針對表皮生長因子受體(egfr)的抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開抗EGFR抗體、包含抗EGFR抗體的組合的治療組合物以及使用所述抗體和組合物治療EGFR相關(guān)病癥(例如癌癥)的方法。
【專利說明】針對表皮生長因子受體(EGFR)的抗體及其用途
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求美國臨時申請?zhí)?1/504633(2011年7月5日提交)和美國臨時申請?zhí)?1/558945(2011年11月11日提交)的優(yōu)先權(quán)益，所述美國臨時申請兩者皆以引用的方式并入本文。
[0003]背景
[0004]天然免疫系統(tǒng)已進化產(chǎn)生用于高效中和病原體的抗體。自免疫動物分離的天然抗體制劑是多克隆起源，且與局限于特定抗原的一個或數(shù)個表位的個別抗體相比顯示免疫優(yōu)勢?？鼓[瘤抗體能夠阻斷其所結(jié)合的腫瘤細胞的生長或殺死所述細胞，已被開發(fā)成高度有效的癌癥治療劑?？鼓[瘤抗體的混合物達成的腫瘤抑制作用可大于由所述混合物中的任何個別抗體所達成的腫瘤抑制作用。
[0005]所述結(jié)果已通過組合兩種或更多種針對表皮生長因子受體EGFR(ErbBl)的中和抗體達成。已證明結(jié)合且抑制EGFR的抗體提供有用抗癌益處且具有巨大醫(yī)學(xué)和商業(yè)價值。拮抗而非競爭性抗EGFR抗體對的特定組合導(dǎo)致EGFR下調(diào)，此比單獨應(yīng)用任一抗體更快且更有效(Friedman等(2005) PNAS102:1915-1920)。兩種交叉競爭性(即彼此競爭性結(jié)合抗原)抗EGFR抗體的組合已顯示是非協(xié)同性的。多個抗體與EGFR的不同表位結(jié)合有可能于細胞表面上形成復(fù)合受體的點陣，從而導(dǎo)致內(nèi)化和降解比用靶向單一表位的抗體獲得的內(nèi)化和降解更高效。也已報道特定抗EGFR受體抗體對的組合在體內(nèi)產(chǎn)生累加性且在一些情況下協(xié)同性抗腫瘤活性(Perera等(2005) Clin Cancer Resll:6390-6399)。與拮抗抗體528組合的單克隆抗體806(針對突變de2-7EGFR產(chǎn)生)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物模型中顯示的抗腫瘤活性顯著高于用任一抗體單獨治療的抗腫瘤活性。顯示協(xié)同抗腫瘤活性的機制與EGFR快速下調(diào)相關(guān)，所述下調(diào)不受用個別抗體進行治療誘導(dǎo)。類似地，在另一對抗EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)和EMD55900存在下EGFR憐酸化大大降低(Kamat等(2008)Cancer Biol Ther7:726- 33)。
[0006]也已顯示祀向相關(guān)受體ErbB2的抗體的某些組合協(xié)同地起作用(Friedman等(2005))。與帕妥珠單抗(pertuzumab)組合的曲妥珠單抗在個別抗體無效的劑量下抑制BT474乳癌細胞的存活(Nahta等(2004)Cancer Res64:2343-2346)。在另一研究中，三種非競爭性抗ErbB2抗體在組合使用時顯示比個別使用時更有效體外殺死BT474細胞，且于BT474體內(nèi)異種移植物模型中獲得類似結(jié)果(Spiridon等(2002) Clin CancerRes8:1699-701)。
[0007]已報道組合一種以上抗體可增強抗體對腫瘤細胞的生長抑制(例如細胞毒性)作用的其它證據(jù)。舉例而言，組合針對腫瘤抗原17-1A的單克隆抗體，研究腫瘤細胞溶解，且發(fā)現(xiàn)單克隆抗體以及競爭性抗體的組合無效，而兩種或更多種非競爭性抗體的組合導(dǎo)致腫瘤細胞完全溶解。
[0008]除組合抗體之外，通過稱為親和力成熟的重組DNA技術(shù)增加重組表達的抗腫瘤抗體的抗原親和力也已達成較高抗體效能。
[0009]因此，仍然需要用于產(chǎn)生抗腫瘤抗體作用以便增強腫瘤對抗EGFR抗體和抗體組合的反應(yīng)性的其它途徑和方法，所述抗EGFR抗體和抗體組合包括增強信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制且提供更有效細胞抑制或細胞毒性抗腫瘤結(jié)果的具有較高腫瘤親和力的抗EGFR抗體和所述高親和力抗EGFR抗體的組合。
[0010]
[0011]本文中提供與EGFR結(jié)合且抑制各種EGFR功能的新型單克隆抗體。這些抗體提供有用治療作用，且當(dāng)彼此組合或與其它抗ErbB受體抗體(例如其它抗EGFR抗體)組合時，與單獨施用各種抗體相比能夠顯示協(xié)同或累加治療作用。這些抗體在個別或以如本文中提供的組合形式施用時適用于治療與EGFR介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的多種病癥(例如癌癥)。因此，本文中也提供顯示與EGFR結(jié)合且抑制各種EGFR功能的性質(zhì)的分離的新型單克隆抗體、以及顯示所述性質(zhì)的所述抗體的組合。也提供這些抗體用于診斷和治療目的的用途，且公開本文中的抗體和抗體組合的用途。
[0012]在一個實施方案中，提供結(jié)合EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域且包含重鏈和輕鏈⑶Rl XDR2和⑶R3序列的單克隆抗體，其中所述重鏈和輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列選自由以下組成的組:
[0013](a)分別為SEQ ID NO: 1、2和3的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID N0:4、5 和 6 的輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列；
[0014](b)分別為SEQ ID N0:7、8和9的重鏈CDRU CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID NO: 10、11和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列；以及
[0015](c)分別為SEQ ID N0:13、14和15的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID N0:16、17 和 18 的輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列。
[0016]在另一實施方案中，提供與EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合且包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體，其中所述重鏈和輕鏈可變區(qū)序列選自由以下組成的組:
[0017](a)包含SEQ ID NO: 19的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)；
[0018](b)包含SEQ ID NO: 21的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 22的輕鏈可變區(qū)；以及
[0019](c)包含SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)。
[0020]以上提及的單克隆抗體可以例如優(yōu)于100nM、或優(yōu)于10nM、或優(yōu)于InM、或優(yōu)于100pM、或優(yōu)于10pM、或優(yōu)于IpM的Kd與EGFR結(jié)合。單克隆抗體可顯示一種或多種本文中公開的功能性質(zhì)。單克隆抗體可為例如人抗體。在其它實施方案中，抗體可為雙特異性抗體、免疫綴合物、Fab、Fab’ 2、ScFv、a〗libody.t.高親和性多聚體(avimer)、納米體或結(jié)構(gòu)域抗體。在其它實施方案中，單克隆抗體可為例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同種型抗體。
[0021]也提供包含以上提及的抗EGFR單克隆抗體的任何一者或多者和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。也提供試劑盒。試劑盒可包括例如于容器中的藥物組合物。也提供治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含以上提及的抗EGFR單克隆抗體的任何一者或多者。也提供用于治療癌癥(或用于制造治療癌癥的藥劑)的以上提及的抗EGFR單克隆抗體或其組合。 [0022]在另一實施方案中，提供包含兩種或三種與EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體的組合物，其中所述兩種或三種單克隆抗體選自由以下組成的組:
[0023](a)包含分別為SEQ ID NO: 1、2和3的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID N0:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；
[0024](b)包含分別為SEQ ID NO: 7、8和9的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID N0:10、ll和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；以及
[0025](c)包含分別為SEQ ID NO: 13、14和15的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 16、17和18的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；
[0026]且其中所述組合物包含(a)和(b)、(a)和(c)、(b)和(c)或(a)、(b)和(c)。
[0027]在另一實施方案中，提供包含兩種或三種與EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體的組合物，其中所述兩種或三種單克隆抗體選自由以下組成的組:
[0028](a)包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；
