Wnt系列衍生肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及WNT系列衍生新肽及其用途。本發(fā)明的WNT衍生肽執(zhí)行與天然的WNT蛋白質(zhì)類似的功能，與天然WNT相比，穩(wěn)定性非常優(yōu)秀，且皮膚滲透度也非常優(yōu)秀。因此，本發(fā)明的包含肽的組合物改善毛發(fā)生長及脫發(fā)防止，且具有抗老化功效，在治療、預(yù)防和改善需要WNT蛋白質(zhì)的活性的疾病或狀態(tài)方面發(fā)揮功效。并且，本發(fā)明的肽的優(yōu)秀的活性及穩(wěn)定性能夠非常有利地適用于醫(yī)藥、醫(yī)藥外品及化妝品。
【專利說明】WNT系列衍生肽及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及WNT系列衍生新肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]毛囊作為哺乳動物皮膚的獨特的器官，是原始表皮的下部生長而向更深的皮膚層伸張的器官。在毛囊的基部有被認(rèn)為嗉囊或真皮乳頭細胞的細胞塞(Stenn andPaus, Physiol.Rev., 81:449 (2002)),乳頭為毛囊的正常循環(huán)(Oliver, Embryol.Exp.Morph.15:331 (1966))及毛干的生長中必不可少的。毛干為用角蛋白絲和絲凝集蛋白質(zhì)填充的由結(jié)實地緊貼的上皮細胞制成的胎面形狀的結(jié)構(gòu)。
[0003]人類的毛發(fā)周期性地反復(fù)生長期、退行期、休止期，并經(jīng)過毛發(fā)脫落且再次生成的過程。通過調(diào)節(jié)激素或很多生長因子等，來周期性調(diào)節(jié)毛發(fā)。另一方面，也會因嚴(yán)重的壓力或營養(yǎng)不良等導(dǎo)入經(jīng)過早期退行期的休止期，由此引起嚴(yán)重的脫發(fā)癥狀(Arck，AmericanJournal of Pathology, 162 (3):803 (2003)。就男性型禿發(fā)而言，頭皮的前面及上部的毛囊對于雄性激素有感受性。因此，像男性型禿發(fā)，與毛囊的破壞相比更相當(dāng)于毛囊的小型化，其原因在于，分泌過多的作為男性激素的雄性激素，使得5-α還原酶活化，進一步使睪丸素(testosterone)變形為二氫睪酮(DHT, dihydrotestosterone),由此生成的二氫睪酮縮短毛發(fā)生長的期間，并使毛囊小型化，來減少既粗又結(jié)實的終毛(terminal hair)的數(shù)量，由此引發(fā)脫發(fā)。并且，推斷脫發(fā)女性的20%在她們一生當(dāng)中常經(jīng)歷以頭皮上部的毛發(fā)變薄為特征的幾種脫發(fā)。隨著年齡變大脫發(fā)的擴散也變大。例如，疤痕脫發(fā)癥、與燒傷或壓迫傷害相關(guān)的疤痕形成狀態(tài)等不同的疾病狀態(tài)可引起顯著的脫發(fā)。與原因無關(guān)地，在現(xiàn)代社會，隨著活躍的女性越來越多，男性也開始關(guān)注外貌，脫發(fā)最終可引起自尊心和自豪感的喪失并引起產(chǎn)生顯著的精神、社會及性別影響的結(jié)果。為了治療這種脫發(fā)現(xiàn)象，目前為止，將多種物質(zhì)等用作醫(yī)藥品，但存在價格太貴、且引發(fā)多種副作用的問題。并且，這種醫(yī)藥品存在需要持續(xù)使用，且當(dāng)停止使用時再次`引發(fā)脫發(fā)的缺點。并且，存在對功效的每個人的差異嚴(yán)重，副作用也根據(jù)不同的人而不同的缺點。
[0004]此外，用作化妝品的原料雖然具有價格低廉的優(yōu)點，但因為由植物提取物衍生成分組成，所以存在實際功效不大的缺點。
[0005]因此，在該領(lǐng)域中，需要效果更好、且在費用方面更經(jīng)濟的新的有效成分。
[0006]目前為止已知的兩種可利用的藥物(米諾地爾及非那雄胺)可延遲追加的脫發(fā)，但不能產(chǎn)生實際上誘導(dǎo)新毛囊的再生的效果。并且，在很多頭發(fā)化妝品中，推出了利用植物提取物等的很多防脫發(fā)產(chǎn)品，尤其開發(fā)了含有苦參、辣椒、當(dāng)藥、桑白皮、桑葉、人參、甘草、芍藥、地黃、茴香、山茱萸、大蒜等的提取物的產(chǎn)品、添加含有黃嘌呤及生長激素的組合物，來改善二氫睪酮過剩引起的細胞代謝抑制，并利用生長激素的生長促進效果來產(chǎn)生防脫發(fā)及通過毛發(fā)再生的毛發(fā)生長促進效果的產(chǎn)品、含有礦物質(zhì)、維生素類、綠茶、迷迭香、艾草、甘草提取液，通過向頭皮和毛發(fā)供給營養(yǎng)來呈現(xiàn)防脫發(fā)及毛發(fā)生長促進效果的產(chǎn)品、以及將維生素B、維生素C、維生素D、維生素E、煙酸、泛酸、生物素及葉酸等物質(zhì)與植物提取物進行混合，來抑制體內(nèi)的5-a還原酶，在男性激素的代謝過程中不使二氫睪酮產(chǎn)生，幫助毛發(fā)的新陳代謝作用，有助于男性型脫發(fā)的改善的產(chǎn)品，但很難找到影響至新生毛發(fā)的生成的產(chǎn)品。另一方面，也由日本的東京慈惠會醫(yī)科大學(xué)健康醫(yī)學(xué)中心研究組臨床組開發(fā)了利用已知的對糖尿等產(chǎn)生功效的科羅索酸(corosolic acid)的產(chǎn)品來抑制體內(nèi)的5_ a還原酶，也開發(fā)了對毛發(fā)生長產(chǎn)生卓越的功效的產(chǎn)品。
