用于降解有機(jī)磷酸酯的酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠水解有機(jī)磷酸酯(OP)分子的酶。特別地，本發(fā)明涉及來(lái)自農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）的OpdA酶的變體，其與天然存在的OpdA相比時(shí)顯示改進(jìn)的活性。本發(fā)明也涉及對(duì)有機(jī)磷酸酯甲基毒死蜱、二嗪農(nóng)和乙基對(duì)硫磷具有有機(jī)磷酸酯水解活性的多肽。
【專利說(shuō)明】用于降解有機(jī)磷酸酯的酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及能夠水解有機(jī)磷酸酯(organophosphate) (OP)分子的酶。
【背景技術(shù)】
[0002]有機(jī)磷酸酯(OP)殺蟲劑殘余物是環(huán)境以及一系列日用品中不期望的污染物。尤其敏感的領(lǐng)域包括土壤的污染、再循環(huán)的灌溉廢水的污染(廢水被下游的灌溉者使用或允許直接流出農(nóng)場(chǎng))、以及在農(nóng)業(yè)和園藝出口商品中存在超出允許水平的殘余物。有機(jī)磷酸酯中毒是暴露在此類化學(xué)品的農(nóng)業(yè)工人面臨的一個(gè)問題，對(duì)于暴露在化學(xué)戰(zhàn)中所用的有機(jī)磷酸酯的軍事人員也是如此。此外，儲(chǔ)備的有機(jī)磷神經(jīng)毒劑也需要對(duì)這些儲(chǔ)備進(jìn)行解毒處理。因此，需要一些生物修復(fù)(bioremediation)策略來(lái)清除或減少此類有機(jī)磷酸酯的殘余物和/或儲(chǔ)備。
[0003]提出的一個(gè)方案涉及使用能夠固定或降解有機(jī)磷酸酯殘余物的酶。例如，這些酶可用于生物反應(yīng)器中，污染的水可能會(huì)流經(jīng)所述生物反應(yīng)器，或是在對(duì)水果、蔬菜或動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行收獲后殺蟲(disinfestation)后用在洗滌溶液中以便降低殘余物的水平和存留時(shí)間(withholding time)。適合用于對(duì)有機(jī)磷酸酯殘余物進(jìn)行降解的酶包括來(lái)自細(xì)菌的 OP 水解酶(Mulbry, 1992 ；Mulbry 和 Kearney, 1991 ；Cheng 等，1999 ；US5, 484，728 ；US5, 589，386; Dong 等，2005)、來(lái)自脊椎動(dòng)物的 OP 水解酶(Wang 等，1993 ；1998 ；Gan等，1991 ；Broomfield等，1999)、以及來(lái)自O(shè)P抗性昆蟲的OP水解酶(W095/19440和W097/19176)。要求OP水解酶應(yīng)該能夠快速降解有機(jī)磷酸酯殘余物。
[0004]研究得最為深入的OP降解酶是細(xì)菌的有機(jī)磷酸酯二水解酶(organophosphatedihydrolase,稱為 OPD>OPH 或 PTE)，其由黃桿菌菌種(Flavobacterium sp.)ATCC27551 和缺陷短波單胞菌MG (Brevundimonas diminuta MG)中的不同質(zhì)粒上相同基因編碼(Harper等，1988 ；MuIbry和Karns, 1989)。OPD是一種同二聚體蛋白，能夠水解很多種磷酸三酯(氧OP和硫OP均可)(Dumas等，1989a, b)。其反應(yīng)機(jī)制直接或間接地涉及金屬離子,優(yōu)選為Co++、也包括Zn++、Cd++、Fe++和其它二價(jià)陽(yáng)離子。OPD對(duì)于磷酸單酯或二酯沒有可檢測(cè)到的活性(Dumas 等，1989a, b ； 1990)。
[0005]已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichiacoli) (ePHP)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis) (mtPHP)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae) (mpPHP)的基因組中鑒定出了 OPD同源物(磷酸三酯酶同源蛋白，或PHP)，不過(guò)僅對(duì)ePHP的磷酸三酯酶活性進(jìn)行了測(cè)試(Scanlan和Reid, 1995 ；Buchbinder等，1998)。在ePHP的粗裂解物中未檢測(cè)到對(duì)任何測(cè)試的底物具有活性，例如P_硝基苯乙酸酯、雙(P_硝基苯)磷酸酯、對(duì)氧磷(paraoxon)和P-硝基苯磷酸酯。已鑒定出一類相關(guān)性更遠(yuǎn)的蛋白，其具有非常低水平的OP水解酶活性但是高水平的內(nèi)酯酶活性，同樣OPD酶也具有非常低水平的內(nèi)酯酶活性(小于針對(duì)OP底物活性的 0.001%) (Afriat 等人，2006)。
[0006]在脊椎動(dòng)物中也鑒定出了 OPD同源物(Davies等，1997)，盡管其在這些生物中的功能仍是未知的。0PD、ePHP、mtPHP和哺乳動(dòng)物的PHP在氨基酸水平具有27-30%的同一性，不過(guò)mpPHP的相似性稍低。在迄今為止所鑒定到的磷酸三酯酶家族的所有成員中，參與Zn++結(jié)合的氨基酸殘基都是保守的(Buchbinder等，1998)。
[0007]最近，從農(nóng)桿菌中(Agrobacterium)分離出OP 降解酶(W002/092803; Horne 等，2002; Jackson等，2009)。這種酶又稱為OpdA，因其與OPD具有90%的氨基酸序列同一性。盡管OpdA與OPD在氨基酸水平上相關(guān)，它們已顯示出針對(duì)不同OP的不同活性。
[0008]需要可用于生物修復(fù)策略中的其它OP降解酶。特別是，需要針對(duì)特定OP具有增強(qiáng)的活性的可用于生物修復(fù)領(lǐng)域的酶。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明已鑒定的多肽與天然存在的OpdA相比具有改進(jìn)的活性。
[0010]因此，在一方面，本發(fā)明提供一種多肽，其含有序列為如下的氨基酸:
[0011]i)如 SEQ ID NO:1 所示，
[0012]ii)與SEQ ID N0:1所示的序列至少95%相同，或
[0013]iii) i)或ii)的片段，其具有有機(jī)磷酸酯水解活性和/或其是至少270個(gè)氨基酸長(zhǎng)，
[0014]其中，所述多肽包含下列中的一個(gè)或更多或全部；
[0015]a)在與SEQ ID NO:1的氨基酸51位相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸；
[0016]b)在與SEQ ID NO:1的氨基酸63位相對(duì)應(yīng)位置上的丙氨酸；
[0017]c)在與SEQ ID NO:1的氨基酸156位相對(duì)應(yīng)位置上的精氨酸；