[0029](b)包含含有SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；以及
[0030](c)包含含有SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；
[0031]且其中所述組合物包含(a)和(b)、(a)和(c)、(b)和(c)或(a)、(b)和(c)。
[0032]于包含兩種或三種抗體的以上提及的組合物中的單克隆抗體(a)、(b)和(C)各自可以例如優(yōu)于100nM、或優(yōu)于IOnM或優(yōu)于InM的Kd與EGFR結(jié)合。單克隆抗體(a)、(b)和
(c)各自可顯示本文中 公開的一種或多種功能性質(zhì)。單克隆抗體(a)、(b)和(c)各自可為例如人抗體。在其它實施方案中，單克隆抗體(a)、(b)和(C)中的一者或多者獨立地選自由雙特異性抗體、免疫綴合物、Fab、Fab’ 2、ScFv、alTibodyK)、高親和性多聚體、納米體和結(jié)構(gòu)域抗體組成的組。在其它實施方案中，單克隆抗體(a)、(b)和(C)各自獨立地選自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE 同種型抗體組成的組。單克隆抗體(a)、(b)和(C)也可呈IgY和駱馬它(came I id)抗體形式。
[0033]也提供藥物組合物，其包含含有兩種或三種抗EGFR單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體的以上提及的組合物中的任一者。也提供試劑盒。試劑盒可包括例如于容器中的藥物組合物。也提供治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含含有兩種或三種抗EGFR單克隆抗體的以上提及的組合物中的任一者。也提供用于治療癌癥的包含兩種或三種抗-抗EGFR單克隆抗體的以上提及的組合物(及其用于制造藥劑的用途)。
[0034]在另一實施方案中，提供包含三種單克隆抗EGFR抗體的組合物，所述組合物包含第一抗體、第二抗體和第三抗體，其中(i)所述第一抗體包含分別為SEQ ID N0:l、2和3的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID N0:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)所述第二抗體包含分別為SEQ ID N0:7、8和9的重鏈CDRU CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID N0:10、ll和12的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列；且(iii)所述第三抗體包含分別為SEQ ID NO: 13、14和15的重鏈CDRU CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ IDNO: 16、17和18的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，且其中所述第一、第二和第三抗體以彼此2:2:1的摩爾比存在。
[0035]在另一實施方案中，提供包含三種單克隆抗EGFR抗體的組合物，所述組合物包含第一抗體、第二抗體和第三抗體，其中(i)所述第一抗體包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)；(ii)所述第二抗體包含含有SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)；且(iii)所述第三抗體包含含有SEQ IDNO: 23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO: 24的輕鏈可變區(qū)，且其中所述第一、第二和第三抗體以彼此2:2:1的摩爾比存在。
[0036]于以上提及的組合物中的第一、第二和第三抗體各自可以例如優(yōu)于100nM、或優(yōu)于IOnM或優(yōu)于InM的Kd與EGFR結(jié)合。在另一實施方案中，第一抗體以IxKT9M至1.1xKT11M范圍內(nèi)的Kd與EGFR結(jié)合，第二抗體以IxlO-9M至7.0xKT11M范圍內(nèi)的Kd與EGFR結(jié)合，且第三抗體以IxlO-9M至3.6xl0^10M范圍內(nèi)的Kd與EGFR結(jié)合。以上提及的組合物中的第一、第二和第三抗體各自可顯示本文中公開的一種或多種功能性質(zhì)。以上提及的組合物中的第一、第二和第三抗體各自可為例如人抗體。在其它實施方案中，第一抗體、第二抗體和第三抗體中的一者或多者獨立地選自由雙特異性抗體、免疫綴合物、Fab、Fab’ 2、ScFv、親和體、高親和性多聚體、納米體和結(jié)構(gòu)域抗體組成的組。在其它實施方案中，第一抗體、第二抗體和第三抗體各自獨立地選自由 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE同種型抗體組成的組。
[0037]也提供包含以上提及的抗EGFR組合物中的任一者的藥物組合物，所述抗EGFR組合物包含2:2:1比率的第一抗體、第二抗體和第三抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。在一個實施方案中，藥物組合物是無菌組合物。在另一實施方案中，藥物組合物適于注射。在另一實施方案中，所述藥物組合物是適于靜脈內(nèi)注射的無菌組合物。也提供試劑盒。試劑盒可包括例如于容器中的藥物組合物。也提供治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物， 所述藥物組合物包含含有2:2:1比率的第一、第二和第三抗體的以上提及的抗EGFR組合物中的任一者。也提供任何以上提及的抗EGFR組合物用于制造治療癌癥的藥劑的用途，所述抗EGFR組合物包含2:2:1比率的第一、第二和第三抗體。
[0038]在另一實施方案中，提供制備抗EGFR抗體組合物的方法，所述方法包括于單一組合物中組合:
[0039](a)包含分別為SEQ ID NO: 1、2和3的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID N0:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；
[0040](b)包含分別為SEQ ID NO: 7、8和9的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID N0:10、ll和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；以及
[0041](c)包含分別為SEQ ID NO: 13、14和15的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 16、17和18的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；
[0042]其中(a)、(b)和(C)以彼此2:2:1的摩爾比組合。
[0043]在另一實施方案中，提供制備抗EGFR抗體組合物的方法，所述方法包括于單一組合物中組合:
[0044](a)包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；
[0045](b)包含含有SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；以及
[0046](c)包含含有SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；
[0047]其中(a)、(b)和(C)以彼此2:2:1的摩爾比組合。
[0048]在另一實施方案中，提供用抗EGFR抗體治療受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用:
[0049](a)包含分別為SEQ ID NO: 1、2和3的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID N0:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；
[0050](b)包含分別為SEQ ID NO: 7、8和9的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID N0:10、ll和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；以及
[0051](c)包含分別為SEQ ID NO: 13、14和15的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 16、17和18的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；
[0052]其中(a)、(b)和(C)以彼此2:2:1的摩爾比施用于所述受試者。
[0053]在另一實施方案中，提供用抗EGFR抗體治療受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用:
[0054](a)包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；
[0055](b)包含含有SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；以及
[0056](c)包含含有SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；
[0057]其中(a)、(b)和(C)以彼此2:2:1的摩爾比施用于所述受試者。
[0058]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將根據(jù)以下詳述和權(quán)利要求而顯而易知。
[0059]附圖簡沭
[0060]圖1A是展示使用野生型EGFR-ECD抗原(WT) ,Binl表位突變體(BinlMT)和Bin3表位突變體(Bin3MT)，用P1X、P2X和P3X抗體進行直接ELISA表位分區(qū)實驗的結(jié)果的柱狀圖。
[0061]圖1B是展示表面等離子共振表位分區(qū)實驗結(jié)果的圖，所述實驗使用綴合于Biacore芯片上的ICRlO表位(Bin2)，其中注射野生型EGFR-E⑶抗原，隨后相繼注射P1X、P2X和P3X抗體。
[0062]圖2A是展示表面等離子共振表位分區(qū)實驗結(jié)果的圖，所述實驗使用綴合于Biacore芯片上的PlX抗體，其中注射野生型EGFR-E⑶抗原，隨后相繼注射P3X、P2X和PlX抗體。