[0007]在毛發(fā)生長和退化的過程中，非常多的因素相互聯(lián)系，本研究人執(zhí)行了在毛根生成中最重要的用于促進毛發(fā)的角質(zhì)細胞的增殖，且誘導(dǎo)向毛發(fā)分化的研究以及利用供給毛發(fā)周圍的營養(yǎng)成分且促進血管內(nèi)皮生長因子的活性的一系列的生長因子的研究。
[0008]尤其，在建議毛發(fā)的周期的多種生長因子中，人類衍生WNT通過在細胞中傳遞信號來影響毛發(fā)，而這種WNT的信號傳遞途徑借助分泌的WNT與作為它們的受體的彎曲(frizzled)的蛋白質(zhì)之間的相互作用來活化,此時,作為低密度脂蛋白(LDL, low-densitylipoprotein)受體-相關(guān)蛋白質(zhì)的LRP5及LRP6起到輔助受體(co-receptor)的作用。WNT的信號傳遞的下游影響包括散亂(disheveled)的蛋白質(zhì)的活化，在使Akt活化之后，以軸蛋白(Axin)-β -連環(huán)蛋白_GSK3 0 -復(fù)合體方式動員(Fukumoto et al., J.Biol.Chem.,276:17479-17483 (2001))。之后，GSK30被磷酸化及非活化，來抑制β-連環(huán)蛋白的磷酸化及分解。蓄積的β-連環(huán)蛋白向核移位，從而與淋巴樣增強因子-T細胞因子(LEF-TCF, lymphoid enhancer factor-T cell factor)族的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，來誘導(dǎo)革巴基因的轉(zhuǎn)錄。如此表達的蛋白質(zhì)對毛發(fā)的生長和分化起到重要的作用，可生成新的母細胞。并且，通過降低雄性激素引起的二氫睪酮的功能來起到防止脫發(fā)的功能。
[0009]在本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。引用的論文及專利文獻的所有公開內(nèi)容作為參照插入于本說明書中，從而更加明確地說明本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的水平及本發(fā)明的 內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明人努力開發(fā)在生長因子中維持與WNT相同或類似的功能并與自然的WNT蛋白質(zhì)相比，具有優(yōu)秀的活性、皮膚滲透度及穩(wěn)定性的物質(zhì)，其結(jié)果，基于天然的WNT蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成了表示上述特性的多個WNT相關(guān)肽，從而完成了本發(fā)明。
[0011]因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種肽，其由選自包含記載于序列表中序列1、序列
2、序列3及序列4的氨基酸序列的組中的一種氨基酸序列組成，用于表示W(wǎng)NT蛋白質(zhì)的活性。
[0012]本發(fā)明的再一個目的在于，提供一種生發(fā)促進及毛發(fā)生成改善用組合物，其包含上述肽作為有效成分。
[0013]本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種脫發(fā)防止改善用組合物，其包含上述肽作為有效成分。
[0014]本發(fā)明的還有一個目的在于,提供一種皮膚狀態(tài)(skin conditions)改善用組合物，其包含上述肽作為有效成分。
[0015]本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的改善或治療用組合物，其包含上述肽作為有效成分。
[0016]本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的治療用組合物，其包含上述肽作為有效成分。
[0017]以下的
【發(fā)明內(nèi)容】
、發(fā)明要求保護范圍以及附圖使本發(fā)明的其他目的以及優(yōu)點更加明確。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一實施方式,提供一種肽,其由選自包含記載于序列表中序列1、序列2、序列3及序列4的氨基酸序列的組中的一種氨基酸序列組成，用于表示W(wǎng)NT蛋白質(zhì)的活性。
[0019]本發(fā)明人努力開發(fā)在生長因子中維持與WNT蛋白質(zhì)相同或類似的功能的同時與天然WNT蛋白質(zhì)相比，具有優(yōu)秀的活性、皮膚滲透度及穩(wěn)定性的物質(zhì)，其結(jié)果，基于天然的WNT蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成了表示上述特性的多個生長因子相關(guān)肽。
[0020]本發(fā)明的肽衍生于人類WNT蛋白質(zhì)，包含選自包含WNT系列衍生的序列表中序列I (肽I)至序列4 (肽4)的氨基酸序列的組中的氨基酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明中的肽必須由選自包含序列表中序列I至序列表中序列4的氨基酸序列的組中的氨基酸序列組成。在本說明書中，術(shù)語“肽”意味著通過肽鍵來使氨基酸殘基相互結(jié)合而形成的線性的分子。
