利用θ-防御素的炎性蛋白酶的阻斷的制作方法
【專利摘要】用于治療一種或多種炎性狀況的藥物組合物可包括θ-防御素、其類似物或衍生物中至少一種。發(fā)明方法包括研究θ-防御素、其類似物或衍生物關(guān)于它們抗炎作用的效力，并為了治療炎性狀況的目的將這樣的組合物提供給市場。具有特別意義的是藥物組合物有效產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)-轉(zhuǎn)化酶(TACE)或其它促炎蛋白酶和/或脫落酶，如RTD-1-27、RTD-1-28或RTD-1-29的臨床相關(guān)的抑制?？紤]優(yōu)選的組合物可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和其它慢性炎性疾病、自身免疫疾病、癌癥和阿爾茨海默氏病、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥相關(guān)的神經(jīng)變性和其它炎癥相關(guān)的疾病。
【專利說明】利用Θ-防御素的炎性蛋白酶的阻斷
[0001]本申請要求2011年6月2日提交的美國臨時專利申請系列號61/492753的優(yōu)先權(quán)權(quán)益。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子活性——包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥途徑——的環(huán)狀肽在多種疾病中的應(yīng)用。更具體地,環(huán)狀肽具有至此未知的生物學(xué)活性,如脫落酶(sheddase)和其它相關(guān)蛋白酶(金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)的抑制，具有跨疾病——其中這些蛋白酶的活性與疾病的發(fā)病相關(guān)-的應(yīng)用。
[0003]直量
[0004]在此所有的出版物通過引用并入，其程度如同每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埍痪唧w地和單獨(dú)地指出以通過引用并入的相同。以下描述包括可用于理解發(fā)明主題的信息。不承認(rèn)任何本文提供的信息是現(xiàn)有技術(shù)或與目前要求保護(hù)的發(fā)明相關(guān)，或任何具體或隱含提到的出版物是現(xiàn)有技術(shù)。
[0005]本文描述的環(huán)狀肽是最近發(fā)現(xiàn)的治療劑，其靶向已知臨床意義的促炎酶促途徑，如腫瘤壞死因子α (TNF-α)-轉(zhuǎn)化酶(“TACE”，也稱作ADAM17)和病理炎癥、組織分解和促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的生長因子動員中牽涉的其它金屬酶(例如，脫落酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(“MMPs”))。
[0006]金屬蛋白酶調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，范圍有發(fā)育程序、響應(yīng)組織損傷或感染、瘢痕重塑和細(xì)胞分裂的刺激(3)。金屬蛋白酶活性的調(diào)節(jié)對細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)是關(guān)鍵性的。許多疾病狀態(tài)與金屬酶活性的過度表達(dá)相關(guān)。例如，受類風(fēng)濕和其它形式關(guān)節(jié)炎影響的關(guān)節(jié)具有提高水平的MMPs以及TNF- a——其通過TACE從TNF- a原(pro_TNF- a )表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞表面釋放(7，8，13，16)。已證明用`單克隆抗體阻斷TNF-a在相當(dāng)一部分具有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的患者——其對第一線藥物如低劑量甲氨蝶呤無反應(yīng)——的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)治療中有效。因?yàn)閷A的TNF-a阻斷不是在所有情況中都有效，和因?yàn)樵诨颊邅喨褐写嬖谂cTNF-a阻斷劑相關(guān)的嚴(yán)重副作用，所以正在繼續(xù)努力開發(fā)可選的抗炎策略。從這一點(diǎn)上，很多制藥公司已將藥物開發(fā)計(jì)劃集中于TACE抑制劑的發(fā)現(xiàn)(17)，但是沒有TACE抑制劑已被FDA批準(zhǔn)。
[0007]Θ-防御素是在恒河猴、狒狒和其它舊大陸猴(Old World monkey)組織中表達(dá)的天然存在的環(huán)狀肽。它們不在人類或其它類人動物中表達(dá)。天然存在的Θ-防御素由18個氨基酸的環(huán)組成，該環(huán)由三個在所有已知Θ-防御素中都保守的二硫鍵穩(wěn)定(9，21-23，25)。如同其它防御素，Θ -防御素最初基于肽的抗微生物性質(zhì)而被發(fā)現(xiàn)。然而，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)到此為止未知的Θ-防御素的第二性質(zhì)，作為有效的抗炎因子。如本文所進(jìn)一步描述的，Θ -防御素的天然和修飾的結(jié)構(gòu)能夠先體外后體內(nèi)和在體內(nèi)下調(diào)炎癥。更重要地，發(fā)現(xiàn)Θ-防御素和源自Θ-防御素結(jié)構(gòu)的肽(例如，環(huán)狀肽)能夠抑制TACE—TNF-a炎癥中的關(guān)鍵因子。該全新的發(fā)現(xiàn)——Θ -防御素是天然的TACE抑制劑——現(xiàn)在為能通過存在于對象的內(nèi)源性細(xì)胞因子相關(guān)途徑調(diào)節(jié)炎癥的分子提供重要來源。這些肽只是已知的在動物中表達(dá)的天然產(chǎn)物，其是TACE的可溶性調(diào)節(jié)子。因此，環(huán)狀肽可用作跨由功能失常的細(xì)胞因子活性產(chǎn)生的多種疾病狀態(tài)或狀況如自身免疫和其它炎性疾病的治療劑，并且人類中多種炎性疾病和/或狀況可由于靈長類進(jìn)化中Θ-防御素表達(dá)的喪失而產(chǎn)生。
[0008]另外，因子如TACE是稱作脫落酶的較寬種類的分子的成員，其具有分裂胞外蛋白結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。該分裂活性已提供加強(qiáng)某些治療——如用于乳腺癌的通過抑制脫落酶ADAMlO的曲妥珠單抗(赫賽汀)——效力的治療途徑。通常，Her2的ADAMlO脫落酶的分裂導(dǎo)致具有組成型激酶活性的Her2片段，和增殖細(xì)胞的不依賴配體的生長以及存活信號。然而，該過程的有害作用可通過脫落酶抑制而被妨礙。因此，具有脫落酶抑制活性的環(huán)狀肽為甚至更多種疾病和/或狀況提供治療方法，包括那些這樣的疾病和/或狀況，其中金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)、表達(dá)和/或功能的改變與疾病和/或狀況的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。
[0009]在超過十二年間，制藥公司已尋求開發(fā)TACE抑制劑(14，17)。雖然幾個小分子(大部分氧肟酸鹽)顯示在RA動物模型中有效，但是由于在人類中不能接受的毒性，這些化合物都沒有被批準(zhǔn)(14，17)。實(shí)際上，所有存在的TNF拮抗劑都具有黑框警告——美國食品和藥物管理局(FDA)的最嚴(yán)厲的警告:藥物可出售并仍然保持在美國市場上。
[0010]因此，在疾病如RA中有效的無毒TACE抑制劑的出現(xiàn)將是對RA、相關(guān)的自身免疫和炎性疾病，以及涉及金屬蛋白酶活性的其它疾病，如癌癥的治療方法的有價值的增加。在更一般的方面，仍然存在對治療炎癥和炎癥相關(guān)狀況，尤其是慢性炎癥狀況的藥物，以及制造、銷售和施用這樣的藥物的方法的需要。
[0011]發(fā)明概沭
[0012]本發(fā)明主題提供裝置、系統(tǒng)和方法，其中包括Θ -防御素、其類似物或衍生物的藥物組合物被研究和推向市場以治療炎性狀況。
[0013]到本申請日時止，`優(yōu)選的組合物包括RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29的至少一種。
[0014]在發(fā)明主題的研究方面考慮毒性、效力和劑量反應(yīng)研究。任何這樣的研究可由制藥或其它公司在其自己的實(shí)驗(yàn)室直接進(jìn)行，或通過附屬機(jī)構(gòu)或甚至不相關(guān)的公司間接進(jìn)行，所有這些應(yīng)在本文被理解為包括在測定藥物組合物效力的概念中。
[0015]本文考慮的抗炎作用應(yīng)被理解廣泛地包括炎癥相關(guān)化合物的所有臨床相關(guān)的抑制，包括例如，腫瘤壞死因子α (TNF-α)轉(zhuǎn)化酶(TACE)、組織蛋白酶C、或其它促炎蛋白酶、金屬蛋白酶ADAMs家族和其它脫落酶的抑制。
[0016]將藥物組合物提供給市場的步驟在本文應(yīng)被理解為制造或已制造、或監(jiān)督、控制或以任何其它方式指導(dǎo)制造商業(yè)數(shù)量的藥物組合物。考慮的最小商業(yè)數(shù)量包括在任何給定的一年期間在一個或多個生產(chǎn)設(shè)備中總計(jì)I千克、10千克、100千克和1000千克。
[0017]考慮的Θ -防御素、其類似物或衍生物的一個有意思的方面是這些化合物中的許多對酸和蛋白酶高度穩(wěn)定和可以口服制劑施用。
[0018]至少部分因?yàn)榭紤]的治療組合物可影響TACE和/或脫落酶，考慮可治療多種不同的炎性狀況，包括例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸疾病和其它慢性炎性疾病、自身免疫疾病、急性菌血癥(acute bactermia)、敗血癥、囊性纖維化、癌癥、阿爾茨海默氏病、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥相關(guān)的神經(jīng)變性和其它炎癥相關(guān)的疾病。特別考慮的是，本文考慮的方法和組合物可被有利地推向市場以治療是對抗TNF- α治療無應(yīng)答者的人。[0019]同樣考慮的是藥物和制造施用給人或非人動物的藥物的方法，其中藥物包括在本文或在優(yōu)先權(quán)申請中公開的新的Θ-防御素、其類似物或衍生物的至少一個，其被推向市場以治療炎性狀況。其中特別感興趣的是RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29。