[0063]圖2B是展示表面等離子共振表位分區(qū)實驗結(jié)果的圖，所述實驗使用綴合于Biacore芯片上的P2X抗體，其中注射野生型EGFR-E⑶抗原，隨后相繼注射P3X、P2X和PlX抗體。
[0064]圖2C是展示表面等離子共振表位分區(qū)實驗結(jié)果的圖，所述實驗使用綴合于Biacore芯片上的P3X抗體，其中注射野生型EGFR-E⑶抗原，隨后相繼注射P3X、P2X和PlX抗體。
[0065]圖3是展示如通過流動式細胞測量術(shù)所測量，P1X、P2X和P3X抗體對A431細胞上的EGFR的結(jié)合動力學(xué)的結(jié)果的圖(FACS圖)。[0066]圖4是展示磷酸-EGFR (pEGFR) ELISA的結(jié)果的圖，其顯示由單一抗體達成的pEGFR抑制:用P1X、P2X或P3X抗體進行單一藥劑處理。
[0067]圖5A是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的結(jié)果的圖，其通過比較由親本抗體(ca抗體)和親和力成熟PlX抗體達成的pERK抑制來顯示親和力成熟對pERK抑制的影響。
[0068]圖5B是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的結(jié)果的圖，其比較由親本抗體(ca和ch抗體)和親和力成熟P1X+P3X抗體達成的pERK抑制。
[0069]圖5C是展示磷酸_ERK(pERK)ELISA的結(jié)果的圖，其比較由親本抗體(ca和cd抗體)和親和力成熟P1X+P2X抗體達成的pERK抑制。
[0070]圖6A是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的結(jié)果的圖，其顯示由PlX抗體達成的pERK抑制，IC50值是約25nM。
[0071]圖6B是展示用5個組合比率的P3X+P2X的稀釋系列以及25nM恒定PlX濃度處理的A431細胞的磷酸-ERK (pERK) ELISA的結(jié)果的圖。
[0072]圖6C是展示用6個組合比率的P1X:P2X:P3X的稀釋系列處理的A431細胞的磷酸-ERK (pERK) ELISA的結(jié)果的圖。
[0073]圖6D是展示用5個組合比率的P1X:P2X的稀釋系列處理的A431細胞的磷酸-ERK (pERK) ELISA的結(jié)果的圖。
[0074]圖7A 是展示磷酸-EGFR (pEGFR) ELISA (圓形)和磷酸-ERK (pERK) ELISA (三角形)的結(jié)果的圖，其顯示由P1X:P2X:P3X的2:2:1組合達成的抑制。
[0075]圖7B是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的結(jié)果的圖，其顯示相對于單獨PlX單一抗體，由 P1X:P2X:P3X(P1X+P2X+P3X)的 2:2:1 制劑達成的抑制。
[0076]圖7C是展示磷酸-ERK(pERK)ELISA的結(jié)果的圖，其顯示相對于單獨P2X單一抗體，由P1X+P2X+P3X達成的抑制。
[0077]圖8A是展示H1975細胞的總EGFR(tEGFR)內(nèi)化動力學(xué)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果的柱狀圖，所述H1975細胞在用EGF刺激之前用P1X+P2X+P3X抗體預(yù)處理各種時間段。
[0078]圖8B是展示在用EGF刺激之前用P1X+P2X+P3X抗體預(yù)處理的H1975細胞的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果的柱狀圖，其展示相對于上樣對照(PCNA)和對照未處理細胞的溶解物校正的細胞 tEGFR、pERK、磷酸-AKT(pAKT)和磷酸-c_Jun (p-c-Jun)含量。
[0079]圖9A是展示HCC827細胞的細胞活力測定的結(jié)果的圖，其顯示與西妥昔單抗相比在EGF配體存在下通過用P1X+P2X+P3X抗體處理所達成的腫瘤細胞增殖抑制。
[0080]圖9B是展示H1975細胞的細胞活力測定的結(jié)果的圖，其顯示與西妥昔單抗相比在EGF配體存在下通過用P1X+P2X+P3X抗體處理所達成的腫瘤細胞增殖抑制。
[0081]圖9C是展示HCC827細胞的細胞活力測定的結(jié)果的圖，其顯示與西妥昔單抗相比在兩性調(diào)節(jié)蛋白(AREG)配體存在下通過用P1X+P2X+P3X抗體處理所達成的腫瘤細胞增殖抑制。
[0082]圖9D是展示H1975細胞的細胞活力測定的結(jié)果的圖，其顯示與西妥昔單抗相比在AREG配體存在下通過用P1X+P2X+P3X抗體處理所達成的腫瘤細胞增殖抑制。
[0083]圖1OA是展示DU145腫瘤異種移植物小鼠模型實驗的結(jié)果的圖，其顯示與PBS和西妥昔單抗對照相比在P1X+P2X+P3X抗體處理的小鼠中體內(nèi)腫瘤體積減小。
[0084]圖1OB是展示H1975腫瘤異種移植物小鼠模型實驗的結(jié)果的圖，其顯示與PBS對照相比在P1X+P2X+P3X抗體處理的小鼠中體內(nèi)腫瘤體積減小。
[0085]圖11是展示配體拮抗細胞結(jié)合測定的結(jié)果的圖，其顯示低劑量下單獨P1X、P2X或P3X的EGF配體阻斷能力。
[0086]圖12A是展示配體拮抗細胞結(jié)合測定的結(jié)果的圖，其顯示高劑量下單獨P1X、P2X或P3X或三元組合的EGF配體阻斷能力。
[0087]圖12B是展示配體拮抗細胞結(jié)合測定的結(jié)果的圖，其顯示高劑量下單獨PlX Fab、P2X Fab或P3X Fab或三元組合的EGF配體阻斷能力。
[0088]圖13A是展示磷酸-EGFR抑制測定的結(jié)果的圖，其顯示低劑量(50ng/ml ；8nM)下P1X+P2X+P3X或PlX Fab+P2X Fab+P3X Fab的三元組合的抑制能力。
[0089]圖13B是展示磷酸-EGFR抑制測定的結(jié)果的圖，其顯示高劑量(500ng/ml ；80nM)下P1X+P2X+P3X或PlX Fab+P2X Fab+P3X Fab的三元組合的抑制能力。
[0090]圖13C是展示磷酸-ERK抑制測定的結(jié)果的圖，其顯示低劑量(50ng/ml ；8nM)下P1X+P2X+P3X或PlX Fab+P2X Fab+P3X Fab的三元組合的抑制能力。
[0091]圖13D是展示磷酸-ERK抑制測定的結(jié)果的圖，其顯示高劑量(500ng/ml ；80nM)下P1X+P2X+P3X或PlX Fab+P2X Fab+P3X Fab的三元組合的抑制能力。
[0092]圖14是用P1X+P2X+P3X或PlX Fab+P2X Fab+P3X Fab的三元組合預(yù)處理或用西妥昔單抗預(yù)處理的細胞中EGF受體下調(diào)測定的免疫印跡。管家蛋白pcna用作對照。
[0093]詳沭
[0094]1.定義
`[0095]術(shù)語“EGFR”、“ErbBI”和“EGF受體”在本文中可互換使用來指人EGFR蛋白；參見UniProtKB/Swiss-Prot條目P00533。人EGFR的細胞外結(jié)構(gòu)域(EGFR-ECD)的氨基酸序列展示于實施例1和SEQ ID NO:33中。
[0096]如本文所用的術(shù)語“抑制”是指生物活性的任何統(tǒng)計顯著降低，包括完全阻斷活性。舉例而言，“抑制”可指生物活性統(tǒng)計顯著降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或約 100%。
[0097]如本文所用，抑制磷酸化是指相對于不存在抗體下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(對照)，抗體能夠統(tǒng)計顯著降低底物蛋白的磷酸化。如本領(lǐng)域中已知，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑包括例如磷酸肌醇3’ -激酶/Akt (PI3K/Akt/PTEN或“AKT”)和/或有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK/ERK或“ERK”)路徑。也如本領(lǐng)域中已知，EGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過測定底物的磷酸化程度(例如AKT和/或ERK的磷酸化或無磷酸化)來測量。因此，在一個實施方案中，抗EGFR抗體組合和組合物提供相對于不存在所述抗體下的AKT和/或ERK磷酸化程度(對照)，使AKT和ERK中任一者或兩者的磷酸化程度統(tǒng)計顯著抑制至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。所述EGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的測量涉及EGFR的細胞級聯(lián)中的蛋白的技術(shù)來測量，所述技術(shù)例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡或多重方法,如Lumincx?...[0098]如本文所用，措詞“抑制表達EGFR的細胞的生長”是指相對于不存在抗體下的細胞生長，抗體能夠體內(nèi)或體外統(tǒng)計顯著降低表達EGFR的細胞的生長。在一個實施方案中，當(dāng)使表達EGFR的細胞(例如癌細胞)與本文中公開的抗體組合物或組合接觸時，相對于不存在所述抗體組合物或組合下測量的生長(對照)，所述細胞的生長可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)測定細胞生長，所述技術(shù)測量細胞分裂速率、細胞群體內(nèi)經(jīng)受細胞分裂的細胞的分?jǐn)?shù)、和/或由于末端分化或細胞死亡而自細胞群體損失細胞的速率(例如使用細胞效價輝光測定(cell titer glow assay)或胸苷并入法)。
[0099]如本文所用，措詞“抑制EGFR配體與EGFR結(jié)合”是指相對于不存在抗體下的EGFR配體結(jié)合(對照)，抗體能夠統(tǒng)計顯著降低EGFR配體與其受體EGFR結(jié)合。此意指相對于對照(無抗體)，在抗體存在下，與EGFR結(jié)合的EGFR配體的量統(tǒng)計顯著降低。在本文中公開的抗體組合物或組合存在下，結(jié)合EGFR的EGFR配體的量相對于不存在所述抗體下的量(對照)可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)來測量EGFR配體結(jié)合的降低，所述技術(shù)測量存在或不存在(對照)抗體下，標(biāo)記的EGFR配體(例如放射性標(biāo)記的EGF或放射性標(biāo)記的P細胞素)的結(jié)合程度。
