用于增加胰島素敏感性和治療糖尿病的方法
【專(zhuān)利摘要】本文描述了用于增加胰島素敏感性和用于治療糖尿病(I型和II型)的方法。本文還描述了用于增加受試者中褐色脂肪的量和用于治療代謝性病癥包括肥胖的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于增加胰島素敏感性和治療糖尿病的方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求于2011年6月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/498，202和于2011年9月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/541，686的權(quán)益；所述申請(qǐng)各自的內(nèi)容通過(guò)引用以其整體特別地結(jié)合到本文中。
_2] 發(fā)明背景
糖尿病(“糖尿病”)是一種慢性代謝性疾病，其特征在于胰島素產(chǎn)生不足(I型糖尿病)或?qū)λa(chǎn)生胰島素的反應(yīng)缺陷(II型糖尿病)所導(dǎo)致的高血糖水平。糖尿病影響著數(shù)百萬(wàn)的個(gè)體，是一個(gè)遍及全世界的主要公共健康問(wèn)題。
[0003]I型糖尿病特征在于產(chǎn)胰島素細(xì)胞的喪失，這導(dǎo)致胰島素缺乏。I型糖尿病通常是T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)胰腺β細(xì)胞的自身免疫攻擊的結(jié)果，代表了大多數(shù)兒童糖尿病病例。目前尚不知I型糖尿病的治愈方法，而I型糖尿病患者通常通過(guò)飲食和胰島素注射控制其癥狀。[0004]在美國(guó)，大多數(shù)糖尿病患者患有II型糖尿病。II型糖尿病特征在于胰島素抵抗，并且伴隨肥胖。II型糖尿病患者顯示一系列的代謝性病癥，其常常促成心血管疾病、中風(fēng)、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病、腎病和肝病的發(fā)展。與I型糖尿病一樣，尚不知II型糖尿病的治愈方法，而II型糖尿病患者必須通過(guò)飲食和運(yùn)動(dòng)控制其癥狀。
[0005]因此，存在對(duì)可增加糖尿病個(gè)體中胰島素敏感性的方法的極大需求。這類(lèi)方法可用于恢復(fù)II型糖尿病個(gè)體的胰島素敏感性和增加許多I型糖尿病患者中保留的少量胰島素的活性。因此這類(lèi)方法可用于治療I型和II型糖尿病兩者。
[0006]發(fā)明概沭
在一些實(shí)施方案中，本文描述了在受試者中增加胰島素敏感性、預(yù)防或治療糖尿病(例如，I型或II型糖尿病)、增加褐色脂肪水平、預(yù)防或治療代謝性病癥(例如，肥胖)、促進(jìn)體重減輕、治療高脂血癥和/或治療心血管和血管疾病的方法。在一些實(shí)施方案中，受試者患有或易患糖尿病、代謝性病癥和/或肥胖。
[0007]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予受試者激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段。在某些實(shí)施方案中，激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與選自SEQ IDNO: 1-41的序列(例如，SEQ ID NO: 1、12或38)至少70%同一性的氨基酸序列。
[0008]在一些實(shí)施方案中，激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者包含治療量的分離的激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的藥物組合物而給予。
[0009]在一些實(shí)施方案中，激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者表達(dá)激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的重組細(xì)胞群而給予。在某些實(shí)施方案中，重組細(xì)胞群包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群最初從受試者中衍生。
[0010]在某些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:給予受試者增加受試者中激肽釋放酶家族肽酶(例如，Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4或Klkl5)表達(dá)的藥劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥劑為小分子、多肽、抗體或抑制性RNA分子(例如，Rheb特異性抑制性RNA分子)。在某些實(shí)施方案中，給予受試者已經(jīng)用核酸分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述核酸分子增加細(xì)胞激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。
[0011]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括給予受試者Rheb表達(dá)或活性降低的一種或多種重組細(xì)胞(例如，與同一類(lèi)型和/或來(lái)自同一物種的非重組細(xì)胞相比，該一種或多種細(xì)胞的Rheb表達(dá)或活性降低)。在某些實(shí)施方案中，將所述一種或多種重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子突變或敲除。在一些實(shí)施方案中，一種或多種重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子二者均被突變或敲除。在一些實(shí)施方案中，該一種或多種重組細(xì)胞表達(dá)Rheb特異性抑制性RNA分子(例如，siRNA分子、shRNA分子或微RNA分子)。
[0012]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種重組細(xì)胞包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種重組細(xì)胞與受試者同源。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種重組細(xì)胞從受試者的一種或多種非重組細(xì)胞產(chǎn)生。
[0013]在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括從受試者獲取一種或多種非重組細(xì)胞的步驟和/或?qū)⒁环N或多種非重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一種或多種重組細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方案中轉(zhuǎn)化通過(guò)(例如,使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù))突變一種或多種非重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子進(jìn)行，從而產(chǎn)生Rheb表達(dá)降低的一種或多種重組細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化步驟通過(guò)向一種或多種非重組細(xì)胞中引入Rheb特異性抑制性RNA分子表達(dá)載體進(jìn)行。
[0014]在一些實(shí)施方案中，本文描述了用于確定測(cè)試化合物是否為可能的用于增加胰島素敏感性、治療糖尿病(例如，I型糖尿病或II型糖尿病)、增加褐色脂肪水平和/或治療代謝性病癥(例如肥胖)的治療劑的方法。
[0015]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:(a)使細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或人細(xì)胞，例如T細(xì)胞)與測(cè)試化合物接觸和(b)檢測(cè)細(xì)胞的激肽釋放酶家族肽酶(例如，Klklb22、Klkl或Klkl2)表達(dá)，其中導(dǎo)致激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)增加的測(cè)試化合物為可能的治療劑。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶mRNA而檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶蛋白而檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，將激肽釋放酶家族肽酶與可檢測(cè)部分連接，并且通過(guò)檢測(cè)可檢測(cè)部分而檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。
[0016]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:(a)使細(xì)胞(例如，人細(xì)胞或小鼠細(xì)胞，例如T細(xì)胞)與測(cè)試化合物接觸，其中該細(xì)胞包含與激肽釋放酶家族肽酶基因的啟動(dòng)子(例如，Klklb22、Klkl或Klkl2啟動(dòng)子)操作性連接的編碼可檢測(cè)部分的核酸序列，和(b)檢測(cè)細(xì)胞的可檢測(cè)部分的表達(dá)，其中導(dǎo)致可檢測(cè)部分的表達(dá)增加的測(cè)試化合物為可能的治療劑。
[0017]附圖簡(jiǎn)沭
圖1顯示Rhebfim⑶4cre小鼠和野生型(WT)小鼠的中值體重。
[0018]圖2顯示Rhebfim CD4cre小鼠和野生型小鼠的體脂分析。
[0019]圖3顯示Rhebfim⑶4cre小鼠和野生型小鼠的葡萄糖攝取和胰島素敏感性。
[0020]圖4顯示Rhebfim⑶4cre小鼠和野生型小鼠的血清甘油三酯和血清高密度脂蛋白水平。[0021]圖5顯示Rhebfim CD4cre小鼠和野生型小鼠的食物消耗。
[0022]圖6顯示使用18-F-FDG質(zhì)子發(fā)射斷層掃描成像測(cè)定的Rhebfl/fCD4cre小鼠和野生型小鼠中葡萄糖的組織攝取。
[0023]圖7顯示Rhebfim CD4cre小鼠和野生型小鼠肝中BMP7、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子_21和乙酰-CoA硫酯酶的表達(dá)。
[0024]圖8顯示從RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠分離的T細(xì)胞中L-乳酸的產(chǎn)生。
[0025]圖9顯示RhebfimCD4cre小鼠和野生型小鼠的呼吸交換率。
[0026]圖10顯示經(jīng)受從Rhebfim OTkre小鼠或野生型小鼠分離的骨髓的骨髓移植的受輻照野生型小鼠的體重變化。
[0027]圖11顯示接受RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠的T細(xì)胞移植的RAGV〃小鼠的葡萄糖攝取。
[0028]圖12顯示糖尿病小鼠在接受來(lái)自RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠的T細(xì)胞之前和之后的胰島素敏感性。