[0020]本發(fā)明主題的多種目的、特征、方面和優(yōu)勢根據(jù)以下優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述將變得更明顯。
[0021]附圖簡述
[0022]圖1.Θ -防御素生物合成和結(jié)構(gòu)。將取代的九肽(顏色標(biāo)記的)切除和拼接以產(chǎn)生成熟的肽RTD-1 (來自(21))。
[0023]圖2.前Θ -防御素原的比對。A.將從cDNA預(yù)測的BTD_a至_d氨基酸序列與RTDI a至-C和人Θ-防御素假基因(HTDp)進(jìn)行手動比對。比對序列中的點(diǎn)表示與BTD-α中相同的氨基酸，星號符號表示末端密碼子的位置，和#符號表示過早地終止翻譯的終止密碼子。B.10個推論的BTD肽——源自cDNA序列——的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
[0024]圖3.RTD-1減少小鼠多菌性敗血癥中的致死率。成年的Balb/c小鼠在T=O接受盲腸結(jié)扎和刺穿(CLP)。小鼠在CLP之后4h接受單次150 μ 1生理鹽水的注射(.，n=10)或在CLP手術(shù)之后4h( ▲，n=ll)或24h( 黑框，n=5)接受含有5mg/kg RTD-1的鹽水。
[0025]圖4.Θ -防御素的抗TNF活性。A.RTD1-6 (23)的共價結(jié)構(gòu)，顏色編碼顯示組成的九肽的衍生物(23)。B.在0-10 μ 1/ml θ -防御素RTD-1和兩種人α -防御素(ΗΝΡ-2和ΗΝΡ-4)存在的情況下，將人全血(I:10)與100CFU/ml活的大腸桿菌(E.coli)溫育4h，并通過ELISA定量TNF-α。C.檢測RTDsl_5對從人全血釋放的如在圖B中TNF-α的作用；通過ELISA定量TNF- α。未檢測只以痕量存在于PMNs中的RTD-6。
[0026]圖5.Θ-防御素抑制由多種TLR激動劑誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子/趨化因子。將RPMI1640+5%人血漿中人外周血細(xì)胞(5X IO5細(xì)胞/ml)與單獨(dú)的10 μ g/ml RTD-1 (沒有激動劑對照)或肽溶劑(0.01%H0Ac)或同時與TLR激動劑于37°C在5%C02中輕搖溫育4h。通過離心收獲上清，并且利用Milliplex細(xì)胞因子/趨化因子組，通過Luminex xMAP分析定量細(xì)胞因子/趨化因子水平。激動劑:TLR2-1X108個熱殺死的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特氏菌(L.monocytogenes) ;TLR4_3.3ng/ml 大腸桿菌 K12LPS ;TLR5_30ng/ml 鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)鞭毛蛋白；TLR8_0.9 μ g/ml ssRNA40。
[0027]圖6.θ -防御素是TACE的競爭性抑制劑。Α.將重組TACE (rTACE)與指示濃度的肽+TACE特異的底物(Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2)溫育，并且熒光測定地測量酶活性。B.分析RTDs 1-5對如圖A中的TACE的抑制。C.以0、50、100和150ng/ml的肽濃度的rTACE的RTD-1抑制的Lineweaver-Burke分析。D.RTD-1和“天然”無環(huán)類似物(S-7)結(jié)構(gòu)的比較。E.RTD-1和RTD-1-S7類似物的rTACE的相對抑制。F.RTD-1引起的TACE對靜息或LPS-預(yù)處理(2h)的THP-1細(xì)胞的抑制(1)。
[0028]圖7.Θ -防御素是ADAM10的有效抑制劑。將重組ADAM10和底物(Mca_PLAQAV_DPa-RSSSR-NH2;0.05 μ g/ml)與RTD1-3于37°C溫育60min，并且熒光測定地測量酶活性。
[0029]圖8.微小Θ -防御素的體內(nèi)效力和抗TNFa和TACE阻斷活性。A.微小Θ -防御素的共價結(jié)構(gòu)。B.微小Θ-防御素在CLP敗血癥中的效力。CLP手術(shù)在T=O時在BALB/c小鼠上進(jìn)行。手術(shù)后四小時，將小鼠用靜脈注射PBS(假性對照)或PBS中5mg/kg指示的微小Θ-防御素治療。當(dāng)存活達(dá)15天時監(jiān)測治療的效力。C.評價微小Θ-防御素對從人全血釋放的TNFa的效力。將EDTA抗凝全血在RPMI1640中1:10稀釋并與活的大腸桿菌細(xì)胞溫育4h，包括0-10g/ml RTD-1 (天然的Θ -防御素)或所述指示的三種微小Θ -防御素。D.測定RTD-1和三種微小Θ -防御素對TACE活性的作用，如圖5所述。
[0030]圖9.RTD-1在大鼠降植烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(PIA)中的作用。如文本中所描述的，PIA在DA大鼠中被誘導(dǎo)，并被隨機(jī)化以接受每天靜脈注射鹽水(N=IO)或5mg/kgRTD-1 (N=Il)。評價和評分宏觀病理學(xué)(20)。每個符號代表個體動物的宏觀病理學(xué)得分。在所有情況中，RTD-1治療引起關(guān)節(jié)疾病的消除，其伴隨正常移動的恢復(fù)。
[0031]詳細(xì)描沭
[0032]本文引用的所有參考以其全部通過引用被并入，好像完全列出。除非另外定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與發(fā)明主題所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意思。 Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3rded.,J.ffiley&Sons(New York, NY 2001) ;March, Advanced Organic ChemistryReactions, Mechanisms and Structure5th ed., J.Wiley&Sons (New York, NY2001);和Sambrook and Russel, Molecular Cloning:A Laboratory Manual3rd ed..Cold SpringHarbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY2001);提供給本領(lǐng)域技術(shù)人員本申請中使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。
[0033]本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到與本文描述的方法和材料相似或相等的許多方法和材料可用于要求保護(hù)的發(fā)明的實(shí)施。實(shí)際上，本發(fā)明主題不應(yīng)被解釋為限于所描述的方法和材料。為了本目的，下面定義以下術(shù)語。
[0034]除非上下文指示相反，本文列出的所有范圍應(yīng)被解釋為包括它們的端點(diǎn)，并且開放式的范圍應(yīng)被解釋為包括商業(yè)上實(shí)用的值。相似地，值的所有列出應(yīng)被認(rèn)為包括中間值，除非上下文指示相反。
[0035]如本文所用，術(shù)語或〃 Θ -防御素〃包括防御素蛋白的Θ -防御素家族成員，如在多種靈長類物種，如舊大陸猴和猿類(實(shí)例是恒河猴、東非狒狒(olive baboon)、合趾猿和猩猩)中所發(fā)現(xiàn)的，其中Θ-防御素前體被轉(zhuǎn)錄地表達(dá)和通過翻譯后修飾加工成Θ-防御素。這進(jìn)一步包括在類人猿(實(shí)例是人、黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)中發(fā)現(xiàn)的假基因，其中Θ -防御素假基因的遺傳修飾可根據(jù)本領(lǐng)域容易知道的技術(shù)來改變，以允許在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)Θ-防御素蛋白。這還包括根據(jù)本領(lǐng)域容易知道的技術(shù)，如描述核酸和/或氨基酸序列比較窗中序列同源性或保守結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模建技術(shù)、或利用核酸探針識別同源Θ-防御素的選擇性雜交技術(shù)，可在相同或不同物種中鑒定的Θ-防御素蛋白。Θ-防御素可從內(nèi)源的來源分離，在自體或異種細(xì)胞系中產(chǎn)生，通過肽合成或根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可用的方法產(chǎn)生。Θ -防御素的實(shí)例包括RTD-1、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5、RTD-6、BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9、BTD-10 或 HTDp。
[0036]“脫落酶”，如本文所用，包括分裂跨膜蛋白的胞外部分的酶蛋白。實(shí)例包括解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶蛋白家族(ADAM)、天冬氨酸蛋白酶(BACE)蛋白家族的成員等。
[0037]是脫落酶的ADAM 蛋白的實(shí)例包括 ADAM2、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10, ADAMl 1、ADAMl2, ADAMl5, ADAMl7, ADAM18 (也稱作 ADAM27)、ADAM19、ADAM20、ADAM21 (也稱作ADAM31)、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30 和 ADAM33。
[0038]術(shù)語“類似物”，如本文用于Θ -防御素，是含有源自防御素，如Θ -防御素的核心結(jié)構(gòu)的多肽和肽，其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子活性、抑制蛋白水解的脫落酶活性、改變與細(xì)胞表面受體相關(guān)的酶功能、和/或具有抗微生物活性。實(shí)例包括含有跨多個半胱氨酸殘基的一、二、三、四或更多個二硫鍵或基本上相似的取代基的環(huán)狀肽，其中類似物長度范圍可以是8-24個氨基酸，并含有凈正電荷。