[0018]d)在與SEQ ID NO:1的氨基酸203位相對(duì)應(yīng)位置上的谷氨酸；以及
[0019]e)在與SEQ ID NO:1的氨基酸236位相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽具有有機(jī)磷酸酯水解活性。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽與第二多肽相比具有更強(qiáng)的有機(jī)磷酸酯水解活性，第二多肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。更優(yōu)選地，與氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽以及氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的多肽相比，所述多肽具有更強(qiáng)的有機(jī)磷酸酯水解活性。
[0022]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與氨基酸序列選自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4、優(yōu)選全部三個(gè)的多肽相比，本發(fā)明的多肽針對(duì)甲基毒死蜱具有高至少2倍、或4倍或6倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)。
[0023]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與氨基酸序列選自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDNO: 4、優(yōu)選全部三個(gè)的多肽相比，本發(fā)明的多肽針對(duì)二嗪農(nóng)具有高至少1.5倍或2倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)。
[0024]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與氨基酸序列選自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4、優(yōu)選全部三個(gè)的多肽相比，本發(fā)明的多肽針對(duì)乙基對(duì)硫磷具有高至少2倍、或3倍或4倍的二級(jí)速率常數(shù)(K)。
[0025]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與氨基酸序列選自SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4、優(yōu)選全部三個(gè)的多肽相比，本發(fā)明的多肽針對(duì)乙基毒死蜱具有高至少1.2倍、或1.5倍的催化常數(shù)(kMt)。
[0026]關(guān)于以上四個(gè)實(shí)施方案，優(yōu)選地，相對(duì)于氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的多肽、氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的多肽、以及氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的多肽，本發(fā)明的多肽具有限定的活性。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中,有機(jī)磷酸酯是芳香族的非乙烯基(non-vinyl)有機(jī)磷酸酯。更優(yōu)選地，所述有機(jī)磷酸酯的離去基團(tuán)具有低于8的pKa。在一個(gè)實(shí)施方案中，有機(jī)磷酸酯是乙基對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、二嗪農(nóng)、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或馬拉硫磷。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有對(duì)乙基毒死蜱至少約ZxlO6Secr1.M'對(duì)甲基毒死蝶至少約3.5xl05sec_1.M'對(duì)二嗪農(nóng)至少約3.6xl06sec_1.M'對(duì)乙基對(duì)硫磷至少約QxlO7sec-1.M—1、或?qū)谆鶎?duì)硫磷至少約SxlO6sec-1.M—1的二級(jí)速率常數(shù)(keat/Km)，或者其兩個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部五個(gè)的組合。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有對(duì)甲基毒死蜱至少約
3.5xl05sec、M \對(duì)二嚷農(nóng)至少約3.6xl06sec、M \對(duì)乙基對(duì)硫憐至少約9xl07sec \ M 1的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)，或者其兩個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部三個(gè)的組合。
[0029]在另一方面，本發(fā)明提供水解有機(jī)磷酸酯分子的多肽，其具有對(duì)甲基毒死蜱至少約3.5xl05sec、M \對(duì)二嚷農(nóng)至少約3.6xl06sec、M \對(duì)乙基對(duì)硫憐至少約9xl07sec、M 1的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)，或者其兩個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部三個(gè)的組合。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含a)至e)中的至少三個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含a)和c)、以及b)、d)和e)中的至少一個(gè)。在又一實(shí)施方案中，多肽包含b)、d)和e)。在還一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含a)至e)。
[0031]優(yōu)選地，本發(fā)明的片段包含至少i)或ii)的氨基酸20至296，更優(yōu)選至少i)或
ii)的氨基酸15至325，以及甚至更優(yōu)選至少i)或ii)的氨基酸10至350。
[0032]優(yōu)選地，多肽由如SEQ ID NO:1所示氨基酸的序列所組成。
`[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含如SEQ ID N0:5所示的氨基酸的序列。
[0034]在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含或由如SEQ ID N0:5所示的氨基酸的序列所組成。