[0029]圖13顯示給予取自RhebfimCD4cre小鼠或野生型小鼠的血清后野生型小鼠的葡萄糖攝取。
[0030]圖14顯示人激肽釋放酶家族肽酶的氨基酸序列。
[0031]圖15顯示小鼠激肽釋放酶家族肽酶的氨基酸序列。
[0032]圖16顯示人激肽釋放酶家族肽酶的核酸序列。
[0033]圖17顯示小鼠激肽釋放酶家族肽酶的核酸序列。
[0034]圖18A-18B顯示Klklb22對(duì)響應(yīng)胰島素劑量反應(yīng)的胰島素受體磷酸化(圖18A)和延長(zhǎng)的胰島素受體磷酸化(圖18B) 二者的增強(qiáng)作用。
[0035]發(fā)明詳沭 1.總述
本文描述了用于在受試者中增加胰島素敏感性和/或褐色脂肪水平和用于治療和預(yù)防多種疾病和病癥(包括糖尿病、代謝性病癥和肥胖)的組合物和方法。本文還描述了用于鑒定另外的可用于本文所述方法的治療劑的組合物和方法。
[0036]糖尿病是遍及全世界的一個(gè)重要的健康問(wèn)題。由于胰島素產(chǎn)生減少(I型糖尿病)或由于胰島素敏感性降低(II型糖尿病)，糖尿病患者不能調(diào)節(jié)其血糖水平。嚴(yán)重的糖尿病相關(guān)長(zhǎng)期并發(fā)癥包括心血管疾病、慢性腎衰竭和視網(wǎng)膜損傷。
[0037]在某些實(shí)施方案中，本文提供了用于增加胰島素敏感性的方法和組合物。這些方法和組合物可用于治療I型糖尿病和II型糖尿病兩者。例如，使用本文所述組合物和方法對(duì)I型糖尿病患者的治療增加了該糖尿病受試者產(chǎn)生的低水平胰島素的效能，而對(duì)II型糖尿病患者的治療恢復(fù)了其細(xì)胞的胰島素敏感性。此外，本文所述組合物和方法可與胰島素或胰島素類(lèi)似物的給予結(jié)合，以便增加胰島素功效并降低達(dá)到治療效果所需的劑量。
[0038]在一些實(shí)施方案中，通過(guò)給予激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段在受試者中達(dá)到治療效果(例如增加胰島素敏感性、預(yù)防和/或治療糖尿病、增加褐色脂肪水平、預(yù)防和/或治療代謝性病癥、預(yù)防和/或治療肥胖、增加體重減輕、預(yù)防和/或治療高脂血癥、治療和/或預(yù)防心血管和血管疾病)。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)給予增強(qiáng)激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)或活性的治療劑達(dá)到治療效果。[0039]肽酶的激肽釋放酶家族是高度保守的絲氨酸蛋白酶的多基因家族。SEQ ID NO:1-15和圖14中提供了人激肽釋放酶家族肽酶的氨基酸序列。SEQ ID NO: 16-41和圖15中提供了小鼠激肽釋放酶家族肽酶的氨基酸序列。SEQ ID NO: 42-56和圖16中提供了人激肽釋放酶家族肽酶的核酸序列。SEQ ID NO: 57-82和圖17中提供了小鼠激肽釋放酶家族肽酶的核酸序列。如本文所述，受試者中激肽釋放酶家族肽酶水平的增加導(dǎo)致胰島素敏感性增加、葡萄糖攝取增加和褐色脂肪水平增加。因此，給予激肽釋放酶家族肽酶或增加激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)或活性的藥劑可用于治療糖尿病和代謝性病癥，包括肥胖。
[0040]在一些實(shí)施方案中，通過(guò)給予Rheb表達(dá)或活性降低的一種或多種重組細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞,例如T細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體,例如造血干細(xì)胞)在受試者中達(dá)到治療效果(例如增加胰島素敏感性、預(yù)防和/或治療糖尿病、增加褐色脂肪水平、預(yù)防和/或治療代謝性病癥、預(yù)防和/或治療肥胖、增加體重減輕、預(yù)防和/或治療高脂血癥、治療和/或預(yù)防心血管和血管疾病)。Rheb是mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的小GTP酶成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。G1:100913214提供了人Rheb mRNA序列，G1:5032041提供了人Rheb蛋白序列，其各自通過(guò)引用結(jié)合。G1: 133893211提供了小鼠Rheb mRNA序列，而G1: 28626508提供了小鼠Rheb蛋白序列，其各自通過(guò)引用結(jié)合。
[0041]I1.定義
為了使本發(fā)明可被更容易地理解，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。另外的定義貫穿整個(gè)詳述說(shuō)明。
[0042]本文使用冠詞“一個(gè)”和“一種”是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))該冠詞語(yǔ)法上的對(duì)象。例如，“一種要素”意指一種要素或多于一種的要素。
[0043]如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“給予”意指向受試者提供藥劑(例如激肽釋放酶家族肽酶或增加激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)或活性的藥劑)或組合物，包括，但不限于，由醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員給予和自己給予。
[0044]本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥劑”指化合物、小分子、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗體、蛋白或其部分)或由生物學(xué)材料例如細(xì)菌、植物、真菌或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物)細(xì)胞或組織制備的提取物。藥劑可通過(guò)下文所述篩選測(cè)定法鑒定為具有特定活性(例如，增加胰島素敏感性)。這些藥劑的活性可使其適于作為“治療劑”，即在受試者局部或全身發(fā)揮作用的一種或多種生物學(xué)、生理學(xué)或藥理學(xué)活性物質(zhì)。
[0045]術(shù)語(yǔ)“氨基酸”意在包括所有分子，不論天然的或合成的，其包含氨基官能性和酸官能性?xún)烧?，并且能包含在天然存在氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸及其?lèi)似物、衍生物和同源物、具有不同側(cè)鏈的氨基酸類(lèi)似物和上述任一的所有立體異構(gòu)體。
[0046]術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性片段”指保留完整激肽釋放酶家族肽酶的生物學(xué)活性(例如增加胰島素敏感性的能力)至少一部分的激肽釋放酶家族肽酶片段。
[0047]如本文所使用的， 術(shù)語(yǔ)“糖尿病”是指多種眾所周知的病況。定義胰島素抵抗為這樣的狀態(tài)，其中需要超過(guò)對(duì)葡萄糖負(fù)荷的正常反應(yīng)的循環(huán)胰島素水平來(lái)維持血糖正常狀態(tài)(Ford E S，等JAMA.(2002) 287:356-9，通過(guò)引用明確地結(jié)合)。胰島素抵抗，以及具有胰島素抵抗的受試者對(duì)治療的反應(yīng)可通過(guò)評(píng)估胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估(HOMA-1R)得分而定量化，該得分為胰島素抵抗的可靠指標(biāo)(Katsuki A,等Diabetes Care 2001;24:362-5,通過(guò)引用明確地結(jié)合)。通過(guò)穩(wěn)態(tài)評(píng)估模型(HOMA) -1R評(píng)分對(duì)胰島素抵抗進(jìn)行估測(cè)用下式計(jì)算(Galvin P,等Diabet Med 1992;9:921-8):HOMA_IR=[空腹血清胰島素(yU/mL)]X[空腹血漿葡萄糖(mmol/L)/22.5]。具有發(fā)展葡萄糖耐量降低(IGT)或2型糖尿病傾向的受試者為血糖正常且伴隨高胰島素血癥的那些，其在定義上是胰島素抵抗的。具有胰島素抵抗的典型受試者常常超重或肥胖。術(shù)語(yǔ)“糖尿病前期(pre-diabetes) ”為其中個(gè)體易發(fā)展2型糖尿病的情況。糖尿病前期將葡萄糖耐量降低的定義延伸至包括空腹血糖在高的正常范圍 100 mg/dL 內(nèi)(J.B.Meigs,等 Diabetes 2003; 52:1475-1484，通過(guò)引用明確地結(jié)合)和具有空腹高胰島素血癥(血漿胰島素濃度提高)的個(gè)體。將糖尿病前期鑒定為嚴(yán)重健康威脅的科學(xué)和醫(yī)學(xué)依據(jù)在由美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)和國(guó)家糖尿病、消化和腎臟疾病研究所聯(lián)合發(fā)布的名為“2型糖尿病的預(yù)防或延誤”(Diabetes Care 2002; 25:742-749,通過(guò)引用明確地結(jié)合)的立場(chǎng)聲明(position statement)中展示?？赡芫哂幸葝u素抵抗的個(gè)體為具有兩種或更多種以下屬性的那些:1)超重或肥胖，2)高血壓，3)高脂血癥，4) 一個(gè)或多個(gè)一級(jí)親屬診斷有IGT或2型糖尿病?？赏ㄟ^(guò)計(jì)算HOMA-1R得分確認(rèn)這些個(gè)體的胰島素抵抗?？蓪⒁葝u素抵抗定義為這樣的臨床情況，其中個(gè)體的HOMA-1R得分>4.0或HOMA-1R得分超過(guò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行葡萄糖和胰島素測(cè)定所定義的上限。定義2型糖尿病為這樣的情況，其中受試者的空腹血糖或血清葡萄糖濃度大于125 mg/dl (6.94 mmol/L)。此外,在本發(fā)明一些實(shí)施方案中可根據(jù)對(duì)胰島素受體磷酸化調(diào)節(jié)(例如，胰島素受體磷酸化增加)和/或延長(zhǎng)的胰島素受體磷酸化的測(cè)量結(jié)果測(cè)量或?qū)崿F(xiàn)糖尿病的治療、預(yù)防或診斷。
[0048]術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”是指在某些實(shí)施方案中從重組DNA或RNA制備的多肽、或合成來(lái)源的多肽，或其某些組合，其(I)與自然界中通常與其一起存在的蛋白不相關(guān)，(2)從其通常存在的細(xì)胞中分離，⑶不含同一細(xì)胞來(lái)源的其它蛋白而分離，⑷由來(lái)自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(5)在自然界中不存在。
[0049]術(shù)語(yǔ)“代謝性病癥”包括受試者中異常代謝(即，為生命過(guò)程和活動(dòng)提供能量的活細(xì)胞的化學(xué)變化)所導(dǎo)致的或以所述異常代謝為特征的病癥、疾病或病況。代謝性病癥包括產(chǎn)熱異?；蛑炯?xì)胞(例如，褐色或白色脂肪細(xì)胞)內(nèi)含物或功能異常相關(guān)的疾病、病癥或病況。代謝性病癥可有害地影響細(xì)胞功能(例如細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化或遷移、穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)通訊)、組織功能(例如肝功能、肌肉功能或`脂肪細(xì)胞功能)、生物的全身反應(yīng)例如激素反應(yīng)(例如胰島素反應(yīng))。