[0100]如本文所用，措詞“抑制EGFR 二聚”是指相對于不存在抗體下的EGFR 二聚(對照)，抗體能夠統(tǒng)計顯著降低EGFR 二聚(與另一 ErbB受體配對以形成同二聚體(例如ErbBI/ErbBI配對)或異二聚體(例如ErbBl/ErbB3配對))。在一個實施方案中，當(dāng)使表達EGFR的細胞與本文中公開的抗體組合物或組合接觸時,相對于不存在所述抗體下測量的EGFR 二聚(對照)，EGFR 二聚可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%?？墒褂帽绢I(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)來測量EGFR 二聚的降低，所述技術(shù)測量存在或不存在(對照)抗體下的EGFR 二聚程度。
[0101]如本文所用，措詞“下調(diào)EGFR表達”是指相對于不存在抗體下的EGFR表達(對照)，抗體能夠統(tǒng)計顯著降低EGFR在細胞表面上的表達，例如通過增加EGFR的內(nèi)化和/或通過減少來自細胞內(nèi)囊 泡的EGFR的再循環(huán)。在一個實施方案中，當(dāng)使表達EGFR的細胞與本文中提供的抗體組合物或組合接觸時，相對于不存在所述抗體下測量的EGFR在細胞表面上的表達(對照)，EGFR表達可降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或約100%。下調(diào)EGFR在細胞表面上的表達包括例如增加受體的內(nèi)化/再循環(huán)和/或增加受體的內(nèi)化/降解。可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)來測量EGFR內(nèi)化的增加，所述技術(shù)測量存在或不存在(對照)抗體下的EGFR內(nèi)化程度。
[0102]關(guān)于EGFR抗體的組合(本文中描述)，如本文所用的措詞“累加”或“累加性”是指兩種或更多種抗體的活性，其中它們的組合活性(相對于特定功能，例如抑制細胞生長)等于它們的個別活性的總和。也就是說當(dāng)個別地作用于表達EGFR的細胞時，本文中提供的兩種或更多種抗體的活性總和約等于所述抗體一起作用于相同細胞的組合效應(yīng)。在一個實施方案中，關(guān)于以上論述的任何性質(zhì)(例如抑制AKT或ERK磷酸化、抑制表達EGFR的細胞的生長等)測量累加效應(yīng)。
[0103]如本文所用，措詞“協(xié)同”或“協(xié)同的”是指兩種或更多種抗體的活性，其中它們的組合活性(相對于特定功能，例如抑制細胞生長)大于它們的個別活性的預(yù)期累加效應(yīng)。舉例而言，預(yù)期累加效應(yīng)可根據(jù)Bliss獨立性準(zhǔn)則(Bliss independence criteria)加以定義。根據(jù)Bliss準(zhǔn)則，兩種或更多種藥物(例如抗體)的效應(yīng)等于個別藥物的效應(yīng)總和減去個別藥物的效應(yīng)的乘積:
[0104]E12=E1+E2_E1*E2
[0105]其中El是由藥物I達成的抑制％，E2是由藥物2達成的抑制％，E12是由組合達成的預(yù)期抑制％。
[0106]協(xié)同效應(yīng)可適用于本文中論述的任何性質(zhì)(例如抑制EGFR依賴性AKT或ERK磷酸化、抑制表達EGFR的細胞的生長等)。在一特定實施方案中，相對于抗體的個別活性的累加效應(yīng)，組合抗體達成活性增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或90%以上。
[0107]如在本文中可互換使用的術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(抗原結(jié)合部分)或單鏈同源物?！翱贵w”包含至少一個重(H)鏈和一個輕(L)鏈。在天然存在的IgG中，例如這些重鏈和輕鏈通過二硫鍵互連且存在兩對重鏈和輕鏈，這兩對也通過二硫鍵互連。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中縮寫SVh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域，即CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為\)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域，即CL。Vh區(qū)和'區(qū)可進一步再分成高變區(qū)(稱為互補決定區(qū)(CDR))，其間散布有更保守區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)或接合(J)區(qū)(重鏈和輕鏈中分別為JH或JL)。各Vh和\主要由依以下順序自氨基端至羧基端排列的三個CDR、三個FR和一個J結(jié)構(gòu)域組成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、J。重鏈和輕鏈的可變區(qū)與抗原結(jié)合?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包括各種免疫系統(tǒng)細胞(例如效應(yīng)細胞)或體液因子，如經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。因此，抗體的保留與抗原(例如EGFR)特異性結(jié)合的能力的一個或多個片段可用于本文中公開的組合中。已顯示全長抗體的片段可執(zhí)行抗體的抗原結(jié)合功能。表示為抗體的抗原結(jié)合部分或片段的結(jié) 合片段的實例包括(i)Fab片段，一種由\、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫橋鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由Vh和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段;(V)包括 VH和 VL 結(jié)構(gòu)域的 dAb ;(vi)dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature341, 544-546)，其由Vh結(jié)構(gòu)域組成；(vii)由VH或VL結(jié)構(gòu)域組成的dAb ;和(viii)分離的互補決定區(qū)(CDR);或(ix)兩種或更多種分離的CDR的組合，所述CDR可任選通過合成接頭加以接合。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域\和Vh由單獨基因編碼，但其可使用重組方法通過合成接頭加以接合，所述合成接頭使其能夠以單一蛋白鏈形式制得，在所述單一蛋白鏈中，Vl區(qū)和VHg配對以形成單價分子(免疫球蛋白片段的所述單鏈同源物稱為單鏈Fv(ScFv))。所述單鏈抗體也意圖涵蓋在術(shù)語“抗體”內(nèi)?？贵w片段是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，且以與完整抗體相同的一般性方式針對效用篩選片段?？乖Y(jié)合部分可通過重組DNA技術(shù)或通過完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)裂解來產(chǎn)生。
[0108]如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指自大致上均質(zhì)抗體的群體獲得的抗體，即除可以少量存在的可能天然存在的突變之外，構(gòu)成所述群體的個別抗體是相同的。如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”也涵蓋所述免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段(包括scFv)。單克隆抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑不同，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇?？墒褂帽绢I(lǐng)域認(rèn)可的任何技術(shù)和本文中描述的技術(shù)，例如像雜交瘤方法、轉(zhuǎn)基因動物、重組DNA方法(參見例如美國專利號4，816，567)，或使用噬菌體抗體文庫，利用描述于例如美國專利號7，388，088和美國專利申請?zhí)?9/856，907 (PCT國際公布號W000/31246)中的技術(shù)來制備單克隆抗體。單克隆抗體包括嵌合抗體、人抗體和人源化抗體且可天然存在或重組產(chǎn)生。
[0109]術(shù)語“重組抗體”是指通過重組手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體，如(a)自免疫球蛋白基因(例如人免疫球蛋白基因)轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如小鼠)或自其制備的雜交瘤分離的抗體，(b)自轉(zhuǎn)型以表達抗體的宿主細胞(例如自轉(zhuǎn)染瘤)分離的抗體，(c)自使用噬菌體展示的重組組合抗體文庫(例如含有人抗體序列)分離的抗體，和(d)通過涉及將免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因)剪接至其它DNA序列的任何其它手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。所述重組抗體可具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，所述重組人抗體可經(jīng)受體外突變誘發(fā)且因此重組抗體的Vh區(qū)和\的氨基酸序列是雖然源自人生殖系Vh和\序列且與人生殖系Vh和\序列相關(guān)，但在體內(nèi)可能不天然存在于人抗體生殖系譜系內(nèi)的序列。
[0110]術(shù)語“嵌合免疫球蛋白”或抗體是指可變區(qū)源自第一物種且恒定區(qū)源自第二物種的免疫球蛋白或抗體。嵌合免疫球蛋白或抗體可例如通過遺傳工程改造，自屬于不同物種的免疫球蛋白基因區(qū)段構(gòu)建。
