使用甲氨蝶呤誘導(dǎo)免疫耐受性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了通過使用甲氨蝶呤治療在患者中降低不想要的免疫應(yīng)答，諸如抗藥物抗體(ADA)應(yīng)答和其它T和/或B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。
【專利說明】使用甲氨蝶呤誘導(dǎo)免疫耐受性
[0001]對其它申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年5月16日提交的美國臨時申請N0.61/486，697的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過提及完整收入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明一般涉及免疫學(xué)，且更具體地，涉及甲氨蝶呤降低患者中不想要的免疫應(yīng)答的用途。
[0004]發(fā)明背景 [0005]目前，美國食品和藥品管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)超過130種蛋白質(zhì)治療劑用于臨床使用(Leader 等，Nat Rev Drug Discov, 7(1): 21-39 (2008)) ? 這些治療劑包括肽、重組人蛋白、蛋白質(zhì)疫苗、自多種動物物種衍生的多克隆抗體制劑、和單克隆抗體。根據(jù)其與內(nèi)源自身抗原的序列和構(gòu)象同源性，糖基化狀態(tài)、劑量水平、施用路徑、局部化、和制造方法相關(guān)特征，治療性蛋白質(zhì)可能在患者中引發(fā)抗體應(yīng)答(Schellekens, Nat Rev Drug Discov, I (6):457-62 (2002);Zinkernagel, Semin Immunol,12(3):163-71 (2000)，discussion257_344;Thorland等，Haemophilia, 5(2):101-5(1999);Goodeve, Blood Coagul Fibrinolysis, 14Suppll:S17-21 (2003))。這些應(yīng)答(稱為抗藥物抗體(ADA)應(yīng)答)有時會影響患者安全性和藥物效力。
[0006]在溶酶體貯積病癥，即蓬佩(Pompe)病的情況中，在酶替換療法(ERT)中會形成針對重組人酸性α-葡糖苷酶的ADA。在不表達可測量量的內(nèi)源酶的患者中，持續(xù)的高抗體滴度水平與患者衰退(CRIM-蓬佩患者)相關(guān)聯(lián)(Kishnani等，Mol GenetMetab., 99(I):26-33(2010);Hunley 等,Pediatrics, 114(4):e532_5(2004);Amalfitano等，Genet Med, 3 (2): 132-8 (2001))。已經(jīng)在形成針對因子IX的ADA的血友病患者中觀察到對藥物安全性和效力的類似危害(Thorland等，Haemophilia, 5(2): 101-5 (1999) ; Ewenstein等，Blood, 89(3): 1115-6 (1997))。在罕見的情況中，ADA還會誘導(dǎo)自身免疫性疾病，如在重組人促紅細胞生成素的情況中(Schellekens, Clin Ther, 24 (11): 1720-40 (2002), discussionl719;Locatelli 等，Perit Dial Int,27Suppl2:S303-7(2007))。
[0007]不管治療劑是非人衍生的、人源化的或甚至是完全人的，抗體治療劑也會發(fā)生ADA應(yīng)答。單克隆和多克隆抗體治療劑兩者的免疫原性會影響患者安全性和藥物效力。針對治療性單克隆抗體諸如英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、利妥昔單抗(rituximab)和那他珠單抗(natalizumab)形成的抗體已經(jīng)與治療性抗體的降低的血清水平和效力聯(lián)系起來(Bendtzen等,Arthritis Rheum, 54 (12): 3782-9 (2006);Schmidt 等,Clin Immunol,132(3):334-41(2009);Bartelds 等,Ann RheumDis, 66 (7): 921-6 (2007) ; Baert 等，N Engl J Med, 348 (7): 601-8 (2003) ; Tahir 等，Rheumatology (Oxford), 44 (4): 561-2 (2005) ;Maini 等,Arthritis Rheum, 41 (9): 1552-63 (1998))。變應(yīng)性反應(yīng)已經(jīng)與抗英夫利昔單抗抗體聯(lián)系起來(Baert等，N Engl JMed, 348(7):601-8 (2003))。已經(jīng)在小百分比的用那他珠單抗治療的復(fù)發(fā)-緩解性多發(fā)性硬化患者中觀察到輸注相關(guān)超敏感性反應(yīng)(Phillips等，Neurology，67 (9):1717-8(2006))O
[0008]阿侖單抗是另一種會在復(fù)發(fā)-緩解性多發(fā)性硬化患者中產(chǎn)生ADA的抗體治療劑(Coles 等，N Engl J Med, 2008.359 (17): 1786-801 (2008))。阿侖單抗是一種與 CD52 (—種在免疫細胞上表達的細胞表面抗原)相互作用的淋巴細胞消減性單克隆抗體。阿侖單抗處于治療復(fù)發(fā)-緩解性多發(fā)性硬化的晚期臨床試驗，并且還已經(jīng)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中評估。一組研究人員已經(jīng)顯示了在一項單劑增加研究中治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中63%形成抗阿侖單抗抗體(Weinblatt 等,Arthritis Rheum, 1995.38 (11): 1589-94 (1995))。在所述研究中，阿侖單抗的效力表現(xiàn)為受到ADA的存在而改變(同上)。
[0009]多克隆抗體治療劑Thymoglobulin?也與較小患者子集中有害的ADA有關(guān)。已
經(jīng)在經(jīng)Thymoglobulin?治療的移植物接受者中觀察到血清病、急性腎衰竭和心血管反應(yīng)(Boothpur 等，Am J Kidney Dis.，55 (I): 141-3 (2009) ; Lundquist 等，Liver Transpl, 13 (5):647-50 (2007) ; Busani 等,Minerva Anestesiol, 72 (4): 243-8 (2006) ; Tanriover 等，Transplantation, 80 (2): 279-81 (2005) ; Buchler 等，Clin Transplant, 17 (6): 539-45 (2003))。
[0010]研究已經(jīng)嘗試尋找使ADA的有害效應(yīng)最小化的方式。已經(jīng)對多種工具測試其誘導(dǎo)免疫耐受性及降低蛋白質(zhì)療法中的ADA的能力，包括例如非消減性抗CD4抗體(Cobbold等,Semin Immunol, 2(6):377-87(1990);Winsor-Hines 等,JImmunol, 173 (7):4715-23 (2004))、阿侖單抗的非細胞結(jié)合最小突變體(Gilliland等，J Immunol, 162(6):3663-71(1999) ; Somerfield 等,J Immunol., 185 (I): 763-8 (2010))、免疫抑制性療法(Bennett 等,Blood, 106(10):3343-7(2005);Dickson 等，J Clin Invest,118(8):2868-76 (2008))、含有磷脂酰肌醇的結(jié)合因子VIII的脂質(zhì)性顆粒(Peng等，AAPS.J.，12(3):473-81 (2010))、和重組酸性α -葡糖苷酶經(jīng)由腺伴隨病毒感染的肝特異性施用(Sun等，Am J HumanGenet, 81(5): 1042-9 (2007) ; Sun 等，Mol Therl8 (2): 353-60 (2009) ; Ziegler 等，Hum GeneTher, 19(6):609-21 (2008))。然而，仍然需要開發(fā)用于降低蛋白質(zhì)療法和其它背景中不想要的抗體應(yīng)答的改善的方法。
[0011]發(fā)明概述
[0012]本發(fā)明提供了一種在需要用治療劑治療的受試者中誘導(dǎo)免疫耐受性的方法。在此方法中，在單個周期中對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中誘導(dǎo)針對所述治療劑的免疫耐受性。
[0013]本發(fā)明還提供了一種在需要用治療劑治療的受試者中抑制針對所述治療劑的抗體應(yīng)答的方法。在此方法中，在單個周期中對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中抑制針對所述治療劑的抗體應(yīng)答。
[0014]本發(fā)明還提供了一種在需要用治療劑治療的受試者中減輕針對所述治療劑的輸注反應(yīng)的方法。在此方法中，對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中減輕針對蛋白質(zhì)治療劑的輸注反應(yīng)。
[0015]本發(fā)明還提供了一種在需要用治療劑治療的自身免疫受試者中降低繼發(fā)性自身免疫的方法。在此方法中，對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中降低繼發(fā)性自身免疫。[0016]本發(fā)明還提供了一種在需要用治療劑治療的受試者中提高治療劑的效力的方法。在此方法中，對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中提高所述蛋白質(zhì)治療劑的效力。
[0017]本發(fā)明還提供了一種在用淋巴細胞消減性療法(例如阿侖單抗療法或Thymoglobulin?療法)治療的受試者中增加T細胞群體中T調(diào)節(jié)細胞百分比的方法。在
此方法中，對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受試者中的所述百分比。
[0018]本發(fā)明還提供了一種在需要用蛋白質(zhì)治療劑(諸如抗體治療劑)治療的受試者中增加B細胞群體中B調(diào)節(jié)細胞百分比的方法。在此方法中，對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受試者中的所述百分比。在一些實施方案中，在單個周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了一種在需要用蛋白質(zhì)治療劑治療的受試者中增加TGF-β、IL-10、和/或FoxP3表達B細胞的方法，其包括在單個周期中施用有效量的甲氨蝶呤。
[0019]本發(fā)明還提供了一種延長治療劑在受試者中的藥動學(xué)的方法。在此方法中，在施用所述治療劑之前或期間或之后以有效延長所述治療劑的藥動學(xué)的量對所述受試者施用甲氨蝶呤。
[0020]本發(fā)明進一步提供了一種在有此需要的人患者中消減淋巴細胞的方法。在此方法中，用淋巴細胞消減劑治療患者，并在用淋巴細胞消減劑治療之前或期間或之后以有效誘導(dǎo)患者中針對淋巴細胞消減劑的免疫耐受性或降低繼發(fā)性自身免疫的量對患者施用甲氨蝶呤。在一些實施方案中，在單個周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。在一些實施方案中，淋巴細胞消減劑可以是單克隆抗體治療劑(例如阿侖單抗或利妥昔單抗)。在這些中的某些實施方案中，患者可以是多發(fā)性硬化患者(例如緩解-復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化患者)。在一些實施方案中，淋巴細胞消減劑可以是多克隆抗體治療劑(例如抗胸腺細胞球蛋白多克隆抗體)。
[0021]本發(fā)明還提供了一種在需要組織移植的受試者中誘導(dǎo)免疫耐受性的方法。在此方法中，對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中誘導(dǎo)針對移植的組織的免疫耐受性。在一些實施方案中，在單個周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。在一些實施方案中，移植的組織是腎組織或心臟組織。在一些實施方案中，所述受試者還接受用于免疫調(diào)控的藥劑(例如免疫抑制劑)，諸如多克隆抗胸腺細胞球蛋白抗體。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種在需要治療劑或組織移植的受試者中抑制T細胞應(yīng)答的方法。在此方法中，在用所述治療劑或組織移植治療所述受試者之前、同時、或之后對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中抑制T細胞應(yīng)答。
[0023]在本發(fā)明方法的一些實施方案中，治療劑是蛋白質(zhì)治療劑。
[0024]在本發(fā)明方法的一些實施方案中，治療劑是抗體治療劑。例如，抗體治療劑可以是單克隆抗體治療劑和/或淋巴細胞消減劑(例如阿侖單抗)，或多克隆抗體治療劑(例如多克隆家兔抗胸腺細胞球蛋白抗體)。在抗體治療劑是阿侖單抗的別的實施方案中，受試者可以是多發(fā)性硬化患者。在抗體治療劑是多克隆家兔抗胸腺細胞球蛋白抗體的別的實施方案中，受試者可以是需要器官移植，具有再生障礙性貧血，和/或具有或有風(fēng)險具有移植物抗宿主病的人患者。在本發(fā)明方法的其它實施方案中，治療劑是酶。例如，酶可以是人α-半乳糖苷酶A或人酸性α -葡糖苷酶。
[0025]在本發(fā)明方法的一些實施方案中，受試者是人。[0026]在本發(fā)明方法的一些實施方案中，甲氨蝶呤的有效量可以是0.lmg/kg至5mg/kg。在一些實施方案中，單個周期的甲氨蝶呤可以由甲氨蝶呤施用I天或甲氨蝶呤施用連續(xù)2、
3、4、5、6、7、8、9、10、或11天組成。在一些實施方案中，可以在治療性處理開始之前48小時和之后48小時之間施用單個周期的甲氨蝶呤。
[0027]附圖簡述
[0028]在下文描述的每幅圖中 ，星號或星形標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，p〈0.05 ;**，P < 0.001; ***，P < 0.0001)。