[0021]本發(fā)明的肽可根據(jù)該領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法，尤其根據(jù)固相合成技術(shù)(solid-phase synthesis techniques) 來制 成(Merrifield, J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963) ;Stewart,et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd.ed., Pierce Chem.C0.:Rockford, 111 (1984))。
[0022]就本發(fā)明的肽而言，隨機地將WNT蛋白質(zhì)的多個部位進行部分合成來第一次探索對受體蛋白質(zhì)的結(jié)合功能部位之后，將這個預(yù)測部位的氨基酸序列最佳化來選定并制成本發(fā)明的肽，并通過 篩選這些候補肽中活性最優(yōu)秀的肽來提供本發(fā)明的肽。
[0023]序列表中序列I肽(肽-1)、序列2肽(肽-2)、序列3肽(肽_3)及序列4肽(肽_4)執(zhí)行與天然WNT蛋白質(zhì)類似的作用。這是與受體相結(jié)合來執(zhí)行如生長因子等功能的肽。
[0024]本發(fā)明的肽其本身與天然的WNT蛋白質(zhì)相比，穩(wěn)定性非常優(yōu)秀。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，上述肽的N-末端結(jié)合有保護基，上述保護基選自包含乙?；?、芴甲氧羰基、甲?；⒆貦磅；?、肉豆蘧基、硬脂?；熬垡叶?PEG，polyethylene glycol)的組。
[0026]上述氨基酸的變形起到大大改善本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性的作用。在本說明書中，術(shù)語“穩(wěn)定性”不僅意味著“體內(nèi)”穩(wěn)定性，還意味著儲存穩(wěn)定性(例如，常溫儲存穩(wěn)定性)。上述保護基起到保護本發(fā)明的肽使其不受生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)切割酶攻擊的作用。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方式，提供一種生發(fā)促進及毛發(fā)生成改善用組合物，其包含本發(fā)明的肽作為有效成分。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，提供一種生發(fā)促進及毛發(fā)生成改善方法，其方法包括將本發(fā)明的肽處理給對象(subject)的步驟。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的還有一個實施方式，本發(fā)明提供一種肽的用途，用于制備生發(fā)促進及毛發(fā)生成改善用醫(yī)藥品(medicaments)。
[0030]由于本發(fā)明的組合物包含上述本發(fā)明的生長因子相關(guān)肽作為有效成分，因而為了避免本說明書過于復(fù)雜，省略兩者之間共同內(nèi)容的記載。
[0031]如以下的實施例中所證明，可見，本發(fā)明的生長因子相關(guān)肽序列具有成纖維細胞、角質(zhì)細胞或毛囊細胞生長促進能力，并且，隨著作為WNT蛋白質(zhì)的代表性信號傳導(dǎo)的β -連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。并且，可見，即使存在WNT的抑制劑即DKK-1，也保持不變地傳遞WNT的信號。可見，作為WNT的靶基因的纖連蛋白的表達也通過肽增加，即使存在DKK-1，纖連蛋白的表達量也增加。這通過動物實驗執(zhí)行將毛發(fā)的生長促進得非常高的功能。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，提供一種脫發(fā)防止改善用組合物，其包含本發(fā)明的肽作為有效成分。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，提供一種脫發(fā)防止改善方法，其包括將本發(fā)明的肽處理給對象(subject)的步驟。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，本發(fā)明提供一種肽的用途，用于制備脫發(fā)防止改
善用醫(yī)藥品。
[0035]本發(fā)明的肽能夠誘導(dǎo)位于可使毛根生成的皮膚組織的毛囊(hair follicle)的干細胞的增殖，并以向毛根移動的方式誘導(dǎo)分化來生成新的毛囊。進而，即使存在由二氫睪酮誘導(dǎo)的DKK-1 (Dickkopf-1)脫發(fā)基因，來抑制WNT功能的狀況下，肽也使WNT-β -連環(huán)蛋白(beta-catenin)的信號傳導(dǎo)活化來表達生發(fā)促進基因。并且，肽起到促進作為毛發(fā)生成和生長時期的生長期的作用，并將由于多種環(huán)境因素而進入退行期的毛發(fā)的周期維持在生長期，來呈現(xiàn)脫發(fā)抑制效果，在正常毛發(fā)中，不僅是毛發(fā)生長，還是向毛發(fā)供給營養(yǎng)成分，對健康的毛發(fā)產(chǎn)生大的影響。因此，本發(fā)明的組合物對毛發(fā)的生長及皮膚狀態(tài)的改善非常有效。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式,提供一種皮膚狀態(tài)(skin conditions)改善用組合物，其包含本發(fā)明的肽作為有效成分。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式,提供一種皮膚狀態(tài)(skin conditions)改善方法，其方法包括將本發(fā)明的肽處理給對象(subject)的步驟。