[0035]在另一方面，本發(fā)明提供水解有機(jī)磷酸酯分子的多肽，其具有對(duì)甲基毒死蜱至少約3.5xl05sec、M \對(duì)二嚷農(nóng)至少約3.6xl06sec、M \對(duì)乙基對(duì)硫憐至少約9xl07sec、M 1的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)，或者其兩個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部三個(gè)的組合。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是基本純化的和/或重組體。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是進(jìn)一步含有至少一種其它多肽序列的融合蛋白。所示至少一個(gè)其它多肽可以是，例如，增強(qiáng)本發(fā)明多肽穩(wěn)定性的多肽、促進(jìn)融合蛋白從細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞)中分泌的多肽(如N端疏水信號(hào)肽)、或協(xié)助純化融合蛋白的多肽(如麥芽糖結(jié)合蛋白或谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽固定在固體支持物(support)上。
[0039]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽存在于微生物細(xì)胞或者在微生物細(xì)胞的提取物、優(yōu)選粗提物中。
[0040]在又一方面，本發(fā)明提供分離的和/或外源的多核苷酸，其包含序列為如下的核苷酸:
[0041]i)如 SEQ ID NO:6 所示，
[0042]ii)編碼本發(fā)明的多肽，或
[0043]iii)與i)或ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸可操作地連接于能夠指導(dǎo)多核苷酸在細(xì)胞中、優(yōu)選微生物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0045]在又一方面，所提供的是含有本發(fā)明多核苷酸的載體。
[0046]在另一方面，所提供的是含有本發(fā)明多核苷酸和/或本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明宿主細(xì)胞的實(shí)例包括、而非限制于植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞。優(yōu)選地，微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞或如酵母細(xì)胞的真菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞適合發(fā)酵。
[0047]在另一方面，本發(fā)明提供含有至少一種本發(fā)明細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人類生物。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因非人類生物是植物、微生物生物，優(yōu)選細(xì)菌或真菌。
[0049]在再一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的生物的提取物，其中提取物包含本發(fā)明的多肽、以及任選的本發(fā)明的多核苷酸。
[0050]在又一方面，本發(fā)明提供組合物，其包含本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、和本發(fā)明的提取物中的一種或更多，以及一種或更多可接受的載體。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含陽(yáng)離子，例如，而并非必須限制于Zn2+、Fe2+、C。2+、Cd2+或者其兩種或更多的組合。
[0052]在另一方面，本發(fā)明提供用于水解有機(jī)磷酸酯分子的方法，所述方法包括使有機(jī)磷酸酯分子與本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的提取物和本發(fā)明的組合物中的一種或更多種相接 觸。
[0053]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以上各方面的方法包括
[0054]a)獲得本發(fā)明的多肽，和
[0055]b)使有機(jī)磷酸酯分子與所述多肽接觸。在這種實(shí)施方案中，所述多肽可形成例如本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的提取物、或本發(fā)明的組合物的部分。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有機(jī)磷酸酯分子是在選自土壤、水、生物材料或其組合的樣本中或在表面上。
[0057]在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將所述多肽、多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞、提取物和組合物中的一種或多種應(yīng)用至實(shí)地(in the field) 土壤或液體中，如綿羊藥浴液(sheep dip)、水壩或廢水。
[0058]在另一方面，本發(fā)明提供在受試者中治療由有機(jī)磷酸酯分子所導(dǎo)致的毒性的方法，所述方法包括向受試者施用本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的提取物或本發(fā)明的組合物中的一種或更多種。
[0059]也提供本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的提取物以及本發(fā)明的組合物中的一種或更多種在制造藥物中的用途，所述藥物用于在受試者中治療由有機(jī)磷酸酯分子所導(dǎo)致的毒性。
[0060]此外，提供本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的提取物以及本發(fā)明的組合物中的一種或更多種作為藥物的用途，所述藥物用于在受試者中治療由有機(jī)磷酸酯分子所導(dǎo)致的毒性。
[0061]在還一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，所述方法包括在允許表達(dá)編碼所述多肽的多核苷酸的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞、或本發(fā)明的載體，以及回收表達(dá)出的多肽。[0062]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括
[0063]i)提供容器，其容納含有適合發(fā)酵的本發(fā)明細(xì)胞(如大腸桿菌)的液體組合物、以及發(fā)酵所需的成分，和