[0029]圖1A-B顯示了針對單個和多個療程mATG (—種家兔抗鼠胸腺細胞球蛋白多克隆抗體)的抗家兔IgG響應(yīng)。測量平均抗家兔IgG滴度，并使用僅用家兔IgG(rblgG)處理的小鼠作為對照。圖1A顯示了在8周時期里針對單個療程mATG的響應(yīng)。圖1B顯示了在20周時期里針對多個療程mATG的響應(yīng)。箭標(biāo)示施用mATG或rblgG的時間點。
[0030]圖2顯示了用阿侖單抗的5次每月處理后的平均阿侖單抗特異性IgG滴度。箭標(biāo)示施用阿侖單抗的時間點。
[0031]圖3顯示了單個療程mATG后甲氨蝶呤(MTX)對抗mATG IgG應(yīng)答的抑制。用僅mATG、僅rblgG、或mATG和甲氨蝶呤處理小鼠。
[0032]圖4A-C顯示了貫穿用mATG的5次每月處理的過程，甲氨蝶呤對抗家兔IgG應(yīng)答的影響。箭標(biāo)示施用mATG或甲氨蝶呤的時間點。圖4A顯示了三個周期的甲氨蝶呤顯著降低平均抗家兔IgG滴度。圖4B顯示了單個療程的甲氨蝶呤顯著降低平均抗家兔IgG滴度。圖4C比較用僅mATG、mATG和單個周期的甲氨蝶呤、或mATG和三個周期的甲氨蝶呤處理的小鼠的平均抗家兔IgG滴度。單個周期的甲氨蝶呤比三個周期的甲氨蝶呤更顯著降低抗家兔IgG滴度。
[0033]圖5顯示了與用mATG但不用甲氨蝶呤處理的小鼠相比，平均抗家兔IgG滴度在經(jīng)甲氨蝶呤處理的小鼠(單個和多個甲氨蝶呤周期)中在mATG再攻擊后降低。箭標(biāo)示施用mATG或甲氨蝶呤的時間點。
[0034]圖6顯示了用mATG和單個周期的甲氨蝶呤處理的小鼠中的平均抗家兔IgG滴度比僅用mATG處理的小鼠中的平均抗家兔IgG滴度小100倍。箭標(biāo)示施用mATG或甲氨蝶呤的時間點。
[0035]圖7A-C顯示了甲氨蝶呤能降低hu⑶52Tg小鼠中的平均抗阿侖單抗IgG滴度。圖7A:抗阿侖單抗滴度在用單個周期的lmg/kg或5mg/kg甲氨蝶呤處理的小鼠中比在用0.5mg/kg或無甲氨蝶呤處理的小鼠中低。用僅阿侖單抗,或阿侖單抗和單個周期的0.5mg/kg、lmg/kg、或5mg/kg甲氨蝶呤處理小鼠。圖7B:測試抗阿侖單抗滴度的研究設(shè)計。在第5劑阿侖單抗后24小時時測定滴度數(shù)據(jù)，如由星形標(biāo)示的。圖7C:在第5劑阿侖單抗后24小時，與僅接受阿侖單抗的小鼠相比，甲氨蝶呤在接受阿侖單抗和甲氨蝶呤的小鼠中降低抗阿侖單抗抗體滴度。
[0036]圖8A-D顯示了用5劑每日0.5mg/kg阿侖單抗或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)處理的小鼠中循環(huán)T細胞的絕對細胞數(shù)目/ μ I全血。圖8Α顯示了總T細胞(CD3+)在處理后2、3和4周降低。圖8Β顯示了總B細胞(CD19+)在處理后3周降低。圖8C顯示了 T輔助細胞(⑶4+)在處理后2、3和4周時降低，且圖8D顯示了細胞毒性T細胞(⑶8+)在處理后2、3和4周時降低。[0037]圖9A-B顯示了阿侖單抗特異性IgG應(yīng)答。圖9A顯示了以0.5mg/kg用阿侖單抗處理的三個周期，及以0.5mg/kg、lmg/kg、或2mg/kg用甲氨蝶呤處理的一個周期后的應(yīng)答。阿侖單抗處理的第一個周期由劑量給藥的連續(xù)5天組成，并且第二個和第三個周期各由劑量給藥的連續(xù)3天組成。圖9B顯示了在第14周時每組的每只動物的抗阿侖單抗IgG滴度。
[0038]圖10顯示了單個周期的5mg/kg甲氨蝶呤恢復(fù)用5劑每月mATG處理的小鼠中的循環(huán)mATG水平。
[0039]圖11顯示了用mATG的5次每月處理和單個周期的甲氨蝶呤處理的小鼠在第5劑mATG后具有血液中增強的mATG介導(dǎo)的⑶4+和⑶8+T細胞消減。從兩個實驗合并這些數(shù)據(jù)。
[0040]圖12A-B顯示了用單個周期的甲氨蝶呤處理的小鼠在第5次每月mATG處理后展現(xiàn)出增加的T調(diào)節(jié)(⑶25+FoXp3+)細胞百分比。用僅mATG的5次每月處理，或mATG的5次每月處理和單個周期的甲氨蝶呤，或mATG的5次每月處理和三個周期的甲氨蝶呤處理小鼠。圖12A顯示了脾中的T調(diào)節(jié)細胞水平。圖12B顯示了血液中的T調(diào)節(jié)細胞水平。 [0041]圖13A顯示了大于10,000的抗家兔IgG滴度能干擾mATG的藥動學(xué)。圖13B顯示了大于100，000的抗家兔滴度能干擾⑶4和⑶8細胞消減。％處理前對照指⑶4和⑶8滴度相對于其在mATG處理前的相應(yīng)水平的百分比。
[0042]圖14顯示了用5mg/kg甲氨蝶呤處理的小鼠在第5劑每月阿侖單抗后展現(xiàn)出增強的阿侖單抗對循環(huán)⑶3+T細胞和⑶19+B細胞的消減。對于研究的頭三天，用僅阿侖單抗，或阿侖單抗和單個周期的甲氨蝶呤處理小鼠。星號標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，ρ〈0.05; ***，P < 0.0001)。
[0043]圖15Α顯示了單個周期的甲氨蝶呤能在16周研究中貫穿處理，且甚至在最后一次rhGAA處理后4周降低重組人酸性α -葡糖苷酶(rhGAA)特異性IgG滴度。箭標(biāo)示施用rhGAA和甲氨蝶呤的時間點。用僅rhGAA，或rhGAA和單個周期的甲氨蝶呤，或rhGAA和三個周期的甲氨蝶呤處理小鼠。圖15B顯示了在6周研究中，單個周期的甲氨蝶呤降低rhGAA特異性IgG滴度。圖15C顯示了單個周期的甲氨蝶呤在18周研究中降低rhGAA特異性IgG滴度。
[0044]圖16A顯示了與僅mATG相比，甲氨蝶呤在與mATG —起施用時降低鼠異基因心臟移植物模型中的抗家兔IgG滴度。圖16B顯示了甲氨蝶呤提高鼠異基因心臟移植物模型中的mATG的循環(huán)水平。用鹽水、僅mATG、或mATG和單個周期的甲氨蝶呤處理小鼠。在研究的第O天和第4天以20mg/kg施用mATG,而在研究的第0_6天施用2mg/kg甲氨蝶呤。
[0045]圖17顯示了 Kaplan-Meier圖，其指示mATG和甲氨蝶呤的組合處理延長移植入接受小鼠中的異基因心臟的存活。將小鼠保持未處理，或者在研究的第O天和第4天僅用20mg/kg mATG,或在研究的第0_6天僅用2mg/kg甲氨蝶呤,或在第0_6天用mATG和2mg/kg甲氨蝶呤兩者，或在第0-6天或第0-11天用mATG和0.5mg/kg甲氨蝶呤兩者處理。
[0046]圖18顯示了用單獨的甲氨蝶呤或與mATG組合的甲氨蝶呤處理的具有移植的異基因心臟的小鼠經(jīng)歷抗同種移植物抗體應(yīng)答的降低。圖18A顯示了第21天結(jié)合異基因成纖維細胞的接受者IgG。圖18B顯示了在指定處理的情況中給予同基因移植物(Syn Tx)或異基因移植物(Alio Tx)的小鼠中第21天的同種抗體水平。顯示了個別接受小鼠血清IgG對異基因成纖維細胞的結(jié)合，并且以均值熒光強度(MFI)與未染色的成纖維細胞的比率表示。圖18C顯示了給予無處理、mATG、甲氨蝶呤、或mATG和甲氨蝶呤的小鼠中第21天的同種抗體水平。同種抗體水平在用甲氨蝶呤或mATG和甲氨蝶呤處理的小鼠中顯著較低(分別為 p=0.0008 和 ρ〈0.0001)。
[0047]圖19顯示了 BlO調(diào)節(jié)B細胞在甲氨蝶呤處理后顯著增加。用單獨的rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤的單個3天周期或鹽水處理小鼠。在研究的第7天和第8天計數(shù)細胞數(shù)目。
[0048]圖20顯示了與僅用rhGAA處理相比，活化的B細胞亞群在用rhGAA和甲氨蝶呤的單個3天周期處理后第6天顯著增加。在研究的第6天計數(shù)⑶86+移行2B細胞、⑶86+移行3B細胞、⑶86+濾泡B細胞、和⑶86+邊緣區(qū)B細胞的絕對細胞數(shù)目。星號標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，Ρ〈0.05; **，P < 0.001)。
[0049]圖21顯示了對于活化的脾B細胞亞群,諸如活化的邊緣區(qū)B細胞、活化的濾泡B細胞、和活化的移行3Β細胞，與僅用rhGAA處理相比，細胞數(shù)目即使在用rhGAA和甲氨蝶呤處理后保持增加。箭代表用rhGAA和甲氨蝶呤處理。在第I天和第8天施用rhGAA。在第I天、第2天、和第3天，以及第8天、第9天、和第10天施用甲氨蝶呤。顯著性差異由星形(*，p〈0.05)表示。沒有對第8天和第9天(以垂直的點線標(biāo)示)顯示數(shù)據(jù)。
[0050]圖22顯示了與僅用rhGAA處理相比，活化的脾T細胞群體，諸如活化的T輔助細胞、活化的T細胞毒性細胞、和活化的T調(diào)節(jié)細胞在用rhGAA和甲氨蝶呤處理后在很大程度上保持不變。箭代表用rhGAA和甲氨蝶呤處理。在第I天和第8天施用rhGAA。在第I天、第2天、和第3天，以及第8天、第9天、和第10天施用甲氨蝶呤。顯著性差異由星形(*，p〈0.05)表示。沒有對第8天和第9天(以垂直的點線標(biāo)示)顯示數(shù)據(jù)。
[0051]圖23顯示了用于檢查與mATG組合的甲氨蝶呤處理的長6個月的研究設(shè)計。實心箭代表5mg/kg mATG注射 ,虛線箭代表5mg/kg甲氨蝶呤注射,而點線箭代表末期處死。
[0052]圖24A-B顯示了與單獨的mATG或三個周期的甲氨蝶呤相比，與mATG結(jié)合的單個周期的甲氨蝶呤富集脾B細胞。圖24A:活化的濾泡B細胞；圖24B:活化的移行3B細胞。
[0053]圖25A-B顯示了甲氨蝶呤對阿侖單抗在血液中的藥效學(xué)的影響。在有或沒有與阿侖單抗的第一次施用結(jié)合的3劑每日5mg/kg/天甲氨蝶呤的情況中，用0.5mg/kg阿侖單抗處理小鼠5個月。圖25A:甲氨蝶呤增強阿侖單抗(AZM)對總T細胞(⑶3+)、T輔助細胞(⑶4+)、和T調(diào)節(jié)細胞(⑶4+CD25+FOXp3+)的消減。黑色柱形代表僅用阿侖單抗處理的小鼠中的測量，而白色柱形代表用阿侖單抗和甲氨蝶呤處理的小鼠中的測量。圖25B:甲氨蝶呤增強阿侖單抗對B細胞的消減。星形標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，p〈0.05)。
[0054]圖26顯示了甲氨蝶呤對阿侖單抗在脾中的藥效學(xué)的影響。在有或沒有與阿侖單抗的第一次施用結(jié)合的3劑每日5mg/kg/天甲氨蝶呤的情況中，用0.5mg/kg阿侖單抗處理小鼠5個月。T細胞在用阿侖單抗的第5次處理后消減。⑶8CEN:⑶8+中央記憶T細胞；⑶8EFF MEM:⑶8+效應(yīng)記憶T細胞KD4CEN MEM:⑶4+中央記憶T細胞<D4EFF MEM:⑶4+效應(yīng)記憶T細胞。星形標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，p〈0.05)。
[0055]圖27A-B顯示了甲氨蝶呤對脾中B細胞數(shù)目的影響。在有或沒有與阿侖單抗的第一次施用結(jié)合的3劑每日5mg/kg/天甲氨蝶呤的情況中，用0.5mg/kg阿侖單抗處理小鼠5個月。星形標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，p〈0.05)。
[0056]圖28A-B顯示了在單劑阿侖單抗后3天的脾淋巴細胞消減。圖28A:T細胞和B細胞是顯著消減的。小方格圖案代表用PBS處理的對照小鼠，而大方格圖案代表用阿侖單抗處理的小鼠。圖28Β:Β細胞(⑶19+)在處理后24小時時是92%消減的，并且在處理后3天仍然是36%消減的。三幅圖代表不同組的動物，將每只動物在不同時間點時取血。星形標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，Ρ〈0.05;**，P≤0.001 ;***，P≤0.0001)。
[0057]圖29Α-Β顯示了甲氨蝶呤對細胞因子水平的影響。圖29Α顯示了 6個月研究的研究設(shè)計以評估脾和淋巴結(jié)中的細胞因子水平。星形標(biāo)示在用阿侖單抗的第5次處理后24小時收集數(shù)據(jù)。箭標(biāo)示施用阿侖單抗或甲氨蝶呤或者實施末期處死的時間點，如標(biāo)示的。圖29Β顯示了僅用阿侖單抗或用阿侖單抗和甲氨蝶呤處理的小鼠中屬于TNF家族(BAFF)的B細胞活化因子的水平。
[0058]圖30Α-Β顯示了在用阿侖單抗和甲氨蝶呤處理后的細胞因子水平。圖30Α顯示了4個月研究的研究設(shè)計。星形標(biāo)示在甲氨蝶呤的第二個周期后I周收集數(shù)據(jù)。箭標(biāo)示施用阿侖單抗或甲氨蝶呤或者實施末期處死的時間點，如標(biāo)示的。圖30Β顯示了僅用阿侖單抗(AZM)或用0.5mg/kg、l.0mg/kg、或2.0mg/kg甲氨蝶呤處理的小鼠中各種細胞因子的水平。
[0059]圖31顯示了甲氨蝶呤對ILlO-/-(敲除)和C57BL/6小鼠中抗rhGAA滴度的影響。在rhGAA的頭三次每周處理后O、24和48小時時,在用或不用5mg/kg/天甲氨蝶呤的情況中，在ILlO-/-敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠中每周施用20mg/kg rhGAA達9周。
[0060]圖32顯示了一些但不是所有脾B細胞群體在用阿侖單抗處理后的I和/或2周時消減。小陰影線柱形代表用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)處理的huCD52轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈?；大陰影線柱形描繪了用0.5mg/kg阿侖單抗處理連續(xù)5天的hu⑶52轉(zhuǎn)基因小鼠。星號標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，Ρ〈0.05;**, P ^ 0.001;***, P ^ 0.0001)。
[0061]圖33顯示了用于在用阿侖單抗處理的背景中檢查甲氨蝶呤對B細胞群體的影響的研究設(shè)計。使用甲狀腺和淋巴結(jié)(LN)進行病理學(xué)評估。箭標(biāo)示施用阿侖單抗或甲氨蝶呤或者實施末期處死的時間點，如標(biāo)示的。
[0062]圖34顯示了三劑每日單獨的5mg/kg/天甲氨蝶呤、單獨的0.5mg/kg阿侖單抗、和組合的0.5mg/kg阿侖單抗和5mg/kg/天甲氨蝶呤對消減B細胞群體的影響。星號標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，ρ〈0.05;**，ρ < 0.001;***, P ^ 0.0001 ;ns,不顯著)。
[0063]圖35顯示了在用單獨的0.5mg/kg阿侖單抗或三劑每日單獨的5mg/kg/天甲氨蝶呤或組合的0.5mg/kg阿侖單抗和5mg/kg/天甲氨蝶呤的5個處理周期后甲氨蝶呤對B細胞消減的影響。星號標(biāo)示具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的測量(*，p〈0.05)。
[0064]圖36顯示了細胞因子MCP-1、IL-13、IL-6、和IL-12的水平在用阿侖單抗處理的第一天施用的5mg/kg甲氨蝶呤的3天單個周期處理的小鼠中降低。在用甲氨蝶呤處理后4個月，在第5劑阿侖單抗后24小時收集數(shù)據(jù)。