[0050]代謝性病癥的實(shí)例包括肥胖(包括胰島素抵抗性肥胖)、非胰島素依賴(lài)型糖尿病(NIDDM或II型糖尿病)、胰島素依賴(lài)型糖尿病(IDDM或I型糖尿病)、II型糖尿病、胰島素抵抗例如葡萄糖耐量降低、葡萄糖耐受不良、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣化疾病、心臟病、高血壓、中風(fēng)、X綜合征、飲食過(guò)多、內(nèi)分泌異常、甘油三酯貯積病、Bardet-Biedl綜合征、Lawrence-Moon 綜合征、Prader-Labhart-ffi 11 i 綜合征、維爾納氏綜合征(Werner’ ssyndrome)、脂質(zhì)生物合成、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、甘油三酯水平、血漿水平和血漿膽固醇相關(guān)的功能障礙、聞脂血癥、游尚脂肪酸提聞、聞膽固醇血癥、聞甘油二酷血癥、低密度脂蛋白_ (LDL)-膽固醇提高、極低密度脂蛋白-(VLDL)-膽固醇提高、中間密度脂蛋白-(IDL)-膽固醇提高或高密度脂蛋白-(HDL)-膽固醇減少相關(guān)的血脂障礙。如果代謝性病癥(例如，糖尿病和/或肥胖)的至少一種癥狀被緩和、終止、減緩或防止，則代謝性病癥(例如，糖尿病和/或肥胖)被“治療”。如本文所使用的，如果代謝性病癥(例如，糖尿病和/或肥胖)的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移被減輕、減緩、延遲或防止，則代謝性病癥(例如，糖尿病和/或肥胖)也被“治療”。[0051]此外，代謝性病癥與一種或多種離散表型相關(guān)。例如，定義受試者的身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為體重(千克)除以身高(米)的平方，使得BMI單位為kg/m2。在一些實(shí)施方案中，定義肥胖為其中個(gè)體的BMI等于或大于30 kg/m2的情況。在另一個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)肥胖用于指內(nèi)臟肥胖，在一些實(shí)施方案中其可被定義為男性腰臀比1.0或女性腰臀比0.8，這在另一方面定義了胰島素抵抗和發(fā)展糖尿病前期的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，定義血糖正常為其中受試者的空腹血糖濃度在大于70 mg/dl (3.89 mmol/L)并小于110 mg/dl (6.11 mmol/L)的正常范圍內(nèi)的情況。詞語(yǔ)空腹具有作為醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)的通常含義。在一個(gè)實(shí)施方案中，定義葡萄糖耐量降低(IGT)為其中受試者的空腹血糖濃度或空腹血清葡萄糖濃度大于110 mg/dl并小于126 mg/dl (7.00 mmol/L)或餐后2小時(shí)血糖或血清葡萄糖濃度大于140 mg/dl(7.78 mmol/L)并小于200 mg/dl (11.11 mmol/L)的情況。術(shù)語(yǔ)葡萄糖耐量降低還意在適用于空腹葡萄糖降低的情況。在一個(gè)實(shí)施方案中，定義高胰島素血癥為這樣的情況，其中具有胰島素抵抗、血糖正?；虿徽５氖茉囌叩目崭够虿秃笱寤蜓獫{胰島素濃度高于無(wú)胰島素抵抗、腰臀比〈1.0 (男性)或〈0.8 (女性)的正常、瘦個(gè)體。
[0052]在一些實(shí)施方案中，“肥胖”是指身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為30 kg/2m或更高(NationalInstitute of Health,Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, andTreatment of Overweight and Obesity in Adults (國(guó)立衛(wèi)生研究所，鑒定、評(píng)估和治療成年人超重和肥胖的臨床指南)(1998)，通過(guò)引用明確地結(jié)合)。然而，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，至少部分上，還意在包括特征為身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)是25 kg/m2或更大、是26kg/m2或更大、是27 kg/m2或更大、是28 kg/m2或更大、是29 kg/m2或更大、是29.5 kg/m2或更大、是29.9 kg/m2或更大的疾病、病癥或病況，通常這些均被稱(chēng)為超重(NationalInstitute of Health,Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, andTreatment of Overweight and Obesity in Adults (國(guó)立衛(wèi)生研究所，鑒定、評(píng)估和治療成年人超重和肥胖的臨床指南)(1998)，通過(guò)引用明確地結(jié)合)。本文所描述的肥胖可由任何原因造成，無(wú)論是遺傳還是環(huán)境的。在一個(gè)實(shí)施方案中，“預(yù)防肥胖”是指若在肥胖情況開(kāi)始前給予治療，則可預(yù)防肥胖或肥胖相關(guān)病癥的發(fā)生。此外，如果治療在已經(jīng)患有或具有肥胖或肥胖相關(guān)病癥癥狀的受試者中開(kāi)始，期望這樣的治療防止肥胖或肥胖相關(guān)病癥或防止肥胖或肥胖相關(guān)病癥的進(jìn)展。
[0053]術(shù)語(yǔ)“肥胖相關(guān)病癥”包括所有與肥胖相關(guān)或至少部分由肥胖引起的病癥。肥胖相關(guān)病癥包括，例如，糖尿病、心血管疾病、高血壓、深靜脈血栓形成、骨關(guān)節(jié)炎、阻塞性睡眠呼吸暫停、癌癥和非酒精性脂肪肝病。
[0054]術(shù)語(yǔ)“同一性百分比”是指兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性。同一性可各自通過(guò)比較各個(gè)序列(其經(jīng)比對(duì)以用于比較目的)的位置確定。當(dāng)所比較序列的對(duì)應(yīng)位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，那么這些分子在該位置是同一的；當(dāng)對(duì)應(yīng)位置被相同或相似的氨基酸殘基(例如，立體和/或電子性質(zhì)相似)占據(jù)時(shí)，那么這些分子可稱(chēng)為在該位置同源的(相似的)。表述為同源性、相似性或同一性的百分比是指在所比較序列共享的位置同一或相似氨基酸數(shù)目的函數(shù)?？墒褂酶鞣N比對(duì)算法和/或程序，包括 FASTA、BLAST 或 ENTREZ。FASTA 和 BLAST 可作為 GCG 序列分析包(University ofWisconsin, Madison, ffis. )的一部分得到，并可以以例如默認(rèn)設(shè)置使用。ENTREZ可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)、國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館、國(guó)立衛(wèi)生研究所、Bethesda, Md得到。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的同一'丨生百分比可通過(guò)空位權(quán)重為I (例如，將每個(gè)氨基酸空位加權(quán)，就好像其為兩序列之間單個(gè)氨基酸或核苷酸錯(cuò)配)的GCG程序確定。
[0055]Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)，第 2冊(cè)卷:Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis (用于大分子序列分析的計(jì)算機(jī)方法)(1996)，ed.Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & C0., San Diego,California, USA中描述了其它用于比對(duì)的技術(shù)。優(yōu)選利用允許序列中空位的比對(duì)程序來(lái)比對(duì)序列。Smith-Waterman是一類(lèi)在序列比對(duì)中允許空位的算法。見(jiàn)Meth.Mol.Biol.70: 173-187 (1997)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中。同樣，可利用使用Needleman和Wunsch比對(duì)方法的GAP程序來(lái)比對(duì)序列。一個(gè)替代的搜索策略使用MPSRCH軟件，該軟件在MASPAR計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。MPSRCH在大規(guī)模并行計(jì)算機(jī)上使用Smith-Waterman算法對(duì)序列評(píng)分。該方法提高了找出遠(yuǎn)緣相關(guān)匹配的能力，并且對(duì)小空位和核苷酸序列錯(cuò)誤尤其寬容。核酸編碼的氨基酸序列可用于搜索蛋白和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0056]術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”為本領(lǐng)域所公認(rèn)的，指藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或溶媒，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，涉及將任何本發(fā)明組合物或其組分從一個(gè)器官或身體的一部分運(yùn)送或轉(zhuǎn)運(yùn)至另一器官或身體的另一部分。從與本發(fā)明組合物及其組分相容且對(duì)患者無(wú)害的意義上說(shuō)，每個(gè)載體都必須是“可接受的”?？捎米魉帉W(xué)上可接受載體的物質(zhì)的一些實(shí)例包括:(I)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉； (3)纖維素，及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；⑷西黃蓍膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；⑶賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油,例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無(wú)熱原水;(17)等滲鹽水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；和(21)藥物制劑中使用的其它無(wú)毒相容性物質(zhì)。