[0064]ii)提供有益于所述容器中容納的液體組合物發(fā)酵的條件。
[0065]在另一方面，本發(fā)明提供用于檢測(cè)有機(jī)磷酸酯存在的生物傳感器，所述生物傳感器包含本發(fā)明的多肽、以及檢測(cè)有機(jī)磷酸酯分子被所述多肽水解的手段。
[0066]在又一方面，本發(fā)明提供用于水解有機(jī)磷酸酯分子的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的提取物和本發(fā)明的組合物中的一種或多種。
[0067]除非另有具體規(guī)定，本文的任何實(shí)施方案應(yīng)加以必要的修改以適用于任何其它實(shí)施方案。
[0068]本發(fā)明并非局限于僅用于示例目的的本文所述的具體實(shí)施方案的范圍。如本文所述，功能上同等的產(chǎn)物、組合物和方法明顯在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0069]在本說(shuō)明書全文中，除非另有具體規(guī)定或上下文另外要求，當(dāng)提到單個(gè)步驟、物質(zhì)的組合物、步驟的組或物質(zhì)組合物的組時(shí)，應(yīng)當(dāng)包括一個(gè)以及多個(gè)(即一個(gè)或更多個(gè))這些步驟、物質(zhì)的組合物、步驟的組或物質(zhì)組合物的組。
[0070]在下文將通過(guò)下列非限制性的實(shí)施例以及參照附圖描述本發(fā)明。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0071]圖1:有機(jī)磷酸酯殺蟲劑的化學(xué)分類。
`[0072]圖2:通過(guò)野生型OpdA (OPA)和改良的變體(含N端Met的A900)降解有機(jī)磷(organophosphorus)殺蟲劑二嚷農(nóng)。
[0073]圖3:三小時(shí)后在模擬的綿羊藥浴溶液中，A900 (含N端Met)和OpdA (OPA)的劑
量率對(duì)二嗪農(nóng)降解程度的影響。
[0074]圖4:通過(guò)壓力計(jì)量的呼吸計(jì)量法(manometric respirometry)測(cè)試評(píng)估A900(含N端Met)(菱形)和苯甲酸鈉(三角形)的生物降解能力。A900對(duì)細(xì)菌呼吸的抑制也通過(guò)在苯甲酸鈉和A900兩者(正方形)存在下測(cè)量呼吸速率得以評(píng)估。
[0075]序列表灃釋:
[0076]SEQ ID NO: 1—A900 的氨基酸序列。
[0077]SEQ ID NO: 2—OpdA的氨基酸序列(移除N端28個(gè)氨基酸并添加N端Met的天然OpdA)o
[0078]SEQ ID NO: 3—OpdA變體M4的氨基酸序列。
[0079]SEQ ID N0:4—0PH 的氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO: 5—N端添加Met的A900的氨基酸序列。
[0081]SEQ ID N0:6—編碼A900的核苷酸序列。
[0082]SEQ ID N0:7—TAT 信號(hào)肽。
【具體實(shí)施方式】
_3] 通用技術(shù)和定義
[0084]除非另有特別定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)應(yīng)認(rèn)為具有與本領(lǐng)域(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳、免疫、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué))普通技術(shù)人員通常所理解的意義相同的意義。
[0085]除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫技術(shù)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程。此類技術(shù)通篇描述并闡述于如下來(lái)源的文獻(xiàn)中，例如J.Perbal的 A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley 和 Sons (1984)、J.Sambrook等的 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour LaboratoryPress (1989)、T.A.Brown (編)的 Essential Molecular Biology:A Practical Approach第一和第二卷，IRL Press (1991)、D.M.Glover 和 B.D.Hames (編)的 DNA Cloning:APractical Approach 第一至第四卷，IRL Press (1995 和 1996))、以及 F.M.Ausubel等(編)的 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates 和Wiley-1nterscience (1988,包括迄今為止所有的更新版)、Ed Harlow 和 David Lane (編)的 Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)和J.E.Coligan 等(編)的 Current Protocols in Immunology, John ffiley&Sons (包括迄今為止所有的更新版)。
[0086]術(shù)語(yǔ)“和/或”，例如“X和/或Y”應(yīng)理解為意思是“X和Y”或者“X或Y”，并且應(yīng)認(rèn)為對(duì)兩個(gè)意思或任一個(gè)意思提供明確的支持。
[0087]如本文所用，除非與所述的相反，所述術(shù)語(yǔ)大約指特定值的+/_20%，更優(yōu)選+/-10%,甚至更優(yōu)選+/_5%。
[0088]在本說(shuō)明書全文中的“包含(comprise)” 一詞或諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的變體,應(yīng)理解為意圖包括所述的元素、整數(shù)或步驟,或是一組元素、整數(shù)或步驟，但并不排除任何其它元素、整數(shù)或步驟，或是其它組元素、整數(shù)或步驟。
[0089]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“水解(hydrolyses)”、“水解(hydrolysing)”、“水解活性”及其變體指本發(fā)明的多肽催化化學(xué)鍵水解的能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽“降解”有機(jī)磷酸酯，以使得所述酶活性的產(chǎn)物對(duì)例如哺乳動(dòng)物和/或魚毒性減低，和/或不如有機(jī)磷酸酯底物穩(wěn)定。