[0111]如本文所用的術(shù)語“人抗體”意圖包括具有可變區(qū)的抗體，其中框架區(qū)與CDR區(qū)兩者皆源自例如由Kabat等(參見Kabat等(1991) Sequences of proteins ofImmunological Interest,第 5 版，U.S.Department of Health and Human Services, NIH出版物號91-3242)所述的人生殖系免疫球蛋白序列。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，那么所述恒定區(qū)也源自人生殖系免疫球蛋白序列。人抗體可包括不由人生殖系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或位點特異性突變誘發(fā)或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所用的術(shù)語“人抗體”不意圖包括CDR序列源自已移植于人框架序列上的另一哺乳動物物種(如小鼠)的生殖系的抗體。
[0112]人抗體的至少一個或多個氨基酸可被氨基酸殘基(例如不由人生殖系免疫球蛋白序列編碼的活性增強性氨基酸 殘基)置換。通常，人抗體的多達二十個位置可被不為人生殖系免疫球蛋白序列的一部分的氨基酸殘基置換。在一特定實施方案中，這些置換在如下文詳細描述的CDR區(qū)內(nèi)。
[0113]術(shù)語“人源化抗體”是指包括至少一個人源化抗體鏈(即至少一個人源化輕鏈或重鏈)的抗體。術(shù)語“人源化抗體鏈”(即“人源化免疫球蛋白輕鏈”)是指如下抗體鏈(即分別為輕鏈或重鏈)，其具有包括大致上來自人抗體的可變框架區(qū)和大致上來自非人抗體的互補決定區(qū)(⑶R)(例如至少一個⑶R、兩個⑶R或三個⑶R)的可變區(qū)且進一步包括恒定區(qū)(例如在輕鏈的情況下，為一個恒定區(qū)或其部分，且在重鏈的情況下，優(yōu)選為三個恒定區(qū))。
[0114]如本文所用，“分離”意指大致上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體或兩種、三種或四種抗體的組合(例如抗體ca、cf和ch(各自與EGFR特異性結(jié)合)的分離的組合物大致上不含特異性結(jié)合除EGFR外的抗原的抗體)。此外，分離的抗體通常大致上不含其它細胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。在一個實施方案中，將具有不同EGFR結(jié)合特異性的“分離的”單克隆抗體的組合于明確組合物中加以組合。
[0115]如本文所用，“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgM或IgGl)。在一些實施方案中，本文中提供的單克隆抗體組合物僅包含IgGl同種型的抗體。在其它實施方案中，本文中提供的單克隆抗體組合物僅包含IgG2同種型的抗體。在其它實施方案中，本文中提供的單克隆抗體組合物包含兩種或三種不同同種型的抗體。
[0116]“抗原”是抗體所結(jié)合的實體(例如蛋白實體或肽)。在各種實施方案中，抗原是EGF。在一特定實施方案中，抗原是人EGFR。
[0117]因此，本公開內(nèi)容也涵蓋結(jié)合EGFR上的表位的抗體的組合，所述表位包含由本文中描述的組合中的特定抗體識別的表位的全部或一部分。在另一實施方案中，提供與本文中描述的抗體競爭結(jié)合EGFR的抗體。競爭性抗體和識別相同或重疊表位的抗體可使用常規(guī)技術(shù)，如免疫測定，例如通過顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶標(biāo)抗原結(jié)合的能力(即競爭性結(jié)合測定)來鑒定?？墒褂萌缑枋鲇谝韵聦嵤├械臏y定來測定競爭性結(jié)合。
[0118]術(shù)語“特異性結(jié)合”和“選擇性結(jié)合”意指抗體顯示對特定抗原或表位的明顯親和力，且大體上不顯示與其它抗原和表位的顯著交叉反應(yīng)性?！懊黠@”或優(yōu)選結(jié)合包括以106、IO7UO8UO9或IOkT1或更佳的Kd進行結(jié)合?？贵w抗原相互作用的Kd(親和力常數(shù))指示50%抗體與抗原分子結(jié)合在一起所處的抗體濃度。因此，在適合固定抗原濃度下，50%的較高(即較強)親和力抗體將在低于將為用較低親和力抗體達成相同結(jié)合百分比所需的抗體濃度的抗體濃度下結(jié)合抗原分子。因此，較低Kd值指示較高(較強)親和力。如本文所用，“較佳”親和力是較強親和力，且具有低于其比較物的數(shù)值，其中IOl1的Kd具有較低數(shù)值且因此表示優(yōu)于IO6M4的Kd的親和力。優(yōu)于(即具有較低Kd值且因此較強)IO7M'優(yōu)選優(yōu)于IO8M4的親和力一般為優(yōu)選的。也涵蓋處于本文中陳述的那些數(shù)值中間的值，且優(yōu)選結(jié)合親和力可指示為親和力的范圍，例如對于本文中公開的抗EGFR抗體，優(yōu)選結(jié)合親和力是IO6至IO12M'優(yōu)選IO7至IO12M'更優(yōu)選IO8至IO12M' “不顯示顯著交叉反應(yīng)性”的抗體是將不與脫靶抗原(例如非EG FR蛋白)明顯結(jié)合的抗體。舉例而言，在一個實施方案中，與EGFR特異性結(jié)合的抗體將對EGFR顯示優(yōu)于對除ErbBl (EGFR)外的ErbB分子或?qū)Ψ荅rbB蛋白或肽至少兩個且優(yōu)選三個、或四個或更多個數(shù)量級的結(jié)合親和力(即顯示低兩個、三個或四個或更多個數(shù)量級的Kd值的結(jié)合)。可根據(jù)用于測定所述結(jié)合的任何本領(lǐng)域認(rèn)可的手段，包括例如根據(jù)如本文所述的Scatchard分析和/或競爭性(競爭)結(jié)合分析來測定特異性或選擇性結(jié)合。
[0119]如本文所用的術(shù)語“KD”意指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)或抗體對抗原的親和力。在一個實施方案中，本文中提供的抗體以IOOnM或更佳(即或更小)(例如90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、lnM 或 InM 以下)的親和力(Kd)結(jié)合抗原(例如EGFR)，如使用表面等離子共振測定、細胞結(jié)合測定或平衡透析測定所測量。在一特定實施方案中，抗體以8nM或更佳(例如7nM、6nM、5nM、4nM、2nM、l.5nM、l.4nM、1.3ηΜ、1.2ηΜ、1.1ηΜ、1ηΜ或InM以下)的親和力(如由解離常數(shù)Kd表示)結(jié)合EGFR，如通過表面等離子共振測定或細胞結(jié)合測定所測量。在其它實施方案中，當(dāng)使用重組EGFR作為分析物以及抗體作為配體在BIAC0RE3000儀器中通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)測定時，抗體以約小于10_7Μ，如約小于10_8Μ、10_9Μ或ΙΟ,Μ或甚至ΙΟ,Μ以下的親和力(Kd)結(jié)合抗原(例如EGFR)，且與預(yù)定抗原結(jié)合的親和力比其與除預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合的親和力大至少兩倍。用于確定Kd的其它方法包括通過流動式細胞測量術(shù)(FACS)或使用KinExA?技術(shù)在溶液中測定與表達EGFR的活細胞的平衡結(jié)合。
[0120]如本文所用的術(shù)語“K.”意指抗體自抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù)。
[0121]如本文所用的術(shù)語“IC50”和“IC90”是指化合物(例如抗EGFR抗體)分別抑制50%和90%的生物學(xué)或生物化學(xué)功能(例如EGFR的功能或活性)的有效性的量度。舉例而言，IC50表示抑制一半EGFR活性(例如表達EGFR的細胞的生長)需要多少抗EGFR抗體。也就是說其為抗EGFR抗體的半數(shù)最大(50%)抑制濃度(IC) (50%IC或IC5tl)。根據(jù)FDA，IC50表示達成體外50%抑制所需的藥物濃度。IC50和IC90可通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，例如通過構(gòu)建劑量-反應(yīng)曲線且檢查不同濃度的拮抗劑(即抗EGFR抗體)對逆轉(zhuǎn)EGFR活性的作用來確定。 [0122]如本文所用，“糖基化樣式”定義為與蛋白質(zhì)、更特定而言與免疫球蛋白共價連接的碳水化合物單元的樣式。
[0123]如本文所用的術(shù)語“核酸分子”意圖包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選為雙鏈DNA。
[0124]如本文關(guān)于編碼抗體或抗體片段(例如VH、\、CDR3)的核酸所用的術(shù)語“分離的核酸分子”意指核苷酸序列基本上不含其它基因組核苷酸序列(例如編碼結(jié)合除EGFR外的抗原的抗體的序列)的核酸分子，所述其它序列可在人基因組DNA中天然側(cè)接核酸。
[0125]如本文所用的術(shù)語“修飾”意指使抗體或其抗原結(jié)合部分中的一個或多個氨基酸變化。變化可通過在一個或多個位置處添加、取代或缺失氨基酸而產(chǎn)生。變化可使用已知技術(shù)，如PCR突變誘發(fā)而產(chǎn)生。舉例而言，在一些實施方案中，可修飾使用本文中提供的方法鑒定的抗體或其抗原結(jié)合部分，從而改進所述抗體或其抗原結(jié)合部分與EGFR的結(jié)合親和力。提供抗體序列中的“保守氨基酸取代”，即不會消除由所述核苷酸序列編碼或含有所述氨基酸序列的抗體與抗原WPEGFR)的結(jié)合的核苷酸和氨基酸序列修飾。保守氨基酸取代包括一個種類中的氨基酸由相同種類的氨基酸取代，其中種類是根據(jù)共有物理化學(xué)氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)和在自然界中所見的同源蛋白中的高取代頻率(如例如通過標(biāo)準(zhǔn)Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣所測定)確定。氨基酸側(cè)鏈已分類為六個一般種類且包括:1類(Cys) ;11 類(Ser>Thr>Pro>Ala>Gly) ;III 類(Asn>Asp>Gln>Glu) ;IV 類(His、Arg、Lys)；V 類(lie、Leu、Val、Met);和 VI 類(Phe、Tyr、Trp)。舉例而言，用 Asp 取代如 Asn、Gln 或Glu的另一 III類殘基是保守取代。因此，抗EGFR抗體中的預(yù)期非必需氨基酸殘基優(yōu)選被來自相同種類的另一氨基酸殘基置換。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。