[0039]防御素是小的富含半胱氨酸的陽離子蛋白質(zhì)，其在進(jìn)化上高度保守，如在脊椎動物、無脊椎動物以及植物中所發(fā)現(xiàn)的。這些蛋白質(zhì)具有抗廣譜生物體如細(xì)菌、真菌和多種有包膜和無包膜病毒的生物學(xué)活性。一般，防御素由18-45個氨基酸組成，包括6 (在脊椎動物中)至8個保守的半胱氨酸殘基。多種免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞和幾乎所有上皮細(xì)胞，含有這些肽作為宿主細(xì)胞，主要功能是殺死吞噬的或胞外微生物。許多防御素通過結(jié)合到微生物細(xì)胞膜起作用，并且，一旦被包入，就形成孔樣膜缺陷，其允許必要的離子和營養(yǎng)素流出以破壞微生物完整性。然而，如本文所進(jìn)一步描述的，防御素蛋白的某些成員，包括Θ -防御素，也通過宿主細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)而起作用。這包括細(xì)胞因子相關(guān)的炎性途徑如TNF- α。
[0040]通常的防御素。防御素是陽離子的、含有三個二硫化物的抗微生物肽，其由白細(xì)胞和多種上皮產(chǎn)生。它們被再分成α _、β _、Θ -防御素亞家族一其通過肽大小和不同的二硫化物基序區(qū)分。在人類中，四種α-防御素(ΗΝΡ-1至ΗΝΡ-4)已從嗜中性粒細(xì)胞分離，兩種腸α-防御素(HD-5和HD-6)在小腸隱窩中由帕內(nèi)特細(xì)胞表達(dá)。HD-5的表達(dá)也已在女性泌尿生殖道中被檢測到。三種人防御素(hBD-Ι至hBD-3)已從多種器官的上皮和非上皮細(xì)胞類型中分離，并且?guī)追N其它防御素的表達(dá)已通過cDNA分析或從人基因組的分析而推論出。許多證據(jù)提示防御素在皮膚、呼吸上皮、泌尿生殖道和多種白細(xì)胞(即，嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞)中提供抗微生物效應(yīng)器作用。此外，防御素激活在先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中涉及的細(xì)胞，提示它們在免疫的兩個分支內(nèi)起作用和連接免疫的兩個分支。
[0041]大環(huán)Θ-防御 素。Θ-防御素是環(huán)狀十八肽，其通過源自76-氨基酸α-防御素相關(guān)的前體的兩個九肽的翻譯后剪接而形成。人類不表達(dá)Θ-防御素肽，因?yàn)橛捎谠陔那绑w中引入未成熟終止密碼子的突變，Θ-防御素的表達(dá)在接近進(jìn)化中猩猩出現(xiàn)的時間停止了。
[0042]Θ-防御素可利用源自Θ-防御素前體的兩個9-氨基酸序列的頭尾剪接而被生物合成，Θ -防御素首先在恒河猴的嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中被鑒定，隨后的系統(tǒng)發(fā)生研究揭示Θ-防御素基因在其它舊大陸猴和兩種猿(合趾猿和猩猩)中的存在，但是Θ-防御素在新大陸猴或原猴中的存在尚未被報(bào)道。人類、黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩表達(dá)Θ-防御素假基因，其中前體mRNA含有在信號序列中產(chǎn)生終止密碼子的突變，因此阻止Θ-防
御素前體的翻譯。恒河猴Θ -防御素-1 (RTD-1)從兩個Θ -防御素前體-proRTDla和
ProRTDlb——的雜二聚體剪接產(chǎn)生。包括proRTDla和proRTDlb的同型二聚體切除/連接反應(yīng)由RTD-2和RTD-3的分離顯示。RTD_1、_2和-3具有有效的抗細(xì)菌和真菌的殺微生物活性，并已知具有抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)和單純皰疹病毒(HSV)的抗病毒活性。
[0043]我們基于具有抗細(xì)菌和抗病毒活性的天然Θ -防御素的序列產(chǎn)生了合成的Θ -防御素設(shè)計(jì)。此外，據(jù)報(bào)道Θ -防御素結(jié)合和滅活來自炭疽桿菌(Bacillus anthracis)的致死毒素。Θ-防御素在存在生理學(xué)濃度的鹽、二價陽離子和血清的情況下是殺微生物的。相反地，α-和β-防御素的抗微生物活性在存在鹽和二價陽離子的情況下明顯降低。無環(huán)RTD-1在生理鹽水中對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是無活性的，而天然的環(huán)狀形式的肽在這些條件下保持有效的殺傷活性。這些數(shù)據(jù)表明Θ-防御素的環(huán)狀主鏈結(jié)構(gòu)賦予鹽不敏感性，同時提供能在生理學(xué)相關(guān)的條件下能夠保持有效生物學(xué)活性的穩(wěn)定分子。
[0044]Θ -防御素的抗微生物活性。原型的Θ -防御素肽是恒河猴Θ -防御素-1 (RTD-1)，18-氨基酸的大環(huán)肽(22)。如所描述的，成熟的肽通過獨(dú)特的過程產(chǎn)生，借此源自截短的α-防御素樣前體的兩個9-氨基酸肽被頭尾剪接，形成由三個二硫化物穩(wěn)定的大環(huán)分子(圖1)。產(chǎn)生成熟大環(huán)Θ -防御素的生物合成途徑是新的。恒河猴(22，23，25)和東非狒狒(9)分別表達(dá)3和4種Θ-防御素前體。每種前體貢獻(xiàn)獨(dú)特的九肽，在所有二元組合中該九肽與相同(同型二聚體剪接)或不同(雜二聚體剪接)九肽配對。這使得能夠產(chǎn)生6種獨(dú)特的短尾猴Θ-防御素和10種狒狒Θ-防御素。本發(fā)明人已分離了所有六種預(yù)測的短尾猴肽(23)和已分離了七種狒狒中預(yù)測的那些(9)。
[0045]與其它防御素，如α -防御素相似，Θ -防御素被包裝進(jìn)短尾猴和狒狒嗜中性粒細(xì)胞的初級顆粒中并還在單核細(xì)胞中表達(dá)(23)。當(dāng)微生物被嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬時，防御素被動員到吞噬體，它們在那里作為殺微生物劑參與細(xì)胞內(nèi)殺傷。Θ-防御素在微摩爾濃度是針對革蘭陽性細(xì)菌、真菌的殺微生物劑(9，22，25)并抑制細(xì)胞攝取HIV-1 (5，6，27，28)。利用特異性中和抗體，發(fā)明人已證明Θ -防御素是形成體外抵抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌(C.albicans) (23)的短尾猴嗜中性粒細(xì)胞的多數(shù)顆粒來源的抗微生物活性的原因。而且，Θ-防御素顯示是形成與來自人嗜中性顆粒(23)提取物相比短尾猴PMN顆粒提取物優(yōu)良?xì)钚缘脑?。在人類全身炎癥(例如，敗血癥)期間，α-防御素以定向和/或偶然的方式被釋放到胞外空間(2，18)。狒狒Θ-防御素
(22)被相似地釋放到菌血癥動物的血漿中。進(jìn)一步，胞外Θ -防御素顯示具有通過在從嚙齒類到人類范圍的物種中有效的抗炎機(jī)制調(diào)節(jié)炎癥的能力，如本文所進(jìn)一步描述的。因此，Θ-防御素和源自Θ-防御素結(jié)構(gòu)的肽代表重要的一類免疫功能調(diào)節(jié)劑。
[0046]TNF-α和炎癥。腫瘤壞死因子α (“TNF-α ”，也稱作惡病質(zhì)或惡病質(zhì)素)是參與全身炎癥的細(xì)胞因子并且是刺激急性期反應(yīng)的一群細(xì)胞因子的成員。
[0047]TNF-α在免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用，包括凋亡細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)、炎癥的促進(jìn)、腫瘤發(fā)生和病毒復(fù)制的抑制。已知TNF-a活性的寬范圍作用，不令人驚訝地發(fā)現(xiàn)TNF-a表達(dá)、產(chǎn)生和發(fā)信號的調(diào)節(jié)異常已牽涉許多種人類疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏病、結(jié)核病、克羅恩氏病等等。
[0048]TNF-a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)首先被產(chǎn)生為26kDa、212_氨基酸-長的II型跨膜蛋白，該跨膜蛋白在成熟期間插入細(xì)胞膜中。在細(xì)胞表面，膜結(jié)合的TNF-α ( "pro-TNF-a ”)是生物學(xué)上有活性的，并能通過鄰分泌細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而引起免疫應(yīng)答。然而，pro-TNF-a可在其Ala76-Val77酰胺鍵處通過金屬蛋白酶TNF-a轉(zhuǎn)化酶(“TACE”，也稱作ADAMl7)進(jìn)行蛋白水解分裂。從該細(xì)胞膜整合形式，可溶的17kDa胞外結(jié)構(gòu)域(胞外結(jié)構(gòu)域)——通常稱作TNF- α —被釋放，這在旁分泌 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有關(guān)鍵的重要性。
[0049]一般，現(xiàn)存的靶向TNF- α活性的治療策略已集中于提供抗可溶的和/或跨膜結(jié)合形式的TNF-α的抗體以阻止受體結(jié)合，或產(chǎn)生可溶的雜合融合受體以中和循環(huán)TNF-a水平。盡管這些治療方法具有重要益處，但是幾乎1/3的患者不響應(yīng)任何形式的抗TNF-α治療，同時已報(bào)道幾種不良作用，包括免疫原性、感染、遲發(fā)的超敏反應(yīng)型反應(yīng)和自身免疫疾病如藥物引起的狼瘡和脫髓鞘。
[0050]TACE和脫落酶活性。如所描述的，TNF-α信號活性中的關(guān)鍵步驟是膜結(jié)合形式的蛋白質(zhì)釋放成可溶形式的循環(huán)TNF- α，如TACE所催化的，稱作〃脫落〃的過程。TACE——由
824個氨基酸組成的70-kDa蛋白質(zhì)-屬于解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶(A Distintegrin And
Metalloproteinase)的ADAM蛋白家族。ADAM蛋白家族成員具有進(jìn)化上保守的結(jié)構(gòu)和可溶的胞外結(jié)構(gòu)域從膜結(jié)合的蛋白原(pro-protein)分裂和釋放的功能性能力。假定TNF-α在炎癥過程中作為有效和重要介質(zhì)的作用，作為TACE抑制劑起作用的環(huán)狀肽將提供對目前抗TNF- α劑的重要替代物，如抗體或基于可溶性受體的組合物。