[0090]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“更強(qiáng)的有機(jī)磷酸酯水解活性”指本發(fā)明的多肽與之前已知多肽相比，對(duì)有機(jī)磷酸酯具有更高的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)，所述之前已知多肽例如而非限制于氨基酸序列如SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4、優(yōu)選全部三個(gè)所示的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“更強(qiáng)的有機(jī)磷酸酯水解活性”指本發(fā)明的多肽，其具有下列中一個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選全部三個(gè):
[0091]i)與氨基酸序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4、優(yōu)選全部三個(gè)所示的多肽相比，針對(duì)甲基毒死蜱具有高至少2倍、或4倍或6倍的二級(jí)速率常數(shù)G^atAm)，
[0092]ii)與氨基酸序列如SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4、優(yōu)選全部三個(gè)所示的多肽相比，針對(duì)二嗪農(nóng)具有高至少1.5倍或2倍的二級(jí)速率常數(shù)G^atAm)，以及
[0093]iii)與氨基酸序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4、優(yōu)選全部三個(gè)所示的多肽相比，對(duì)乙基對(duì)硫磷具有高至少2倍、或3倍或4倍的二級(jí)速率常數(shù)G^atAm)。
[0094]如本 文所用，短語(yǔ)“在與氨基酸位相對(duì)應(yīng)位置上”指氨基酸參照確定的氨基酸序列相對(duì)于周圍氨基酸而言的相對(duì)位置。例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可具有附加的N端氨基酸以協(xié)助細(xì)胞內(nèi)定位或細(xì)胞外分泌，當(dāng)比對(duì)例如SEQ ID NO:1時(shí)其改變所述氨基酸的相對(duì)位置。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)進(jìn)行的蛋白質(zhì)比對(duì)，技術(shù)人員很容易理解在SEQ ID NO:1的氨基酸位置14上的脯氨酸是與SEQ ID NO:1的氨基酸位置15上的脯氨酸相對(duì)應(yīng)的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含在指定的殘基位上確定的氨基酸。
[0095]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“處理/治療(treating)”、“處理/治療(treat)”或“處理/治療(treatment)”包括施用治療有效量的例如本發(fā)明的多肽、或其編碼多核苷酸，其足以減少或消除至少一個(gè)由有機(jī)磷酸酯所導(dǎo)致的毒性癥狀。
[0096]本文所用術(shù)語(yǔ)“生物材料”在其最廣泛意義上包括生物起源的任何產(chǎn)物。這樣的產(chǎn)物包括，而非限制于用于人類食品和動(dòng)物飼料。所述產(chǎn)品包括液體介質(zhì)，其包括水和如牛奶的液體食物，以及如酸奶的半固體食物，等等。本發(fā)明也延伸至固體食物，特別是動(dòng)物飼料。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物材料優(yōu)選為植物材料例如，而非限制于水果、蔬菜、甘蔗、油菜種子、小麥種子、大麥種子、高粱種子、水稻、玉米、菠蘿或棉花種子。
[0097]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“提取物”指包含本發(fā)明的多肽、優(yōu)選也包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞或非人類轉(zhuǎn)基因生物的任何部分。所述部分可以是整體，如植物的種子、水果、葉、莖或根，或是通過(guò)至少部分均質(zhì)化和/或純化所獲得。所述術(shù)語(yǔ)包括從宿主細(xì)胞分泌的部分，并因此包括培養(yǎng)上清。優(yōu)選地，所述提取物是相對(duì)粗的提取物，其未經(jīng)歷純化步驟將本發(fā)明的多肽從與其共產(chǎn)生的其它多肽中純化出來(lái)。提取物也可以是含有本發(fā)明多肽的組合物。
[0098]有機(jī)磷酸酯
[0099]有機(jī)磷酸酯是合成的有機(jī)磷酯和相關(guān)的化合物，例如磷酰胺酸酯(phosphoroamidate)。其具有通式(RR’X)P=0或(RR，X)P=S，其中R和R’是短鏈基團(tuán)。在磷酰胺酸酯中，R’是伯胺或仲胺。對(duì)于殺蟲的有機(jī)磷酸酯，X是良好的離去基團(tuán)(leavinggroup)，其對(duì)于乙酰膽堿酯酶的不可逆抑制是必需的。
[0100]本發(fā)明的多肽水解有機(jī)磷酸酯的磷酸酯鍵。所述有機(jī)磷酸酯可以具有芳香族或脂肪族尚去基團(tuán)(X)以及也可含有乙烯基基團(tuán)(圖1)。
[0101]優(yōu)選地，所述有機(jī)磷酸酯的離去基團(tuán)具有小于8的電離常數(shù)(pKa) (Jackson等，2009)。
[0102]盡管有機(jī)磷酸酯作為殺蟲劑的用途是眾所周知的，然而其也用作針對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)毒氣。因此，本發(fā)明的多肽也能夠用于水解不是殺蟲劑的有機(jī)磷酸酯。在具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于水解0-乙基S-(2- 二異丙胺)乙基-甲基硫代磷酸酯(VX)。
[0103]Ui
[0104]術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)” 一般可互換使用，其指可或不可通過(guò)添加非氨基酸基團(tuán)而修飾的單個(gè)多肽鏈。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的多肽鏈可與其它多肽或蛋白或如輔因子的其它分子相結(jié)合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”也包括本文所述的多肽的變體、突變體、生物活性片段、和/或修飾。