[0126]術(shù)語“非保守氨基酸取代”是指用來自另一種類的氨基酸取代一個種類中的氨基酸；例如用如Asp、Asn、Glu或Gln的III類殘基取代II類殘基Ala。
[0127]或者，在另一實施方案中，可沿抗EGFR抗體編碼序列的全部或一部分，如通過飽和突變誘發(fā)來隨機引入突變(保守或非保守)，且所得修飾的抗EGFR抗體可針對結(jié)合活性進行篩選。
[0128]“共有序列”是由相關(guān)序列家族中最常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)形成的序列。在蛋白質(zhì)家族中，共有序列中的各位置由家族中最常出現(xiàn)在那個位置的氨基酸占據(jù)。如果兩個氨基酸同等頻繁地出現(xiàn)，那么共有序列中可包括任一者。免疫球蛋白的“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架區(qū)。類似地，關(guān)于CDR的共有序列可通過本文中提供的EGFR抗體的CDR氨基酸序列的最佳比對獲得。
[0129]對于核酸，術(shù)語“實質(zhì)上同源”指示兩種核酸或其指定序列在最佳對準(zhǔn)且比較時在至少約80%核苷酸、通常至少約90%至95%且更優(yōu)選至少約98%至99.5%核苷酸中為相同的，伴有適當(dāng)核苷酸插入或缺失?；蛘?，當(dāng)區(qū)段將在選擇性雜交條件下與所述鏈的互補鏈雜交時，存在實質(zhì)上同源。
[0130]核酸可存在于完整細胞、細胞溶解物中或以部分純化或大致上純凈形式存在。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括堿性/SDS處理、CsCl條帶化(CsCl banding)、柱色譜法、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域中熟知的其它技術(shù))與其它細胞組分或其它污染物(例如其它細胞核酸或蛋白質(zhì))純化分離時，核酸被“分離”或“變得大致上純凈”。
[0131]來自cDNA、基因組或其混合物的核酸組合物雖然常包含天然序列(除修飾的限制位點等之外)，但或者可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行突變以提供改變的基因序列。對于編碼序列，這些突變必要時可修飾編碼的氨基酸序列。特定而言，涵蓋與本文中描述的天然V、D、J、恒定、轉(zhuǎn)換序列及其它所述序列大致上同源的DNA序列。
[0132]術(shù)語“可操作地連接”是指將核酸序列與另一核酸序列呈某一功能關(guān)系置放。舉例而言，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白，那么其可操作地連接至多肽的DNA ;如果啟動子或增強子影響序列轉(zhuǎn)錄，那么其可操作地連接至編碼序列；或如果核糖體結(jié)合位點被定位以便于翻譯，那么其可操作地連接至編碼序列。一般而言，“可操作地連接”意指所連接的DNA序列是鄰近的，且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是鄰近的且處于閱讀相中。然而，增強子不必是鄰近的。連接是通過在適宜限制位點處進行接合來達成。如果所述位點不 存在，那么根據(jù)常規(guī)規(guī)范使用合成寡核苷酸轉(zhuǎn)接頭或接頭。當(dāng)核酸與另一核酸序列呈某一功能關(guān)系置放時，其被“可操作地連接”。舉例而言，如果啟動子或增強子影響序列轉(zhuǎn)錄，那么其可操作地連接至編碼序列。關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，可操作地連接意指所連接的DNA序列是鄰近的，且當(dāng)有必要接合兩個蛋白編碼區(qū)時，是鄰近的且處于閱讀框中。對于轉(zhuǎn)換序列，可操作地連接指示序列能夠影響轉(zhuǎn)換重組。
[0133]如本文所用的術(shù)語“載體”意指能夠轉(zhuǎn)運其已連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，其是指其中可接合其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載體，其中其他DNA區(qū)段可接合至病毒基因組中。某些載體能夠在其所引入的宿主細胞中自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和游離哺乳動物載體)。其它載體(例如非游離哺乳動物載體)在引入宿主細胞中后可整合至宿主細胞的基因組中，且由此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠引導(dǎo)其可操作地連接的基因的表達。所述載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。一般而言，適用于重組DNA技術(shù)中的表達載體常呈質(zhì)粒形式。術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用。然而，也涵蓋起相等作用的其它形式的表達載體，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
[0134]如本文所用的術(shù)語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)意指其中已引入重組表達載體的細胞。應(yīng)了解所述術(shù)語不僅意指特定標(biāo)的細胞，而且指所述細胞的子代。因為某些修飾可由于突變或環(huán)境影響而出現(xiàn)在后代中，所以所述子代實際上可不與親本細胞相同，但仍包括在如本文所用的術(shù)語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。
[0135]如本文所用的術(shù)語“治療”是指本文中描述的治療或預(yù)防措施。“治療”方法采用將本文中公開的抗體或抗體對或三元組合施用于受試者，例如患有與EGFR依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病或病癥或易患有所述疾病或病癥的受試者，以預(yù)防、治愈、延遲所述疾病或病癥或復(fù)發(fā)疾病或病癥，減輕其嚴(yán)重性或改善其一種或多種癥狀，或使受試者存活延長超過不存在所述治療下的預(yù)期存活。
[0136]如本文所用的術(shù)語“與EGFR依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病”或“與EGFR依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的病癥”包括發(fā)現(xiàn)EGFR含量增加和/或涉及EGFR的細胞級聯(lián)的活化程度增加的疾病狀態(tài)和/或與疾病狀態(tài)相關(guān)的癥狀。術(shù)語“與EGFR依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病”也包括與替代性EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的活化相關(guān)的疾病狀態(tài)和/或癥狀。一般而言，術(shù)語“與EGFR依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病”是指任何病癥，其發(fā)作、進展或癥狀持續(xù)需要EGFR的參與。示例性EGFR介導(dǎo)的病癥包括但不限于例如癌癥。
[0137]術(shù)語“癌癥”和“癌性”是指或描述哺乳動物中的生理學(xué)病狀，其特征通常在于細胞生長不受調(diào)控。癌癥的實例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌癥的更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰臟癌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞腫瘤(如神經(jīng)膠母細胞瘤和神經(jīng)纖維瘤)、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer/renalcancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭頸部癌。在一特定實施方案中，使用本文中公開的方法治療或診斷的癌癥選自黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、腎癌、胃腸/結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌。
[0138]如本文所用的術(shù)語“有效量”是指結(jié)合EGFR的抗體或其抗原結(jié)合部分的量，所述量在施用于受試者時足以影響如本文所述的與EGFR依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的疾病的治療、預(yù)后或診斷。當(dāng)單獨或組合使用時，本文中提供的抗體的治療有效量將視抗體和組合的相對活性(例如抑制細胞生長)而變化，且視所治療的受試者和疾病狀況、受試者的重量和年齡、疾病狀況的嚴(yán)重性、施藥方式等而變化，其可易于由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員確定。施藥劑量可在以下范圍內(nèi):例如約Ing至約10，OOOmg、約5ng至約9，500mg、約IOng至約9，OOOmg、約 20ng 至約 8，500mg、約 30ng 至約 7，500mg、約 40ng 至約 7，OOOmg、約 50ng 至約 6，500mg>約 IOOng 至約 6，OOOmg> 約 200ng 至約 5，500mg> 約 300ng 至約 5，OOOmg> 約 400ng 至約4, 500mg、約 500ng 至約 4，OOOmg、`約 Iyg 至約 3，500mg、約 5 μ g 至約 3，OOOmg、約 10 μ g 至約 2, 600mg、約 20 μ g 至約 2, 575mg、約 30 μ g 至約 2, 550mg、約 40 μ g 至約 2, 500mg、約 50 μ g至約 2, 475mg、約 100 μ g 至約 2, 450mg、約 200 μ g 至約 2, 425mg、約 300 μ g 至約 2, 000、約400 μ g 至約 I, 17511^、約500 4 g 至約 I, 150mg、約 0.5mg 至約 I, 125mg、約 Img 至約 I, IOOmg、約 1.25mg 至約 1，075mg> 約 1.5mg 至約 1，050mg> 約 2.0mg 至約 1，025mg> 約 2.5mg 至約I, OOOmg> 約 3.0mg 至約 975mg、約 3.5mg 至約 950mg、約 4.0mg 至約 925mg、約 4.5mg 至約900mg、約 5mg 至約 875mg、約 IOmg 至約 850mg、約 20mg 至約 825mg、約 30mg 至約 800mg、約40mg 至約 775mg、約 50mg 至約 750mg、約 IOOmg 至約 725mg、約 200mg 至約 700mg、約 300mg至約675mg、約400mg至約650mg、約500mg或約525mg至約625mg抗體?？烧{(diào)整劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。有效量也為如下量，其中抗體的任何毒性或有害作用(即副作用)最小和/或由有益作用超過。