[0051]另外，TNF-α和TACE只代表幾種潛在的環(huán)狀肽治療活性的治療靶中的兩種，假定跨幾種不同蛋白質(zhì)的“脫落”活性的寬度和多樣性，如許多不同疾病狀態(tài)和/或狀況中所牽涉的。TACE和其它ADAM家族分子組成更大的“脫落酶”家族的大多數(shù)成員。然而，其它脫落酶包括天冬氨酸蛋白酶(BACE)蛋白家族的成員。除了脫落酶類型的寬度，脫落酶活性的功能與以下方面不同:通過跨膜蛋白受體胞外結(jié)構(gòu)域(例如，Her2)的分裂的信號激活，或跟隨結(jié)合受體的激動劑以允許釋放的激動劑進(jìn)一步刺激另一受體(例如，EGFR)。由于在賦予和傳播信號功能中的這種重要作用，脫落酶活性的抑制提供重要的治療策略，打開新的治療途徑，還使現(xiàn)存藥物治療的效力加強(qiáng)。例如，Her2的ADAMlO脫落酶分裂導(dǎo)致具有組成型激酶活性的Her2片段，和給增殖細(xì)胞的不依賴配體的生長和存活信號。該過程的有害作用可通過曲妥珠單抗(赫賽汀)施用和ADAMlO脫落酶活性的抑制而阻止(30，31)。因此，環(huán)狀肽可用于限制與免疫功能相關(guān)的有害的細(xì)胞因子活性，同時打開對疾病如癌癥、或涉及脫落酶功能失調(diào)的其它疾病和/或狀況的甚至更寬的治療機(jī)會。Θ-防御素一具有內(nèi)源的脫落酶抑制活性——的該方面可解釋人類對象中許多自身免疫、炎性疾病和其它疾病狀況，這是由于靈長類進(jìn)化期間Θ-防御素表達(dá)的喪失。因此，Θ-防御素和源自多種Θ-防御素結(jié)構(gòu)的環(huán)狀肽可用作遭受與金屬蛋白酶調(diào)節(jié)異常相關(guān)的疾病和狀況痛苦的人類對象中的相容性治療劑。`
`[0052]在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明主題提供環(huán)狀肽。在一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽是防御素、其類似物或衍生物。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽是α-防御素、β-防御素、Θ-防御素、其類似物或衍生物。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽是Θ-防御素、其類似物或衍生物。
[0053]在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素是在靈長類中內(nèi)源地表達(dá)。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素在恒河猴中內(nèi)源地表達(dá)。在另一類實(shí)施方式中，Θ -防御素是RTD-l、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5或RTD-6。在另一類實(shí)施方式中，Θ -防御素在東非狒狒中內(nèi)源地表達(dá)。在另一類實(shí)施方式中，Θ -防御素是 BTD-l、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9或BTD-10。在另一類實(shí)施方式中，Θ -防御素在人類中內(nèi)源地表達(dá)。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素是人Θ-防御素假基因(HTDp)。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素在合趾猿或猩猩中表達(dá)。
[0054]在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素從哺乳動物分離。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素從靈長類分離。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素從人類分離。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素從獲自哺乳動物的生物樣品純化。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素從獲自靈長類的生物樣品純化。在另一類實(shí)施方式中，Θ-防御素從獲自人類的生物樣品純化。[0055]在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23或24個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度超過24個氨基酸。在【具體實(shí)施方式】中，環(huán)狀肽的長度是14個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有至少2個形成一個二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有4個形成2個二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有6個形成3個二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽包括合成的氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽具有凈正電荷。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽可由與SEQ.N0.1、SEQ.N0.2、SEQ.N0.3、SEQ.N0.4、SEQ.N0.5、SEQ.N0.6 和 / 或 SEQ.N0.7 具有小于約 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或更多百分比同一性的多核苷酸編碼。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法建立百分比同一性，包括建立參考序列和第二多核苷酸序列之間的比較窗，以建立百分比同一性的程度。
[0056]在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽調(diào)節(jié)炎癥。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和/或趨化因子的活性。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽調(diào)節(jié)TNF-α的活性。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽通過與解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶家族成員的競爭性抑制來調(diào)節(jié)TNF-α的活性。在另一類實(shí)施方式中，解聯(lián)蛋白和金屬蛋白家族的成員是脫落酶。在另一類實(shí)施方式中，脫落酶是TACE。在另一類實(shí)施方式中，脫落酶是ADAM10。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽能調(diào)節(jié)蛋白水解酶活性。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽能抗微生物殺傷。
[0057]在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明主題提供利用環(huán)狀肽治療炎性疾病和/或狀況的方法，包括以下步驟:提供大量環(huán)狀肽；將該量的環(huán)狀肽施用給需要治療炎性疾病和/或狀況的對象，其中環(huán)狀肽能調(diào)節(jié)炎癥，由此治療對象。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽是Θ-防御素、其類似物或衍生物。在另一類實(shí)施方式中，9-防御素是1^1)-1、1^1)-2、1^1)-3、1^1)-4、RTD-5、RTD-6、BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9 或 BTD-10。在另一類實(shí)施方式中，環(huán) 狀肽的長度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度超過24個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度是14個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有至少2個形成一個二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有至少4個形成兩個或更多個二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，施用的環(huán)狀肽的量是環(huán)狀肽的治療有效量。在另一類實(shí)施方式中，對象是哺乳動物。在另一類實(shí)施方式中，對象是人。
[0058]在各種實(shí)施方式中，炎性疾病和/或狀況是急性或慢性炎癥或自身免疫疾病。在另一類實(shí)施方式中，炎性疾病和/或狀況涉及細(xì)胞因子或趨化因子的活性。在另一類實(shí)施方式中，炎性疾病和/或狀況涉及TNF-α的活性。在另一類實(shí)施方式中，炎性疾病和/或狀況是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、炎性腸疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸結(jié)腸炎、銀屑病、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、貝赫切特氏病、狼瘡、化膿性汗腺炎、難治性哮喘、結(jié)腸炎、皮炎、憩室炎、肝炎、腎炎、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、充血性心臟病、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎和變態(tài)反應(yīng)。
[0059]在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明主題進(jìn)一步提供利用環(huán)狀肽提高炎性疾病和/或狀況治療效力的方法，包括以下步驟:提供大量環(huán)狀肽；將該量的環(huán)狀肽施用給接受炎性疾病和/或狀況治療的對象，其中環(huán)狀肽能提高炎性疾病和/或狀況治療的效力，由此提高治療的效力。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽與能治療炎性疾病和/或狀況的組合物同時施用。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽與能治療炎性疾病和/或狀況的組合物的施用相繼施用、在能治療炎性疾病和/或狀況的組合物的施用之前或之后施用。在另一類實(shí)施方式中，對象是哺乳動物。在另一類實(shí)施方式中，對象是人。