[0057]術(shù)語(yǔ)“多肽片段”或“片段”，當(dāng)參照參考多肽而使用時(shí)，指這樣的多肽，其中與參考多肽本身相比氨基酸殘基缺失，但剩余的氨基酸序列通常與參考多肽中的相應(yīng)位置同一。這樣的缺失可發(fā)生在參考多肽的氨基末端或羧基末端，或者備選地，兩個(gè)末端。片段通常至少5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)、至少14個(gè)氨基酸長(zhǎng)、至少20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個(gè)氨基酸長(zhǎng)、至少 75 個(gè)氨基酸長(zhǎng)或至少 100、115、125、135、150、160、175、180、190、200、215、230、250、275、290、300、250、400、425、450、475、500或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)。片段可保留參考多肽的一種或多種生物活性。在某些實(shí)施方案中，片段可包含成藥區(qū)(druggable region),和任選成藥區(qū)一側(cè)或兩側(cè)的額外氨基酸，額外的氨基酸數(shù)目可為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50，或多達(dá) 100 或更多殘基。此外，片段可包括特定區(qū)域的亞片段，所述亞片段保留其所來(lái)源區(qū)域的功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段可具有免疫原性。片段可在野生型蛋白的N-或C-末端缺乏約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100 或更多個(gè)氨基酸。
[0058]術(shù)語(yǔ)“小分子”為本領(lǐng)域公認(rèn)的，指分子量小于約2000 amu、或小于約1000 amu以及甚至小于約500 amu的組合物。小分子可為，例如，核酸、肽、多肽、肽核酸、模擬肽、碳水化合物、脂質(zhì)或其它有機(jī)(含碳)或無(wú)機(jī)分子。許多制藥公司具有擴(kuò)充的化學(xué)和/或生物混合物(通常為真菌、細(xì)菌或藻類(lèi)提取物)文庫(kù)，可用本文所述任何測(cè)定法進(jìn)行篩選。術(shù)語(yǔ)“有機(jī)小分子”是指通常被確定為有機(jī)或藥用化合物的小分子，并且不包括僅僅為核酸、肽或多肽的分子。
[0059]如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“多個(gè)受試者”指動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，包括非靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，奶牛、豬、馬、驢、山羊、駱騎、貓、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、綿羊)和靈長(zhǎng)類(lèi)(例如猴，例如食蟹猴、大猩猩、黑猩猩和人)。在一些實(shí)施方案中，受試者或患者患有代謝性病癥例如肥胖。
[0060]如本文所使用的，短語(yǔ)“治療有效量”和“有效量”意指包含本發(fā)明化合物的化合物、物質(zhì)或組合物的量，其至少在動(dòng)物的細(xì)胞亞群中以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比有效產(chǎn)生一些期需的治療效果。
[0061]“治療”受試者的疾病或“治療”具有疾病的受試者是指對(duì)受試者進(jìn)行藥物治療，例如給予藥物，使得至少一種疾病癥狀減退或防止其惡化。
[0062]II1.激肽釋放酶家族肽酶
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“激肽釋放酶家族肽酶”或“激肽釋放酶家族成員蛋白”指氨基酸序列在SEQ ID NO: 1-41中提供的絲氨酸蛋白酶家族，及其生物學(xué)活性片段(例如至少50、
60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、225、230、235 或240個(gè)氨基酸的片段)，和其生物學(xué)活性同源變體(例如與SEQ ID NO: 1_41中所提供序列具有至少 50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白)。激肽釋放酶家族成員的示例性生物學(xué)活性片段和/或同源變體可，例如，具有絲氨酸蛋白酶活性和/或增強(qiáng)胰島素敏感性的能力。激肽釋放酶家族成員蛋白的變體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)`方法，包括定點(diǎn)和隨機(jī)誘變產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中激肽釋放酶相關(guān)肽酶為Klklb22 (SEQ ID NO: 38)或其片段或同源變體。在一些實(shí)施方案中，激肽釋放酶相關(guān)肽酶為Klkl (SEQ ID NO:1)或Klkl2 (SEQ ID NO: 12)或其片段或同源變體。
[0063]激肽釋放酶家族成員蛋白通常以無(wú)活性的前蛋白形式翻譯，然后經(jīng)蛋白水解剪切為活性蛋白(見(jiàn)例如，Schmaier, International Immunopharmacology 8:161—165(2008),通過(guò)引用明確地結(jié)合到本文中)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“激肽釋放酶家族肽酶”和“激肽釋放酶家族成員蛋白”包括無(wú)活性的前蛋白和蛋白的活性形式兩者。
[0064]激肽釋放酶家族成員蛋白增強(qiáng)胰島素敏感性的能力可使用本領(lǐng)域已知的任何方法體內(nèi)或體外測(cè)定。例如，為了體外測(cè)定激肽釋放酶家族成員蛋白增強(qiáng)胰島素敏感性的能力，可將該蛋白添加到在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞系中，并且測(cè)量胰島素受體響應(yīng)胰島素而隨時(shí)間的磷酸化。為了體內(nèi)測(cè)量激肽釋放酶家族成員蛋白增強(qiáng)胰島素敏感性的能力，可將該蛋白注射入動(dòng)物(例如，小鼠)或在動(dòng)物中表達(dá)，并且在給予葡萄糖推注或注射胰島素后測(cè)定血液中的葡萄糖清除率。測(cè)量胰島素敏感性的方法的非限制性實(shí)例也在下文的實(shí)施例中提供。
[0065]在某些實(shí)施方案中，本文所述蛋白進(jìn)一步與異源多肽(例如，包含增加其溶解度和/或促進(jìn)其純化、鑒定、檢測(cè)和/或結(jié)構(gòu)表征的結(jié)構(gòu)域的多肽)連接。本文所述蛋白可與至少2、3、4、5或更多個(gè)異源多肽連接。多肽可與同種異源多肽的多個(gè)拷貝連接，或可與兩種或更多種異源多肽連接。融合可發(fā)生在多肽的N-末端、多肽的C-末端或多肽的N-和C-兩個(gè)末端。在一些實(shí)施方案中本文所述蛋白與融合結(jié)構(gòu)域之間包含接頭序列以促進(jìn)融合蛋白的構(gòu)建或優(yōu)化蛋白表達(dá)或融合蛋白的結(jié)構(gòu)約束。
[0066]在另一個(gè)實(shí)施方案中,可對(duì)蛋白進(jìn)行修飾使其穿過(guò)細(xì)胞膜的速率增加。例如,多肽可與促進(jìn)“胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用”(例如細(xì)胞對(duì)肽的攝取)的另一肽融合。所述肽可為HIV反式激活子(TAT)蛋白的一部分，例如與TAT殘基37-62或48-60相應(yīng)的片段、已經(jīng)觀察到在體外迅速被細(xì)胞攝取的部分(Green和Loewenstein, (1989) Cell 55:1179-1188)?；蛘?，內(nèi)化肽可來(lái)源于果蠅觸角足iProsophila antennapedia)蛋白或其同源物。已經(jīng)證實(shí)同源異型蛋白觸角足的60個(gè)氨基酸長(zhǎng)的同源異型結(jié)構(gòu)域移位通過(guò)生物膜，并且可促進(jìn)其偶聯(lián)的異源多肽的移位。因此，可將多肽與由果蠅觸角足的約42-58個(gè)氨基酸組成的肽或用于胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用的更短片段融合(Derossi 等(1996) J Biol Chem 271:18188-18193; Derossi 等(1994) J Biol Chem 269:10444-10450;和Perez等(1992) J Cell Sci 102:717-722)，所有這些均通過(guò)引用結(jié)合。胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用多肽還可為非天然存在的膜移位序列(MTS)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，248，558中公開(kāi)的肽序列，所述專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合。
[0067]IV.激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)的誘導(dǎo)物
本文所述某些方法涉及給予增加或降低激肽釋放酶家族肽酶活性和/或表達(dá)的藥劑?？捎糜谠黾蛹る尼尫琶讣易咫拿副磉_(dá)或活性的藥劑包括抗體(例如綴合抗體)、蛋白、肽、小分子和抑制性RNA分子，例如siRNA分子、shRNA、核酶和反義寡核苷酸。這些藥劑可為本文所描述的那些、本領(lǐng)域所已知的那些或通過(guò)常規(guī)篩選測(cè)定法(例如本文所述篩選測(cè)定法)鑒定的那些。例如，在一些實(shí)施方案中所述藥劑為RheB GTP酶特異性抑制性RNA分子(例如，siRNA或shRNA分子)。
[0068]在一些實(shí)施方案中，測(cè)定法用于鑒定可用于本文所述方法的藥劑。例如，本文提供了用于確定測(cè)試化合物是否為可能的用于增加胰島素敏感性、增加褐色脂肪水平、治療糖尿病、治療代謝性病癥或治療肥胖的治療劑的方法。一般而言，這些方法包括以下步驟:(a)使細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和(b)檢測(cè)細(xì)胞的激肽釋放酶家族肽酶(例如，Klklb22、Klkl或Klkl2)的表達(dá)。引起激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)增加(例如，與用安慰劑處理的細(xì)胞或未處理的細(xì)胞相比)的測(cè)試化合物為可能的治療劑。
[0069]任何細(xì)胞均可用于上述篩選方法。例如，在一些實(shí)施方案中細(xì)胞為小鼠細(xì)胞或人細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞或T細(xì)胞系。用于篩選的細(xì)胞可為原代細(xì)胞或細(xì)胞系。可用于本文所述篩選測(cè)定法的其它細(xì)胞系的實(shí)例包括，但不限于，293-T細(xì)胞、3T3細(xì)胞、721細(xì)胞、9L細(xì)胞、A2780細(xì)胞、A172細(xì)胞、A253細(xì)胞、A431細(xì)胞、CHO細(xì)胞、C0S-7細(xì)胞、HCA2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞和Vero細(xì)胞。