[0139]術(shù)語“治療劑”意圖涵蓋具有以下能力的任何和所有化合物:減輕或抑制疾病或病癥的癥狀的嚴(yán)重性，或增加疾病或病癥中無癥狀或癥狀減輕時期的頻率和/或持續(xù)時間，或抑制或預(yù)防由疾病或病癥痛苦所致的損傷或失能，或抑制或延遲疾病或病癥的進展，或抑制或延遲疾病或病癥的發(fā)作，或抑制或預(yù)防傳染性疾病或病癥中的感染。治療劑的非限制性實例包括小有機分子、單克隆抗體、雙特異性抗體、重組工程改造的生物制品、RNAi化合物、酪氨酸激酶抑制劑和商業(yè)抗體。在某些實施方案中，酪氨酸激酶抑制劑包括例如目前市面上的藥物埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)和拉帕替尼(Iapatinib)中的一者或多者。可商購醫(yī)藥抗EGFR抗體包括西妥昔單抗和帕尼單抗(panitumumab)。其它醫(yī)藥抗EGFR抗體包括處于開發(fā)中的扎魯木單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)和馬妥珠單抗(matuzumab)。
[0140]術(shù)語“患者”包括接受預(yù)防性或治療性治療的人和其它哺乳動物受試者。
[0141]術(shù)語“受試者”包括任何哺乳動物，例如靈長類動物。舉例而言，本文中公開的方法和組合物可用于治療患有癌癥的受試者。在一特定實施方案中，受試者是人。
[0142]術(shù)語“樣本”是指取自患者或受試者的組織、體液或細胞(或任何前述者的一部分)。通常，組織或細胞將自患者移除，但也涵蓋體內(nèi)診斷。在實體腫瘤的情況下，組織樣本可取自手術(shù)移除的腫瘤且通過常規(guī)技術(shù)制備以供測試。在淋巴瘤和白血病的情況下，可獲得淋巴細胞、白血病細胞或淋巴組織(例如來自血液的白血病細胞)且加以適當(dāng)制備。其它樣本，包括尿、眼淚、血清、血漿、腦脊髓液、糞便、痰、細胞提取物等也可適用于特定癌癥。
[0143]本公開內(nèi)容的多個方面更詳細描述于以下各小節(jié)中。
[0144]I1.抗EGFR抗體及其組合
[0145]本文中公開新型抗EGFR單克隆抗體，包括實施例中稱為P1X、P2X和P3X的三種單克隆抗體。Pix、P2X和P3X單克隆抗體是PCT申請?zhí)朠CT/US2011/35238中公開的分別稱為ca、Cd和ch的親本抗體的親和力成熟抗體。以下展示親本和親和力成熟抗體的CDR氨
基酸序列，其中親和力成熟抗體中的變化 氨基酸加粗且加下劃線: [0146]
【權(quán)利要求】
1.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體結(jié)合EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域且包含重鏈和輕鏈⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列，其中所述重鏈和輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列選自由以下組成的組: (a)分別為SEQID NO: 1、2和3的重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列以及分別為SEQ IDN0:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列； (b)分別為SEQID N0:7、8和9的重鏈CDRU CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ IDNO: 10、11和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列；以及 (c)分別為SEQID NO: 13、14和15的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ IDNO:16、17 和 18 的輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列。
2.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體與EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合且包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈和輕鏈可變區(qū)序列選自由以下組成的組: (a)包含SEQID NO: 19的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)； (b)包含SEQID NO:21的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)；以及 (c)包含SEQID NO:23的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體以優(yōu)于IOOnM的Kd與EGFR結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體以優(yōu)于IOnM的Kd與EGFR結(jié)合。
5.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體以優(yōu)于InM的Kd與EGFR結(jié)合。
6.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是人抗體。
7.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其中所述抗體選自由雙特異性抗體、免疫綴合物、Fab、Fab’ 2、ScFv、高親和性多聚體、納米體和結(jié)構(gòu)域抗體組成的組。
8.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體選自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE 同種型抗體組成的組。
9.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種試劑盒，所述試劑盒包括于容器中的如權(quán)利要求9所述的藥物組合物。
11.一種治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的如權(quán)利要求9所述的藥物組合物。
12.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體用于治療癌癥。
13.—種包含兩種或三種與EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體的組合物，其中所述兩種或三種單克隆抗體選自由以下組成的組: (a)包含分別為SEQID NO: 1、2和3的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID NO:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體； (b)包含分別為SEQID NO:7、8和9的重鏈CDRU CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID NO: 10、11和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；以及 (c)包含分別為SEQID NO:13、14和15的重鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列以及分別為SEQID NO: 16、17和18的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體； 且其中所述組合物包含(a)和(b)、(a)和(c)、(b)和(C)或者(a)、(b)和(c)。
14.一種包含兩種或三種與EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的單克隆抗體的組合物，其中所述兩種或三種單克隆抗體選自由以下組成的組:(a)包含含有SEQID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體； (b)包含含有SEQID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；以及 (c)包含含有SEQID NO:23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體； 且其中所述組合物包含(a)和(b)、(a)和(c)、(b)和(C)或者(a)、(b)和(c)。
15.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中單克隆抗體(a)、(b)和(C)各自以優(yōu)于IOOnM的Kd與EGFR結(jié)合。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中單克隆抗體(a)、(b)和(c)各自以優(yōu)于IOnM的Kd與EGFR結(jié)合。
17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中單克隆抗體(a)、(b)和(c)各自以優(yōu)于InM的Kd與EGFR結(jié)合。
18.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中單克隆抗體(a)、(b)和(c)各自為人抗體。
