給藥
作為人FGF2分泌雙歧桿菌和對照，將非分泌雙歧桿菌用MRS培養(yǎng)基(從關(guān)東化學(xué)株式會社獲取)繼代培養(yǎng)2次。使用生理鹽水將繼代培養(yǎng)2次的培養(yǎng)液進行離心清洗，用生理鹽水進行懸濁并使用。在模型制作翌日，向眼窩靜脈叢以lX109cfu/ml的濃度給藥0.2ml菌，如上述(2)那樣測定下肢血流。
[0098]將結(jié)果示于圖19和20。圖19示出人FGF2分泌B.1ongum菌的血流改善效果，圖20示出人FGF2分泌B.breve菌的血流改善效果。在人FGF2分泌B.1ongum菌中，第6日以后與PBS相比顯示顯著的血流改善效果。(longumFGF12avsPBS ;在第6日，0.41±0.Ilvs0.14±0.02 ;在第 8 日，0.55±0.Ilvs0.32±0.08)。另外，人 FGF2分泌B.breve菌在第8日顯示顯著的血流改善效果。(breveFGF12avsbreve對照、0.67±0.1lvs0.38±0.02)。需要說明的是，在任意組中，F(xiàn)GF非分泌菌給藥組(對照)與PBS給藥組之間均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0099]通過本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)運載體，能夠提供在缺血性疾病部位特異性地生長、增殖，隨著疾病狀態(tài)的改善而消失的基因轉(zhuǎn)運載體。因此，與以往的方法相比，能夠低侵襲且簡便地進行血管新生療法。另外，由于基因轉(zhuǎn)運載體本身由細(xì)菌形成，因此基因向目標(biāo)部位導(dǎo)入的效率等不會成為問題，與以往相比能夠進行效率非常高的處置。由此，對于老年人等、本來血管新生療法是有效的但由于侵襲性高或全身性副作用成為障害從而無法處置的對象等而言也能夠有效地處置。
【權(quán)利要求】
1.一種基因轉(zhuǎn)運載體，其是由能夠在缺血性疾病部位特異性地生長、且能夠表達至少I種對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)的厭氧性菌形成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，厭氧性菌是用遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進行遺傳轉(zhuǎn)化而成的，該質(zhì)粒包含用于編碼對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，缺血性疾病為慢性缺血性疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，厭氧性菌是非病原性的腸道細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，厭氧性菌為雙歧桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，雙歧桿菌是選自由青春雙歧桿菌、角雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、牛雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、小豬雙歧桿菌、棒狀雙歧桿菌、兔雙歧桿菌、寓齒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、高盧雙歧桿菌、雞雙歧桿菌、球雙歧桿菌、蜜蜂雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、殊形雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、Bifidobacteriumlactentis、自由雙歧桿菌、長雙歧桿菌、大雙歧桿菌、反會動物雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、Bifidobacteriummongoliens、微小粒雙歧桿菌、假鏈狀雙歧桿菌、偽長雙歧桿菌、嗜冷雙岐桿菌、雛雙歧桿菌、棲瘤胃雙歧桿菌、反芻雙歧桿菌、世紀(jì)雙歧桿菌、Bifidobacteriumscardov1、細(xì)長雙歧桿菌、豬雙歧桿菌、嗜酸熱雙歧桿菌、以及嗜熱雙歧桿菌組成的組中的I種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，雙歧桿菌為長雙歧桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，對缺血性疾病的診斷是有用的蛋白質(zhì)為突光蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，對缺血性疾病的治療是有用的蛋白質(zhì)為選自由成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)血管生長因子(AGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFi3)、血管生成素、肝配蛋白等具有血管新生促進活性的蛋白質(zhì)；前列腺素類等與血管擴張有關(guān)的因子；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等集落刺激因子；神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3等神經(jīng)營養(yǎng)蛋白；胰島素樣生長因子(IGF)組成的組中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求2~9中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為非穿梭質(zhì)粒。
11.根據(jù)權(quán)利要求2~10中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒還包含用于編碼分泌信號肽的基因序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求2~11中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒包含pTB6rep 單兀。
13.根據(jù)權(quán)利要求2~12中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒具有表達盒，所述表達盒包含用于編碼P37啟動子、HU終止子以及FGF2的基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求2~13中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒包含用于編碼具有序列號40中記載的序列的多肽的DNA序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求2~14中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體，其中，遺傳轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pFGF12a(序列號 38)。
16.一種缺血性疾病用藥物組合物，其包含權(quán)利要求1~15中任一項所述的基因轉(zhuǎn)運載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的缺血性疾病用藥物組合物，其通過全身給藥進行給藥。
18.—種診斷或處置缺血性疾病的方法，其包括給藥厭氧性菌，所述厭氧性菌能夠在缺血性疾病部位特異性地生長、且能夠表達至少I種對缺血性疾病的診斷或治療是有用的蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要 求18所述的方法，其中，給藥為全身給藥。
【文檔編號】A61P9/10GK103958680SQ201280034792
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月13日
【發(fā)明者】和田有子, 嶋谷裕子, 清水瞳, 佐佐木貴之 申請人:阿內(nèi)羅藥物科學(xué)株式會社