[0060]在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明主題進(jìn)一步提供利用環(huán)狀肽治療對象中疾病和/或狀況的方法。在另一類實(shí)施方式中，疾病和/或狀況是癌癥或神經(jīng)變性疾病。在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明主題進(jìn)一步提供利用環(huán)狀肽提高疾病和/或狀況治療效力的方法。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽與能治療疾病和/或狀況的組合物同時施用。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽與能治療疾病和/或狀況的組合物的施用相繼施用、在能治療疾病和/或狀況的組合物的施用之前或之后施用。在優(yōu)選實(shí)施方式中，對象是哺乳動物，并且在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，對象是人。
[0061]在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明主題進(jìn)一步提供藥物組合物。在另一類實(shí)施方式中，藥物組合物包括環(huán)狀肽和藥學(xué)上可接受的載體。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽是Θ-防御素、其類似物或衍生物。在另一類實(shí)施方式中，Θ -防御素是RTD-1、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5、RTD-6、BTD-1、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9 或 BTD-10。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度是14個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度超過24個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有至少2個形成一個二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有至少4個形成兩個或更多二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，藥物組合物中的環(huán)狀肽包括治療有效量的細(xì)胞周期蛋白肽。 在另一類實(shí)施方式中，藥物組合物包括一種或多種環(huán)狀肽和藥學(xué)上可接受的載體。
[0062]在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明主題進(jìn)一步提供制造環(huán)狀肽的方法。在另一類實(shí)施方式中，該制造方法包括以下步驟:提供一個或多個編碼環(huán)狀肽的多核苷酸；在宿主細(xì)胞中表達(dá)一個或多個多核苷酸和從宿主細(xì)胞提取環(huán)狀肽。在另一類實(shí)施方式中，制造方法包括以下步驟:在宿主細(xì)胞中表達(dá)一個或多個多核苷酸和從宿主細(xì)胞提取環(huán)狀肽。在另一類實(shí)施方式中，一個或多個多核苷酸包括SEQ.N0.1、SEQ.N0.2和/或SEQ.N0.3。在另一類實(shí)施方式中，一個或多個多核苷酸包括SEQ.N0.4、SEQ.N0.5、SEQ.N0.6和/或SEQ.N0.7。
[0063]在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽是Θ -防御素、其類似物或衍生物。在另一類實(shí)施方式中，Θ -防御素是 RTD-l、RTD-2、RTD-3、RTD-4、RTD-5、RTD-6、BTD-l、BTD-2、BTD-3、BTD-4、BTD-5、BTD-6、BTD-7、BTD-8、BTD-9或BTD-10。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度是8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽的長度是14個氨基酸。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有至少2個形成一個二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一類實(shí)施方式中，環(huán)狀肽含有至少4個形成兩個或更多二硫鍵的半胱氨酸殘基。在另一個實(shí)施方式中，制造方法包括利用液相合成或固相合成的肽合成步驟。在另一類實(shí)施方式中，固相合成是Fmoc或BOC合成。
[0064]本文考慮的組合物的制造可以任何合適的方式實(shí)現(xiàn)，包括例如利用表達(dá)載體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可選擇合適的表達(dá)載體，并將認(rèn)識到存在大量的選擇。這些載體中的許多利用病毒啟動子。細(xì)胞系的許多選擇適合宿主細(xì)胞，包括例如，細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和植物。實(shí)施例
[0065]實(shí)施例1-多效的Θ -防御素的獨(dú)特性質(zhì)和抗炎性質(zhì)
[0066]Θ -防御素通過在介導(dǎo)其自己攝取的細(xì)胞包膜中產(chǎn)生小孔而殺死大腸桿菌細(xì)胞
(24)。在該研究中，發(fā)明人作出了值得注意的發(fā)現(xiàn)，與許多α-和防御素不同，Θ-防御素對宿主細(xì)胞無毒(24)并且可通過多種途徑施用給小鼠(29)。從這一點(diǎn)上，小鼠容易耐受至少80mg/kg劑量的三種不同Θ-防御素的靜脈注射施用。發(fā)明人還以漸升的靜脈注射劑量(3mg/kg最大值)將RTD-1施用給兩只成年黑猩猩。在所有注射后，在任何點(diǎn)都未觀察到臨床毒性，并且所有的臨床化學(xué)和血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室值都在正常范圍內(nèi)。動物都沒有產(chǎn)生對RTD-1的抗體，由此顯示顯著缺少毒性和跨不同哺乳動物物種的免疫原性?；谶@些和其它數(shù)據(jù)，測試RTD-1在盲腸結(jié)扎和刺穿(CLP)引起的嚴(yán)重?cái)⊙Y模型中的效力(12)。如圖2所示，當(dāng)肽在CLP手術(shù)之后4或24h施用時，單次注射RTD-1 (5mg/kg)顯著減少BALB/c小鼠的死亡(P〈0.01，在第4和第7天)。存活者在第7天到第15天——在此時間將它們處死——在臨床上是正常的。Θ -防御素在CLP-敗血癥中的該治療作用是高度可再現(xiàn)的(N=5次實(shí)驗(yàn))。然而，Θ -防御素的高度有效性提示RTD-1在該模型中的效力不是主要由抗菌作用介導(dǎo)的，因?yàn)槎嗑鷶⊙Y中的微生物是巨大的。相反，認(rèn)為顯示的治療作用的效力將通過抗炎機(jī)制進(jìn)一步介導(dǎo)。為了探究這種可能性，發(fā)明人進(jìn)行了另外的實(shí)驗(yàn)，其中CLP小鼠的RTD-1治療伴隨多種血清促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-6和MIF的顯著減少。
[0067]其它研究已證明天然的(10，15)或設(shè)計(jì)的(Il)AMPs在嚙齒動物敗血癥模型中是有效的。在每種情況中，明顯的保護(hù)機(jī)制是肽與細(xì)菌LPS的結(jié)合，由此防止與宿主細(xì)胞蛋白(LPS結(jié)合蛋白)或受體(TLR-4、⑶14)的相互作用。從這一點(diǎn)上，幾乎所有分析的AMPs已顯示結(jié)合和中和LPS，支持這是介導(dǎo)它們抗敗血癥活性的主要機(jī)制的結(jié)論(19)。
[0068]然而，Θ -防御素`在直接中和LPS中的有效性較小，活力較在中和內(nèi)毒素中的多粘菌素B小100倍。相反，如下面所討論的，研究顯示Θ -防御素具有幾種有用的能力，包括通過與宿主細(xì)胞相互作用調(diào)節(jié)炎癥的主要方法。該發(fā)現(xiàn)與較早的研究一其中評價RTD-1在SARS-冠狀病毒(SARS-CoV)肺炎的小鼠模型中的效力(29)。在該研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)RTD-1的鼻內(nèi)施用在防止病毒感染的小鼠死亡中100%有效。重要地，RTD-1不是針對SARS-CoV殺病毒的。然而，肽施用減少肺部炎癥和幾種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，由此提示治療作用是通過RTD-1的抗炎性質(zhì)介導(dǎo)。不受任何具體理論的束縛，本發(fā)明人的Θ-防御素調(diào)節(jié)宿主對促炎刺激的反應(yīng)的信念通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該實(shí)驗(yàn)顯示RTD-1在大鼠中降植烷誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(圖9 ;下面討論)和膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎中是治療有效的。
[0069]實(shí)施例2-RTD-1活性通過宿主細(xì)胞相互作用而不是抗微生物作用介導(dǎo)。