19.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中單克隆抗體(a)、(b)和(c)中的一種或多種獨立地選自由雙特異性抗體、免疫綴合物、Fab、Fab’ 2、ScFv、高親和性多聚體、納米體和結(jié)構(gòu)域抗體組成的組。
20.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中單克隆抗體(a)、(b)和(c)各自獨立地選自由 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE 同種型抗體組成的組。`
21.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，所述組合物進一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
22.—種試劑盒，所述試劑盒包括于容器中的如權(quán)利要求21所述的組合物。
23.一種治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的如權(quán)利要求21所述的組合物。
24.如權(quán)利要求13或14所述的組合物，所述組合物用于治療癌癥。
25.—種包含三種單克隆抗EGFR抗體的組合物，所述組合物包含第一抗體、第二抗體和第三抗體，其中(i)所述第一抗體包含分別為SEQ ID NO: 1、2和3的重鏈⑶R1、⑶R2和CDR3序列以及分別為SEQ ID NO:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)所述第二抗體包含分別為SEQ ID NO:7、8和9的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ IDNO: 10、11和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列；且(iii)所述第三抗體包含分別為SEQ IDNO: 13、14和15的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 16、17和18的輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，且其中所述第一、第二和第三抗體以2:2:1的摩爾比存在。
26.—種包含三種單克隆抗EGFR抗體的組合物，所述組合物包含第一抗體、第二抗體和第三抗體，其中(i)所述第一抗體包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ IDNO:20的輕鏈可變區(qū)；(ii)所述第二抗體包含含有SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQID NO:22的輕鏈可變區(qū)；且(iii)所述第三抗體包含含有SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)，且其中所述第一、第二和第三抗體以2:2:1的摩爾比存在。
27.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，其中所述第一抗體、所述第二抗體和所述第三抗體各自以優(yōu)于IOOnM的Kd與EGFR結(jié)合。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述第一抗體、所述第二抗體和所述第三抗體各自以優(yōu)于IOnM的Kd與EGFR結(jié)合。
29.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述第一抗體、所述第二抗體和所述第三抗體各自以優(yōu)于InM的Kd與EGFR結(jié)合。
30.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，其中所述第一抗體以1x10_9M至1.lxlO_nM范圍內(nèi)的Kd與EGFR結(jié)合，所述第二抗體以IxlO-9M至7.0xKT11M范圍內(nèi)的Kd與EGFR結(jié)合，且所述第三抗體以IxlO-9M至3.6xlO-1QM范圍內(nèi)的Kd與EGFR結(jié)合。
31.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，其中所述第一抗體、所述第二抗體和所述第三抗體各自是人抗體。
32.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，其中所述第一抗體、所述第二抗體和所述第三抗體中的一種或多種獨立地選自由雙特異性抗體、免疫綴合物、Fab、Fab’ 2、ScFv、高親和性多聚體、納米體和結(jié)構(gòu)域抗體組成的組。
33.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，其中所述第一抗體、所述第二抗體和所述第三抗體各自獨立地選自由 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 和 IgE 同種型抗體組成的組。
34.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，所述組合物進一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
35.如權(quán)利要求34所 述的組合物，所述組合物是無菌組合物。
36.如權(quán)利要求34所述的組合物，所述組合物適于注射。
37.如權(quán)利要求34所述的組合物，所述組合物是適于靜脈內(nèi)注射的無菌組合物。
38.一種試劑盒，所述試劑盒包括于容器中的如權(quán)利要求34所述的組合物。
39.一種治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的如權(quán)利要求34所述的組合物。
40.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，所述組合物用于治療癌癥。
41.一種制備抗EGFR抗體組合物的方法，所述方法包括于單一組合物中組合: (a)包含分別為SEQID NO: 1、2和3的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID NO:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體； (b)包含分別為SEQID NO:7、8和9的重鏈CDRU CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID NO: 10、11和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；以及 (c)包含分別為SEQID NO:13、14和15的重鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列以及分別為SEQID NO: 16、17和18的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體； 其中(a)、(b)和(c)以2:2:1的摩爾比組合。
42.一種制備抗EGFR抗體組合物的方法，所述方法包括于單一組合物中組合: (a)包含含有SEQID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體； (b)包含含有SEQID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；以及 (c)包含含有SEQID NO:23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；其中(a)、(b)和(c)以2:2:1的摩爾比組合。
43.一種用抗EGFR抗體治療受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用: (a)包含分別為SEQID NO: 1、2和3的重鏈CDRl、CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID N0:4、5和6的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體； (b)包含分別為SEQID N0:7、8和9的重鏈CDRU CDR2和CDR3序列以及分別為SEQID NO: 10、11和12的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體；以及 (c)包含分別為SEQID NO:13、14和15的重鏈⑶R1XDR2和⑶R3序列以及分別為SEQID NO: 16、17和18的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列的單克隆抗體； 其中(a)、(b)和(C)以2:2:1的摩爾比施用于所述受試者。
44.一種用抗EGFR抗體治療受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用: (a)包含含有SEQID NO: 19的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:20的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體； (b)包含含有SEQID NO:21的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:22的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體；以及 (c)包含含有SEQID NO:23的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:24的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體； 其中(a)、(b)和(c)以2:2:1的摩爾比施用于所述受試者。
【文檔編號】A61K39/395GK103781494SQ201280040289
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月5日
【發(fā)明者】R·布克哈利德, M·菲爾德豪斯, A·金, N·科利, E·克勞蘭德, J·D·卡恩斯, A·A·盧戈夫斯科伊, U·尼爾森 申請人:梅里麥克制藥股份有限公司