[0070]激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)可使用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)。例如，激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)可通過(guò)使用例如可檢測(cè)的標(biāo)記核酸探針、RT-PCR和/或微陣列技術(shù)檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶mRNA而檢測(cè)。激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)還可通過(guò)使用例如可檢測(cè)的具有激肽釋放酶家族蛋白酶結(jié)合特異性的標(biāo)記抗體檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶蛋白檢測(cè)。 [0071]在一些實(shí)施方案中，在篩選測(cè)定法中使用已經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞以便于進(jìn)行該測(cè)定。例如，在一些實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造使得激肽釋放酶家族肽酶作為與可檢測(cè)部分(例如熒光部分例如GFP或發(fā)光部分例如螢光素酶)連接的異源蛋白表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞包含編碼與激肽釋放酶家族成員啟動(dòng)子操作性連接的可檢測(cè)部分的核酸序列。在這樣的實(shí)施方案中，直接檢測(cè)可檢測(cè)部分的表達(dá)，而不是檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。這樣的細(xì)胞可使用本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)產(chǎn)生。
[0072]可用于本發(fā)明方法的藥劑可獲自任何可用的來(lái)源，包括天然和/或合成化合物的系統(tǒng)文庫(kù)。藥劑還可通過(guò)本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)方法中許多方法的任一獲得，所述組合文庫(kù)方法包括:生物文庫(kù)、類(lèi)肽文庫(kù)(具有肽的功能性，但含有新的非肽主鏈的分子文庫(kù)，其抗酶降解但仍保留生物活性，見(jiàn)，例如，Zuckermann等，1994，J.Med.Chem.37:2678-85,通過(guò)引用結(jié)合)、空間可尋址的平行固相或溶液相文庫(kù)、需要解卷積的合成文庫(kù)方法、’ 一珠一化合物’文庫(kù)方法和使用親和色譜法選擇的合成文庫(kù)方法。生物文庫(kù)和類(lèi)肽文庫(kù)方法僅限于肽文庫(kù)，而其它四種方法適用于肽、非肽寡聚體或化合物的小分子文庫(kù)(Lam, 1997, Anticancer Drug Des.12:145,通過(guò)引用結(jié)合)。
[0073]用于合成分子文庫(kù)的方法的實(shí)例可參見(jiàn)本領(lǐng)域，例如在:DeWitt等(1993) Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.90:6909; Erb 等(1994)/*roc.Natl.Acad.ScL USA91:11422; Zuckermann 等(1994).J.Med.Chem.37:2678; Cho 等(1993) Science261:1303; Carrell 等(1994) Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2059; Carell 等(1994) Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2061; and in Gallop 等(1994) J.Med.Chem.37:1233，所有這些均通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
[0074]V.Rheb活性或表達(dá)降低的重組細(xì)胞
本文所述某些實(shí)施方案涉及給予Rheb表達(dá)或活性降低的一種或多種重組細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，Rheb表達(dá)或活性的降低水平與以下非重組細(xì)胞進(jìn)行比較:與重組細(xì)胞同一類(lèi)型和種類(lèi)的非重組細(xì)胞。例如，重組細(xì)胞可為與非重組人T細(xì)胞相比Rheb表達(dá)降低的重組人T細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，自同一生物體(例如，同一個(gè)人)制備重組細(xì)胞和與其進(jìn)行比較的非重組細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，重組細(xì)胞的Rheb表達(dá)或活性為非重組細(xì)胞Rheb表達(dá)的 75%、50%、40%、35%、50%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2% 或 1%?？衫缡褂帽绢I(lǐng)域已知方法(例如定量RT-PCR或 蛋白質(zhì)印跡)測(cè)定Rheb的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，重組細(xì)胞無(wú)Rheb表達(dá)或活性。
[0075]可使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)降低重組細(xì)胞中的Rheb表達(dá)水平。例如，在某些實(shí)施方案中細(xì)胞內(nèi)Rheb基因和/或Rheb啟動(dòng)子中的一個(gè)或兩個(gè)被突變或敲除以產(chǎn)生重組細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，向重組細(xì)胞中引入Rheb特異性抑制性RNA表達(dá)載體，使其表達(dá)Rheb特異性抑制性RNA分子。
[0076]在一些實(shí)施方案中，重組細(xì)胞為免疫細(xì)胞或免疫細(xì)胞前體，例如淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體。例如，在一些實(shí)施方案中重組細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。
[0077]在一些實(shí)施方案中，重組細(xì)胞與其所給予的受試者同源。與受試者同源的重組細(xì)胞可，例如，通過(guò)使用重組基因技術(shù)將獲自受試者的非重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Rheb表達(dá)或活性減低的重組細(xì)胞而產(chǎn)生。
[0078]V1.藥物組合物
可將本文所述藥劑(例如激肽釋 放酶家族肽酶、Rheb活性或表達(dá)降低的細(xì)胞和/或增加激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)或活性的藥劑)摻入適合給予受試者的藥物組合物中。所述組合物可包含單一的這些藥劑或本文所述調(diào)節(jié)劑和藥學(xué)上可接受載體的任何組合。藥物組合物可進(jìn)一步包含可用于治療糖尿病或代謝性病癥例如肥胖的額外藥劑。
[0079]如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”意在包括任何和所有與藥物給予相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這類(lèi)介質(zhì)和劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域眾所周知。除非到任何常規(guī)介質(zhì)或劑與活性化合物均不相容的程度，否則即考慮其在組合物中的應(yīng)用。還可將補(bǔ)充的活性化合物摻入組合物中。
[0080]本發(fā)明藥物組合物配制為與其預(yù)期給藥途徑相容。給藥途徑的實(shí)例包括胃腸外例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、透皮(局部)、透粘膜和直腸給藥。
[0081]可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中例如用于測(cè)定LD50 (50%群體致死的劑量)和ED50(50%群體中治療有效的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序測(cè)定本文所述藥劑的毒性和治療功效。毒性和療效之間的劑量比為治療指數(shù)，其可表述為L(zhǎng)D50/ED50比率。盡管可使用顯示毒性副作用的化合物，但應(yīng)小心設(shè)計(jì)將這些化合物靶向至受影響組織位點(diǎn)的遞送系統(tǒng)，以將對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損傷最小化，從而減少副作用。
[0082]自細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制一系列人用劑量。這類(lèi)化合物的劑量?jī)?yōu)選處于包含較小或無(wú)毒性ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可根據(jù)使用的劑型和利用的給藥途徑在此范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明的本文所述方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可最初從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法估測(cè)?？稍趧?dòng)物模型中配制劑量以達(dá)到包含如細(xì)胞培養(yǎng)中所測(cè)定IC50 (即，達(dá)到癥狀的半最大抑制的測(cè)試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這些信息可用于更精確地測(cè)定人中的有用劑量。血漿中的水平可例如通過(guò)高效液相色譜法測(cè)量。
[0083]藥劑的適當(dāng)劑量取決于普通技術(shù)醫(yī)師、獸醫(yī)或研究者知識(shí)范圍內(nèi)的多種因素。小分子的劑量將例如根據(jù)以下而變化:根據(jù)待治療受試者或樣品的身份、大小和狀況，進(jìn)一步根據(jù)該組合物的給藥途徑(若適用)和從業(yè)醫(yī)生希望該小分子對(duì)本發(fā)明核酸或多肽所具有的作用。
[0084]VI1.治療方法
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于通過(guò)給予受試者(例如，需要其的受試者)本文所述藥劑(例如激肽釋放酶家族肽酶、Rheb表達(dá)或活性降低的重組細(xì)胞或增加激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)的藥劑)而增加胰島素敏感性、預(yù)防或治療糖尿病(例如，I型或II型糖尿病)、增加褐色脂肪水平、預(yù)防或治療代謝性病癥(例如肥胖)、促進(jìn)體重減輕、治療高脂血癥和/或治療心血管和血管疾病的方法。