[0070]幾行數(shù)據(jù)顯示原型的Θ-防御素，RTD-1，通過與宿主細(xì)胞相互作用而不是通過抗微生物作用發(fā)揮其抗炎作用(29)。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)——通過用大腸桿菌或金黃色葡萄球菌刺激的人全血評價RTDs對TNF- α產(chǎn)生的作用。代表性的實(shí)驗(yàn)，圖4 (B&C)中所示，顯示RTDSl-5(圖4A)抑制大腸桿菌引起的TNF-a釋放；注意，即使在不同Θ-防御素之中，在它們之間存在顯著不同的抑制效力。在用金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。在對照實(shí)驗(yàn)中，基于顯示肽不改變ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線和免疫測定只檢測有活性的三聚體TNF-α的結(jié)果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與許多其它防御素不同，Θ-防御素不直接與TNF-α蛋白相互作用。這些和其它實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示RTD-1在CLP敗血癥中的保護(hù)作用(圖3)是由于免疫調(diào)節(jié)活性而不是抗微生物作用。遵循該結(jié)果，發(fā)明人用針對TLRsl-9的激動劑刺激人外周血白細(xì)胞(PBL) 4h，同時添加或沒有添加10 μ g/ml RTD-10如圖5所示，PBLs與RTD-1的共同溫育顯著降低由針對TLR2、4、5和8的激動劑引起的TNF-α釋放。此外，RTD-1還抑制每種激動劑刺激的IL-1 β和IL-6的釋放，并且IL-8在除了存在TLR2激動劑的情況外的所有誘導(dǎo)中被強(qiáng)烈抑制。RTD-1基本上對未刺激的細(xì)胞沒有作用(圖5，上面的左圖)。RTD-1治療對MCP-1水平的作用不同。發(fā)明人在分析中包括該趨化因子，因?yàn)樵谑骃ARS肺炎中，RTD-1顯著減少肺MCP-1水平(29)。這與RTD-1對用病毒ssRNA刺激的PBLs的作用一致(圖5，)。最后，發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RTD-1以劑量依賴的方式抑制用產(chǎn)生腸毒素的金黃色葡萄球菌先體外后體內(nèi)刺激的人PBMCs的IL-17A的表達(dá)(>85%減少)。
[0071]實(shí)施例3- Θ -防御引起的TACE抑制
[0072]由于這些結(jié)果顯示Θ-防御素介導(dǎo)的對由細(xì)菌(圖4)、多種TLR激動劑(圖5)和動物中測量的TLR激動劑(參見上面)引起的TNF-a的抑制，一個可能的作用機(jī)制是TNF-a轉(zhuǎn)化酶的活性可被Θ-防御素拮抗。該TNF-a轉(zhuǎn)化酶(“TACE”，也稱作ADAM17，ADAM(解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)家族的成員)，是形成膜結(jié)合的TNF-a釋放的釋放原因的脫落酶。令人驚訝地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)RTD-1是重組TACE (rTACE)的有效的抑制劑，具有~
0.1 μ g/ml (48nM)的 IC50。注意，人 a -防御素(ΗΝΡ_2、ΗΝΡ_4)都不抑制 rTACE (圖 6A)，使Θ -防御素的活性在防御素之中獨(dú)特。測試天然Θ -防御素(RTD1-5 ；圖4A中的結(jié)構(gòu))的相對抑制活性并發(fā)現(xiàn)在IC50值的~10倍范圍內(nèi)變化(圖6B)。注意，RTD1-5引起的TACE抑制的分層與人血中的肽引起的TNF-a抑制非常相關(guān)(圖4C)。RTD-1引起的TACE抑制沒有被與TACE的15min預(yù)溫育增強(qiáng)，該發(fā)現(xiàn)提示迅速結(jié)合和競爭性抑制。這通過酶動力學(xué)數(shù)據(jù)的雙倒數(shù)圖分析證實(shí)(圖6C)，指示RTD-1充當(dāng)TACE的假底物。測試RTD-1的開鏈類似物(S-7 ;圖6D)的TACE 抑制并發(fā)現(xiàn)具有小于約20%的RTD-1活性，指示環(huán)狀構(gòu)造對于有效的TACE抑制是必要的(圖6E)。
[0073]TACE的抑制在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中被進(jìn)一步證實(shí)。利用改良的Alvarez-1glesias等描述的分析⑴，顯示RTD-1抑制在靜息和LPS刺激的THF-1細(xì)胞中表達(dá)的TACE(圖6F)?；诩?xì)胞的試驗(yàn)中對RTD-1獲得的IC50是~15 μ g/ml (7.4 μ M)。這有利地與對THP-1細(xì)胞的TACE阻斷的研究中小分子TACE抑制劑GM6001的IC50 (5.5+/-3 μ Μ)進(jìn)行比較⑴。
[0074]實(shí)施例4- Θ -防御素抑制ADAMlO
[0075]多種ADAMs已作為釋放錨定膜的生長因子、細(xì)胞因子和受體的調(diào)節(jié)性脫落酶被牽涉⑶。因?yàn)锳DAMs在包括炎癥和癌癥的調(diào)節(jié)在內(nèi)的許多關(guān)鍵生物過程中被牽涉，ADAM抑制劑的鑒定是激烈的研究領(lǐng)域。發(fā)明人確定天然的Θ -防御素RTD1-3抑制ADAMlO (圖7)，具有與TACE抑制觀察到的大約相同的IC50 (參見圖6)。因此，Θ -防御素是至少兩種ADAMs的金屬蛋白酶抑制劑。
[0076]實(shí)施例5-通討微小Θ -防御素的杭-TNF- α和TACE抑制
[0077]天然和修飾的Θ -防御素的結(jié)構(gòu)-活性分析提示預(yù)測介導(dǎo)這些肽的抗炎作用的某些序列特征。作為實(shí)例，三種十四肽(微小-Θ-防御素)被設(shè)計(jì)含有認(rèn)為對天然Θ-防御素的抗炎性質(zhì)重要的特征。將這些并入到圖8Α顯示的肽的序列中。評價每種肽在鼠CLP敗血癥中的效力。如圖8B所示，與PBS假治療相比，所有三種微小Θ -防御素減少小鼠的致死率。發(fā)明人進(jìn)一步評價每種微小6-防御素對來自刺激的人血的TNF-α釋放的作用(圖8C)和其對TACE的抑制活性(圖8D)。如圖8中的數(shù)據(jù)所示，微小Θ -防御素具有與CLP試驗(yàn)(與圖3比較)、TNF- α抑制試驗(yàn)(圖8C)或TACE抑制試驗(yàn)(圖8D)中的RTD-1相似或更好的活性。
[0078]成熟的Θ _防御素妝RTD-1是兩股片層，其如同α-和β-防御素，由二個二硫化物穩(wěn)定。然而，RTD-1 二硫化物排列的平行定位允許圍繞其短軸的基本的靈活性。與a -和β -防御素不同，RTD-1缺少兩親的拓?fù)鋵W(xué)，不受任何理論束縛，這和其它相似的結(jié)構(gòu)差異可解釋與Θ-防御素相比獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)能力。
[0079]實(shí)施例6-Θ-防御素在大鼠降植烷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(PIA)中的效力
[0080]如果Θ -防御素對TNF的體外或先體外后體內(nèi)阻斷對肽的抗炎作用是重要的，那么發(fā)明人認(rèn)為它應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)已知由TNF-a驅(qū)動的疾病過程。發(fā)明人繼續(xù)測試RTD-1對具有確定的PIA的大鼠的作用。在代表性的實(shí)驗(yàn)(N=3)中，用0.3ml降植烷在O天皮下注射成年Dark Agouti (DA ;01aHsd品系)大鼠(N=21),如Vingsbo等所描述的(26)。在臨床疾病的第一征兆(14-21天；基于Brand等參考(4)的宏觀病理學(xué)等級，動物交替地分配到鹽水(N=IO)或 RTD-1 治療(N=Il)組。鹽水(0.2-0.25ml)或 RTD-1 (在 0.2-0.25ml 鹽水中 5mg/kg)的盲法施用每天通過尾靜脈注射進(jìn)行，持續(xù)達(dá)14天，除非關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性(三個觀察者每天盲法評分，持續(xù)達(dá)36天)回到更早的零(在鹽水組中N=I ;在RTD-1組中N=8)。RTD-1處理的動物在第7天開始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(通過不成對雙尾學(xué)生T檢驗(yàn)，*=p ( 0.05)關(guān)節(jié)病理學(xué)減少；圖9。該模型還通過相同的RTD=I劑量和制劑的皮下注射來證明效力。治療停止之后，在至少45天沒有疾病復(fù)發(fā)的跡象。
[0081]實(shí)施例7- Θ -防御素是高度穩(wěn)定的
[0082]將Θ -防御素RTD-1在室溫以50 μ g/ml在人血漿、人血清或50mg/ml人血清白蛋白中溫育72小時。進(jìn)行定量HPLC分析，其顯示超過95%的肽在每種測試條件下都未改變。而且，Θ -防御素對在低(~PH2.5)或中性(pH7.4)條件下長時間儲存是穩(wěn)定的。
[0083]總之，Θ -防御素具有抗炎性質(zhì)，其通過阻斷促炎蛋白酶如TACE和其它金屬蛋白酶介導(dǎo)。它們在傳染性和非傳染性炎性疾病的動物模型中是有效的，當(dāng)全身施用時被良好耐受，并且不產(chǎn)生免疫性。此外，與其它抗炎劑不同，Θ-防御素物是非免疫抑制的。
[0084]藥物組合物、劑暈、劑暈形式和施用途徑
[0085]根據(jù)本發(fā)明主題的組合物可利用多種途徑施用，包括經(jīng)口、腸胃外、吸入、局部、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻或通過植入的藥盒，其中術(shù)語“腸胃外”如本文所用包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)(intralesional)和盧頁內(nèi)施用(通常注射或輸注)。優(yōu)選，組合物經(jīng)口、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。
[0086]例如，考慮的化合物的無菌可注射形式可以是水溶液或油狀懸浮液。這些懸浮液可根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)利用合適的分散或濕潤劑和懸浮劑來配制。無菌可注射的制劑還可作為無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為1，3-丁二醇中的溶液，而被制備。在其它可接受的載體和溶劑之中，特別考慮的液體包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的、不揮發(fā)性油可用作共溶劑或懸浮介質(zhì)(例如，天然或合成的一脂酰甘油酯或二脂酰甘油酯)。還可利用脂肪酸，合適的脂肪酸包括油酸和它的甘油酯衍生物、橄欖油、蓖麻油，特別是以它們的聚氧乙烯化形式。這樣的油性溶液或懸浮液可進(jìn)一步含有長鏈醇稀釋劑或分散劑。
[0087]在另一個實(shí)例中，考慮的化合物可以以任何經(jīng)口可接受的劑型一包括膠囊、片劑、水混懸液或溶液一經(jīng)口施用。在用于口服的片劑的情況中，所有藥學(xué)上可接受的載體(例如，乳糖、玉米淀粉等)被認(rèn)為是合適的。相似地，可加入多種潤滑劑(例如，硬脂酸鎂)。對于以膠囊形式的口服施用，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)需要水混懸液口服時，將活性成分與乳化劑和懸浮劑組合。如果需要，還可加入某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