[0065]圖37A-B顯示了 nu/nu裸鼠中第2周、第6周、和第12周的rhGAA滴度。圖37A顯示了第2周和第6周的rhGAA滴度。從左至右,用鹽水處理的對照小鼠、用rhGAA處理的小鼠、和用rhGAA和甲氨蝶呤處理的小鼠中的第2周測量，接著是用鹽水處理的對照小鼠、用rhGAA處理的小鼠、和用rhGAA和甲氨蝶呤處理的小鼠中的第6周測量。圖37B顯示了(從左至右)僅用rhGAA(Myo)處理的nu/nu小鼠、用甲氨蝶呤和rhGAA處理的nu/nu小鼠、僅用rhGAA處理的BL6小鼠、和用甲氨蝶呤和rhGAA處理的BL6中的第12周測量。
[0066]圖38A-B顯示了 IL-1O表達BlO B細胞的數(shù)目和百分比在用甲氨蝶呤實現(xiàn)針對rhGAA耐受的小鼠中增加。通過流式細胞術(shù)對自用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物分離的BlOB細胞評估IL-1O蛋白質(zhì)表達。[0067]圖39A-B顯示了 IL-10在活化的(⑶86+)和非活化的(⑶860B10 B細胞兩者中表達。圖39A描繪了用⑶86染色的BlOB細胞的FACS圖，而圖39B描繪了響應(yīng)用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的⑶86+IL10+B10 B細胞和⑶861L10+B10 B細胞的數(shù)目。
[0068]圖40A-B顯示了與rhGAA —起的甲氨蝶呤處理誘導(dǎo)BlO B細胞提高其TGF-β表達。圖40Α的第二幅和第三幅小圖是FACS圖,其顯示了來自用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物的用TGF-β和⑶86染色的BlO B細胞。圖40A的第一幅小圖描繪了用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物中TGF-β+BlO B細胞的數(shù)目。圖40Β描繪了⑶86+TGF-β+BlOB細胞和⑶86-TGF- β +BlO B細胞計數(shù)。[0069]圖41Α描繪了 BlO B細胞表現(xiàn)為在用rhGAA處理的動物中表達FoxP3 (圖41A)。圖41B描繪了 FoxP3+B細胞數(shù)目在甲氨蝶呤和rhGAA兩者處理的情況中增加。圖41C描繪了活化的(CD86+)和非活化的(CD86_)B10 B細胞表達FoxP3。
[0070]圖42A-C顯示了濾泡、移行2、和移行3B細胞(頂部至底部)表達IL-10，并且與僅用rhGAA處理的小鼠相比，IL-10表達B細胞子集的細胞數(shù)目在甲氨蝶呤的情況中增加。
[0071]圖43A-C顯示了濾泡、移行2、和移行3B細胞(頂部至底部)表達TGF-β，并且與僅用rhGAA處理的小鼠相比，TGF-β表達B細胞子集的細胞數(shù)目在甲氨蝶呤的情況中增加。
[0072]圖44A-C顯示了顯示了濾泡、移行2、和移行3Β細胞(頂部至底部)表達FoxP3，并且與僅用rhGAA處理的小鼠相比，F(xiàn)oxP3表達B細胞子集的細胞數(shù)目在甲氨蝶呤的情況中增加。
[0073]圖45顯示了在存在或缺乏5mg/kg抗TGF-β抗體(1D11, Genzyme)或同種型對照(13C4)的情況中用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物中在第6周的抗rhGAA滴度。在不同的四組動物中兩周一次評估抗體滴度。
[0074]圖46A-C顯示了 IDll處理干擾甲氨蝶呤誘導(dǎo)的表達TGF-β、IL-10、或FoxP3的BlO B細胞擴充。從用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理，并在單次rhGAA處理或單次rhGAA和甲氨蝶呤處理后7天還共施用IDll或13C4的動物分離脾。然后，將每組中的細胞合并，并培養(yǎng)2天，然后使用流式細胞術(shù)計數(shù)。
[0075]圖47A-C顯示了 IDll處理干擾甲氨蝶呤誘導(dǎo)的表達TGF-β或IL-10的濾泡B細胞擴充，盡管FoxP3+濾泡B細胞不表現(xiàn)為經(jīng)歷IDll效應(yīng)。從用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物分離脾，所述動物在單次rhGAA處理或單次rhGAA和甲氨蝶呤處理后7天還共施用IDll或13C4。然后，將每組中的細胞合并，并培養(yǎng)2天，然后使用流式細胞術(shù)計數(shù)。
[0076]圖48A-C顯示了在移行2B細胞中，雖然IDll處理干擾甲氨蝶呤誘導(dǎo)的TGF-β表達移行2B細胞擴充，但是沒有對IL-1O+移行2B細胞看到效應(yīng)。從用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理,并在單次rhGAA處理或單次rhGAA和甲氨蝶呤處理后7天還共施用IDll或13C4的動物分離脾。然后，將每組中的細胞合并，并培養(yǎng)2天，然后使用流式細胞術(shù)計數(shù)。
[0077]圖49A-C顯示了在移行3B細胞中，存在有可檢測的TGF-β ,IL-10和FoxP3，但是IDll處理對細胞沒有明顯影響。從用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理，并在單次rhGAA處理或單次rhGAA和甲氨蝶呤處理后7天還共施用IDll或13C4的動物分離脾，并使用流式細胞術(shù)對細胞計數(shù)。
[0078]圖50A-C顯示了 IDll處理不影響濾泡B細胞、移行2B細胞和移行3B細胞(頂部至底部)中的IL-10、TGF-β、和FoxP3的基礎(chǔ)水平。[0079]圖51A是一幅示意圖，其顯示了將來自對rhGAA(Myozyme?或“ΜΥ0”)耐受的小鼠的總脾B細胞轉(zhuǎn)移至rhGAA未接觸(na‘ive)的接受小鼠。在轉(zhuǎn)移后，用20mg/kg rhGAA每周處理接受者(以及用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的非轉(zhuǎn)移的對照動物)。
[0080]圖51B顯示了滴度分析,其證明了自用rhGAA和單個周期的甲氨蝶呤處理的動物分離的總脾B細胞可以在未接觸(naive )宿主中轉(zhuǎn)移針對rhGAA的免疫耐受性。
[0081]圖52描繪了來自用家兔186(1^186)、單獨的11^了6、1^186和甲氨蝶呤、或11^了6和甲氨蝶呤處理的正常小鼠的血液或脾的細胞計數(shù)。甲氨蝶呤在正常動物中沒有消減CD4+、CD8+、T 調(diào)節(jié)(CD4+CD25+FoxP3+)T 細胞、或總 CD19+B 細胞。
[0082]圖53描繪了來自在移植后14天用rblgG、單獨的mATG、rblgG和甲氨蝶呤、或mATG和甲氨蝶呤處理的移植小鼠的血液或脾的細胞計數(shù)。甲氨蝶呤在移植動物中沒有消減CD4+、CD8+、T 調(diào)節(jié)(CD4+CD25+FoxP3+)T 細胞、和總 CD19+B 細胞。
[0083]圖54顯示了甲氨蝶呤處理誘導(dǎo)多個細胞子集中IL-10的統(tǒng)計學(xué)顯著增加，如通過在用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物中這些蛋白質(zhì)的均值熒光強度(MFI)的變換觀察到的。
[0084]圖55顯示了甲氨蝶呤處理誘導(dǎo)多個細胞子集中TGF-β的統(tǒng)計學(xué)顯著增加，如通過在用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物中這些蛋白質(zhì)的均值熒光強度(MFI)的變換觀察到的。
[0085]圖56顯示了甲氨蝶呤處理誘導(dǎo)多個細胞子集中FoxP3的統(tǒng)計學(xué)顯著增加，如通過在用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤處理的動物中這些蛋白質(zhì)的均值熒光強度(MFI)的變換觀察到的。
[0086]發(fā)明詳述
[0087]本發(fā)明基于我們的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即單個周期或短療程的甲氨蝶呤施用降低接受蛋白質(zhì)治療劑(諸如替換酶或治療性抗體)的患者中不想要的免疫應(yīng)答(諸如ADA應(yīng)答，和其它不想要的T和/或B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)，和組織移植中的抗移植物抗體應(yīng)答。此發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致用于提高蛋白質(zhì)療法和器官移植的安全性和效力兩者的新方法。
[0088]更具體地 ，我們的研究已經(jīng)顯示了單個周期的甲氨蝶呤降低針對抗體治療劑的ADA。如下文詳述的，用一種鼠型式的多克隆抗體治療劑即Thymoglobulin?完成一組實
驗。Thymoglobulin?是一種家兔抗人胸腺細胞球蛋白多克隆抗體，用于實體器官移植背景中的免疫抑制、再生障礙性貧血及預(yù)防移植物抗宿主病。已經(jīng)開發(fā)出家兔抗鼠胸腺細胞球蛋白多克隆抗體(mATG)。它維持與Thymog丨obulilT?相似的特征(Ruzek,等，Transplantation, 88⑵:170-9 (2009))。我們已經(jīng)證明了單個療程的甲氨蝶呤可以將抗mATGIgG滴度降低>95%。實際上，令人驚訝地，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了單個周期的甲氨蝶呤在降低ADA上比三個周期的甲氨蝶呤更好地起作用。另外，此ADA降低維持循環(huán)mATG的水平，并且在重復(fù)mATG劑量給藥后增強mATG介導(dǎo)的細胞消減和T調(diào)節(jié)細胞百分比。用單克隆抗體治療劑阿侖單抗完成我們的另一組研究。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了單個療程的甲氨蝶呤可以類似地控制抗阿侖單抗應(yīng)答，并且增強阿侖單抗介導(dǎo)的淋巴細胞消減。
[0089]我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了甲氨蝶呤的此單個周期方案還降低蛋白質(zhì)治療劑是酶的情況中的ADA。在我們的兩項研究中，我們證明了單個周期的甲氨蝶呤可以有效控制抗Myozyme? (重組人阿葡糖苷酶α或“rhGAA”)應(yīng)答，其中最初認為需要多個周期來降低ADA。
[0090]我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了甲氨蝶呤也可用于器官移植。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了單個周期的甲氨蝶呤可以控制心臟異基因移植物移植中的抗異基因移植物抗體應(yīng)答。在與mATG組合時，心臟異基因移植物的存活顯著更長。
[0091]我們的研究顯示了蛋白質(zhì)療法的第一周內(nèi)給予單個周期的甲氨蝶呤可以提供多個月的劑量給藥里ADA長時間的大于95%的降低。此抗體滴度降低是長時間的，盡管貫穿大部分研究缺乏甲氨蝶呤。此外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了單個周期的甲氨蝶呤可以控制抗異基因移植物應(yīng)答(例如在鼠異基因心臟移植物模型中)，顯示了同時控制針對多種抗原的抗體應(yīng)答。
[0092]經(jīng)典地，已知甲氨蝶呤是二氫葉酸還原酶拮抗劑，認為其通過抑制嘌呤代謝并且干擾重新 DNA 合成來殺死增殖細胞(Kremer, Arthritis Rheum, 50 (5): 1370-82 (2004))?？梢匀菀准僭O(shè)，經(jīng)由此充分描述的機制，甲氨蝶呤僅可以殺死反應(yīng)性細胞，但是這在我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的單個周期方案的情況中似乎不太可能。甲氨蝶呤具有較短的半衰期，并且在細胞或循環(huán)中不太可能長得足以在處理后3至4個月仍活躍殺死細胞(Walling, Invest New Drugs, 24(1):37-77(2006) ; Slavikova 等，Neoplasma, 25(2):211-6 (1978))。此外，我們沒有發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤處理后淋巴細胞消減的證據(jù)。更確切地，令人驚訝地，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了甲氨蝶呤的單個周期方案通 過誘導(dǎo)免疫控制的活性機制，不是通過無差別消減淋巴細胞來降低不想要的抗體應(yīng)答。
[0093]我們的研究顯示了單個周期的甲氨蝶呤增加BlO調(diào)節(jié)B細胞及活化的邊緣區(qū)B細胞、活化的濾泡B細胞和活化的移行3B細胞。我們的研究還顯示了單個周期的甲氨蝶呤增加IL-10表達、TGF- β表達、和FoxP3表達B10、濾泡、移行2和移行B細胞的數(shù)目，且此擴充是由TGF-β介導(dǎo)的。這些研究還顯示了甲氨蝶呤提高IL-10、TGF-β、和FoxP3的表達水平。鑒于目前對甲氨蝶呤的作用機制的了解，脾B細胞群體的擴充是令人驚訝的，并且提示了在此劑量給藥示例中，甲氨蝶呤以獨特的、先前未知的方式起作用。已經(jīng)顯示了在經(jīng)英夫利昔單抗治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中較低連續(xù)劑量的甲氨蝶呤降低抗英夫利昔單抗抗體應(yīng)答；但因為暴露是連續(xù)的，此方案較有可能牽涉持續(xù)的免疫抑制，而不是耐受性誘導(dǎo)。已經(jīng)顯示了單獨的甲氨蝶呤處理在以低劑量每周給予時在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中降低疾病活性。最近的出版物提示了連續(xù)施用低劑量甲氨蝶呤(每隔一天)后，出現(xiàn)自身抗原特異性T調(diào)節(jié)細胞，其可以幫助解釋甲氨蝶呤處理在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的效力(Xinqiang等，Biomed Pharmacother, 64 (7): 463-471(2010))。比較而言，本文中對甲氨蝶呤描述的劑量給藥示例是真正獨特的，因為它牽涉較短療程的甲氨蝶呤處理，其可以提供對不想要的免疫學(xué)應(yīng)答的長期控制。