[0085]需要其的受試者可包括，例如，已經(jīng)診斷有糖尿病的受試者、已經(jīng)診斷有代謝性疾病的受試者、肥胖的受試者、或已經(jīng)針對(duì)代謝性疾病或糖尿病而治療的受試者(包括難以用先前治療而治療的受試者)。需要其的受試者還可包括，例如，易患代謝性疾病或糖尿病的受試者(包括易患肥胖的受試者)、超重的受試者和具有代謝性疾病或糖尿病家族史的受試者。
[0086]在某些實(shí)施方案中，本文所述方法涉及糖尿病的治療。本文所述方法可用于治療任何形式的糖尿病,包括I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。
[0087]在某些實(shí)施方案中，本文所述方法包括任何代謝性病癥的治療。在某些實(shí)施方案中，治療的代謝性病癥為肥胖、胰島素抵抗、高胰島素血癥、低胰島素血癥(hypoinsulinemia) > II型糖尿病、高血壓、高肝脂肪變性(hyperhepatosteatosis)、高尿酸血癥、脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、多囊性卵巢綜合征、黑棘皮病、飲食過(guò)多、內(nèi)分泌異常、甘油三酯忙積病、Bardet-Biedl 綜合征、Lawrence-Moon 綜合征、Prader-Labhart-Willi 綜合征或肌肉發(fā)育不全。在某些實(shí)施方案中，代謝性病癥為肥胖相關(guān)病癥，例如糖尿病、心血管疾病、高血壓、深靜脈血栓形成、骨關(guān)節(jié)炎、阻塞性睡眠呼吸暫停、癌癥或非酒精性脂肪肝病。
[0088]在一些實(shí)施方案中，本文所述藥物組合物將摻入以足以為患者遞送治療有效量的所摻入治療劑的量遞送的治療劑或其它物質(zhì)作為預(yù)防性或治療性治療的一部分?；钚詣┑钠谛铦舛葘⑷Q于藥物的吸收、失活和排泄速率以及該化合物的遞送速率。需指出的是劑量值還可隨著待緩解病況的嚴(yán)重性而變化。應(yīng)進(jìn)一步理解的是對(duì)于任何特定的受試者，應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要和給予或監(jiān)督給予組合物的人的專(zhuān)業(yè)判斷隨時(shí)間調(diào)整具體的劑量方案。一般地，將使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)確定劑量。
[0089]本發(fā)明藥劑的劑量可通過(guò)參照該藥劑的血漿濃度確定。例如，可使用最大血漿濃度(Cmax)和從時(shí)間O到無(wú)窮的血漿濃度-時(shí)間曲線(xiàn)下面積(AUC (0_4))。用于本發(fā)明的劑量包括產(chǎn)生Cmax和AUC (0-4)上述值的那些和使這些參數(shù)值更大或更小的其它劑量。
[0090]可改變本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平，以獲得對(duì)于特定患者、組合物和給藥方式有效達(dá)到期需治療反應(yīng)而對(duì)患者無(wú)毒性的活性成分的量。
[0091]所選劑量水平將取決于多種因素，包括所使用特定藥劑的活性、給藥途徑、給藥時(shí)間、所使用特定化合物的排泄或代謝率、治療持續(xù)時(shí)間、與所用特定化合物組合使用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)、待治療患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康和以前的病史以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類(lèi)似因素。
[0092]本領(lǐng)域普通技術(shù)醫(yī)師或獸醫(yī)可容易地確定并開(kāi)出所需的藥物組合物的有效量。例如，醫(yī)師或獸醫(yī)可開(kāi)出和/或給予低于達(dá)到期需的治療效果所需水平的組合物中所用本發(fā)明藥劑的劑量，并逐步增加劑量直到`達(dá)到期需的效果。
[0093]一般而言，本文所述藥劑的合適日劑量將為有效產(chǎn)生治療效果的最低劑量的藥劑的量。這一有效劑量將通常取決于上述因素。
[0094]在某些實(shí)施方案中，通過(guò)給予受試者表達(dá)激肽釋放酶家族肽酶的細(xì)胞群而給予受試者激肽釋放酶家族肽酶。在某些實(shí)施方案中，這些細(xì)胞經(jīng)工程改造以表達(dá)提高水平的激肽釋放酶家族肽酶。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)向細(xì)胞中插入轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含與組成型或有條件的啟動(dòng)子操作性連接的激肽釋放酶家族肽酶編碼核酸。或者，細(xì)胞可通過(guò)敲除內(nèi)源性Rheb GTP酶基因或通過(guò)插入包含與組成型或有條件的啟動(dòng)子操作性連接的RhebGTP酶抑制性RNA分子編碼核酸的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行工程改造，使得其表達(dá)降低水平的Rheb GTP酶。
[0095]在某些實(shí)施方案中，給予受試者的表達(dá)激肽釋放酶家族肽酶的細(xì)胞群包含T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。在某些實(shí)施方案中，使用受試者自身的細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)激肽釋放酶的細(xì)胞群。例如，在一些實(shí)施方案中從受試者中分離骨髓或外周血干細(xì)胞，如上文所述經(jīng)工程改造以表達(dá)提高水平的激肽釋放酶家族肽酶，然后給回受試者。在這樣的實(shí)施方案中，細(xì)胞排斥的可能性較小。
[0096]本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述，這些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請(qǐng)所引用的所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和出版的專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容，以及圖形，通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
[0097]實(shí)施例1
mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路為營(yíng)養(yǎng)物敏感的級(jí)聯(lián)，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用LoxP-cre技術(shù)開(kāi)發(fā)了僅在T細(xì)胞中缺乏該信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)成員Rheb的小鼠系(由此稱(chēng)為 Rhebfl/fl CD4cre)。
[0098]Rhebfim⑶4cre小鼠以比其對(duì)應(yīng)WT快的速率增加體重(圖1)。這些小鼠顯示體脂沉積量的顯著增加，其中與其對(duì)應(yīng)WT相比，7周齡Rhebfim⑶4cre小鼠呈現(xiàn)3_6倍的體脂質(zhì)量(圖2a、2b)。Rhebfl7fl CD4cre小鼠的瘦體重未增加(圖2c)。
[0099]當(dāng)研究Rhebfim⑶4cre小鼠攝取葡萄糖的能力時(shí)，觀察到其顯示腹膜內(nèi)D-葡萄糖挑戰(zhàn)(D-Glucose challenge)后從其血流中攝取葡萄糖的能力增加(圖3a),和胰島素敏感性增加(圖3b)。還觀察到Rhebfim⑶4cre小鼠具有比WT對(duì)照低的血清甘油三酯水平(圖4a)，但血清高密度脂蛋白(HDL)水平并無(wú)不同(圖4b)。這是一個(gè)傳統(tǒng)上與“擬合(fit) ”情況相關(guān)的表型，并且不是通常在嚴(yán)重肥胖個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的。
[0100]Rhebfim CD4cre小鼠在24小時(shí)期間吃的食物比年齡一致的WT對(duì)照多(圖5a)，而每30g體重每小時(shí)所吃的食物量并無(wú)不同(圖5b)，這提示體重的增加并不是因?yàn)樯窠?jīng)病癥，而是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)代謝的一些不同。
[0101]為了確定哪個(gè)組織造成了 Rhebfim⑶4cre小鼠葡萄糖攝取增強(qiáng)和胰島素敏感性增加，使用18F-FDG質(zhì)子發(fā)射斷層掃描(PET)成像將放射性葡萄糖的組織攝取可視化。在WT小鼠中，大部分的可檢測(cè) 信號(hào)位于膀胱、腦、心臟和腸(圖6a)。然而，在Rhebfim CD4cre小鼠中，肩胛骨之間的背上的組織中存在高水平的葡萄糖攝取(圖6b)。這一解剖學(xué)位置和代謝概況提示與WT對(duì)照相比Rhebfim⑶4cre小鼠具有明顯的褐色脂肪組織(BAT)沉積。已知BAT富含血管并具有高葡萄糖代謝率。
[0102]進(jìn)行肝和脂肪組織的實(shí)時(shí)PCR分析檢測(cè)基因表達(dá)概況，這將解釋在Rhebfl/fl⑶4cre小鼠中觀察到的表型。在Rhebfim⑶4cre小鼠肝中觀察到骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7，TGF-β家族成員，其增強(qiáng)褐色脂肪組織的發(fā)展)的表達(dá)增加(圖7a)。在Rhebfl/fl⑶4cre小鼠中還觀察到成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21 (FGF-21)的表達(dá)增加(圖7b)。FGF-21為脂肪組織中刺激葡萄糖攝取的因子。最后，在Rhebfim⑶4cre小鼠肝中觀察到乙酰-CoA硫酯酶I的表達(dá)減少(圖7c)。
[0103]檢查了 Rhebfim⑶4cre小鼠的T細(xì)胞利用葡糖糖的能力。如通過(guò)乳酸產(chǎn)生所測(cè)量的，從Rhebfim⑶4cre小鼠分離的⑶4 T細(xì)胞具有比其對(duì)應(yīng)WT低的糖酵解率(圖8)。
[0104]使用Oxymax間接測(cè)熱法測(cè)量WT和Rhebfim CD4cre小鼠的呼吸交換率(RER)。該技術(shù)確定了小鼠使用的代謝底物性質(zhì)，得分在I附近指示碳水化合物利用，得分在0.7附近指示脂肪利用。在光/暗周期期間Rhebfim⑶4cre小鼠顯示RER得分的急劇變化(圖9)。這些結(jié)果提示在暗周期期間，當(dāng)食物被消耗時(shí)，Rhebfl7fl CD4cre小鼠主要利用其食物中消耗的碳水化合物產(chǎn)生能量。然而，在光周期期間，很少的食物被消耗，其依靠脂肪儲(chǔ)存。這些結(jié)果與Rhebfim⑶4cre小鼠的高 胰島素敏感性一致。[0105]為了確保Rhebfim⑶4cre小鼠中觀察到的表型不是因?yàn)門(mén)細(xì)胞以外組織中Rheb的異位缺失所致，使用從WT和Rhebfim CD4cre小鼠分離的骨髓進(jìn)行骨髓移植(BMT)，并注射入經(jīng)輻照WT受者。正如親代品系，接受Rhebfim⑶4cre小鼠骨髓的小鼠比接受WT骨髓的小鼠體重增加快(圖10)。