[0105]通過(guò)GAP (Needleman和Wunsch, 1970)分析確定多肽的％同一性(GCG程序)，空位插入罰分=5，以及空位延伸罰分=0.3。查詢序列至少250個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且GAP分析在至少250個(gè)氨基酸長(zhǎng)的區(qū)域?qū)蓚€(gè)序列進(jìn)行比對(duì)。更優(yōu)選地，查詢序列至少300個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且GAP分析在至少300個(gè)氨基酸長(zhǎng)的區(qū)域?qū)蓚€(gè)序列進(jìn)行比對(duì)。甚至更優(yōu)選地，查詢序列至少350個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且GAP分 析在至少350個(gè)氨基酸長(zhǎng)的區(qū)域?qū)蓚€(gè)序列進(jìn)行比對(duì)。甚至更優(yōu)選地，GAP分析在兩個(gè)序列的全長(zhǎng)對(duì)其進(jìn)行比對(duì)。
[0106]如本文所用“生物活性片段”是本文所述的多肽的一部分，其保留全長(zhǎng)多肽所定義的活性。只要生物活性片段保留所定義的活性，其可以是任意尺寸。優(yōu)選地，生物活性片段是至少300，優(yōu)選至少350個(gè)氨基酸長(zhǎng)。此外，生物活性片段指具有“有機(jī)磷酸酯水解活性”的片段。
[0107]對(duì)于所定義的多肽，應(yīng)了解，高于上面所提供的％同一性的數(shù)字將包括優(yōu)選的實(shí)施方案。因此，在合適的情況下，根據(jù)最?。ネ恍詳?shù)字，優(yōu)選所述多肽包括與相關(guān)指定的SEQ ID NO具有至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99.1%，更優(yōu)選至少99.2%，更優(yōu)選至少99.3%，更優(yōu)選至少99.4%，更優(yōu)選至少99.5%，更優(yōu)選至少99.6%，更優(yōu)選至少99.7%，更優(yōu)選至少99.8%，以及甚至更優(yōu)選至少99.9%同一性的氨基酸序列。
[0108]對(duì)“基本純化的”或“純化的”，我們指的是已經(jīng)從其天然狀態(tài)所關(guān)聯(lián)的一種或多種脂質(zhì)、核酸、其它多肽或其它污染分子中分離出的多肽。優(yōu)選地，所述基本純化的多肽是至少60%，更優(yōu)選地至少75%，以及更優(yōu)選地至少90%不含其它天然關(guān)聯(lián)的成分。雖然目前沒有證據(jù)證明本發(fā)明的多肽存在于天然中，術(shù)語(yǔ)天然狀態(tài)或天然關(guān)聯(lián)的也包括本發(fā)明的宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的多肽。
[0109]在提及多肽的上下文中術(shù)語(yǔ)“重組的”指當(dāng)被細(xì)胞產(chǎn)生或在無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生時(shí)，相比其天然狀態(tài)，具有改變的量或改變的速率的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞不是天然產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞。本發(fā)明的重組多肽包括沒有從產(chǎn)生該多肽的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞、或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其它成分中分離出的多肽，以及在這樣的細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的、隨后從至少一些其它成分中純化出來(lái)的多肽。 [0110]通過(guò)在本文定義的核酸中引入合適的核苷酸改變，或通過(guò)體外合成所需的多肽，可以制備本文所述多肽的氨基酸序列突變體。此類突變體包括，例如氨基酸序列中的殘基的刪除、插入或取代。只要最終的多肽產(chǎn)物具有所需的特征，就可進(jìn)行刪除、插入和取代的組合以得到最終的構(gòu)建體。
[0111]突變的(改變的)多肽可以使用本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)制備，例如使用定向進(jìn)化或合理設(shè)計(jì)的策略(見下文)。源自突變/改變的DNA的產(chǎn)物可使用本文所述技術(shù)容易地進(jìn)行篩選，以確定其是否具有有機(jī)磷酸酯水解活性(參見，例如實(shí)施例1和2)。在另一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)將有機(jī)磷酸酯溶解于約5%的甲醇中并使其與酶在pH8.0的50mM Tris-HCl中在25°C反應(yīng)以測(cè)量有機(jī)磷酸酯水解活性。使用標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程根據(jù)實(shí)際的有機(jī)磷酸酯測(cè)量酶活性。例如，以分光光度法通過(guò)監(jiān)測(cè)在276nm處的吸光度的增加以測(cè)量毒死蜱(Dumas等，1989b)，而用放射性標(biāo)記的二嗪農(nóng)(乙基-1-14C ；14.8MBq/mmol)通過(guò)曾經(jīng)用于放射性標(biāo)記的OP底物的放射分區(qū)分析可監(jiān)測(cè)二嗪農(nóng)的水解(Campbell等，1998)。
[0112]在設(shè)計(jì)氨基酸序列的突變時(shí)，突變位點(diǎn)的定位以及突變的性質(zhì)取決于待修飾特征?？蓪?duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)或系列修飾，例如，通過(guò)(I)首先以可供選擇的保守氨基酸進(jìn)行取代，然后根據(jù)得到的結(jié)果進(jìn)行更多基團(tuán)的選擇、(2)刪除靶殘基、或(3)在定位的位點(diǎn)附近插入其它殘基。
[0113]氨基酸序列的刪除通常為約I至15個(gè)殘基，更優(yōu)選地為大約I至10個(gè)殘基且典型地為大約I至5個(gè)連續(xù)的殘基。[0114]取代突變?yōu)槎嚯姆肿又械闹辽僖粋€(gè)氨基酸殘基被去掉并在其原來(lái)的位置上插入一個(gè)不同的殘基。目的位點(diǎn)是在其位點(diǎn)上獲自各種株或物種的特定殘基都相同的那些。這些位置可能對(duì)生物學(xué)活性是重要的。優(yōu)選以相對(duì)保守的方式取代這些位點(diǎn)，特別是落入至少3個(gè)其它相等保守位點(diǎn)的序列中的那些。保守取代的實(shí)例見表1。
[0115]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與本文特別定義的多肽相比，突變/變體多肽僅具有保守取代。
[0116]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與本文特別定義的多肽相比，突變/變體多肽具有I個(gè)或2個(gè)或3個(gè)或4個(gè)保守氨基酸改變。保守氨基酸改變?cè)敿?xì)提供在表1中。優(yōu)選地，如果沒有特別指出，所述多肽在給定的氨基酸位置上包含SEQ ID NO:1所提供多肽的對(duì)應(yīng)位置上所發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