[0094]總之，我們已經(jīng)鑒定出獨特的甲氨蝶呤劑量給藥方案，其可以對幾種不同類型的ADA應(yīng)答和組織移植中的抗異基因移植物抗體應(yīng)答，及T細胞和B細胞應(yīng)答產(chǎn)生長期控制。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了可以將由甲氨蝶呤形成的免疫耐受性從一只動物轉(zhuǎn)移至另一只，例如通過將來自耐受化動物的B細胞移植至非耐受化動物進行。我們的數(shù)據(jù)提示了甲氨蝶呤經(jīng)由獨特的作用機制起作用，該作用機制牽涉擴充活化的B細胞子集，該活化的B細胞子集可以代表在抑制免疫應(yīng)答中有活性的調(diào)節(jié)B細胞。此外，甲氨蝶呤也可以經(jīng)由T調(diào)節(jié)細胞擴充機制起作用。
[0095]生物療法中不想要的免疫應(yīng)答
[0096]本發(fā)明的方法可以控制多種生物學(xué)療法(例如使用生物制劑，諸如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)和代謝物的療法)中不想要的免疫學(xué)應(yīng)答(例如ADA應(yīng)答，和其它不想要的T和/或B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。蛋白質(zhì)療法指治療劑是蛋白質(zhì)性物質(zhì)(包括肽和蛋白質(zhì))的療法。例如，蛋白質(zhì)治療劑可以是酶、細胞因子、生長因子、免疫調(diào)節(jié)劑、溶血栓藥、抗體(包括多克隆和單克隆抗體)、抗體片段或經(jīng)修飾的抗體(例如Fab、F(ab’)2、Fv、Fd、scFv、和dAb)。例如，已經(jīng)針對具有某些遺傳疾病的患者開發(fā)出許多酶替換療法，包括用于法布里(Fabry)病的Fabrazyme? (重組人Cl -半乳糖苷酶)、用于戈謝(Gaucher)病的 Cerezyme κ (伊米苷酶(imiglucerase))、用于粘多糖忙積癥I (MPS I)的Aldurazyme?(拉羅尼酶(Iaronidase))、和用于蓬佩病的MyozymefB)和Lumizyme? (阿葡糖苷酶α )?？贵w治療劑的例子包括Campath? (阿侖單抗)、Thymoglobulin?、Avastin? (貝伐單抗(bevacizumab) )、Lucentis? (蘭尼單抗(ranibizumab) )、Remicade(R)(英夫利昔單抗)、Humira? (阿達木單抗(adalimumab) )、Rituxan? (利妥昔單抗)、Tysabri?(那他珠單抗(natalizumab) )、Simulect? (巴利昔單抗(basiliximab) )、Zenapax?(達克珠單抗(daclizumab) )、OKT3? (莫羅單抗-CD3 (muromonab-CD3) )、Erbitux? (西妥昔單抗(Cetuximab) )、Mylota_rg? (吉姆單抗(gemtuzumab) )、Herceptin? (曲妥單抗(trastuzumab))、和Benlysta? ( m利木單抗(belimumab))。其它蛋白質(zhì)治療劑的例子包括Enbrel? (依那西普(etanercep)),和其它融合蛋白。
[0097]在許多情況中，在患者中可以產(chǎn)生不想要的針對蛋白質(zhì)治療劑的免疫應(yīng)答，這對患者結(jié)果引起可變的影響。此類應(yīng)答由于生物制劑治療劑經(jīng)常含有對于人患者而言外來的序列和構(gòu)象而發(fā)生。例如，ADA干擾治療劑效力和/或增加安全性風(fēng)險。ADA可以引起超敏感性反應(yīng)、過敏反應(yīng)、血清病、免疫復(fù)合物病(immune complex disease)、急性腎衰竭。臨床醫(yī)生可以使用完善確立的方法(包括ELISA和免疫組織化學(xué))在接受蛋白質(zhì)療法的患者中監(jiān)測晝。
[0098]在一些情況中，如本文中使用的，“蛋白質(zhì)療法”指病毒療法，其中使用病毒載體來投遞核酸治療劑。此類療法中使用的例示性病毒包括但不限于腺病毒、腺伴隨病毒、和逆轉(zhuǎn)錄病毒?？梢孕纬舍槍Σ《镜臍んw蛋白的抗體，這降低此類療法的效力并且增加安全性風(fēng)險。本發(fā)明的方法也可用于控制病毒療法中不想要的免疫學(xué)應(yīng)答(例如ADA應(yīng)答，和其它不想要的T和/或B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。
[0099]本發(fā)明的方法也可以控制非蛋白質(zhì)生物學(xué)療法中不想要的免疫學(xué)應(yīng)答。例示性的非蛋白質(zhì)生物療法包括但不限于核酸療法(例如反義療法、siRNA療法、和miRNA療法)。
[0100]移植中的抗移植物應(yīng)答
[0101]也可以使用本發(fā)明的方法在接受組織移植(諸如腎移植、肝移植、心臟移植、和干細胞移植)的患者中誘導(dǎo)免疫耐受性。宿主抗移植物和移植物抗宿主排斥經(jīng)常在組織移植(尤其是異基因移植物和異種移植物移植)中發(fā)生?？梢詥为毣蚺c另一種免疫調(diào)控劑(例如免疫抑制劑iiV川Thymoglobulin?) —起使用單個周期的甲氨蝶呤以管理抗移植物抗體應(yīng)答。另外，Thymoglobulin?和甲氨蝶呤的組合可以在移植中起延長移植物存活的作用。最后，在慢性自身免疫性疾病諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化的背景中調(diào)查Thymoglobulin?的情況中，甲氨蝶呤可以容許更安全的Thymoglobulin?再次治療，這
保護患者免于形成相當(dāng)多的抗家兔抗體(諸如IgG和/或IgM)和/或輸注相關(guān)反應(yīng)。
[0102]用甲氨蝶呤管理不想要的免疫學(xué)應(yīng)答
[0103]我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了單個短周期的甲氨蝶呤可以顯著降低接受生物制劑治療劑(例如蛋白質(zhì)治療劑)的受試者中不想要的免疫學(xué)應(yīng)答諸如ADA和接受組織移植的患者中的抗異基因移植物應(yīng)答。降低不想要的ADA不僅可以改善患者安全性，而且還可以經(jīng)由改善蛋白質(zhì)治療劑的藥效學(xué)和/或藥動學(xué)改善蛋白質(zhì)治療劑的效力。 [0104]甲氨蝶呤(一種小分子化合物)已經(jīng)用于治療患有重度活動性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重度銀屑病、和某些類型的癌癥，包括在子宮中受精卵周圍形成的組織中開始的癌癥、乳腺癌、肺癌、某些頭和頸癌、某些類型的淋巴瘤、和白血病(在白細胞中開始的癌癥)的患者。甲氨蝶呤通過減緩癌細胞生長來治療癌癥。甲氨蝶呤通過減緩皮膚細胞生長以停止鱗屑形成來治療銀屑病。甲氨蝶呤可以通過降低免疫系統(tǒng)的活性來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0105]已經(jīng)在控制針對α -半乳糖苷酶A和α -葡糖苷酶引發(fā)的ADA應(yīng)答的背景中研究甲氨蝶呤。然而，那些研究是用多個周期的甲氨蝶呤處理(Garman等，Clin Exp Immunol,137(3):496-502(2004) ; Jos 印h 等，Cl in Exp Immunol, 152(1):138-46(2008) ; Mendelsohn等，N Engl J Med，360 (2):194-5 (2009))，而不是單個周期的甲氨蝶呤完成的。
[0106]令人驚訝地，我們的研究顯示了單個周期的甲氨蝶呤足以顯著降低ADA和抗異基因移植物抗體。實際上，在牽涉抗體治療劑(例如mATG)的研究中，我們顯示了單個周期的甲氨蝶呤處理比多個周期的甲氨蝶呤處理在降低ADA上更有效。使用甲氨蝶呤的先前研究沒有給出如下的指示，即單個周期的甲氨蝶呤會足以誘導(dǎo)降低ADA，更不用說，它比多個周期處理更有效。已知甲氨蝶呤是細胞毒性的。因此，若假設(shè)通過甲氨蝶呤降低ADA的機制依賴于此特性，則預(yù)測降低治療周期數(shù)目實際上會降低甲氨蝶呤的有益效果。此外，那些先前發(fā)表的研究沒有證明甲氨蝶呤處理對藥動學(xué)、藥效學(xué)、效力、或安全性的益處，如本文中已經(jīng)用單個療程的甲氨蝶呤令人驚訝地證明的。它們也確實沒有披露甲氨蝶呤可以降低抗體療法中的ADA。 [0107]如本文中使用的，單個周期方案指連續(xù)或非連續(xù)幾天的治療方案或治療單元，并且優(yōu)選地，在主要蛋白質(zhì)治療劑的劑量給藥或移植后不超過5 (例如不超過3)天時開始。若將主要蛋白質(zhì)治療劑在多個時期中劑量給藥，則優(yōu)選地，單個周期的甲氨蝶呤處理不延伸過蛋白質(zhì)治療劑劑量給藥的第一個時期。舉例而言，在每周、每月或每年蛋白質(zhì)療法中，單個周期的甲氨蝶呤由在第O天，即第一次對患者給予主要蛋白質(zhì)治療劑，或患者接受組織移植的日期開始連續(xù)三天的甲氨蝶呤攝取(例如口服)組成。然后，患者在第I天(24小時后)和第2天(48小時后)接受一劑甲氨蝶呤。例如，單個周期的甲氨蝶呤也可以由在第O天開始的2、3、4、5、6、7、或8個連續(xù)每日劑量的甲氨蝶呤組成。甲氨蝶呤也可以在認為適當(dāng)?shù)钠渌鼤r間時施用，例如在例如淋巴細胞消減療法中管理繼發(fā)性自身免疫時。優(yōu)選地，單個周期的甲氨蝶呤不持續(xù)長于8天。在一些實施方案中，單個周期的甲氨蝶呤在主要治療性處理(即，用生物制劑治療劑處理)開始之前48小時和之后48小時之間開始。例如，單個周期的甲氨蝶呤可以在主要治療性處理開始之前48小時，之前36小時，之前24小時，之前12小時，同時，之后12小時，之后24小時，之后36小時，或之后48小時開始。
[0108]令人驚訝地，我們的研究還顯示了低劑量的甲氨蝶呤足以管理蛋白質(zhì)療法和移植中不想要的免疫學(xué)應(yīng)答(例如ADA應(yīng)答，和其它不想要的T和/或B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)。因而，在本發(fā)明的實施方案中，可以在超過一個周期中，但是以較低的總劑量施用甲氨蝶呤。例如，可以在患者中在兩個或更多個(例如3、4、5、6，等等)周期中，但是以不超過5mg/kg的總組合劑量施用甲氨蝶呤。
[0109]甲氨蝶呤的劑量會是甲氨蝶呤在單個周期中給予時在降低不想要的免疫學(xué)應(yīng)答(諸如抗體或細胞應(yīng)答)中的有效量。甲氨蝶呤在人患者中的有效量可以在0.05mg/kg至5mg/kg的范圍中。在一些實施方案中，有效量是0.lmg/kg至1.5mg/kg。在一些實施方案中，有效量是0.12mg/kg至1.28mg/kg。在某些實施方案中，有效量是0.12mg/kg。在某些實施方案中，有效量是1.28mg/kg。推薦劑量的甲氨蝶呤可以引起最小限度的安全性風(fēng)險，因為劑量給藥方案僅牽涉短暫療程的甲氨蝶呤，其的劑量水平比低新生物劑量更類似于用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的劑量。在我們的研究中，在小鼠中在每個周期中測試的甲氨蝶呤的總量是14或15mg/kg。小鼠中的14mg/kg甲氨蝶呤大致等于重量為60kg的平均成年人中的68mg或5.92mg/m2。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者可以在不遭受相當(dāng)多毒性的情況中每周接受多至25mg甲氨蝶呤。認為甲氨蝶呤的低新生物劑量是30mg/m2,其顯著高于5.92mg/m2。如此，與此甲氨蝶呤方案的短暫性質(zhì)組合，上文推薦的劑量在成年人中可能是耐受良好的?？紤]患者的身體狀況、年齡、重量、性別、他/她在服用的其它藥物及其已知的副作用和任何其它相關(guān)因素，甲氨蝶呤的確切劑量和方案當(dāng)然應(yīng)當(dāng)由臨床醫(yī)生建立?？梢酝ㄟ^公知的方法監(jiān)測甲氨蝶呤在管理 患者中不想要的抗體應(yīng)答方面的效果，所述公知的方法包括患者的臨床檢查、癥狀、測定ADA或抗異基因移植物抗體滴度的血液測試、免疫組織化學(xué)測定法(例如C4沉積測定法和其它固相抗體檢測方法諸如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和基于珠的熒光測量測定法)。也可以通過測量生物標(biāo)志物諸如MCP-l、IL-13、IL-6、和IL-12 (我們已經(jīng)顯示了它們的水平因甲氨蝶呤處理而降低)，和移行2B細胞、移行3B細胞、濾泡B細胞、邊緣區(qū)B細胞、BlOB細胞、和BlB細胞(我們已經(jīng)顯示了它們的數(shù)目因甲氨蝶呤處理而增加)的水平監(jiān)測效果。另外，在需要時，可以使用TGF-β、FoxP3、IL-5、IL-10、IL-15、和GM-CSF作為生物標(biāo)志物來監(jiān)測甲氨蝶呤對不想要的免疫應(yīng)答的影響。也可以使用生物標(biāo)志物的水平來監(jiān)測甲氨蝶呤對T細胞對治療劑(例如蛋白質(zhì)治療劑)的響應(yīng)性的影響。也可以監(jiān)測T細胞活化的生物標(biāo)志物諸如IL-2、干擾素-Y、和TNF-α作為甲氨蝶呤對T細胞應(yīng)答的影響的讀出。
[0110]由于其控制不想要的免疫應(yīng)答的能力，本發(fā)明的單個周期甲氨蝶呤方案可以擴展許多蛋白質(zhì)治療劑的用途，所述蛋白質(zhì)治療劑在給定患者中的重復(fù)使用過去由于安全性和效力憂慮而受到限制。例如，甲氨蝶呤與Thymoglobulin?的伴隨使用可以將
Thymoglobulin?的效用擴展到期望再次劑量給藥的其它疾病背景，諸如τ細胞介導(dǎo)的
自身免疫性疾病，包括但不限于糖尿病、狼瘡、硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和多發(fā)性硬化。另外，甲氨蝶呤可以擴充阿侖單抗的效力和安全性，例如在自身免疫性疾病諸如多發(fā)性硬化中(其中通常在重復(fù)每年周期中)或在慢性B細胞淋巴細胞性白血病中(其中在12周周期中施用阿侖單抗)，劑量給藥以3mg/天開始(直至輸注反應(yīng)等于或小于2級)，然后放大至IOmg/天(直至輸注反應(yīng)等于或小于2級),且最終向上移動至30mg/天(隔天,每周3次)。這些類型的劑量給藥方案可以加強抑制性ADA應(yīng)答。如此，可以使用甲氨蝶呤來控制ADA和任何其它不想要的免疫應(yīng)答。
[0111]用甲氨蝶呤改善淋巴細胞消減療法
[0112]本發(fā)明的一項例示性應(yīng)用是在治療多發(fā)性硬化(MS)(諸如復(fù)發(fā)-緩解性MS)中使用甲氨蝶呤來改善淋巴細胞消減療法(諸如阿侖單抗療法)。“淋巴細胞消減”是一類通過減少循環(huán)淋巴細胞(例如T細胞和/或B細胞)，導(dǎo)致淋巴細胞減少的免疫抑制。在治療上，可以通過蛋白質(zhì)治療劑諸如Thymoglobulin?、人源化抗CD52單克隆抗體CAMPATH-1H?