[0088]考慮本發(fā)明主題的藥物組合物可局部施用，特別是當(dāng)治療的靶包括局部施用容易進(jìn)入的區(qū)域或器官，包括眼、皮膚、下部腸道的疾病，或外科手術(shù)期間暴露的區(qū)域。存在許多本領(lǐng)域已知的局部制劑，并且所有這樣的制劑都被認(rèn)為適合用于本文。
[0089]對于局部應(yīng)用，期望的組合物可在合適的軟膏一含有懸浮或溶解于一種或多種載體的活性成分——中配制。用于本發(fā)明主題的化合物的局部施用的載體包括礦物油、液體礦脂、白礦脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?？蛇x地，藥物組合物可在合適的洗劑或膏劑——含有懸浮或溶解于一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的活性成分——中配制。合適的載體包括礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯臘、鯨臘硬脂醇(cetearyl alcohol )、2_辛基十二燒醇、苯甲醇和水。
[0090]根據(jù)本發(fā)明主題的藥物組合物還可通過鼻氣霧劑或吸入劑施用。利用苯甲醇或其它合適的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進(jìn)劑、氟碳化合物和/或其它常規(guī)的增溶劑或分散劑，這樣的組合物根據(jù)藥物制劑領(lǐng)域熟知的技術(shù)來制備并且可作為鹽水中的溶液被制備。
[0091]關(guān)于組合物中考慮的化合物的量，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到具體的量將通常取決于特定的制劑、活性成分和期望的目的。因此，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到考慮的化合物的量將顯著變化。然而，通常優(yōu)選，化合物以最低有效量存在以遞送治療作用和/或體外和/或體內(nèi)可看見。
[0092]因此，在大多數(shù)優(yōu)選的`液體制劑中，考慮的化合物將以約20mg/ml至約30mg/ml的量，更通常地以約24mg/ml至約26mg/ml，和最通常地約25mg/ml的量存在。其中制劑是固體或凝膠，考慮的化合物將以約lmg/g至約100mg/g的量存在。關(guān)于劑量單位，通?？紤]，所考慮的化合物以有效獲得期望的治療作用的劑量或以有效提供體外和/或體內(nèi)可視化的劑量施用。
[0093]對于人和非人哺乳動物，考慮的化合物的合適的劑量應(yīng)是約l-10mg/kg的范圍。
[0094]在炎性疾病的治療和/或預(yù)防中，通常優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明主題的化合物或組合物以藥學(xué)上可接受的方式配制。合適的制劑將優(yōu)選包括用于注射進(jìn)眼前房和/或眼后房，或用于注射進(jìn)半規(guī)管、耳蝸和/或顳骨的骨迷路的液體制劑?？蛇x地或另外，可植入的載體(例如，生物可降解的/溶解的)可被配制以便載體包括治療有效量的化合物或組合物，并且載體可以以控制的和預(yù)設(shè)的方式釋放化合物或組合物。其它合適的載體之中，釋放可以是時間依賴的和/或通過用一個或多個波長的光輻照而開始。
[0095]考慮根據(jù)本發(fā)明主題的藥物組合物包括至少一種考慮的化合物(例如，RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29中的一種或多種)和藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)具體應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，制劑、途徑和/或施用時間表可相當(dāng)大地發(fā)生變化，并且通?？紤]，特定的制劑、途徑和/或施用不限于本發(fā)明主題。
[0096]然而，應(yīng)當(dāng)理解，藥物組合物的施用劑量將相當(dāng)大地變化，并且具體劑量將至少部分取決于(a)有效獲得期望的治療反應(yīng)的活性成分的量，(b)考慮的化合物制劑，(C)施用途徑，(d)具體化合物的藥物代謝動力學(xué)和藥效性質(zhì)，和(e)其它因素，包括正被治療的患者的年齡、性別、重量、一般健康和先前的醫(yī)療史。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易確定和規(guī)定需要的藥物組合物的有效量。例如，內(nèi)科醫(yī)師可開始以比期望的治療作用正常需要的低的水平開始給患者服藥，然后增加劑量直到獲得期望的作用。
[0097]通?？紤]根據(jù)本發(fā)明主題的化合物可以用于腸胃外應(yīng)用的制劑制備，并且特別考慮的腸胃外制劑將是用于注射的液體制劑。因此，適當(dāng)?shù)闹苿⑼ǔ０ㄋ帉W(xué)上可接受的溶劑(例如，無菌等滲水性或非水溶液)，和可作為分散相、懸浮液或乳狀液而制備?？蛇x地，腸胃外制劑還可作為試劑盒提供，該試劑盒包括考慮的化合物和在使用之前可重構(gòu)成液體產(chǎn)品的其它組分。在進(jìn)一步考慮的方面，根據(jù)本發(fā)明主題的化合物還可作為重組核酸以允許化合物在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方式而被施用。例如，重組核酸可通過腺病毒載體、利用脂質(zhì)或脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染、電穿孔或本領(lǐng)域熟知的其它方式提供給靶組織。 [0098]可用于藥物組合物的合適的水性和非水載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和其合適的混合物、植物油、和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥杀槐３郑?，通過使用涂覆材料，如卵磷脂，在分散相的情況種通過需要的粒度的保持，和通過表面活化劑的使用。最通常，合適的流體是無菌的和被緩沖以保持對活性成分的穩(wěn)定性和注射部位或其它應(yīng)用適當(dāng)?shù)膒H。
[0099]考慮的化合物可被制備為藥學(xué)上可接受的鹽(一種或多種)，其特別包括可存在于所考慮的化合物的酸性或堿性基團(tuán)的鹽。例如，天然是堿性的考慮的化合物可與多種無機(jī)和有機(jī)酸形成許多種鹽。合適的酸將提供藥學(xué)上可接受的陰離子，包括氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異煙酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖二酸鹽(glucaronate)、糖質(zhì)酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、P-甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(pamoate)[l，l-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽)]陰離子。相似地，天然是酸性的化合物可與多種藥學(xué)上可接受的陽離子形成堿性鹽，并且特別合適的陽離子包括堿金屬或堿土金屬離子(例如，鈉和鉀陽離子)。
[0100]仍然進(jìn)一步特別考慮，根據(jù)本發(fā)明主題的化合物還可被制備為前藥，并且認(rèn)為所有已知方式和類型的前藥適合用于本文，只要這樣的前藥將增加在靶器官或靶細(xì)胞的藥物(或前藥的代謝產(chǎn)物)濃度。
[0101]例如，其中化合物具有游離的氨基、酰氨基、羥基、硫代基或羧基，考慮這樣的基團(tuán)可用于共價地和可釋放地結(jié)合將藥物轉(zhuǎn)化成前藥的部分。因此，前藥特別包括這樣的那些，其中考慮的化合物與另一個可分裂的部分形成酯、酰胺或二硫鍵。這樣的部分可輔助器官或細(xì)胞特異的藥物遞送。例如，羧基可被衍生以形成酰胺或烷基酯，其可包括醚、胺-和/或羧酸基團(tuán)。利用半琥珀酸酯、磷酸酯、二甲基氨基乙酸鹽和磷?；跫籽豸驶?phosphoryloxymethyloxycarbonyl),游離的羥基可被衍生，如 D.Fieisher, R.Bong, B.H.Stewart, Advanced Drug Deliver40Reviews (1996) 19，115 所描述的。羥基和氨基的氨基甲酸鹽前藥也被包括，其是碳酸鹽前藥和羥基的硫酸酯。作為(酰氧基)甲基和(酰氧基)乙醚一其中酰基可以是烷基酯(任選地取代的)，或其中?；前被?br> 酯-的羥基的衍生也是期望的(該類型的前藥在R.P.Robinson et al., J.Medicinal
Chemistry (1996) 39:p.10 中被描述)。
[0102]仍然進(jìn)一步，還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到考慮的化合物可在細(xì)胞或細(xì)胞外區(qū)室中代謝，并且這樣的代謝產(chǎn)物可顯示相同或不同的藥理學(xué)作用。例如，考慮的化合物可被磷酸化并因此較母體化合物更有活性。另一方面，還原或糖基化可影響考慮的化合物的生物利用度。因此，考慮的化合物將不僅包括上面描述的那些，還包括其代謝產(chǎn)物。
[0103][0104]上面描述的各種方法和技術(shù)提供實(shí)現(xiàn)涉及本發(fā)明主題的方法的許多途徑。當(dāng)然，將理解，不必描述的所有目的或優(yōu)勢都可根據(jù)本文描述的任何具體的實(shí)施方式而獲得。因此，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，方法可以以獲得或優(yōu)化如本文所教導(dǎo)的一個優(yōu)勢或一組優(yōu)勢的方式進(jìn)行，而不必獲得如可被本文教導(dǎo)或提示的其它目的或優(yōu)勢。本文提到許多種有利和不利的替代物。將理解，一些優(yōu)選實(shí)施方式特別地包括一個、另一個或幾個有利的特征，而其它實(shí)施方式特別地排除一個、另一個或幾個不利的特征，而仍然其它實(shí)施方式通過包括一個、另一個或幾個有利的特征而特別地減輕目前不利的特征。
[0105]此外，技術(shù)人員將認(rèn)識到來自不同實(shí)施方式的多種特征的適用性。相似地，上面討論的各種要素、特征和步驟，以及對每個這樣的要素、特征和步驟的其它已知等價形式可被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員混合和匹配，以進(jìn)行根據(jù)本文描述的原理的方法。各種要素、特征和步驟之中，在不同實(shí)施方式中一些將被特別包括，其它的被特別排除。