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式`，提供一種肽的用途，用于制備皮膚狀態(tài)(skinconditions)改善用醫(yī)藥品(medicament)。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物用于皮膚狀態(tài)的改善，上述皮膚狀態(tài)的改善包括皺紋改善、皮膚彈性改善、皮膚老化防止、皮膚保濕改善、傷口消除或皮膚再生。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，提供一種基于WNT相關(guān)信號傳遞的衰竭的多種疾病的預(yù)防或治療用組合物，包含上述本發(fā)明的肽作為有效成分。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，提供一種WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療方法，其方法包括將本發(fā)明的肽處理給對象(subject)的步驟。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，本發(fā)明提供一種肽的用途，用于制備WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥品(medicament)。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地用于包括骨疾病、骨發(fā)生疾病、骨折、老年性骨質(zhì)疏松、軟骨營養(yǎng)不良、高鈣血癥、骨質(zhì)增生、成骨不全癥、骨軟化癥、骨髓炎、骨質(zhì)疏松癥、佩吉特氏病、骨關(guān)節(jié)炎、佝僂病或肥胖的WNT相關(guān)信號傳遞的衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療，更優(yōu)選為骨質(zhì)疏松癥、骨疾病或肥胖。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，提供一種作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用組合物，其包含本發(fā)明的肽作為有效成分。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，提供一種作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療方法，其方法包括將本發(fā)明的肽處理給對象(subject)的步驟。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方式，本發(fā)明提供一種肽的用途，用于制備作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥品(medicament)。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，就本發(fā)明的組合物而言，優(yōu)選地，DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病用于包括胰島素抵抗、低胰島素血癥、高胰島素血癥、糖尿病或肥胖的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療。
[0048]本發(fā)明的組合物可用作包含(a)本發(fā)明的上述生長因子相關(guān)肽的藥劑學(xué)有效量；以及(b)藥劑學(xué)上接受的載體的藥劑學(xué)組合物。
[0049]在本說明書中，術(shù)語“藥劑學(xué)有效量”意味著充分達成上述生長因子相關(guān)肽的功效或活性的量。
[0050]包含在本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上接受的載體是在制劑時通常利用的，其包含乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯膠(acacia gum)、磷酸|丐(calcium phosphate)、藻酸鹽(alginate)、明膠(gelatin)、娃酸?丐(calcium silicate)、微晶纖維素(microcrystallinecellulose)、聚乙烯批咯燒酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖衆(zhòng)(syrup)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)>羥基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸續(xù)(magnesium stearate)及礦物油(mineral oil)等，但并不局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分之外，還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。
[0051]優(yōu)選地，以非口服的方式將本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物進行給藥，例如，可通過皮膚局部給藥來進行給藥。