(阿侖單抗)、和利妥昔單抗實現(xiàn)淋巴細胞消減。淋巴細胞消減在治療許多自身免疫性狀況中是期望的，包括多發(fā)性硬化(Coles 等，Ann.Neurol.46，296-304 (1999) ; Coles 等，2008)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、和狼瘡。
[0113]淋巴細胞消減療法可以引起繼發(fā)性自身免疫。自身免疫當(dāng)其在第一(“原發(fā)性”)疾病(例如“原發(fā)性”自身免疫性疾病)的發(fā)作后出現(xiàn)時在本文中稱為“繼發(fā)性自身免疫”。繼發(fā)性自身免疫有時在例如淋巴細胞消減療法后具有或已經(jīng)具有淋巴細胞減少的MS患者中出現(xiàn)。在一些個體中，繼發(fā)性自身免疫在淋巴細胞消減療法(例如用阿侖單抗治療)后不久出現(xiàn)。在其他個體中，繼發(fā)性自身免疫可以直到淋巴細胞消減療法后幾個月或幾年才出現(xiàn)；在那些個體中的一些中，到他們形成繼發(fā)性免疫時，可以已經(jīng)發(fā)生實質(zhì)性淋巴細胞恢復(fù)(總淋巴細胞計數(shù))，使得他們可能不再是淋巴細胞減少的。在用抗體治療劑或小分子治療劑治療的背景中可以發(fā)生淋巴細胞消減。
[0114]在淋巴細胞減少性MS患者中出現(xiàn)的繼發(fā)性自身免疫可以是與MS不同的任何類型的自身免疫性狀況，包括但不限于甲狀腺自身免疫(例如格雷夫斯(Graves)氏病)、血小板減少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、免疫性血小板減少癥(immunethrombocytopenia, ITP)、古德帕斯徹(Goodpasture)氏病、自身免疫性嗜中性白血球減少癥(autoimmune neutropenia)、自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)、和自身免疫性淋巴細胞減少(autoimmune lymphopenia)。在一些實施方案中，繼發(fā)性自身免疫是B細胞介導(dǎo)的，即B細胞應(yīng)答和自身抗體與疾病形成和病理學(xué)直接聯(lián)系。
[0115]用于診斷和監(jiān)測這些自身免疫性疾病的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括評估癥狀和醫(yī)學(xué)檢查諸如血液分析。本發(fā)明涵蓋任何已知方法的使用。例如，可以測定患者體液(例如血液)中的自身抗體水平作為檢測自身免疫體征的手段。具體地，可以測量抗核抗體、抗平滑肌抗體、和抗線粒體抗體。如果檢測抗核抗體，那么可以實施別的測定法以測量抗雙鏈DNA抗體、抗核糖核蛋白抗體、和抗La抗體?？梢詼y量抗甲狀腺過氧化物酶(TPO)和抗促甲狀腺激素(TSH)受體抗體以檢測自身免疫性甲狀腺疾??；若檢測抗TPO或抗TSH受體抗體，則可以通過測量游離的T3、游離的T4和TSH水平測量甲狀腺功能是否受到影響?？梢詼y量抗血小板抗體以檢測自身免疫性血小板減少，并且血液血小板水平的測量可以用來測定抗血小板抗體的存在是否引起血小板數(shù)目減少。還可見W02010/041149。
[0116]可以使用本發(fā)明的單個周期甲氨蝶呤方案通過降低ADA以及使繼發(fā)性自身免疫最小化來改善淋巴細胞消減療法的安全性和效力。不希望限于理論，我們認為甲氨蝶呤可以通過同時耐受多種自身抗原來降低繼發(fā)性自身免疫。
[0117]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。雖然與本文中描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用于實施或測試本發(fā)明，下文描述了例示性的方法和材料。通過提及將本文中提及的所有出版物和其它參考文獻完整收錄。在沖突的情況中，應(yīng)當(dāng)以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。雖然本文中引用許多文件，但是此引用不構(gòu)成承認，任何這些文件形成本領(lǐng)域的公知常識的一部分。貫穿本說明書和權(quán)利要求書，詞語“包含”或變型應(yīng)當(dāng)理解為暗示包括陳述的整數(shù)或整數(shù)組，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。材料、方法和例子僅是例示性的，而并不意圖為限制性。
實施例
[0118]本發(fā)明的更多詳情會在以下非限制性實施例中描述。應(yīng)當(dāng)理解，雖然指示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，這些實施例僅作為例示給出，而不應(yīng)解釋為限制所附實施方案。從本公開內(nèi)容和這些實施例看，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的某些特征，且在不偏離其精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明做出各種變化和修飾以使其適合于各種用途和條件。這些工作例中使用的材料和方法如下描述。
[0119]小鼠
[0120]6和12周齡之間的正常雌性C57BL/6小鼠用于家兔抗鼠胸腺細胞球蛋白多克隆抗體(mATG)的體內(nèi)研究，并且獲自 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)或 TaconicLaboratories (Hudson, NY)。阿侖單抗相關(guān)研究米用6-12周齡的人Q)52 (huQ)52)轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠，其獲自Charles RiverLaboratories/Genzyme Corp0依照實驗室動物護理和使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)且在美國實驗室動物護理認可協(xié)會I認可下將小鼠收容并維持，并且這些研究中使用的所有動物方案得到機構(gòu)動物護理和使用委員會批準(zhǔn)。
[0121]用于非臨床藥理學(xué)研究的huO)52Tg小鼠由Xenogen(Cranbury, NJ, USA)生成。為了生成所述小鼠，將含有來自人染色體I的約145個千堿基的基因組DNA的桿粒構(gòu)建體隨機整合入⑶-1胚胎干細胞的小鼠基因組中。依靠此桿粒含有的人基因組DNA跨距，在人⑶52外，構(gòu)建體包含總共5個未知功能的部分或完整基因。桿粒中含有的5個部分或完整基因區(qū)段如下:人CD52基因、新基因(DKFZP434L0117)的3’端、SH3BGRL3基因(SH3域結(jié)合富含脯氨酸的蛋白樣3)、伙伴(socius)基因(SOC)、AIM1L (黑素瘤缺乏I樣)基因、和鋅指蛋白683基因。生成3種建立者系，并且系107在Genzyme建立。
[0122]抗體施用
[0123]如Ruzek 等， Transplantation, 88 (2): 170-9 (2009)中描述的那樣制備多克隆抗體mATG和rblgG，并根據(jù)實驗在多個方案中通過腹膜內(nèi)注射施用。以0.5mg/kg的單次注射或者在0.5mg/kg/天的3或5天周期中靜脈內(nèi)施用單克隆抗體阿侖單抗。
[0124]Myozyme? 處理
[0125]作為配制的藥物產(chǎn)品，使用重組人阿葡糖苷酶a (rhGAA，由Genzyme Corp.以Myozyme?出售)。除非不同地敘述，通過尾靜脈推注用20mg/kg rhGAA每周處理小鼠。在rhGAA 施用前用 5 至 30mg/kg 苯海拉明(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL)腹膜內(nèi)預(yù)防性處理所有小鼠。用無菌0.9%鹽水或rhGAA配制緩沖液靜脈內(nèi)處理對照動物。
[0126]甲氨蝶呤處理
[0127]通過腹膜內(nèi)注射以0.5、1.0、2.0或5mg/kg施用甲氨蝶呤(Calbiochem產(chǎn)品目錄編號#454125) 1-3個周期，其中根據(jù)實驗，每個周期等于注射連續(xù)3、6或7天。在牽涉每月mATG處理的研究中，在初始mATG處理或頭三次mATG處理后0、24、和48小時時以5mg/kg腹膜內(nèi)施用甲氨蝶呤。在第O天和第4天服用mATG的移植物研究中，每日以2mg/kg從第O天至第6天,每日以0.5mg/kg從第O天至第6天,或每日以0.5mg/kg從第O天至第11天給予甲氨蝶呤。
[0128]mATG 處理
[0129]以每四周的5mg/kg腹膜內(nèi)注射或者以在用移植物當(dāng)天(第O天)給予的第一劑的移植物背景中時以相隔4天給予的兩劑20mg/kg施用多克隆抗體mATG。
[0130]來自各種組織的細胞制備物
[0131]對于脾細胞和淋巴結(jié)細胞制備物，通過磨砂玻璃載玻片間均質(zhì)化入含有2%FCS的PBS中，從收獲的小鼠脾或腹股溝和腸系膜淋巴結(jié)生成單細胞懸浮液。對于脾細胞制備物，通過與紅細胞裂解溶液(BD Biosciences, San Diego, CA) 一起溫育1-2分鐘裂解紅細胞。通過眶后取血分離血液，并通過用紅細胞裂解溶液(BD Biosciences)將紅細胞裂解20-30分鐘實施細胞制備。對于所有組織制備物，使用ViCell自動化計數(shù)器(BeckmanCoulter, Fullerton, CA)計數(shù)活細胞。在分離后，在下文描述的測定法中使用前，用PBS/2%FCS清洗所有細胞制備物。
[0132]流式細胞術(shù)
[0133]為了評估不同組織內(nèi)的細胞群體，將組織的單細胞懸浮液與綴合有熒光染料的抗體一起溫育，所述抗體包括抗小鼠⑶4、⑶8、⑶25、⑶44、⑶62L (所有抗體來自 BD Biosciences 或 eBioscience, San Diego, CA)。依照抗 Foxp3 制造商的方案(eBiosciences, San Diego, CA)實施胞內(nèi)Foxp3表達分析。在與抗體一起溫育后,將細胞清洗，并通過流式細胞術(shù)(FACSCanto, BD Biosciences和FCS Express軟件，De Novo軟件,Los Angeles, CA)分析。
[0134]如下定義評估的細胞群體:
[0135]總CD4T 細胞:CD4+CD8、
[0136]總CD8T 細胞:CD8+CD4、
[0137]CD4 未免疫細胞:CD4+CD25TD62L+CD44、
[0138]CD4 記憶細胞:CD4+CD25TD62LXD44+，
[0139]未免疫CD8T 細胞:CD8+CD44XD62L+，
[0140]CD8 記憶細胞:CD8+CD44+CD62I7，
[0141]調(diào)節(jié)T 細胞:CD4+CD25+Foxp3+，
[0142]總B 細胞:CD19+，
[0143]B2/ 濾泡 B 細胞:CD19+CD21intCD23 高，
[0144]BlB 細胞:CD19+CD43+CDllb+，
[0145]移行 IB 細胞:CD19+CD93+CD231gM*，[0146]移行2B 細胞:CD19+CD93+CD23+IgM*，
[0147]移行3B 細胞:CD19+CD93+CD23+IgM低，
[0148]邊緣區(qū)B細胞:CD19+CD21高CD23低，和
[0149]BlOB 細胞:CD19+CD5+CDld+。
[0150]體外阻斷研究測定多至100 μ g/ml mATG沒有阻止這些群體的檢測。
[0151]抗mATG IgG ELISA
[0152]通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分析小鼠血清中抗mATG IgG的水平。簡言之，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中I μ g/ml家兔IgG包被96孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)過夜。在用 Super Block 封閉緩沖液(ThermoScientific, Rockford, IL, USA)封閉后，將血清的連續(xù)稀釋液一式兩份添加至經(jīng)家兔IgG包被的板，并于37°C溫育I小時。將板清洗，并添加綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠 IgG 二抗(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA),并容許于37°C溫育I小時。在最終清洗后，添加3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺底物(BioFx，OwingsMills, MD, USA)，并容許于室溫顯現(xiàn)15分鐘。通過添加IN HCl停止反應(yīng)，并在ELISA讀板儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)上于 450/650nm 閱讀吸光度數(shù)值。終點滴度定義為使用Softmax軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)得到的平均值為高于0.100吸光度的最低稀釋度。
[0153]mATG 特異性 IgG ELISA
[0154]通過ELISA測定小鼠血清。簡言之，用I μ g/ml山羊抗家兔IgG-Fc片段抗體(Bethyl Laboratories, TX, USA)將 96 孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)包被過夜。用0.5%BSA (高純度)封閉后，在必要時稀釋標(biāo)準(zhǔn)對照和血清樣品，并將其一式兩份添加至經(jīng)包被板的孔，并于36-38°C在溫和搖動的情況中溫育I小時。將板清洗，并在適當(dāng)時添加綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗家兔IgG-Fc片段抗體Oethyl Laboratories, TX, USA),并于36-38°C在溫和搖動的情況中溫育I小時。在最終清洗后，添加3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺底物(BioFx, Owings Mills, MD, USA)，并容許于23_25°C顯現(xiàn)15分鐘。通過添加IN HCL停止反應(yīng)，并在 ELISA 讀板儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)上于 450/650nm 閱讀吸光度數(shù)值。對標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推最終濃度。預(yù)先確定的是，通過此方法測量mATG特異性IgG僅受到大于218，000的抗mATG IgG滴度中度影響。