[0117]關(guān)于其它可進(jìn)行的取代突變的指南描述于Yang等(2003)、Cho等(2004)，Horne等(2006)和 Jackson 等(2009)。
[0118]如果在指定位點(diǎn)上的氨基酸不符合表1所提供的氨基酸取代，則優(yōu)選該指定氨基酸。
[0119]表1.示例性的取代
[0120]
【權(quán)利要求】
1.一種多肽，其含有序列如下的氨基酸:
i)如SEQ ID NO:1 所示， ii)與如SEQID NO:1所示的序列至少95%相同，或
或ii)的片段，其具有有機(jī)磷酸酯水解活性和/或至少270個(gè)氨基酸長(zhǎng)， 其中，所述多肽包含下列中的一種或更多或全部； a)在與SEQID NO:1的氨基酸51位相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸； b)在與SEQID NO:1的氨基酸63位相對(duì)應(yīng)位置上的丙氨酸； c)在與SEQID NO:1的氨基酸156位相對(duì)應(yīng)位置上的精氨酸； d)在與SEQID NO:1的氨基酸203位相對(duì)應(yīng)位置上的谷氨酸；以及 e)在與SEQID NO:1的氨基酸236位相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其具有有機(jī)磷酸酯水解活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其與氨基酸序列選自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQID N0:4的第二多肽相比具有更強(qiáng)的有機(jī)磷酸酯水解活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的多肽，其具有下列中的兩種或更多或全部: i)與氨基酸序列選自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)甲基毒死蜱高至少2倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)， ii)與氨基酸序列選自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)二嗪農(nóng)高至少1.5倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)， iii)與氨基酸序列選自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)乙基對(duì)硫磷高至少2倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)，或者 iv)與氨基酸序列選自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)乙基毒死蝶高至少1.2倍的催化常數(shù)(keat)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽，其具有: i)與氨基酸序列選自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)甲基毒死蜱高至少2倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)， ii)與氨基酸序列選自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)二嗪農(nóng)高至少1.5倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)， iii)與氨基酸序列選自SEQID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)乙基對(duì)硫磷高至少2倍的二級(jí)速率常數(shù)(kMt/Km)，和 iv)與氨基酸序列選自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的多肽相比，針對(duì)乙基毒死蝶高至少1.2倍的催化常數(shù)(keat)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5的任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述有機(jī)磷酸酯的離去基團(tuán)具有低于8的pKa。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6的任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述有機(jī)磷酸酯是芳香族非乙烯基有機(jī)磷酸酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述有機(jī)磷酸酯是乙基對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、二嗪農(nóng)、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱或馬拉硫磷。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至8任一項(xiàng)所述的多肽，其具有下列中的兩個(gè)或更多: i)對(duì)乙基毒死蜱至少約ZxKfsec'M—1的二級(jí)速率常數(shù)(keat/Km)，ii)對(duì)甲基毒死蝶至少約3.5xl05sec' IVT1的kcat/Km,
iii)對(duì)二嗪農(nóng)至少約3.6xl06sec^.M—1 的 kcat/Km, iv)對(duì)乙基對(duì)硫磷至少約gxKfsec—1.1VT1的keat/Km,或 v)對(duì)甲基對(duì)硫磷至少約SxlO6Secr1.1VT1的kcat/Km。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，其具有: i)對(duì)乙基毒死蜱至少約ZxIO6sec'M—1的二級(jí)速率常數(shù)(keat/Km)， ii)對(duì)甲基毒死蝶至少約3.5xl05sec' IVT1的kcat/Km,
iii)對(duì)二嗪農(nóng)至少約3.6xl06sec^.M—1 的 kcat/Km, iv)對(duì)乙基對(duì)硫磷至少約QxlO7Secr1.1VT1的keat/Km,以及 v)對(duì)甲基對(duì)硫磷至少約SxlO6Secr1.1VT1的kcat/Km。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)所述的多肽，其包含a)至e)中的至少三個(gè)，或包含a)和c)、以及b)、d)和e)中的至少一個(gè)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽，其包含b)、d)和e)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12的任一項(xiàng)所述的多肽，其包含a)至e)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13的任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述片段包含至少SEQID NO:1的氨基酸20至296。