[0106]接著，將CD4 T細(xì)胞從WT和Rhebfim CD4cre小鼠轉(zhuǎn)移至Rag-/-受者。2.5周后，小鼠禁食6小時(shí)，并檢驗(yàn)其從血流中清除葡萄糖的能力。如圖11所示，接受Rhebfim CD4cre小鼠的CD4 T細(xì)胞的小鼠顯示其從血流中清除葡萄糖的能力增強(qiáng)。這證明僅通過(guò)提供缺乏Rheb活性的CD4 T細(xì)胞群而調(diào)節(jié)宿主的總體葡萄糖敏感性是可能的。
[0107]對(duì)從WT和Rhebfim⑶4cre小鼠分離的⑶4和⑶8 T細(xì)胞進(jìn)行了微陣列分析。基因Klklb22 (激肽釋放酶蛋白酶家族成員)在從Rhebfim⑶4cre小鼠分離的⑶4和⑶8細(xì)胞兩者中均非常高地表達(dá)。通過(guò)RT-PCR確認(rèn)了這一結(jié)果。
[0108]接下來(lái)檢驗(yàn)了 Rheb缺陷的T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移是否可逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)時(shí)間高脂肪飲食誘導(dǎo)的胰島素不敏感性。為此，WT小鼠用60%脂肪飲食維持25周，此時(shí)間點(diǎn)后約40%的小鼠顯示明顯的胰島素不敏感性。此時(shí)，對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行輕微輻照(700rad)，并靜脈注射4xl06個(gè)從Rhebfim⑶4cre小鼠分離的⑶4 T細(xì)胞。I周后，對(duì)糖尿病小鼠取血以測(cè)定過(guò)繼轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞擴(kuò)增的水平，并測(cè)定其對(duì)胰島素的敏感性。約50%接受Rhebfim⑶4cre T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的小鼠顯示對(duì)胰島素的敏感性增加(圖12a)。此外，胰島素敏感性增長(zhǎng)最強(qiáng)勁的小鼠為被供體T細(xì)胞最高程度重構(gòu)的那些(圖12b)。因此將Rhebfim⑶4cre T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至II型糖尿病小鼠能夠治愈其糖尿病。
[0109]檢驗(yàn)了 Rhebfim CD4cre小鼠的血清傳送增強(qiáng)的葡萄糖攝取的能力。將WT和Rhebfl/fl⑶4cre小鼠禁食2小時(shí)，然后心臟穿刺取血并分離其血清。靜脈注射100 μ I血清至已經(jīng)禁食4小時(shí)的WT小鼠中。30分鐘后，受體小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射1.5g/kg D-葡萄糖。使用OneTouch Ultra系統(tǒng)測(cè)量血糖水平。如圖13中所示，與給予WT小鼠血清的小鼠相比，給予Rhebfl7fl⑶4cre小鼠血清的小鼠的葡萄糖攝取水平顯著提高。
`[0110]實(shí)施例2
本文已經(jīng)進(jìn)一步確定Klklb22增強(qiáng)響應(yīng)胰島素劑量反應(yīng)的胰島素受體磷酸化和延長(zhǎng)的胰島素受體磷酸化兩者。具體而言，用不同劑量的胰島素在重組(Flag標(biāo)簽分離的)Klklb22存在或不存在的情況下孵育HEK293T細(xì)胞。收集裂解物，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析評(píng)估胰島素受體磷酸化(圖18A)。類(lèi)似地，在重組(Flag標(biāo)簽分離的)Klklb22存在或不存在的情況下孵育HEK293T細(xì)胞。在不同時(shí)間點(diǎn)收集裂解物，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析評(píng)估胰島素受體磷酸化(圖18B)。圖18A-18B中所顯示的數(shù)據(jù)證明Klklb22增強(qiáng)響應(yīng)胰島素劑量反應(yīng)的胰島素受體磷酸化和延長(zhǎng)的胰島素受體磷酸化兩者。
[0111]等價(jià)實(shí)施方案
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定，本文所述本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等價(jià)實(shí)施方案。這些等價(jià)實(shí)施方案意在被所述權(quán)利要求書(shū)包括。
【權(quán)利要求】
1.用于在受試者中預(yù)防或治療糖尿病的方法，包括給予受試者激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與選自SEQ ID NO: 1-41的序列至少70%同一性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQID NO: 38至少70%同一性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQID NO: 12至少70%同一性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQID NO:1至少70%同一性的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖尿病為I型糖尿病。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖尿病為II型糖尿病。
8.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者包含分離的激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的藥物組合物而給予。
9.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者表達(dá)激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的重組細(xì)胞群而給予。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述重組細(xì)胞群包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。
11.用于在受試者中增加胰 島素敏感性的方法，包括給予受試者激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與選自SEQ ID NO: 1-41的序列至少70%同一性的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQ ID NO: 38至少70%同一性的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQ ID NO: 12至少70%同一性的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQ ID NO:1至少70%同一性的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的方法,其中所述受試者具有I型糖尿病。
17.權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者具有II型糖尿病。
18.權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者包含分離的激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的藥物組合物而給予。
19.權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者表達(dá)激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的重組細(xì)胞群而給予。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述重組細(xì)胞群包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。
21.用于在受試者中預(yù)防或治療代謝性病癥的方法，包括給予受試者激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與選自SEQ ID NO: 1-41的序列至少70%同一性的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQ ID NO: 38至少70%同一性的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQ ID NO: 12至少70%同一性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段具有與SEQ ID NO:1至少70%同一性的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述代謝性病癥為肥胖。
27.權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者包含分離的激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的藥物組合物而給予。
28.權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段通過(guò)給予受試者表達(dá)激肽釋放酶家族肽酶或其生物學(xué)活性片段的重組細(xì)胞群而給予。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述重組細(xì)胞群包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。
30.用于在受試者中預(yù)防或治療糖尿病的方法，包括給予受試者增加受試者中激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)的藥劑。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶選自Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4 和 Klkl5。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶為Klkl2。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶為Klkl。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述藥劑為小分子、多肽、抗體或抑制性RNA分子。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述藥劑為Rheb的小分子抑制劑或Rheb特異性抑制性RNA分子。
36.權(quán)利要求30-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖尿病為I型糖尿病。
37.權(quán)利要求30-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖尿病為II型糖尿病。
38.用于在受試者中增加胰島素敏感性的方法，包括給予受試者增加受試者中激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)的藥劑。