[0155]抗阿侖單抗IgG ELISA
[0156]在阿侖單抗處理后4-6天對小鼠取血，并通過ELISA測量特異性抗阿侖單抗IgG。簡言之，用 PBS (ρΗ7.2)中的 3 μ g/ml 阿侖單抗將 96 孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)包被過夜。在用PBS中的0.1%BSA封閉后，將血清的連續(xù)稀釋液一式兩份添加至經(jīng)阿侖單抗包被的板，并于37°C溫育I小時。將板清洗，并添加綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠 IgG 二抗(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA),并容許于37°C溫育I小時。在最終清洗后，添加TMB底物(BioFx, Owings Mills, MD，USA)，并容許于室溫顯現(xiàn)15分鐘。通過添加IN HCl停止反應(yīng)，并在ELISA讀板儀(MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA)上于450/650nm閱讀吸光度數(shù)值。終點滴度定義為使用Excel軟件(Microsoft，Redmond, WA, USA)得到的經(jīng)對數(shù)換算的在吸光度數(shù)值0.2處插入的樣品稀釋度的逆對數(shù)。[0157]抗rhGAA IgG ELISA
[0158]在rhGAA處理后4-6天對小鼠取血，并通過ELISA測量特異性IgG。簡言之，用乙酸鈉緩沖液(pH5.0)中的 5 μ g/ml rhGAA 將 96 孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)包被過夜。在用PBS中的0.1%BSA封閉后，將血清的連續(xù)稀釋液一式兩份添加至經(jīng)rhGAA包被的板，并于37°C溫育I小時。將板清洗，并添加綴合有HRP的山羊抗小鼠IgG 二抗(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA),并容許于 37 °C 溫育 I 小時。在最終清洗后，添加3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺底物(TMB, KPL, Gaithersburg1MD),并容許于室溫顯現(xiàn)15分鐘。通過添加IN HCL停止反應(yīng)，并在ELISA讀板儀(MolecularDevices, Sunnyvale, CA)上于450/650nm閱讀吸光度數(shù)值。終點滴度定義為使用Softmax軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)得到的產(chǎn)生吸光度數(shù)值0.2的樣品稀釋度的倒數(shù)。
[0159]離體研究
[0160]通過腹膜內(nèi)注射1-3個周期對8-12周齡的C57BL/6 (Jackson Laboratories)或E4GAAK0(Charles River)小鼠給予5mg/kg 甲氛蝶呤(Calbiochem產(chǎn)品目錄編號#454125),其中I個周期等于連續(xù)注射3天。以第一劑甲氨蝶呤開始，通過尾靜脈注射給予20mg/kg Myozyme? (Genzyme Corporation) 一次或持續(xù)2-6個每周劑量。在啟動處理后每周
或每日處死動物。收集脾、腸系膜、和腹股溝淋巴結(jié)以對T和B細胞子集進行流式細胞術(shù)分析，并收集血清進行ELISA測定法。將脾在玻璃載玻片間加工，并將紅細胞(RBC)用購自BD Biosciences的裂解緩沖液(產(chǎn)品目錄編號#555899)依照制造商的用法說明書裂解。將淋巴結(jié)在玻璃載 玻片間加工，并用含有2%胎牛血清(FCS)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗。將細胞在200 μ L含有4%胎牛血清和25 μ g/mL總小鼠IgG的PBS中重懸，并于4°C封閉30分鐘。用不同抗體混合物染色約300萬個脾細胞和100萬個淋巴結(jié)細胞，并在BectonDickinson CANT0II流式細胞儀上用高通量取樣器(HTS)分析。在淋巴細胞門內(nèi)獲得至少100，000個細胞事件。抗小鼠抗體混合物由PE-CD21/35產(chǎn)品目錄編號#552957、FITC-產(chǎn)品目錄編號#553138、PE-CD138產(chǎn)品目錄編號#553714、PE-CD127產(chǎn)品目錄編號#552543、APC-Cy7-CD19 產(chǎn)品目錄編號 #557655、FITC_CD43 產(chǎn)品目錄編號 #553270、PE-Cy7_CD4 產(chǎn)品目錄編號#552775、FITC-CD3e產(chǎn)品目錄編號#553062、APC-CDllb產(chǎn)品目錄編號#553312、PE-Cy7-1gM產(chǎn)品目錄編號 #552867、APC-Cy7-CD8 產(chǎn)品目錄編號 #557654、PE-CD273 (PD-L2)產(chǎn)品目錄編號#557796、APC-CD138產(chǎn)品目錄編號#558626、PE-Cy7_CDllb產(chǎn)品目錄編號#552850、PE-CD93 (早期B譜系)產(chǎn)品目錄編號#558039、APC_CD69產(chǎn)品目錄編號#560689、Pe-Cy7-CD24產(chǎn)品目錄編號#560536、FITC-CDld產(chǎn)品目錄編號#553845、APC-CD5產(chǎn)品目錄編號 #550035、和 Percp-Cy5-7AAD 產(chǎn)品目錄編號 #559925 (均購自 BD Pharmingen)組成。FITC-FoxP3 胞內(nèi)染色試劑盒購自 eBioscience。Pacific Blue (PB)-CD25 產(chǎn)品目錄編號#102022、PB-CD23產(chǎn)品目錄編號#101616和PB-CD86產(chǎn)品目錄編號#105022購自BioLegend0用由De Novo軟件提供的FCS Express第3版軟件實施對淋巴細胞子集的分析。用批處理選項產(chǎn)生百分比，并依照獲得的細胞計數(shù)計算絕對數(shù)目。用Beckman計數(shù)器V1-細胞XR細胞存活力分析儀依照制造商的用法說明書獲得脾和淋巴結(jié)細胞計數(shù)。
[0161]體外和細胞因子分析
[0162]以用20mg/kg rhGAA處理開始，通過腹膜內(nèi)注射對8-12周齡的C57BL/6 (JacksonLaboratories)或 E4GAAK0 (Charles River)小鼠給予 5mg/kg 甲氛蝶呤(Calbiochem 產(chǎn)品目錄編號#454125)達I個周期(連續(xù)3個每日劑量)。對于IDll研究，以rhGAA和甲氨蝶呤處理開始，每周3次(每隔一天)用5mg/kglDll或13C4(Genzyme Corporation)的腹膜內(nèi)注射處理動物。根據(jù)小鼠品系，在rhGAA啟動后第6天或第7天處死動物。將脾制備為單細胞懸浮液，并依照制造商的用法說明書加載至RoboSep (STEMCELL technologies)儀上,并進行B細胞負選擇。將純化的B細胞在96孔圓底板(Costar產(chǎn)品目錄編號#3799)中以每孔500，000個細胞接種，并于37°C在無刺激的情況中或與IOy g/mL LPS(Sigma產(chǎn)品目錄編號札5014) —起溫育48小時。依照制造商的用法說明書，所有孔接受莫能菌素(Monensin)(BD Bioscience產(chǎn)品目錄編號#554724)。容許細胞于37°C溫育至少4小時。將樣品轉(zhuǎn)移至V底孔(USA Scientific產(chǎn)品目錄編號#651201)，并于4°C以1200rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。將細胞在200 μ L含有4%胎牛血清和25 μ g/ml總小鼠IgG的PBS中重懸，并于4°C封閉30分鐘。將板再次旋轉(zhuǎn)，并在添加10 μ I上文描述的抗體混合物的情況中在90 μ L PBS/2%FCS中重懸，并于4°C溫育20分鐘，對于最后10分鐘的染色規(guī)程，添加5 μ L7AAD。將100 μ L緩沖液添加至樣品及隨后的旋轉(zhuǎn)用作清洗?？梢詫悠吩诰彌_液中重懸以進行蛋白質(zhì)表面分析和立即獲取或者在Fix/Perm (eBioscience產(chǎn)品目錄編號#11-5773)中重懸以依照制造商的用法說明書進行IL-10 (BioLegend產(chǎn)品目錄編號#505008) ,TGF-β (BioLegend產(chǎn)品目錄編號#141404)和FoxP3 (eBioscience產(chǎn)品目錄編號#11-5773-82)的胞內(nèi)染色。別的表面染色包括TGF-β和Tim-1 (BioLegend產(chǎn)品目錄編號#119506)抗體。如上文描述的那樣獲得并分析所有樣品。
[0163]動物和心臟異基因移植物模型
[0164]C57BL/6 和 BALB/c 小鼠獲自 Charles River (Kingston, NY 或 Raleigh, NC)，并在8和13周齡之間在這些實驗中使用。首先用氯胺酮(Fort Dodge Animal Health/Pfizer, Fort Dodge, IA)和甲苯噻嗪(Lloyd, Shenandoah, IA)的腹膜內(nèi)注射麻醉供體異體C57BL/6小鼠，并實施正中胸骨切開術(shù)。經(jīng)由下腔靜脈給供體心臟緩慢原位輸注Iml冷肝素化林格(Ringer)氏乳酸鹽溶液(Baxter Healthcare, Deerfield, IL),并將上腔靜脈前的主動脈和肺靜脈結(jié)扎并分開。然后，橫切升主動脈和肺動脈，從供體取出移植物，并將心臟在冰冷的鹽水中貯存，直至嫁接。將接受小鼠(Balb/c)類似麻醉并準(zhǔn)備，如上文對供體小鼠描述的，只是打開腹腔。使用手術(shù)顯微鏡觀察打開的腹腔，分離腹主動脈(AA)和下腔靜脈(IVC)。將供體心臟放入接受者腹部中(顛倒)，并在供體肺動脈和接收者下腔靜脈，以及供體主動脈和接受者腹部主動脈之間用端-側(cè)吻合術(shù)對移植物血運重建。在確認止血后，用連續(xù) 5-0 Vicryl 縫線(Ethicon, Johnson&Johnson, Somerville, NJ)閉合腹肌，并用連續(xù)5-OEthilon縫線(Ethicon)閉合皮膚。實施標(biāo)準(zhǔn)的術(shù)后疼痛評估和管理。通過對于頭30天，每周觸診5-7次，然后每周3-4次，直到研究結(jié)束來評估移植物。
[0165]用I 劑 20mg/kg 靜脈內(nèi) rhGAA (Genzyme Corporation)、連續(xù) 3 劑腹膜內(nèi) 5mg/kg 甲氨蝶呤(APP Pharmaceuticals, LLC)、和每隔一天 3 劑 5mg/kglDll 或 13C4(GenzymeCorporation)處理C57B1/6小鼠。甲氨蝶呤、1D11、和13C4處理以rhGAA注射開始。處理啟動后7天收集脾，并加工，如上文對B細胞、培養(yǎng)和流動分析描述的。另外，通過如上文描述的那樣處理動物獲得rhGAA滴度數(shù)據(jù)，在12周里每周給藥rhGAA，將甲氨蝶呤給藥I或3個周期，并每隔一天一周3次將IDll或13C4給藥12周。每2周收集血清樣品進行ELISA分析。
[0166]組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)
[0167]將心臟移植物在10%中性緩沖福爾馬林中固定，沿著縱軸兩分以暴露右和左心室和流出道，并常規(guī)加工以進行石蠟包埋。以5微米切出切片，并用蘇木精和曙紅(H&E)或馬森(Masson)氏三色染色。還對連續(xù)切片免疫染色，如下文描述的。使用組織學(xué)分級方案對每個經(jīng)H&E染色的切片定性評估異基因移植物排斥病理學(xué)的各種特征(例如血管炎、心肌變性和壞死、心肌炎)。
[0168]使用Bond-Max 自動化免疫染色系統(tǒng)(Leica Microsystems Inc., BuffaloGrove, IL)實施免疫組織化學(xué)。為了檢測⑶3和Foxp3雙重免疫陽性細胞，使用Bond聚合物精制檢測試劑盒(Polymer Refine Detection kit)和Bond聚合物AP紅色試劑盒(Leica, Buffalo Grove, IL)遵循制造商的指南將移植物組織切片用抗⑶3和抗Foxp3抗體進行雙重免疫染色。簡言之，將脫石蠟的石蠟包埋移植物切片進行熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)(于99 °C為25分鐘)，與無血清蛋白質(zhì)封閉劑(serum free protein block)(Dako, Carpentaria, CA)、家兔單克隆抗 Q)3 抗體(Lab Vision/Neo Marker)、綴合有過氧化物酶的聚合物、過氧化物酶封閉劑(peroxidase block)、和二氨基聯(lián)苯檢測試劑,接著是大鼠抗小鼠Foxp3抗體(eBioscience Inc., San Diego, CA)，然后是家兔抗大鼠抗體(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 一起溫育。然后，將載玻片與 Bond 聚合物AP和混合的紅色檢測試劑一起溫育，最終用蘇木精復(fù)染色。在陰性對照載玻片中，分別用Chromepure 全家兔 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)和大鼠 IgG2a(AbD Serotec, Raleigh, NC)替換抗 CD3 和抗 Foxp3—抗。
[0169]血清同種抗體水平
[0170]通過將以1:50稀釋的來自經(jīng)心臟移植的或正常的小鼠的血清與經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的C57BL/6成纖維細胞系(SVB6) —起溫育，接著使用FITC家兔抗小鼠IgG(Dako, Carpinteria, CA)及通過流式細胞術(shù)分析檢測成纖維細胞結(jié)合的抗體(同種抗體)來測定血清同種抗體水平。用血清染色的成纖維細胞的幾何均值熒光強度除以經(jīng)同種型對照染色的成纖維細胞以在實驗間標(biāo)準(zhǔn)化同種抗體水平。特別地，血清抗體對同種成纖維細胞的結(jié)合是同種抗體， 因為相同血清樣品不結(jié)合經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的BALB/c成纖維細胞系(SVBalb)(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0171]過繼轉(zhuǎn)移小鼠模型