15.一種多肽，其水解有機(jī)磷酸酯分子，并且其具有對(duì)甲基毒死蜱至少約3.SxlO5Sec-1.M'對(duì)二嗪農(nóng)至少約3.6xl06sec_1.M_\對(duì)乙基對(duì)硫磷至少約gxKfsec' M—1的二級(jí)速率常數(shù)(kcat/Kffl)，或者其兩個(gè)或更多個(gè)的組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15的任一項(xiàng)所述的多肽，其是進(jìn)一步含有至少一種其它多肽序列的融合蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16的任一項(xiàng)所述的多肽，其固定在固體支持物上。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17的任一項(xiàng)所述的多肽，其存在于微生物細(xì)胞或者在微生物細(xì)胞的提取物、優(yōu)選粗提物中。
19.一種分離的和/或外源的多核苷酸，其包含序列為如下的核苷酸: i)如SEQ ID NO:6 所示， ii)編碼根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽，或 iii)與i)或ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的多核苷酸，其可操作地連接于能夠指導(dǎo)所述多核苷酸在細(xì)胞中、優(yōu)選微生物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
21.—種載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的多核苷酸。
22.—種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的多核苷酸、和/或根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
24.一種轉(zhuǎn)基因非人類生物，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)基因非人類生物，其是植物、微生物生物，優(yōu)選細(xì)菌或真菌。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞、和/或根據(jù)權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的生物的提取物，其中所述提取物包含根據(jù)權(quán)利要求1至18任一項(xiàng)所述的多肽、以及任選地根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的多核苷酸。
27.一種組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞、和根據(jù)權(quán)利要求26所述的提取物中的一種或多種，以及一種或多種可接受的載體。
28.一種用于水解有機(jī)磷酸酯分子的方法，所述方法包括使有機(jī)磷酸酯分子接觸根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求26所述的提取物以及根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物中的一種或更多種。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述有機(jī)磷酸酯分子在選自土壤、水、生物材料或其組合的樣本中或在表面上。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或權(quán)利要求29所述的方法，其包括將所述多肽、宿主細(xì)胞、提取物或組合物中的一種或更多種應(yīng)用至實(shí)地土壤或液體中。
31.一種在受試者中治療由有機(jī)磷酸酯分子所導(dǎo)致的毒性的方法，方法包括向受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求26所述的提取物以及根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物的一種或更多種。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求11所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求16所述的提取物以及根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物的一種或更多種，在制造用于在受試者中治療由有機(jī)磷酸酯分子所導(dǎo)致的毒性的藥物中的用途。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求21所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求26所述的提取物以及根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物的一種或更多種，作為用于在受試者中治療由有機(jī)磷酸酯分子所導(dǎo)致的毒性的藥物的用途。
34.一種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽的方法，所述方法包括:在允許編碼所述多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞，以及回收表達(dá)的多肽。
35.一種用于檢測(cè)有機(jī)磷酸酯存在的生物傳感器，所述生物傳感器包含根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽、以及檢測(cè)有機(jī)磷酸酯分子被所述多肽水解的手段。
36.一種用于水解有 機(jī)磷酸酯分子的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求26所述的提取物以及根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物的一種或更多種。
【文檔編號(hào)】A61K38/46GK103814127SQ201280045762
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月20日
【發(fā)明者】C·斯科特, J·奧克肖特, R·拉塞爾, N·弗倫克, S·科措尼斯, 劉凱燕 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)工業(yè)研究組織