[0106]雖然本發(fā)明主題已在某些實(shí)施方式和實(shí)施例的上下文中公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明主題的實(shí)施方式超過特別公開的實(shí)施方式延伸到其它可選的實(shí)施方式和/或應(yīng)用和其修改和等價形式。
[0107]許多變化和可選的要素已在本發(fā)明主題的實(shí)施方式中被公開。仍然進(jìn)一步的變化和可選的要素對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。這些變化，沒有限制地是環(huán)狀肽的來源，包括Θ-防御素；制備、分離或純化Θ-防御素、其類似物和衍生物的方法；利用Θ-防御素、其類似物和衍生物治療多種疾病和/或狀況的方法；本文使用的解決方案的技術(shù)和組合及應(yīng)用；和通過本文的教導(dǎo)產(chǎn)生的產(chǎn)物的具體應(yīng)用。各種實(shí)施方式可特別包括或排除這些變化或要素中的任何一個。
[0108]在一些實(shí)施方式中,用于描述和要求保護(hù)某些實(shí)施方式的表達(dá)成分、性質(zhì)如濃度、反應(yīng)條件等的量的數(shù)將被理解為在一些實(shí)例中由術(shù)語〃約〃修飾。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方式中，書面的描述和所附權(quán)利要求中列出的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可根據(jù)試圖由【具體實(shí)施方式】獲得的期望的性質(zhì)而改變。在一些實(shí)施方式中，數(shù)值參數(shù)應(yīng)根據(jù)報(bào)道的有效數(shù)字的數(shù)和通過應(yīng)用普通的舍入技術(shù)而被解釋。雖然列出一些實(shí)施方式的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但是在具體實(shí)施例中列出的數(shù)值被報(bào)道精確可用的。一些實(shí)施方式中呈現(xiàn)的可數(shù)值含有某些誤差，其必然地由在它們各自的測試測量中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差產(chǎn)生。
[0109]如本文描述和遍及所附的權(quán)利要求所用，“一 (a) ”、“一 (an) ”、“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)的指示物，除非上下文另外清楚地指示。同樣，如本文描述所用，〃in (在……中)〃包括〃in〃和〃on (在……上)〃，除非上下文另外清楚地指示。[0110]本文的值的范圍的描述僅意圖充當(dāng)個別地提到落進(jìn)該范圍的每個單獨(dú)的值的速記法。除非部位另外指出，每個個體值被并入說明書，如同它在本文被個別描述。本文描述的所有方法可以以任何合適的順序進(jìn)行，除非本文另外指出或另外同上下文明顯矛盾。本文關(guān)于某些實(shí)施方式提供的任何和所有實(shí)施例或示例性的語言(例如"如")的使用只是意欲更好地說明本發(fā)明主題，并不是對要求保護(hù)的發(fā)明的范圍提出限制。說明書中沒有語言應(yīng)被解釋為指示對要求保護(hù)的發(fā)明的實(shí)施必要的任何不要求保護(hù)的要素。
[0111]本文公開的本發(fā)明主題的可選要素或?qū)嵤┓绞降姆纸M不被解釋為限制。每組成員可被個別地提到和要求保護(hù)或與組的其它成員或本文發(fā)現(xiàn)的其它組分任意組合。為了方便和/或?qū)＠缘脑?，組的一個或多個成員可包括在組中或從組中刪除。當(dāng)任何這樣的包含或刪除發(fā)生時，說明書在這里被認(rèn)為含有如所修改的組，因此實(shí)現(xiàn)用于所附權(quán)利要求的馬庫什組的書面描述。
[0112]本文描述了本發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方式，包括本發(fā)明人已知的實(shí)現(xiàn)要求保護(hù)的發(fā)明的最好方式。讀過前面的描述之后，那些優(yōu)選實(shí)施方式的變化對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是明顯的?？紤]技術(shù)人員可酌情利用這樣的變化，并且除了本文具體描述的，要求保護(hù)的發(fā)明可被另外實(shí)施。相應(yīng)地，要求保護(hù)的發(fā)明被解釋為包括描述的主題的所有修改和等價形式，如可適用的法律所允許的。而且，上面描述的要素以所有其可能變化的任何組合包括在相應(yīng)的要求保護(hù)的發(fā)明里，除非本文另外指出或另外同上下文明顯矛盾。
[0113]此外，遍及本說明書，已對專利和印刷的出版物作出了很多參考。上面提到的參考和印刷的出版物中的每個以其全部通過引用被個別地并入本文。
[0114]應(yīng)當(dāng)理解，本文公開的實(shí)施方式是示例性說明本發(fā)明主題的原理。因此，通過實(shí)例，但沒有限制，本發(fā)明主題的可選的配置可根據(jù)本文的教導(dǎo)被利用。相應(yīng)地，本發(fā)明主題的實(shí)施方式不被限制到如所`精確顯示和描述的那些。
【權(quán)利要求】
1.使藥物組合物推向市場的方法，其中所述藥物組合物包括Θ-防御素、其類似物或衍生物，所述方法包括: 測定所述藥物組合物關(guān)于在人類中的抗炎作用的效力；和 將所述藥物組合物提供給市場以治療炎性狀況。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物是RTD-1-27。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物是RTD-1-28。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物是RTD-1-29。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中測定效力的步驟包括發(fā)起關(guān)于藥物組合物的毒性研究、效力研究和劑量-反應(yīng)研究中的至少一個。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中測定效力的步驟包括依賴關(guān)于所述藥物組合物的毒性研究、效力研究和劑量反應(yīng)研究中的至少一個的另一個產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括促炎蛋白酶的臨床相關(guān)的抑制。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述促炎蛋白酶是腫瘤壞死因子α(TNF-α)-轉(zhuǎn)化酶(TACE)。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括促炎蛋白酶的臨床相關(guān)的抑制。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗炎作用包括脫落酶的臨床相關(guān)的抑制。
11.權(quán)利要求1所述的方`法，其中所述抗炎作用包括組織蛋白酶C的臨床相關(guān)的抑制。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述將所述藥物組合物提供給所述市場的步驟包括生產(chǎn)出售至少一千克所述藥物組合物。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中生產(chǎn)步驟包括制造所述至少一千克所述藥物組合物。
14.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括包裝在口服制劑中的所述藥物組合物。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎性狀況包括慢性炎性疾病。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎性狀況包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎性狀況包括自身免疫疾病。
18.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將所述藥物組合物作為癌癥的治療推向市場。
19.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將所述藥物組合物作為神經(jīng)變性疾病的治療推向市場。
20.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將所述藥物組合物作為炎性腸病的治療推向市場。
21.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將所述藥物組合物作為阿爾茨海默氏病的治療推向市場。
22.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將所述藥物組合物作為骨關(guān)節(jié)炎的治療推向市場。
23.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將所述藥物組合物推向市場以治療對抗TNF-α治療無反應(yīng)者的人。
24.制造施用給動物以治療炎性狀況的藥物的方法，其中所述所述藥物包括Θ-防御素、其類似物或衍生物中至少一個。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述藥物包括RTD-1-27、RTD-1-28和RTD-1-29中至少一個。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述藥物有效產(chǎn)生促炎蛋白酶的臨床相關(guān)的抑制。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述促炎蛋白酶是腫瘤壞死因子α(TNF-α)-轉(zhuǎn)化酶(TACE)。
28.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述藥物有效產(chǎn)生促炎蛋白酶的臨床相關(guān)的抑制。
29.權(quán)利要求24所述的方法， 其中所述藥物有效產(chǎn)生脫落酶的臨床相關(guān)的抑制。
【文檔編號】A61K38/10GK103732239SQ201280038432
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月2日
【發(fā)明者】M·E·瑟爾斯特德, D·Q·特蘭 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會