[0172]C57BL/6小鼠獲自Jackson Laboratories,并且在無特定病原體條件下收容。以20mg/kg對對照小鼠給予rhGAA的單次靜脈內(nèi)注射。在三次連續(xù)的每日0.5mg甲氨蝶呤腹膜內(nèi)注射外，以20mg/kg對耐受化小鼠給予rhGAA的單次靜脈內(nèi)注射。在初始rhGAA注射后第6天從兩個供體組收獲脾，并加工成合并的單細胞懸浮液。將細胞清洗,并過濾流過0.22 μ M濾器。然后，使用StemCell Technologies RoboSep細胞分離系統(tǒng)對細胞富集B細胞，并重懸以容許200 μ I靜脈內(nèi)注射。耐受化的和非耐受化的接受者組經(jīng)由靜脈內(nèi)注射接受較高的細胞IOxlO6或較低的細胞5χ106濃度。對對照組給予僅rhGAA，或rhGAA和甲氨蝶呤(單個周期的三次連續(xù)每日MTX注射)。所有組接受每周靜脈內(nèi)rhGAA20mg/kg注射，并每兩周眶后取血16周，放入BD Vacutainer血清分離管。將血清取出，并在_20°C下貯存，直至用于ELISA。使用ELISA測定抗rhGAA抗體滴度，在SpectraMax M2上讀出，并使用Softmax計算以推斷滴度數(shù)值。將含有對照和滴度信息的原始數(shù)據(jù)Softmax文件和EXCEL擴展頁存儲在網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上。使用GraphPad Prism軟件產(chǎn)生所有圖和統(tǒng)計學(xué)。
[0173]實施例1:響應(yīng)抗體治療劑生成抗藥物抗體
[0174]多克隆抗體mATG結(jié)合多種免疫細胞類型，包括抗原呈遞細胞。我們的數(shù)據(jù)顯示了單個療程的mATG (相隔三天給予的兩劑25mg/kg，腹膜內(nèi)施用)可以在小鼠中產(chǎn)生高達100，000的抗mATG IgG滴度(圖1A)。在以連續(xù)每月注射(5mg/kg，每4周)給予時，抗mATG滴度進一步升高，滴度在5次每月注射后高達5xl06 (圖1B)。對于單個療程和每月注射兩者，使用家兔IgG(rblgG)作為對照。 [0175]由于阿侖單抗不與鼠⑶52起交叉反應(yīng)，必須在hu⑶52Tg小鼠(其中轉(zhuǎn)基因表達樣式與人中的⑶52表達相似)中完成用阿侖單抗的臨床前研究。與mATG類似，阿侖單抗(0.5mg/kg)的靜脈內(nèi)施用在hu⑶52Tg小鼠中引發(fā)顯著的ADA應(yīng)答。這些應(yīng)答在頭四次處理中升高，然后降低，使得在第五劑阿侖單抗后，hu⑶52Tg小鼠不再生成抗阿侖單抗抗體(圖2)。此非響應(yīng)性提示了已經(jīng)發(fā)生天然耐受性(Rosenberg等，Blood, 93 (6):2081-8 (1999))。
[0176]數(shù)據(jù)顯示了 C57BL/6小鼠中針對mATG的ADA滴度和huCD52Tg CDl小鼠中針對阿侖單抗的ADA滴度較高(>100，000)。此高水平的免疫原性可以歸因于mATG和阿侖單抗結(jié)合抗原呈遞細胞的能力，由此增強抗原加工和呈遞以誘導(dǎo)針對它們的免疫應(yīng)答。
[0177]實施例2:甲氨蝶呤在單個周期施用的情況中控制抗mATG IgG應(yīng)答
[0178]已經(jīng)在Thymoglobulin?處理后報告了升高的抗體滴度，并且已經(jīng)在用
Thymoglobul in?治療的患者中描述了血清病、急性腎衰竭和心血管反應(yīng)的病例報告(Boothpur 等，見上文；Lundquist 等，Liver Transpl, 13(5):647-50(2007);Busani等,Minerva Anestesiol, 72 (4): 243-8 (2006) ; Tanriover 等，Transplantation, 80 (2): 279-81(2005) ; Buchler 等，Clin Transplant, 17(6): 539-45 (2003))。為了測定甲氨蝶呤是否可以降低抗ATG應(yīng)答，且如此減輕這些安全性憂慮，評估僅以單個周期給予的三天甲氨蝶呤方案作為控制小鼠中抗mATG IgG應(yīng)答的手段。這與先前發(fā)表的方案的不同之處在于與在ERT的背景中給予的至少三個周期形成對比，僅與mATG —起施用單個周期的甲氨蝶呤。在比較效應(yīng)曲線下面積時，在兩次mATG施用(25mg/kg,相隔3天)的第一次開始，以5mg/kg腹膜內(nèi)施用連續(xù)6天的甲氨蝶呤(Calbiochem產(chǎn)品目錄編號#454125)可以在處理后至少8周里將抗mATG IgG應(yīng)答抑制95% (圖3)。
[0179]接著，評估以5mg/kg/注射5次每月注射mATG后甲氨蝶呤對抗mATG滴度的影響。實施mATG處理的每月注射，因為淋巴細胞再增殖在mATG處理后I個月幾乎完成(Ruzek，見上文)。然后，在每月處理的20周里每周量化抗藥物抗體應(yīng)答。在此時段期間，盡管mATG消減⑶4+T細胞，抗體滴度達到高達500萬(圖1B)。令人感興趣地，以與mATG相同的劑量水平和日程表接受非特異性家兔IgG的動物顯示較低的抗家兔IgG應(yīng)答(圖1B)。一種關(guān)于增強的mATG免疫原性的可能性可以是mATG對抗原呈遞細胞(APC)諸如濾泡樹突細胞(其在存在補體的情況中時可以顯著增強B細胞應(yīng)答)的特異性結(jié)合。還評估兩種甲氨蝶呤處理方案。在用酶替換療法(ERT)的先前工作中，在頭三劑酸性α-葡糖苷酶期間給予的三個周期的甲氨蝶呤在每周ERT劑量給藥的至少8個月里提供抗體滴度的持續(xù)降低(Joseph等，Clin Exp Immunol, 152(1):138-46 (2008))。在mATG的背景中評估相似療程的甲氨蝶呤，其中在mATG施用15分鐘內(nèi)及頭三次每月mATG處理之每次后24和48個小時給予5mg/kg甲氨蝶呤。比較效應(yīng)曲線下面積，此方案將抗mATG抗體應(yīng)答從約400萬的滴度成功降低至816，000的滴度，這產(chǎn)生79%降低(圖4A)。
[0180]另外，評估僅5次每月mATG處理的第一次左右給予的單個療程甲氨蝶呤對抗mATGIgG應(yīng)答的影響，并與三周期方案直接比較。令人驚訝地，此單個周期方案比三周期方案甚至進一步降低抗mATG IgG滴度至約50，000的滴度(圖4B)。比較效應(yīng)曲線下面積,單個周期方案將抗mATG IgG滴度降低98%，而三周期方案將滴度降低69%(圖4C)。單個周期對三周期方案的升高的效果提示提高甲氨蝶呤暴露可以實際上拮抗其耐受化效應(yīng)，其可能通過殺死介導(dǎo)對抗體滴度的控制的細胞進行。
[0181]實施例3:甲氨蝶呤誘導(dǎo)免疫耐受性的活性機制[0182]如上文顯示的，非常短暫療程的甲氨蝶呤可以在多輪抗原攻擊里顯著控制抗體應(yīng)答。在此背景中，短暫的周期是單個周期的甲氨蝶呤，其在測試數(shù)月的過程里(對抗體滴度和細胞因子兩者)產(chǎn)生持久的影響。對抗體應(yīng)答的此長時間控制提示了甲氨蝶呤可以成功誘導(dǎo)免疫耐受性。至此已經(jīng)在連續(xù)5劑每月mATG的背景中評估了甲氨蝶呤。為了進一步評估是否已經(jīng)活化免疫耐受性機制，從處理扣留最初接受5次每月mATG注射的動物達8周。在此休息期后，對動物給予最終的mATG注射。若采用免疫耐受性的機制，則抗mATG IgG滴度在第6次mATG處理后不應(yīng)顯著升高。
[0183]我們的數(shù)據(jù)顯示了沒有用甲氨蝶呤劑量給藥的動物經(jīng)歷抗mATG IgG滴度的升高，如預(yù)期的(圖5)。相反，在第一次mATG注射時僅接受一個周期的甲氨蝶呤的動物不生成顯著較大的抗mATG IgG滴度(圖5)。在用三個周期的甲氨蝶呤處理的動物中觀察到類似的趨勢，盡管效果不是一樣顯著的(圖5)。在比較效應(yīng)曲線下面積時，單個療程的甲氨蝶呤將滴度降低99%，而三周期方案將滴度降低85%。這些數(shù)據(jù)指示甲氨蝶呤可以維持對回憶應(yīng)答的控制，這提示了小鼠已經(jīng)形成針對此抗原的耐受性。
[0184]雖然經(jīng)甲氨蝶呤處理的動物在連續(xù)mATG處理的情況中生成升高的可測量滴度，但是總體上，經(jīng)甲氨蝶呤處理的動物中的滴度水平比僅用mATG處理的動物中觀察到的那些滴度水平一致地低100倍(圖6)。較低的抗體滴度水平應(yīng)當(dāng)顯著降低安全性風(fēng)險和效力影響的潛力。雖然不希望受限于理論，但是這些數(shù)據(jù)提示已經(jīng)導(dǎo)出控制的活性機制，其可以顯著降低抗mATG IgG應(yīng)答，并且在甲氨蝶呤處理后長期維持。
[0185]實施例4:單個周期的甲氨蝶呤可以顯著控制抗阿侖單抗應(yīng)答
[0186]在緩解-復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化中，在每年周期中劑量給藥阿侖單抗，并且患者可以產(chǎn)生 ADA (Coles 等，N Engl J Med, 359 (17): 1786-801 (2008))。由于免疫原性和藥動學(xué)測試在多項III期研究中正在進行，不清楚抗阿侖單抗抗體在患者子集中是否會影響暴露、效力、和/或安全性。如此，我們評估單個周期的甲氨蝶呤是否可以控制5個每月單次注射周期的阿侖單抗后的ADA滴度。對huCD52Tg小鼠每月靜脈內(nèi)給予阿侖單抗(0.5g/kg)達連續(xù)5個月。在第一劑每月阿侖單抗給藥前15分鐘及給藥后24和48小時以0.5、I或5mg/kg給予甲氨蝶呤。lmg/kg甲氨蝶呤提供一些益處，因為它將抗阿侖單抗應(yīng)答降低88% (圖7A)。5mg/kg甲氨蝶呤將抗阿侖單抗IgG應(yīng)答成功降低99%(圖7A)。甲氨蝶呤表現(xiàn)為對天然耐受性沒有影響。
[0187]第二項研究確認上述發(fā)現(xiàn)。如上文,用5劑每月0.5mg/kg阿侖單抗處理hu⑶52轉(zhuǎn)基因小鼠。與第一次阿侖單抗施用結(jié)合，還用或不用3劑每日5mg/kg/天甲氨蝶呤處理小鼠(圖7B)。貫穿整個研究收集血清樣品以評估抗阿侖單抗滴度并確認耐受性。在第5劑每月給藥后24小時時獲得滴度數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)證明了甲氨蝶呤降低抗阿侖單抗抗體滴度(圖7C)。
[0188]實施例5:甲氨蝶呤在臨床相關(guān)阿侖單抗劑量給藥方案的背景中可以控制抗阿侖單抗抗體應(yīng)答
[0189]進行一系列實驗以評估甲氨蝶呤是否可以成功控制huCD52Tg小鼠中在阿侖單抗的臨床相關(guān)劑量給藥方案的背景中的ADA。在臨床中，以12mg/天的5次每日處理的初始周期劑量給藥阿侖單抗。患者中初始處理周期后12個月，施用額外周期三劑每日12mg阿侖單抗。在第二個處理周期時，循環(huán)⑶19+B細胞的水平已經(jīng)恢復(fù)到基線數(shù)值；然而，循環(huán)⑶4+T輔助細胞和⑶8+T細胞毒性細胞的水平尚未完全再生(Coles等，N Engl JMed, 359(17):1786-801(2008))。
[0190]最初，在hu⑶52Tg小鼠中調(diào)查5次阿侖單抗每日處理后循環(huán)T和B細胞子集的消減和再生動力學(xué)。在經(jīng)由靜脈內(nèi)注射以0.5mg/kg (等同于12mg/kg人劑量)用阿侖單抗連續(xù)5天處理的hu⑶52Tg小鼠的外周血中，總⑶3+T細胞、⑶4+T輔助細胞、和⑶8+T細胞毒性細胞在處理后4周沒有恢復(fù)到處理前水平，而⑶19+B細胞數(shù)目回到對照水平(圖8A-D) 。
[0191]為了模擬再次處理時患者經(jīng)歷的細胞環(huán)境，在第一個周期后4和5周之間在hu⑶52Tg小鼠中再施用阿侖單抗。由于阿侖單抗的初始療程是5天周期，在每次每日阿侖單抗處理前15分鐘施用甲氨蝶呤，然后施用2天。此方案中給予的甲氨蝶呤的最大累積循環(huán)劑量是14mg/kg(2mg/kg/天)，其非常類似于在以5mg/kg/天的三天療程給予甲氨蝶呤時15mg/kg的積累劑量。我們評估2、I和0.5mg/kg/天甲氨蝶呤施用在三個阿侖單抗處理周期里對抗阿侖單抗抗體的影響。在lmg/kg，甲氨蝶呤表現(xiàn)為控制測試的8只小鼠之7只中的滴度，并且總體上將滴度降低79%(圖9B)。在2mg/kg，在比較效應(yīng)曲線下面積時，甲氨蝶呤將ADA成功降低98% (圖9A)。
[0192]實施例6:甲氨蝶呤可以改善mATG的藥動學(xué)和藥效學(xué)
[0193]ADA可以干擾蛋白質(zhì)治療劑的藥動學(xué)和藥效學(xué)。我們評估了抗mATGIgG ADA應(yīng)答是否干擾mATG藥動學(xué)。用單獨的mATG或與單個周期的甲氨蝶呤一起的mATG的每月注射處理小鼠5個月。以5mg/kg每日施用甲氨蝶呤達三劑。在第I個月、第3個月、和第5個月后的多個時間點時對血液取樣以測定循環(huán)mATG的水平(圖10)。
[0194]在第I個月時，循環(huán)mATG的水平在兩個處理組間是相似的，但是在第3個月和第5個月時，僅經(jīng)甲氨蝶呤處理的組具有可測量的循環(huán)mATG水平。在不施用甲氨蝶呤的情況中，第三和第五劑mATG后測量的mATG水平顯著低于第一劑后測量的那些水平(圖10)。先前的研究已經(jīng)顯示了甲氨蝶呤顯著降低抗mATG IgG應(yīng)答。如此，表現(xiàn)為針對mATG的抗體干擾mATG暴露和藥動學(xué)。
[0195]由于針對mATG的抗體表現(xiàn)為在重復(fù)劑量給藥后顯著降低循環(huán)mATG的水平，可以預(yù)期在再次劑量給藥時mATG的藥效學(xué)也受到負面影響。在第五次每月mATG處理(此時滴度為其最高)時評估血液、脾和淋巴結(jié)中的淋巴細胞消減。如上文描述的，對用甲氨蝶呤處理的動物給予單個周期的處理。
[0196]循環(huán)⑶4+和⑶8+T細胞的水平在用mATG而非甲氨蝶呤處理的動物中在第五次mATG處理后不變。然而，在用mATG和一個周期的甲氨蝶呤處理的動物中，循環(huán)⑶4+和⑶8+T細胞是顯著消減的(圖11)。在脾和淋巴結(jié)中也類似地觀察到此效果。甲氨蝶呤處理增強mATG增加脾和血液中T調(diào)節(jié)細胞的百分比的能力(圖12A-B)。在血液和淋巴結(jié)中觀察到類似的效果。已經(jīng)假定mATG和Thymoglobulin?處理后增強的T調(diào)節(jié)細胞存在促成此治療劑的效力(Ruzek等，Blood, 111 (3): 1726-34 (2008))。甲氨蝶呤在連續(xù)療程的mATG后幫助維持此效應(yīng)的能力是顯著降低抗體抗家兔IgG滴度的潛在添加益處。