[0052]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適當(dāng)?shù)慕o藥量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性等因素而不同，普通熟練的醫(yī)生可容易地決定對所需的治療或預(yù)防有效的給藥量，并開處方。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的I天的給藥量為0.001~1000 mg / kg。
[0053]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物可根據(jù)本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員容易實施的方法，利用藥劑學(xué)上接受的載體和/或賦形劑進行制劑化，由此制備為單位容量形態(tài)，或者裝入至大容量容器內(nèi)而制備。此時，劑型可以是油性或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或者也可以是浸膏劑、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑或凝膠(例如，水凝膠)形態(tài)，還可包含分散劑或穩(wěn)定劑。
[0054]并且，本發(fā)明的組合物可用作包含(a)本發(fā)明的上述生長因子相關(guān)肽的化妝品學(xué)有效量(cosmetically effective amount);以及(b)化妝品學(xué)上接受的載體的化妝品組合物。
[0055]在本說明文中，術(shù)語“化妝品學(xué)有效量”意味著充分達成上述本發(fā)明的組合物的功效的量。
[0056]本發(fā)明的化妝品組合物也能夠以在該領(lǐng)域中通常所制備的任何劑型制成，例如，能夠以溶液、懸浮液、乳濁液、糊劑、凝膠、乳霜、乳液、粉、皂、含有表面活性劑清潔劑、油、粉狀粉底、乳濁液粉底、蠟粉底及噴霧劑等劑型化，但并不局限于此。更詳細地，能夠以柔膚化妝水、營養(yǎng)化妝水、營養(yǎng)霜、按摩霜、精華素、眼霜、潔面霜、潔面泡沫、卸妝水、面膜、噴霧劑或粉的劑型制備。
[0057]本發(fā)明的劑型為糊劑、乳霜或凝膠的情況下，作為載體成分，可利用動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、胺黃樹膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、二氧化硅、滑石或氧
化鋅等。
[0058]本發(fā)明的劑型為粉或噴霧劑的情況下，作為載體成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉，尤其噴霧劑的情況下，還可包含氯氟烴、丙烷/ 丁烷或二甲醚等推進劑。
[0059]本發(fā)明的劑型為溶液或乳濁液的情況下，作為載體成分，利用溶劑、增溶劑或乳濁劑，例如有水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3- 丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐的脂肪酸酯。
[0060]本發(fā)明的劑型為懸浮液的情況下，作為載體成分，可利用水、乙醇或丙二醇等液狀稀釋劑、乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯等懸浮劑、微晶纖維素、甲基氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂或胺黃樹膠等。
[0061]本發(fā)明的劑型為含有表面活性劑的卸妝油的情況下，作為載體成分，可利用脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇醚硫酸鹽、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、甲基?；撬猁}、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
[0062]包含在本發(fā)明的化妝品組合物的成分除了作為有效成分的肽類和載體成分之外包含通常用于化妝品組合物的成分，例如，可包含抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等常規(guī)的助劑。
[0063]歸納本發(fā)明的特征 及優(yōu)點如下:
[0064]( i )本發(fā)明的WNT相關(guān)肽可起到與天然的WNT蛋白質(zhì)相同或類似的功能。
[0065](ii)本發(fā)明的肽與天然的WNT蛋白質(zhì)相比，穩(wěn)定性非常優(yōu)秀，且皮膚滲透度也非常優(yōu)秀。
[0066](iii)因此，本發(fā)明的包含肽的組合物對毛發(fā)的生長及生成具有活性，且在治療、預(yù)防或改善需要生長因子的活性的疾病或狀態(tài)方面發(fā)揮非常優(yōu)秀的功效。
[0067](iv)本發(fā)明的上述肽的優(yōu)秀的活性及穩(wěn)定性可非常有利地適用于醫(yī)藥、醫(yī)藥外品及化妝品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0068]圖1為表示通過本發(fā)明的合成例制成的序列表中序列I (肽-1)至序列4 (肽-4)的肽的高效液相色譜法分析結(jié)果的圖表。
[0069]圖2a為表示處理通過本發(fā)明的合成例制成的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽_2、序列