39.權(quán)利要求38的方法， 其中所述激肽釋放酶家族肽酶選自Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4 和 Klkl5。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶為Klkl2。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶為Klkl。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述藥劑為小分子、多肽、抗體或抑制性RNA分子。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述藥劑為Rheb的小分子抑制劑或Rheb特異性抑制性RNA分子。
44.權(quán)利要求38-42中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者具有I型糖尿病。
45.權(quán)利要求38-42中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者具有II型糖尿病。
46.用于在受試者中預(yù)防或治療代謝性病癥的方法，包括給予受試者增加受試者中激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)的藥劑。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶選自Klkl、Klk2、Klk3、Klk4、Klk5、Klk6、Klk7、Klk8、Klk9、KlklO、Klkll、Klkl2、Klkl3、Klkl4 和 Klkl5。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶為Klkl2。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶為Klkl。
50.權(quán)利要求46的方法，其中所述藥劑為小分子、多肽、抗體或抑制性RNA分子。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述藥劑為Rheb的小分子抑制劑或Rheb特異性抑制性RNA分子。
52.權(quán)利要求46-51中任一項(xiàng)的方法，其中所述代謝性病癥為肥胖。
53.用于在受試者中預(yù)防或治療糖尿病的方法，包括給予受試者一種或多種重組細(xì)胞，其中所述一種或多種重組細(xì)胞的Rheb表達(dá)或活性降低。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子被突變或敲除。
55.權(quán)利要求53的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞表達(dá)Rheb特異性抑制性RNA分子。
56.權(quán)利要求53-55中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其 組合。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞與受試者同源。
58.權(quán)利要求57的方法，其中使用受試者的一種或多種非重組細(xì)胞產(chǎn)生所述一種或多種重組細(xì)胞。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括從受試者中獲取一種或多種非重組細(xì)胞的步驟。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將一種或多種非重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一種或多種重組細(xì)胞的步驟。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟通過(guò)突變一種或多種非重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子進(jìn)行。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟通過(guò)向一種或多種非重組細(xì)胞中引入Rheb特異性抑制性RNA分子表達(dá)載體進(jìn)行。
63.用于在受試者中增加胰島素敏感性的方法，包括給予受試者一種或多種重組細(xì)胞，其中所述一種或多種重組細(xì)胞的Rheb表達(dá)或活性降低。
64.權(quán)利要求63的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子被突變或敲除。
65.權(quán)利要求63的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞表達(dá)Rheb特異性抑制性RNA分子。
66.權(quán)利要求63-65中任一項(xiàng)的方法,其中所述一種或多種重組細(xì)胞包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞與受試者同源。
68.權(quán)利要求67的方法,其中使用受試者的一種或多種非重組細(xì)胞產(chǎn)生所述一種或多種重組細(xì)胞。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括從受試者中獲取一種或多種非重組細(xì)胞的步驟。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將一種或多種非重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一種或多種重組細(xì)胞的步驟。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟通過(guò)突變一種或多種非重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子進(jìn)行。
72.權(quán)利要求70的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟通過(guò)向一種或多種非重組細(xì)胞中引入Rheb特異性抑制性RNA分子表達(dá)載體進(jìn)行。
73.用于在受試者中預(yù)防或治療代謝性病癥的方法，包括給予受試者一種或多種重組細(xì)胞，其中所述一種或多種重組細(xì)胞的Rheb表達(dá)或活性降低。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子被突變或敲除。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞表達(dá)Rheb特異性抑制性RNA分子。
76.權(quán)利要求73-75中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞包括T細(xì)胞、T細(xì)胞前體、B細(xì)胞、B細(xì)胞前體、骨髓干 細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或其組合。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述一種或多種重組細(xì)胞與受試者同源。
78.權(quán)利要求77的方法，其中使用受試者的一種或多種非重組細(xì)胞產(chǎn)生所述一種或多種重組細(xì)胞。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括從受試者中收獲一種或多種非重組細(xì)胞的步驟。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將一種或多種非重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一種或多種重組細(xì)胞的步驟。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟通過(guò)突變一種或多種非重組細(xì)胞中的Rheb基因或Rheb啟動(dòng)子進(jìn)行。
82.權(quán)利要求80的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟通過(guò)向一種或多種非重組細(xì)胞中引入Rheb特異性抑制性RNA分子表達(dá)載體進(jìn)行。
83.用于確定測(cè)試化合物是否為可能的用于治療糖尿病的治療劑的方法，包括下列步驟: (a)使細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；和 (b)檢測(cè)細(xì)胞的激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)； 其中導(dǎo)致激肽釋放酶家族肽酶表達(dá)增加的測(cè)試化合物為可能的用于治療糖尿病的治療劑。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述細(xì)胞為小鼠細(xì)胞，并且所述激肽釋放酶家族肽酶為Klklb22。
85.權(quán)利要求83的方法，其中所述細(xì)胞為人細(xì)胞，并且所述激肽釋放酶家族肽酶為Klkl 或 Klkl2。
86.權(quán)利要求83-85中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞。
87.權(quán)利要求83-85中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶mRNA而檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。
88.權(quán)利要求83-85中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶蛋白而檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。
89.權(quán)利要求83-85中任一項(xiàng)的方法，其中所述激肽釋放酶家族肽酶與可檢測(cè)部分連接。
90.權(quán)利要求89的方法，其中通過(guò)檢測(cè)可檢測(cè)部分而檢測(cè)激肽釋放酶家族肽酶的表達(dá)。
91.用于確定測(cè)試化合物是否為可能的用于治療糖尿病的治療劑的方法，包括下列步驟: (a)使細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，其中所述細(xì)胞包含與激肽釋放酶家族肽酶基因啟動(dòng)子操作性連接的編碼可檢測(cè)部分的核酸序列；和 (b)檢測(cè)細(xì)胞的可檢測(cè)部分的表達(dá)； 其中導(dǎo)致可檢測(cè)部分的表達(dá)增加的測(cè)試化合物為可能的用于治療糖尿病的治療劑。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述啟動(dòng)子為Klklb22啟動(dòng)子。
93.權(quán)利要求91的方法，其中所述啟動(dòng)子為Klkl啟動(dòng)子或Klkl2啟動(dòng)子。
94.權(quán)利要求90-93中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61K38/00GK103889435SQ201280040043
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月17日
【發(fā)明者】J.D.鮑威爾, B.肖, P.F.沃爾利, G.M.德?tīng)柛攴? A.維克曼 申請(qǐng)人:約翰斯·霍普金斯大學(xué)