[0197]至此，藥動學(xué)和效力研究提示了抗mATG抗體干擾mATG的暴露和效力?？筸ATG IgG滴度和mATG暴露之間的直接比較揭示了在終點滴度大于10，000時，循環(huán)mATG的水平顯著降低(圖13a)。然而，在抗mATG IgG滴度大于100,000時，mATG介導(dǎo)的細胞消減受到抑制(圖13b和13c)。滴度和細胞消減之間的R2關(guān)聯(lián)>0.7。
[0198]實施例7:甲氨蝶呤可以改善阿侖單抗的藥效學(xué)
[0199]甲氨蝶呤不僅增強mATG的藥效學(xué)，而且在抗阿侖單抗應(yīng)答表現(xiàn)為中和一些消減活性時還恢復(fù)阿侖單抗介導(dǎo)的對循環(huán)T和B細胞的消減。在此實施例中描述的研究中，在有和無甲氨蝶呤的情況中對huCD52Tg小鼠給予5次每月靜脈內(nèi)阿侖單抗注射。對于6個月研究的頭三天，每日施用5mg/kg甲氨蝶呤。在第五劑前2天和第五劑阿侖單抗后I天從兩個處理組的動物收獲血液。通過流式細胞術(shù)評估細胞群體,如實施例6中描述的。
[0200]我們的數(shù)據(jù)顯示了第五劑每月阿侖單抗表現(xiàn)為不再消減T細胞，因為循環(huán)T細胞的絕對數(shù)目在處理之前和之后似乎是相似的(圖14 (每個時間點代表不同組的動物))。相反，甲氨蝶呤表現(xiàn)為已經(jīng)恢復(fù)阿侖單抗消減T細胞的能力(P=0.012)。在阿侖單抗劑量給藥前2天或后I天比較僅用阿侖單抗處理的動物和用阿侖單抗和甲氨蝶呤兩者處理的動物中的循環(huán)T細胞的絕對數(shù)目時，循環(huán)T細胞的數(shù)目在經(jīng)甲氨蝶呤處理的動物中顯著更低(P=0.034和0.02;圖14)。類似地，甲氨蝶呤處理似乎增強阿侖單抗對B細胞的消減(分別為P=L 2xl0_5，P=0.02)， 并且循環(huán)B細胞的數(shù)目在經(jīng)甲氨蝶呤處理的動物中在處理后I天進一步減少(圖14)。
[0201]實施例8:單個周期的甲氨蝶呤可以顯著控制抗rhGAA抗體應(yīng)答
[0202]我們還研究了甲氨蝶呤在rhGAA酶替換療法中的效果。在此研究中，將動物每周注射rhGAA達連續(xù)12天,然后休息4周,然后在第16周時用rhGAA再攻擊。還對動物給予第I周時單個周期的連續(xù)三劑每日5mg/kg甲氨蝶呤，或者在第I周、第2周和第3周之每周給予一個周期(總共三個周期)。在第O周(任何處理前)、第6周、第8周、第12周、第16周、第18周、和第20周時在動物中測量rhGAA特異性IgG滴度。我們的數(shù)據(jù)顯示了單個周期的甲氨蝶呤與三周期方案一樣好地控制至少20周里的抗rhGAA應(yīng)答(圖15)。
[0203]還已經(jīng)在T細胞缺陷型Nu/Nu小鼠中進行研究以評估T細胞在產(chǎn)生抗rhGAA滴度中的作用。在這些實驗中，我們已經(jīng)重復(fù)觀察到在這些T細胞缺陷型小鼠中很少至不形成針對rhGAA的ADA(圖37A-B)。這些數(shù)據(jù)支持如下的觀念，即T細胞促成抗rhGAA滴度。如此，由于甲氨蝶呤可以控制針對rhGAA的ADA，它也可能影響針對rhGAA的T細胞應(yīng)答。
[0204]實施例9:甲氨蝶呤增強mATG介導(dǎo)的心臟異基因移植物存活
[0205]在評估甲氨蝶呤是否可以增強mATG在正常小鼠中的效力外，我們還調(diào)查了在移植背景中是否可以通過甲氨蝶呤提升mATG功能。由于Thymoglobulin?在臨床上用作誘
導(dǎo)療法以延長移植物存活，我們評估甲氨蝶呤的添加是否可以提升鼠異基因心臟移植物模型中mATG的效力。在第O天和第4天施用20mg/kg mATG,而在第0_6天以單個周期處理施用2mg/kg甲氨蝶呤。[0206]另外，我們調(diào)查了在相同方案下或在連續(xù)12天的延長方案的情況中給予的低4倍劑量的甲氨蝶呤(0.5mg/kg)。各組小鼠接受無處理(鹽水對照)、單獨的mATG、或mATG和甲氨蝶呤組合方案。與正常小鼠中的研究相似，與mATG共施用的甲氨蝶呤降低針對mATG的抗藥物抗體滴度，不管使用的方案如何(圖16A和表1)。此外，與抗體滴度降低一致的是此移植物背景中觀察到的mATG暴露延長(圖16)。鑒于針對移植的組織的有力的、一致的免疫應(yīng)答的條件下可能的輔助效應(yīng)，抗藥物抗體滴度甚至比在正常小鼠背景中更快升高，并且導(dǎo)致第一次mATG施用的7天內(nèi)幾乎檢測不到的mATG水平(圖16B)。相反，到移植后7天，抗家兔IgG抗體滴度在用甲氨蝶呤處理的小鼠中顯著較低，并且循環(huán)mATG水平在那些小鼠中顯著較高。這強調(diào)在正在進行的炎性應(yīng)答的條件下，抗藥物抗體應(yīng)答可以被加速，并且可能對藥效學(xué)和效力具有甚至更大的影響。重要地，即使在這些條件下，甲氨蝶呤對mATG抗藥物抗體具有深遠的抑制影響，并且增強mATG暴露。然而，由于循環(huán)mATG水平在mATG和甲氨蝶呤組合處理的情況中到21天仍然低得檢測不到，鑒于>100天移植物存活，別的耐受性機制可能發(fā)揮作用。這些結(jié)果證明了 mATG和甲氨蝶呤處理之間對同種移植物存活的明顯協(xié)同作用，并且顯示了類似水平的mATG抗藥物抗體降低和mATG暴露增強，如在正常小鼠中觀察到的。
[0207]表1:甲氨蝶呤方案降低心臟異基因移植物移植小鼠中的抗mATG抗體滴度
[0208]
【權(quán)利要求】
1.一種在需要用治療劑治療的受試者中誘導(dǎo)免疫耐受性的方法，其包括在單個周期中對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中誘導(dǎo)針對所述治療劑的免疫耐受性。
2.一種在需要用治療劑治療的受試者中抑制針對蛋白質(zhì)治療劑的抗體應(yīng)答的方法，其包括在單個周期中對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中抑制針對所述治療劑的抗體應(yīng)答。
3.一種在需要用治療劑治療的受試者中減輕針對治療劑的輸注反應(yīng)的方法，其包括對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中減輕針對蛋白質(zhì)治療劑的輸注反應(yīng)。
4.一種在需要用治療劑治療的自身免疫受試者中降低繼發(fā)性自身免疫的方法，其包括對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中降低繼發(fā)性自身免疫。
5.一種在需要用治療劑治療的受試者中提高治療劑的效力的方法，其包括對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中提高所述蛋白質(zhì)治療劑的效力。
6.一種在需要用治療劑治療的受試者中增加T細胞群體中T調(diào)節(jié)細胞百分比的方法，其包括對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受試者中的所述百分比。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述治療劑是蛋白質(zhì)治療劑。
8.一種在需要用抗體治療劑治療的受試者中增加B細胞群體中B調(diào)節(jié)細胞百分比的方法，其包括對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受試者中的所述百分比。
9.權(quán)利要求3-8中任一項的方法，其中在單個周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
10.一種延長治療劑在受試者中的藥動學(xué)的方法，其包括在施用所述治療劑之前或期間或之后以有效延長所述治療劑的藥動學(xué)的量對所述受試者施用甲氨蝶呤。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述受試者是人。
12.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述治療劑是抗體治療劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體治療劑是單克隆抗體治療劑。
14.權(quán)利要求12或13中任一項的方法，其中所述抗體治療劑是淋巴細胞消減劑。
15.權(quán)利要求14的方法,其中所述抗體治療劑是阿侖單抗(alemtuzumab)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述受試者是多發(fā)性硬化患者。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體治療劑是多克隆抗體治療劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體治療劑是多克隆家兔抗胸腺細胞球蛋白抗體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者是需要器官移植，具有再生障礙性貧血，和/或具有或有風(fēng)險具有移植物抗宿主病的人患者。
20.權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述治療劑是酶。
21.權(quán)利要求21的方法，其中所述酶是人α-半乳糖苷酶A。
22.權(quán)利要求22的方法，其中所述酶是人酸性α-葡糖苷酶。
23.權(quán)利要求1-22中任一項的方法，其中所述有效量是0.lmg/kg至5mg/kg。
24.權(quán)利要求1-22中任一項的方法，其中所述單個周期的甲氨蝶呤由甲氨蝶呤施用I天或甲氨蝶呤施用連續(xù)2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11天組成。
25.權(quán)利要求1-22中任一項的方法，其中在治療性處理開始之前48小時和之后48小時之間施用所述單個周期的甲氨蝶呤。
26.一種在有此需要的人患者中消減淋巴細胞的方法，其包括: 用淋巴細胞消減劑治療所述患者，并 在用所述淋巴細胞消減劑治療之前或期間或之后以有效誘導(dǎo)所述患者中針對所述淋巴細胞消減劑的免疫耐受性的量對所述患者施用甲氨蝶呤。
27.權(quán)利要求26的方法，其中在單個周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
28.權(quán)利要求26或27中任一項的方法，其中所述淋巴細胞消減劑是單克隆抗體治療劑。
29.權(quán)利要求26或27中任一項的方法，其中所述淋巴細胞消減劑是多克隆抗體治療劑。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述單克隆抗體治療劑是阿侖單抗。
31.權(quán)利要求28的方法,其中所述單克隆抗體治療劑是利妥昔單抗(rituximab)。
32.權(quán)利要求26-31中任一項的方法，其中所述患者是多發(fā)性硬化患者。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述患者具有緩解-復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述多克隆抗體治療劑是抗胸腺細胞球蛋白多克隆抗體。
35.一種在需要組織移植的受試者中誘導(dǎo)免疫耐受性的方法，其包括對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中誘導(dǎo)針對移植的組織的免疫耐受性。
36.權(quán)利要求35的方法，其中在單個周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
37.權(quán)利要求35或36中任一項的方法，其中所述移植的組織是腎組織或心臟組織。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述受試者還接受另一種用于免疫調(diào)控的藥劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述用于免疫調(diào)控的藥劑是免疫抑制劑。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述用于免疫調(diào)控的藥劑是多克隆抗胸腺細胞球蛋白抗體。
41.一種在需要治療劑或組織移植的受試者中抑制T細胞應(yīng)答的方法，其包括在用所述治療劑或組織移植治療所述受試者之前、同時、或之后對所述受試者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受試者中抑制T細胞應(yīng)答。
42.權(quán)利要求41的方法，其中在單個周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
43.權(quán)利要求41或42中任一項的方法，其中所述治療劑是蛋白質(zhì)治療劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述蛋白質(zhì)治療劑是抗體治療劑。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗體治療劑是單克隆抗體治療劑。
46.權(quán)利要求44或45中任一項的方法，其中所述抗體治療劑是淋巴細胞消減劑。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述抗體治療劑是阿侖單抗。
48.權(quán)利要求47的方 法，其中所述受試者是多發(fā)性硬化患者。
49.權(quán)利要求44的方法，其中所述抗體治療劑是多克隆抗體治療劑。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述多克隆抗體治療劑是多克隆家兔抗胸腺細胞球蛋白抗體。
51.權(quán)利要求43的方法，其中所述移植的組織是腎組織或心臟組織。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述受試者還接受另一種用于免疫調(diào)控的藥劑。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述用于免疫調(diào)控的藥劑是免疫抑制劑。
【文檔編號】A61K31/519GK103648501SQ201280035299
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月16日
【發(fā)明者】A.喬瑟夫, S.理查茲, M.魯澤克, R.加曼 申請人:建新公司