3;肽_3、序列4 ;肽-4)的角質(zhì)細胞的細胞生長促進效果的圖表。
[0070]圖2b為處理通過本發(fā)明的合成例制成的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ；肽_3、序列4 ;肽-4)的成纖維細胞的細胞生長促進效果的圖表。
[0071]圖2c為處理通過本發(fā)明的合成例制成的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ；肽_3、序列4 ;肽-4)的毛囊細胞的細胞生長促進效果的圖表。
[0072]圖3a為用顯微鏡確認(rèn)處理本發(fā)明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽_2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽-4)的角質(zhì)細胞的細胞生長促進效果的照片。
[0073]圖3b為用顯微鏡確認(rèn)處理本發(fā)明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽_4)的成纖維細胞的細胞生長促進效果的照片。
[0074]圖3c為用顯微鏡確認(rèn)處理本發(fā)明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽-4)的毛囊細胞的細胞生長促進效果的照片。
[0075]圖4為確認(rèn)作為基于本發(fā)明的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽-4)的受體的LRP5的磷酸化增加的數(shù)據(jù)。
[0076]圖5a為確認(rèn)本發(fā)明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽_2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽_4)使β_連環(huán)蛋白的活性增加的數(shù)據(jù)。
[0077]圖5b為即使存在作為WNT抑制劑的DKK-1及脫發(fā)基因，借助本發(fā)明的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽-4)活化的β -連環(huán)蛋白也顯示表達量的免疫印跡法數(shù)據(jù)。
[0078]圖6為表示作為基于本發(fā)明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列
4;肽-4)的轉(zhuǎn)錄因子的LEF-1的活性的數(shù)據(jù)。
[0079]圖7a為示出隨著本發(fā)明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽_2、序列3 ;肽_3、序列4 ；肽-4)的處理時間的纖連蛋白的表達增加的圖表。
[0080]圖7b為示出即使存在DKK-1即WNT抑制劑及脫發(fā)基因，本發(fā)明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽-4)使纖連蛋白的表達增加的圖表。
[0081]圖7c為示出當(dāng)將本發(fā)明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列4 ；肽-4)處理給細胞時，通過免疫染色化學(xué)法使肽存在于細胞的照片。
[0082]圖8為處理本發(fā)明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽_4)的小鼠等皮膚的毛發(fā)生長效果。
【具體實施方式】
[0083]實施例
[0084]以下，通過實施例對本發(fā)明進行更為詳細的說明。這些實施例僅用于更加具體地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不根據(jù)本發(fā)明的要旨而受這些實施例的限制，這對于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
[0085]實施例
[0086]合成例1 =Leu-Cys-Cys-Gly-Arg-Gly-His-Arg-Thr-Arg-Thr-Gln-Arg (序列表)的合成[0087]將700mg 的氯三苯甲基氯樹脂(Chloro trityl chloride resin ；CTL resin,Nova biochem Cat N0.01-64-0021)放入反應(yīng)容器，并添加IOml的亞甲基氯(MC,methylene chloride)來攪拌3分鐘。除去溶液，并放入IOml的二甲基甲酰胺(DMF,Dimethyl Formamide)來攪拌3分鐘之后,再次除去溶劑。向反應(yīng)器放入IOml的二氯甲燒(DCM, Dichloromethane)溶液，并放入 200mmole 的荷甲氧擬基-Ala (pbf) -OH (Fmoc-Ala(pbf ) -0H)(巴亨公司(Bachem),瑞士(Swiss))及 400mmole 的 N,N- 二異丙基乙胺(DIEA,N, N-Diisopropylethylamine)之后進行攪拌使它們均勻溶解,再攪拌I小時并進行反應(yīng)。反應(yīng)后進行清洗，將甲醇和DIEA (2:1)溶解在DCM進行10分鐘反應(yīng)，并用過量的DCM/DMF(1:1)進行清洗。除去溶液,并放入IOml的DMF攪拌3分鐘之后，再次除去溶劑。將IOml的脫保護溶液(20%的哌啶(Piperidine) /DMF)放入反應(yīng)容器，在常溫下攪拌10分鐘之后除去溶液。放入相同量的脫保護溶液，再維持10分鐘的反應(yīng)之后去除溶液，并分別隔3分鐘用DMF清洗2次，用MC清洗I次，并用DMF清洗I次，來制備了 Arg (pbf)-氯三苯甲基氯樹脂(Ala(pbf )-CTL Resin)。向新的反應(yīng)器放入IOml的DMF溶液,并放入200mmole的荷甲氧擬基 _ Y _ 三苯甲基-L-谷氨酸胺(Fmoc-Gln (trt)-OH) (Bachem, Swiss)、200mmole 的羥基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑_1_基氧基三(二甲基氨基)磷鐵六氟磷酸鹽(Bop)之后進行攪拌來使它們均勻溶解。以分餾的方式向反應(yīng)器分兩次放入400mmole的N,N- 二異丙基乙胺(DIEA,N,N_Diisopropylethylamine)2次之后,最小限度地攪拌5分鐘，直到所有固體溶解為止。將溶解的氨基酸混合溶液放入有脫保護的樹脂的反應(yīng)容器，并在常溫下攪拌I小時并進行反應(yīng)。除去反應(yīng)液，用DMF溶液隔5分鐘攪拌3次之后進行除去。取出少量的反應(yīng)樹脂，并利用卻三酮試驗(Nihydrin test)檢查反應(yīng)程度。與上述方法相同地，用脫保護溶液進行2次脫保護反應(yīng)，來制備了甘氨酸(trt)-Arg (pbf)-氯三苯甲基氯樹脂(Gin (trt)-Arg (pbf)-CTL Resin)。用DMF和MC充分清洗，再次執(zhí)行一次茚三酮試驗之后，與上述方法相同地，執(zhí)行了以下的氨基酸附著實驗。通過選定的氨基酸序列，以 Fmoc-Thr (tBu)、Fmoc-Arg (pbf)、Fmoc-Thr (tBu)、Fmoc-Arg (pbf)、Fmoc-His (trt)及 Fmoc-Gly、Fmoc-Arg (pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys> Fmoc-Cys 及 Fmoc-Leu 順序進行了鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。用脫保護溶液使Fmoc-保護基隔10分鐘反應(yīng)2次之后，通過均勻清洗來進行除去。放入乙酸酐和DIEA、羥基苯并三唑(HoBt, Hydroxybenzotriazole)執(zhí)行I小時乙?；?，用DMF、MC及甲醇分別將制成的肽基樹脂清洗3次，慢慢將氮空氣流出來進行干燥之后，在五氧化二磷(P2O5, Phosphorus pentoxide)條件下用真空進行減壓,等完全干燥之后，放入30ml的泄漏溶液[三氟乙酸(TFA，Trifluroacetic acid)95%、蒸餾水2.5%、茴香硫醚(Thioanisole)2.5% ]之后，在常溫下偶爾搖晃，并維持2小時反應(yīng)。對樹脂進行過濾，并用少量的溶液清洗樹脂之后將其與母液合起來。利用減壓來蒸餾，使得整體容積剩一半左右，并添加50ml的涼的醚誘導(dǎo)沉淀之后，進行離心分離來收集沉淀，并用更涼的醚清洗2次。除去母液，并在氮條件下充分干燥，提純之前合成了 0.65g的Leu-Cys-Cys-Gly-Arg-GIy-His-Arg-Thr-Arg-Thr-Gln-Arg肽I (收率:92.6% )。當(dāng)利用分子量測定儀來測定時，可獲得分子量1543.8 (理論值:1543.81)。利用如上所述的方法，還合成了序列2肽、序列3及序列4肽(圖1)。
[0088]表1
[0089]
【權(quán)利要求】
1.一種肽，其特征在于，由選自包含記載于序列表中序列1、序列2、序列3及序列4的氨基酸序列的組中的一種氨基酸序列組成，用于表示W(wǎng)NT蛋白質(zhì)的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽的N-末端結(jié)合有保護基，上述保護基選自包含乙酰基、芴甲氧羰基、甲?；⒆貦磅；⑷舛罐净?、硬脂酰基及聚乙二醇的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽衍生于人類WNT蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽具有成纖維細胞、角質(zhì)細胞或毛囊細胞的生長促進功能。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽促進β連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽即使存在干涉脫發(fā)的DKK-1蛋白質(zhì)，也促進β_連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽用于促進纖連蛋白的表達，上述纖連蛋白為WNT的靶蛋白，即為毛發(fā)生長重要的蛋白質(zhì)。
8.—種生發(fā)促進及毛發(fā)生成改善用組合物，其特征在于，包含上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽作為有效成分。
9.一種脫發(fā)防止改善用組合物，其特征在于，包含上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽作為有效成分。
10.一種皮膚狀態(tài)改善用組合物，其特征在于，包含上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽作為有效成分。`
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的皮膚狀態(tài)改善用組合物，其特征在于，上述皮膚狀態(tài)的改善為皺紋改善、皮膚彈性改善、皮膚老化防止、皮膚保濕改善、傷口消除或皮膚再生。
12.—種WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，包含上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽作為有效成分。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病為骨質(zhì)疏松癥、骨疾病或肥胖。
14.一種作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，包含上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽作為有效成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用組合物，其特征在于，上述DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病為胰島素抵抗、低胰島素血癥、高胰島素血癥、糖尿病或肥胖。
16.一種生發(fā)促進及毛發(fā)生成改善方法，其特征在于，包括將上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽處理給對象的步驟。
17.一種脫發(fā)防止改善方法，其特征在于，包括將上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽處理給對象的步驟。
18.一種皮膚狀態(tài)改善方法，其特征在于，包括將上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽處理給對象的步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的皮膚狀態(tài)改善方法，其特征在于，上述皮膚狀態(tài)的改善為皺紋改善、皮膚彈性改善、皮膚老化防止、皮膚保濕改善、傷口消除或皮膚再生。
20.一種WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療方法，其特征在于，包括將上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽處理給對象的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療方法，其特征在于，上述WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病為骨質(zhì)疏松癥、骨疾病或肥胖。
22.—種作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療方法，其特征在于，包括將上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽處理給對象的步驟。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療方法，其特征在于，上述DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病為胰島素抵抗、低胰島素血癥、高胰島素血癥、糖尿病或肥胖。
24.一種上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽的用途，其特征在于，用于制備生發(fā)促進及毛發(fā)生成改善用醫(yī)藥品。
25.—種上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽的用途，其特征在于，用于制備脫發(fā)防止改善用醫(yī)藥品。
26.—種上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽的用途，其特征在于，用于制備皮膚狀態(tài)改善用醫(yī)藥品。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的肽的用途，其特征在于，上述皮膚狀態(tài)的改善為皺紋改善、皮膚彈性改善、皮膚老化防止、皮膚保濕改善、傷口消除或皮膚再生。
28.—種上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽的用途，其特征在于，用于制備WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥品。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的肽的用途，其特征在于，上述WNT相關(guān)信號傳遞衰竭相關(guān)疾病為骨質(zhì)疏松癥、骨疾病或肥胖。`
30.一種上述權(quán)利要求1至7中任一項所述的肽的用途，其特征在于，用于制備作為WNT拮抗劑的DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用醫(yī)藥品。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的肽的用途，其特征在于，上述DKK-1蛋白質(zhì)相關(guān)疾病為胰島素抵抗、低胰島素血癥、高胰島素血癥、糖尿病或肥胖。
【文檔編號】A61K38/18GK103781799SQ201280038648
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月4日
【發(fā)明者】鄭熔池, 金銀美 申請人:凱爾格恩有限公司